Caracterización de células madre embrionarias de ratón obtenidas a partir de embriones en estadio de blastocisto Fagundez Carol 1 , Delcourt Stella 1 , Ojea Quintana Marcos 1 , Gogorza Sebastián 2 , Testa Roberto 2 , Argibay Pablo 1 1. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental – Hospital Italiano de Buenos Aires 2. Servicio de Ginecología – Hospital Italiano de Buenos Aires INTRODUCCIÓN Las células madre embrionarias de ratón (CMEr) son células indiferenciadas que pueden autorrenovarse durante largos periodos de tiempo conservando aún su pluripotencia. Estas células poseen una alta relación núcleo/citoplasma y expresan ciertos genes y productos génicos asociados con la autorrenovación y pluripotencia, tales como el factor de transcripción de unión a octámero - 4 (Oct-4), nanog y sox 2. Además, expresan el antígeno embrionario estadio específico (SSEA-1) y muestran actividad enzimática para fosfatasa alcalina (ALP) y telomerasa. Durante el cultivo in vitro mantienen un cariotipo relativamente estable, y al ser crecidas en suspensión pueden originar cuerpos embrioides (EBs) así como formar teratomas al ser inyectados en ratones inmunosuprimidos. El objetivo de este trabajo es derivar y cultivar CMEr a partir de embriones que hayan alcanzado el estadio de blastocisto eclosionado y proceder a su caracterización con el fin de obtener una línea celular. MATERIALES Y MÉTODOS Embriones en estadio de dos células fueron obtenidos de ratones hembra superovuladas de la cepa C57BL/6 y cultivados en medio HTF hasta el estadio de blastocisto eclosionado, los cuales fueron luego sembrados sobre una capa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados y crecidos en medio DMEM knock-out suplementado con suero de reemplazo hasta la obtención de las primeras colonias. Éstas fueron repicadas sucesivamente mediante disgregación mecánica. La verificación del estado indiferenciado se realizó mediante la detección de la actividad ALP y la presencia de los marcadores SSEA-1 y Oct-4 . La evaluación de la pluripotencia se hizo mediante la formación de EBs. RESULTADOS Hasta el momento se han podido derivar 13 colonias de CMEr, de las cuales una de ellas continúa en proliferación y ha podido ser caracterizada. La misma ha dado resultados positivos tanto para ALP (Fig.1B) como para la marcación con los anticuerpos anti-SSEA-1 (Fig.1C) y anti-Oct-4 (Fig.1D), además de mostrar la morfología característica de las colonias CMEr (Fig.1A). Los EBs obtenidos han mostrado el típico aspecto quístico y la formación de estructuras semejantes a sacos vitelinos (Fig.2 A,B). La tinción con hematoxilina y eosina ha revelado la formación de estructuras variadas dentro de los EBs (Fig.2 C,D), mientras que las células derivadas de éstos que se adhirieron a la placa de cultivo demostraron diferenciarse espontáneamente a derivados de endodermo, mesodermo y ectodermo (Fig.3). CONCLUSIÓN Ha sido posible obtener colonias de CMEr a partir de blastocistos, pudiendo conservarse su estado indiferenciado durante varios pasajes.

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Caracterización de células madre embrionarias de ratón obtenidas a partir de embriones en estadio de blastocisto

Fagundez Carol1, Delcourt Stella1, Ojea Quintana Marcos1, Gogorza Sebastián2, Testa Roberto2, Argibay Pablo1

1. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental – Hospital Italiano de Buenos Aires2. Servicio de Ginecología – Hospital Italiano de Buenos Aires

INTRODUCCIÓNLas células madre embrionarias de ratón (CMEr) son células indiferenciadas que pueden autorrenovarsedurante largos periodos de tiempo conservando aún su pluripotencia. Estas células poseen una alta relación núcleo/citoplasma y expresan ciertos genes y productos génicos asociados con la autorrenovación y pluripotencia, tales como el factor de transcripción de unión a octámero - 4 (Oct-4), nanog y sox 2. Además, expresan el antígeno embrionario estadio específico (SSEA-1) y muestran actividad enzimática para fosfatasa alcalina (ALP) y telomerasa. Durante el cultivo in vitro mantienen un cariotipo relativamente estable, y al ser crecidas en suspensión pueden originar cuerpos embrioides(EBs) así como formar teratomas al ser inyectados en ratones inmunosuprimidos.El objetivo de este trabajo es derivar y cultivar CMEr a partir de embriones que hayan alcanzado el estadio de blastocisto eclosionado y proceder a su caracterización con el fin de obtener una línea celular.

MATERIALES Y MÉTODOSEmbriones en estadio de dos células fueron obtenidos de ratones hembra superovuladas de la cepa C57BL/6 y cultivados en medio HTF hasta el estadio de blastocisto eclosionado, los cuales fueron luego sembrados sobre una capa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados y crecidos en medio DMEM knock-out suplementado con suero de reemplazo hasta la obtención de las primeras colonias. Éstas fueron repicadas sucesivamente mediante disgregación mecánica. La verificación del estado indiferenciado se realizó mediante la detección de la actividad ALP y la presencia de los marcadores SSEA-1 y Oct-4 . La evaluación de la pluripotencia se hizo mediante la formación de EBs.

RESULTADOSHasta el momento se han podido derivar 13 colonias de CMEr, de las cuales una de ellas continúa en proliferación y ha podido ser caracterizada. La misma ha dado resultados positivos tanto para ALP (Fig.1B) como para la marcación con los anticuerpos anti-SSEA-1 (Fig.1C) y anti-Oct-4 (Fig.1D), además de mostrar la morfología característica de las colonias CMEr (Fig.1A). Los EBs obtenidos han mostrado el típico aspecto quístico y la formación de estructuras semejantes a sacos vitelinos (Fig.2 A,B). La tinción con hematoxilina y eosina ha revelado la formación de estructuras variadas dentro de los EBs (Fig.2 C,D), mientras que las células derivadas de éstos que se adhirieron a la placa de cultivo demostraron diferenciarse espontáneamente a derivados de endodermo, mesodermo y ectodermo (Fig.3).

CONCLUSIÓNHa sido posible obtener colonias de CMEr a partir de blastocistos, pudiendo conservarse su estado indiferenciado durante varios pasajes.