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1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Agilent, WTC-BarcelonaIsidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
U/HPLC MasterClass
Orientado a Laboratorios
de Control de Calidad.
2.-Introducción
a la UHPLC.
Capítulo 2
Objetivo: Conocer las Posibilidades de la
UHPLC “versus” HPLC
2.- Introducción a la UHPLC:
2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC
• Ecuación de Van Deemter.
• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.
2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con
gradientes de concentración.
• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis aumentando el
flujo con gradientes de concentración.
2.3.- Conclusiones
Página: 2
Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2
El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se
aborda en el curso orientado a Laboratorios de
Investigación y Desarrollo 12:00h
Cap. 2
2.- Introducción a la UHPLC:
2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC
• Ecuación de Van Deemter.
• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.
2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con gradientes
de concentración.
• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis aumentando el
flujo con gradientes de concentración.
2.3.- Conclusiones
Página: 3
Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2
El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se
aborda en el curso orientado a Laboratorios de
Investigación y Desarrollo
Cap. 2
Historia* de la UHPLC Moderna
10 New UHPLC Systems in 5 Years – All different.
10 nuevos sistemas UHPLC en 5 años
Todos con características diferentes
Equipos Columnas & Filosofía
2003 Agilent 1100 Binario (400bars). Mezcla en
alta presión
Primeras columnas submicron 1.8um x 5 (10) cm
RRHT, filosofía UFLC/UHPLC.
2004 Waters Acquity U-class Binario (1000bars)
Mezcla en alta presión
Columnas 1,7 um BEH, campaña marketing
filosofía UPLC.
2006 Agilent 1200-RRLC binario, (600bars)
Mezcla en alta presión
2º generación* 1.8 um, x 10 (15) cm concepto
UHPLC. *reducen 20-30% presión de trabajo
2008 Agilent 1220/1260 binario, cuaternario
(600bar) Mezcla alta o baja presión
Rediseño 1200RRLC. Filosofía equipo hibrido
HPLC/UHPLC.
2010 Agilent 1290 binario (1200bars)
UHPLC. Mezcla en alta presión.
UHPLC con la máxima potencia del mercado (P x F).
- Poroshell 120 UHPLC 2,7um a presiones más
bajas (40-50% menor) x 10 (15) cm con 400bars
2010 Waters Acquity H-class cuaternario
(1000bar). Mezcla en baja presión
UHPLC con mezclado a baja presión.
2011 Waters Acquity I-Class binario (1000bars) Rediseño U-Class.
2011 Agilent 1290 cuaternario (1200bars)
Mezcla en baja presión
Más versátil UHPLC del mercado.
2013 Waters Rediseño Alliance (345bars).
Mezcla baja presión
Prolonga la vida de la serie Alliance.
Pre-historia: 198X ya existían en el mercado columnas de 1.5 µm (x30mm long.): UFLC
Cap. 2
Página: 4
Fundamentos UHPLC
1. Ecuación de Van Deemter:
• Capacidad de poder trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia, con columnas:
– De pequeño tamaño de partícula totalmente porosas (TP <2µm)
– Fino espesor de fase estacionaria; columnas núcleo sólido superficialmente porosas (SP 2.7µm).
2. Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• La capacidad de separación de picos trabajando con gradientes de concentración es directamente proporcional al flujo de trabajo y al tiempo de gradiente subir el flujo permitirá mejorar la separación con gradientes.
Página: 5
Cap. 2
Columnas UHPLC “versus” HPLC
• UHPLC:
• Columnas que permiten trabajar a flujos elevados SIN perder eficacia:
– Rellenos totalmente porosos de pequeño tamaño de partícula (<2µm).
– Rellenos superficialmente porosos (fino espesor de fase estacionaria 0.5µm) con núcleo sólido (1.7µm). Tipo “Poroshell-120”
• Los cromatógrafos de 400 bars se pueden adaptar para trabajar con columnas de UHPLC tipo Poroshell-120 (hasta 10cm long.) y totalmente porosas de 1.8µm (hasta 5cm long.) con acetonitrilo/agua.
• HPLC:
• Columnas tradicionales de 3.5 y 5µm de tamaño de partícula.
Página: 6
Cap. 2
2.- Introducción a la UHPLC:
2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC
• Ecuación de Van Deemter.
• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.
2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con
gradientes de concentración.
• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis aumentando el
flujo con gradientes de concentración.
2.3.- Conclusiones
Página: 7
Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2
El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se
aborda en el curso orientado a Laboratorios de
Investigación y Desarrollo
10-20mCap. 2
Efecto del Tamaño de Partícula en la Eficacia.
HPLC vs UHPLC: Gráfico Van Deemter
Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18
Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)
Eluyente: 85:15 ACN: Agua - ISOCRATICO
Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente
1/ 2.5
+
EFI
CA
CIA
-
HPLC:EFICACIA A FLUJOS ALTOS:
EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS
Partícula H_min
5 μm 9,1 μm
3,5 μm 5,8 μm
1,8 μm 3,7 μm
N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)
1.6 x Rs(5µm)
0.0000
S.T.M.: Sub Two Microns
Ultra Fast LC
Particulas1,8 μm a 5ml/min* dan más eficacia
N(1.8µm) = 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)
* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.
HPLC
GC: Diám. col. cap.
Espesor film f.estac. N
/ Diámetro Columna & Espesor Film (GC)
Página 8
o Poroshell 120
YA VISTO en
Cap 1.1
Cap. 2
4.6 x 150, 1.8um
490 bar
N = 28669
RS = 1.80 (+ 57%)
S/N = 44
7 Impurezas
Las 7 Separadas
a línea de base
4.6 x 150, 5um
93 bar
N = 7259
RS = 1.15
S/N = 42
Ejemplo de un cliente
Método Impurezas Isocr.
Zoom zona critica
rango tiempo @ 7min
4.6 x 150, 3.5um
165 bar
N = 14862
RS = 1.37 (+19%)
S/N = 50
7 Impurezas
6 No Separadas
a línea de base
Aportaciones Ejemplo de Mejora de Resolución
HPLC vs UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µmEjemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución
Manteniendo Tiempo de Análisis
4 Impurezas
2 No Separadas
a línea de base
HPLC UHPLC
Página: 9
2.1mm x 50mm 1.8µm
1.00ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 0.9 min
Analysis Time= 1.1min
UHPLC, 40°C
10x faster
PW = 0.5 sec
min0.2 0.4 0.6 0.8 10
Aportaciones Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC
vs UHPLC Agilent 1200-RRLC (UHPLC-600bars)
HPLC, 40°C
PW = 3.4sec
4.6 x 150mm, 5µm
1.20ml/min, 40°C
Grad.: 35-95% en 10.8 min
Analysis Time = 11minmin0 2 4 6 8 10
0.2 0.60 0.4 min
2.1mm x 50mm 1.8µm
2.40ml/min, 95°C
Grad.: 35-95% en 0.38 min
Analysis Time: 0.4min
Presión < 600bars
UHPLC, 95°C
27x faster
PW = 197msec
150mm > 50mm: 3x
1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x 3 x 10 = 30x
Hasta +20x más rápido que un HPLC. manteniendo la resolución
Página: 10
F xTg
/ V0
1.2 x10.8
/1.5 =
8.6
1.0 x 0.9
/0.1 =
9.0
2.4x0.38
/0.1=
9.1
Página 11
Efecto de la Temperatura en Gráfico de “Van Deemter”Al aumentar la temperatura* el óptimo se desplaza a flujos mayores
25°C, 45%ACN 60°C, 40%ACN 90°C, 35%ACN 120°C, 28%ACN
uo, opt
25ºC
60ºC
90ºC
120ºC
H = f (u) – butilparaben Tamaño partícula: 5 µm
7.00
9.00
11.00
13.00
15.00
17.00
19.00
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
u (mm/s)
H (
µm
)
HTLC: HPLC a Alta Temperatura* permite trabajar a mayores flujos sin pérdida
de eficiencia y con mejor transferencia de masa (curva más plana a flujos altos)
*Tener en cuenta que la temperatura afecta al pH de la fase
móvil
Cap. 2
2.- Introducción a la UHPLC:
2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC
• Ecuación de Van Deemter.
• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.
2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con
gradientes de concentración.
• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis
aumentando el flujo con gradientes de concentración.
2.3.- Conclusiones
Página: 12
Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2
El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se
aborda en el curso orientado a Laboratorios de
Investigación y Desarrollo
16-14mCap. 2
El factor de Capacidad de Separación de picos con Gradientes de concentración, es DIRECTAMENTE proporcional al FLUJO y al tiempo del gradiente:
• x2 flujo gradiente x2 factor de Capacidad de Separación de picos *.
• x3 flujo gradiente x3 factor de Capacidad de Separación de picos *.
• …
Doblar el flujo produce la misma mejora en resolución que doblar el tiempo del gradiente
• Flujos elevados permiten maximizar el poder de separación en gradientepor unidad de tiempo:
• P. Petersson et al., J.Sep.Sci, 2008,31, 2346-2357
• D. Guillarme et al., Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 3232–3243
* El nº de picos que se pueden separar aumentará algo menos con columnas de 5um (por la ligera perdida de eficacia al subir el flujo), pero aún así compensa la pérdida de eficacia.
¿Porqué es Importante en Gradiente poder trabajar
a FLUJOS Elevados en HPLC y UHPLC?
K‘ α F x Tg
Página: 13
Cap. 2
HPLC con GRADIENTES: NO es Imprescindible Cambiar
de Columna para Reducir Tiempos SIN perder ResoluciónIncluso con tamaños de partícula de 5 y 3.5µm
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm
Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
Tg = 3 min
3min
1
23
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
Tg = 2 min
2min
• Sin cambiar de columna, ni de tiempo de gradiente, SUBIR el FLUJO, permitirá
mejorar la resolución/capacidad de separación.
• El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de
eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.
K‘ = (87 x F x Tg) / (Δ % x V0 x S)
• La capacidad de separación no cambiará si: F1xTg1/V0 col.1 = F2xTg2/V0 col.2
Si mantenemos Tg=3 ( y F=3) obtendremos:
+Resolución y un tiempo análisis < 3min
Página: 14
Cap. 2
Columnas: ZORBAX Eclipse XDB-C18
Dimensiones: 4,6 x 50 mm (30 mm, 1,8 m)
Eluyente: 85:15 ACN: Agua
Velocidades de flujo: 0,05 – 5,0 mL/min
Temp: 20°C
Muestra: 1,0 L octanofenona en eluyente1/ 2.5
+
EFI
CA
CIA
-EFICACIA A FLUJOS ÓPTIMOS
Partícula H_min
5 μm 9,1 μm
3,5 μm 5,8 μm
1,8 μm 3,7 μm
N(1.8µm) = 2.5 x N(5µm)
1.6 x Rs(5µm)
0.0000
Ultra Fast LC
* 5ml/min con columnas 4.6mm - 1ml/min con columnas de 2.1mm D.I.
HPLC
Página: 15
El aumento de capacidad de separación al subir el flujo, compensa la pérdida de
eficacia de las columnas de 3.5 y 5 µm.:
• 5µm 0.75 mL/min: Eficacia/2.4 pero Capacidad Separación x7
• 3.5µm 0.85 mL/min: Eficacia/2 pero Capacidad Separación x6
K‘ = (87 x F x Tg) / ( Δ % x V0 x S)
Las columnas de 1.8µm NO conviene
que trabajen a flujos bajos; empiezan a
perder eficacia por debajo de
0.8mL/min (en columnas 4.6mm d.i //0.16
mL/min con 2.1mm d.i..)
La Ventaja de Subir el Flujo Trabajando con
Gradientes Incluso en HPLC (columnas 3.5 y 5µm)
ó Poroshell 120
Cap. 2
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación GRADIENTE 10 min a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/min 1290 Infinity Cuaternario
Columna: 5µm 4.6x150mm Eclipse XDB-C8
Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en 10 min
Flujo: 1, 3 y 5mL/min (pruebas respetando Pmáx
columna: 400bars) 40ºC.
Inyección: 2 µl muestra (1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-
terfenilo en metanol)
8min
4.5min
3.3min
Al subir flujo se reduce el
tiempo y el ancho de los picos
Página: 16
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
Cap. 2
Influencia del Flujo en Gradiente con Columnas 5 µm Comparación en ESCALA TIEMPO NORMALIZADA GRADIENTE 10 min a 1-3-5
ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
3mL/min
1mL/min
5mL/minAl subir flujo en gradiente se reduce el tiempo y el
ancho de los picos y en especial de los del principio
mejora la capacidad de separación de picos
8min
4.5min
3.3min
Peak width:
0.0546
Peak width:
0.0242
Peak width:
0.0171
Peak width:
0.0496
Peak width:
0.0542
Peak width:
0.0696
Página: 17
Peak width:
0.0696
Peak width:
0.0446
Peak width:
0.0371
Flujo
mL/
min
Capacidad
Separación
Nº picos(ref.1º)
Capacidad
Separación
Nº picos(ref.3º)
1 35 30
3 45 35
5 55 40
• Nº de picos que se pueden
separar con resolución
hasta línea de base en
función del ancho en línea de
base del 1er (zona inicial) y
3er pico (zona central) del
cromatograma a distintos
flujos con la columna de 5µm
totalmente porosa.
• Eficacia (N) 5µm a 5mL/min =
½ de la N a 1mL/min
Al subir flujo aumenta el nº de picos que se pueden separar -INCLUSO con una
columna de 5µm- y además se reduce el tiempo e análisis.
FxTg= 10
FxTg= 30
FxTg= 50
¿Porqué se reduce el ancho del pico ?
min2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0401.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
1.9
63
2.6
62
5.4
15
10.6
43
min2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-3601.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
0.6
72
0.9
09
1.8
32
3.5
89
min2 4 6 8 10
mAU
0
500
1000
1500
DAD1 A, Sig=240,80 Ref=360,100 of AIAFOR~1\1AA-0501.AIA\SIGNAL01.CDF (AIA imported)
0.4
07
0.5
50
1.1
15
2.2
04
HPLC ISOCRÁTICO: Pérdida de Eficacia con 5 µm a Flujos Elevados Comparación Isocrático a 1-3-5 ml/min con Columna 5µm 150x4.6mm
Flujo: 1 ml/min. ACN/H2O 70/30
Flujo: 3 ml/min. ACN/H2O 70/30
Flujo: 5 ml/min. ACN/H2O 70/30 Isocrático: ACN/H2O 70/30
Inyección: 5 µl muestra (isocrática:1500ppm dimetilftalato y
dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm o-terfenilo en metanol
Detección: DAD 240/80 nm ref:360/100nm, slit8nm y frecuencia de adquisición a 0.01 y 0.05min Celda 6mm y 5µl
N= 15.700N= 16.200
N= 10.000N= 9.900
N= 6.900
N= 6.500
• En ISOCRÁTICO Con 5µm hay una pérdida
de eficacia al pasar de 1 a 3-5 ml/min, pero
mantiene una buena resolución.
• 5ml/min con columna 4.6mm d.i.: N(1.8µm)
= 2.5 x N(3.5µm) = 4 x N(5µm)
Comparación Normalizada
min2 4 6 8 10
1mL/min
3mL/min
5mL/min
Página 18
Entre 1 y 3ml/min
apenas se aprecia
pérdida de resolución
Cap. 2
Comparación Estrategias Mejora de la Resolución
k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Columna: ZORBAX SB-C8
Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min
Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2
B: Acetonitrilo
Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C
Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine
5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor
Tg = 10 min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
15min
1,2
34 5
6
7
8
0 5 10 15Time (min)
• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1
Tg = 60 min a 1mL/min 4
2
0 25 50Time (min)
3
5
8
6
7 40min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
Tradicional
• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml
N = 10,000
Tg = 15 min a 2mL/min
“Moderna”:
Si k se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.
Página: 19
Time (min)0 5 10
2
3
45
67
8
1
7min
1x10/1.5= 6,7
2x15/0.75= 40
1x60/1.5= 40
¡¡¡Se reduce Tiempo análisis
a 1/6 pero se mantiene la
Separación !!!
¿Cómo mejorar?
Cap. 2
2.- Introducción a la UHPLC:
2.1.- Historia, Introducción y Fundamentos de la UHPLC
• Ecuación de Van Deemter.
• Posibilidades de la UHPLC para aumentar resolución o reducir tiempos.
2.2.- La importancia del Flujo en separaciones con
gradientes de concentración.
• Ecuación de la Capacidad de Separación en Gradientes:
• Cómo ganar resolución y reducir tiempos de análisis aumentando el
flujo con gradientes de concentración.
2.3.- Conclusiones
Página: 20
Agenda Curso U/HPLC (1/3): Capítulo 2
El desarrollo y traspaso de métodos de HPLC a UHPLC se
aborda en el curso orientado a Laboratorios de
Investigación y Desarrollo
27-3mCap. 2
Conclusiones: UHPLC “versus” HPLC
Página: 21
UHPLC permite MAXIMIZAR:
• Reducción de Tiempos de Análisis SIN perder Resolución.
• Aumentar la Resolución SIN incrementar tiempo de Análisis.
HPLC (400 bars) -incluso sin cambiar de columna- permite:
• Simplemente SUBIENDO el FLUJO de trabajo* Reducir Tiempos y
Aumentar la Resolución.
* Trabajando con gradientes de concentración
Cap. 2
1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
Serie 1200 Infinity: la Máxima Flexibilidad
para trabajar en HPLC y UHPLC,
en Todo Tipo Aplicaciones.
Hasta 5mL/min*
para máxima eficacia y
mínimo tiempo de análisis
incluso con las
tradicionales y robustas
columnas de 4.6mm d.i
*hasta 10mL/min con bombas
cuaternarias
Página: 22
Cap. 2
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890 [email protected]
[email protected] www.agilent.com/chem
¿Preguntas?
30min
12:0012:30