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INSTITUTO POLITEacuteCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS
SECCIOacuteN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIOacuteN
DEPARTAMENTO DE GRADUADOS E INVESTIGACIOacuteN EN
ALIMENTOS
CARACTERIZACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
PRESENTES EN LA SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA (Salvia hispanica L) MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
T E S I S
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS
PRESENTA
FRANCISCO ERIK GONZAacuteLEZ JIMEacuteNEZ
DIRECTORES DE TESIS
M EN C MARIacuteA DEL CARMEN BELTRAacuteN OROZCO
DRA MARIacuteA GABRIELA VARGAS MARTIacuteNEZ
MEacuteXICO D F DICIEMBRE 2010
RESUMEN
Actualmente el estudio de alimentos con propiedades antioxidantes ha aumentado
considerablemente debido al intereacutes que se tiene sobre los efectos beneacuteficos a la
salud que previenen dichos compuestos tales como la prevencioacuten de caacutencer
enfermedades cardiovasculares y otras patologiacuteas de caraacutecter inflamatorio Ademaacutes
de que el consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminucioacuten de
otras enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias En esta
investigacioacuten se estudiaron 4 tipos de semilla de chiacutea de los estados de Puebla y
Colima y el aceite extraiacutedo de la misma determinando la capacidad antioxidante de
cada muestra por el meacutetodo del ABTS y la cantidad de fenoles totales con el reactivo
de Folin-Ciocalteu e identificacioacuten de los compuestos fenoacutelicos mediante la teacutecnica
de electroforesis capilar la cual es una herramienta muy uacutetil en el anaacutelisis de
alimentos ya que disminuye la generacioacuten de contaminantes el tiempo de anaacutelisis y
costo de los mismos Los resultados obtenidos mostraron que la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea contiene una elevada capacidad antioxidante
(9873 micromol Troloxg muestra) comparada con frutos como la frambuesa (84 micromol
Troloxg muestra) y la manzana roja (40 micromol Troloxg muestra) que se distinguen
por su alto contenido de antioxidantes Mientras que el aceite de chiacutea muestra
valores de fenoles totales comparables (12 mg acido gaacutelico100 g muestra) en
relacioacuten al aceite de olivo (1336 mg acido gaacutelico100 g muestra) en lo que respecta
al anaacutelisis mediante electroforesis capilar se lograron identificar hasta 9 compuestos
fenoacutelicos en el caso de la semilla desgrasada aacutecido feruacutelico aacutecido vainillinico aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido gaacutelico aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina quercetina
kaempferol En el caso del aceite se logroacute identificar hasta 4 compuestos fenoacutelicos
(dependiendo del tipo de aceite) aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-
cumaacuterico y Quercetina En general se puede considerar la semilla de chiacutea como un
alimento con potente capacidad antioxidante que incluyeacutendola en la dieta diaria
ayudariacutea a satisfacer los requerimientos diarios de antioxidantes y prevenir ciertas
enfermedades de patologiacutea inflamatoria ademaacutes de los beneficios que se obtendriacutean
por los demaacutes nutrientes que contiene como es el caso de la proteiacutena fibra y aacutecidos
grasos omega 3 y 6
ABSTRACT
Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the
interest that has beneficial efects on health from such compounds such as cancer
prevention cardiovascular and other inflammatory cancer diseases
In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of
other diseases such as diabetes and heart disease In this work we have studied 4
types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it
determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the
amount of total phenolics with the FolinndashCiocalteu reagent and identification of
phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food
analysis because it reduces the generation of pollutants the analysis time and cost of
them
The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant
capacity (9873 mmol Trolox g sample) compared with fruits such as raspberries (84
mmol Trolox g sample) and red apple (40 mmol Trolox g shown) that are
distinguished by their high antioxidant content While chia oil shows comparable
values of total phenols (12 mg acid gallic100 g sample) compared to olive oil (1336
mg acid gallic100 g sample) with respect to analysis by capillary electrophoresis was
achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted ferulic
acid vanillin trans-cinnamic acid gallic acid caffeic acid chlorogenic acid myricetin
quercetin and kaempferol In the case of oils were identified up to 4 phenolic
compounds (depending on the type of oil) trans-cinnamic acid chlorogenic acid p-
coumaric acid and quercetin
In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that
including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and
prevent certain inflammatory disease pathology in addition to the benefits to be
gained by the other nutrients it contains such as protein fiber omega 3 and 6
II
INDICE GENERAL Paacutegina
IacuteNDICE GENERAL i
IacuteNDICE DE CUADROS iii
IacuteNDICE DE FIGURAS v
1 INTRODUCCIOacuteN
11 Caracteriacutesticas de la semilla de chiacutea
112 Cultivo
113 Usos y aplicaciones
114 Composicioacuten de las semillas de chiacutea
115 La chiacutea como fuente de aacutecidos grasos indispensables en la nutricioacuten humana 12 Antioxidantes
13 Compuestos polifenoacutelicos
131 Biosiacutentesis de compuestos fenoacutelicos
132 Actividad antioxidante de los compuestos fenoacutelicos
133 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos
14 Electroforesis capilar
141 Tipos de electroforesis
142 Flujo electroosmoacutetico 19
143 Inyeccioacuten de la muestra
15 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anaacutelisis de alimentos
16 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en alimentos mediante EC
JUSTIFICACIOacuteN
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos especiacuteficos
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia prima
22 Reactivos y materiales 32
1
1
2
3
5
7
8
10
11
14
15
16
17
23
25
25
30
31
31
31
32 32
i
ii
23 Desarrollo experimental
24 Equipo
3 MEacuteTODOS
31 Determinacioacuten de proteiacutenas
32 Determinacioacuten de humedad
33 Determinacioacuten de fibra
34 Determinacioacuten de cenizas
35 Determinacioacuten de liacutepidos
36 Determinacioacuten de carbohidratos
37 Extraccioacuten del aceite de chiacutea
38 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos de la semilla de chiacutea
39 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos presentes en el aceite de chiacutea
310 Determinacioacuten de fenoles totales
311 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de chiacutea por el meacutetodo del radical ABTS
312 Anaacutelisis de compuestos polifenoacutelicos mediante 38 electroforesis capilar
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 Anaacutelisis proximal
42 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
43 Determinacioacuten de la capacidad antioxidante por el meacutetodo del ABTS
44 Identificacioacuten de compuestos fenoacutelicos mediante 47 electroforesis capilar 441 Eleccioacuten de las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis 47
442 anaacutelisis de los extractos de aceite de chiacutea 65 5 CONCLUSIONES 92
6 BIBLIOGRAFIacuteA 94
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
36
37
38
40
40
41
45
iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
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0100
0125
0150
0175
0200
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0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
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0250
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AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
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30
40
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60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
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120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
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40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
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100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
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70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
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20
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45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
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30
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40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
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50
60
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100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
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0050
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2
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4
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7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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000
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
001
002
003
004
005
AU
001
002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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0050
0055
AU
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0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
Minutes
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0045
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0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
003
004
005
006
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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003
004
005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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001
002
003
004
005
006
1
2 3
4
5
6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
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005
006
1
2 3
7
4
5 6
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
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006
AU
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001
002
003
004
005
006
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
loro
geacuteni
co
ac f
eruacutel
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Kaem
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Ac
p-cu
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Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
afeiacute
co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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RESUMEN
Actualmente el estudio de alimentos con propiedades antioxidantes ha aumentado
considerablemente debido al intereacutes que se tiene sobre los efectos beneacuteficos a la
salud que previenen dichos compuestos tales como la prevencioacuten de caacutencer
enfermedades cardiovasculares y otras patologiacuteas de caraacutecter inflamatorio Ademaacutes
de que el consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminucioacuten de
otras enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias En esta
investigacioacuten se estudiaron 4 tipos de semilla de chiacutea de los estados de Puebla y
Colima y el aceite extraiacutedo de la misma determinando la capacidad antioxidante de
cada muestra por el meacutetodo del ABTS y la cantidad de fenoles totales con el reactivo
de Folin-Ciocalteu e identificacioacuten de los compuestos fenoacutelicos mediante la teacutecnica
de electroforesis capilar la cual es una herramienta muy uacutetil en el anaacutelisis de
alimentos ya que disminuye la generacioacuten de contaminantes el tiempo de anaacutelisis y
costo de los mismos Los resultados obtenidos mostraron que la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea contiene una elevada capacidad antioxidante
(9873 micromol Troloxg muestra) comparada con frutos como la frambuesa (84 micromol
Troloxg muestra) y la manzana roja (40 micromol Troloxg muestra) que se distinguen
por su alto contenido de antioxidantes Mientras que el aceite de chiacutea muestra
valores de fenoles totales comparables (12 mg acido gaacutelico100 g muestra) en
relacioacuten al aceite de olivo (1336 mg acido gaacutelico100 g muestra) en lo que respecta
al anaacutelisis mediante electroforesis capilar se lograron identificar hasta 9 compuestos
fenoacutelicos en el caso de la semilla desgrasada aacutecido feruacutelico aacutecido vainillinico aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido gaacutelico aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina quercetina
kaempferol En el caso del aceite se logroacute identificar hasta 4 compuestos fenoacutelicos
(dependiendo del tipo de aceite) aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-
cumaacuterico y Quercetina En general se puede considerar la semilla de chiacutea como un
alimento con potente capacidad antioxidante que incluyeacutendola en la dieta diaria
ayudariacutea a satisfacer los requerimientos diarios de antioxidantes y prevenir ciertas
enfermedades de patologiacutea inflamatoria ademaacutes de los beneficios que se obtendriacutean
por los demaacutes nutrientes que contiene como es el caso de la proteiacutena fibra y aacutecidos
grasos omega 3 y 6
ABSTRACT
Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the
interest that has beneficial efects on health from such compounds such as cancer
prevention cardiovascular and other inflammatory cancer diseases
In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of
other diseases such as diabetes and heart disease In this work we have studied 4
types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it
determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the
amount of total phenolics with the FolinndashCiocalteu reagent and identification of
phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food
analysis because it reduces the generation of pollutants the analysis time and cost of
them
The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant
capacity (9873 mmol Trolox g sample) compared with fruits such as raspberries (84
mmol Trolox g sample) and red apple (40 mmol Trolox g shown) that are
distinguished by their high antioxidant content While chia oil shows comparable
values of total phenols (12 mg acid gallic100 g sample) compared to olive oil (1336
mg acid gallic100 g sample) with respect to analysis by capillary electrophoresis was
achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted ferulic
acid vanillin trans-cinnamic acid gallic acid caffeic acid chlorogenic acid myricetin
quercetin and kaempferol In the case of oils were identified up to 4 phenolic
compounds (depending on the type of oil) trans-cinnamic acid chlorogenic acid p-
coumaric acid and quercetin
In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that
including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and
prevent certain inflammatory disease pathology in addition to the benefits to be
gained by the other nutrients it contains such as protein fiber omega 3 and 6
II
INDICE GENERAL Paacutegina
IacuteNDICE GENERAL i
IacuteNDICE DE CUADROS iii
IacuteNDICE DE FIGURAS v
1 INTRODUCCIOacuteN
11 Caracteriacutesticas de la semilla de chiacutea
112 Cultivo
113 Usos y aplicaciones
114 Composicioacuten de las semillas de chiacutea
115 La chiacutea como fuente de aacutecidos grasos indispensables en la nutricioacuten humana 12 Antioxidantes
13 Compuestos polifenoacutelicos
131 Biosiacutentesis de compuestos fenoacutelicos
132 Actividad antioxidante de los compuestos fenoacutelicos
133 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos
14 Electroforesis capilar
141 Tipos de electroforesis
142 Flujo electroosmoacutetico 19
143 Inyeccioacuten de la muestra
15 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anaacutelisis de alimentos
16 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en alimentos mediante EC
JUSTIFICACIOacuteN
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos especiacuteficos
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia prima
22 Reactivos y materiales 32
1
1
2
3
5
7
8
10
11
14
15
16
17
23
25
25
30
31
31
31
32 32
i
ii
23 Desarrollo experimental
24 Equipo
3 MEacuteTODOS
31 Determinacioacuten de proteiacutenas
32 Determinacioacuten de humedad
33 Determinacioacuten de fibra
34 Determinacioacuten de cenizas
35 Determinacioacuten de liacutepidos
36 Determinacioacuten de carbohidratos
37 Extraccioacuten del aceite de chiacutea
38 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos de la semilla de chiacutea
39 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos presentes en el aceite de chiacutea
310 Determinacioacuten de fenoles totales
311 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de chiacutea por el meacutetodo del radical ABTS
312 Anaacutelisis de compuestos polifenoacutelicos mediante 38 electroforesis capilar
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 Anaacutelisis proximal
42 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
43 Determinacioacuten de la capacidad antioxidante por el meacutetodo del ABTS
44 Identificacioacuten de compuestos fenoacutelicos mediante 47 electroforesis capilar 441 Eleccioacuten de las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis 47
442 anaacutelisis de los extractos de aceite de chiacutea 65 5 CONCLUSIONES 92
6 BIBLIOGRAFIacuteA 94
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
36
37
38
40
40
41
45
iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
-001
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
AU
-001
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
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En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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1 2
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1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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illin
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Que
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co
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aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
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Aacutec p
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aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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ABSTRACT
Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the
interest that has beneficial efects on health from such compounds such as cancer
prevention cardiovascular and other inflammatory cancer diseases
In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of
other diseases such as diabetes and heart disease In this work we have studied 4
types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it
determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the
amount of total phenolics with the FolinndashCiocalteu reagent and identification of
phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food
analysis because it reduces the generation of pollutants the analysis time and cost of
them
The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant
capacity (9873 mmol Trolox g sample) compared with fruits such as raspberries (84
mmol Trolox g sample) and red apple (40 mmol Trolox g shown) that are
distinguished by their high antioxidant content While chia oil shows comparable
values of total phenols (12 mg acid gallic100 g sample) compared to olive oil (1336
mg acid gallic100 g sample) with respect to analysis by capillary electrophoresis was
achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted ferulic
acid vanillin trans-cinnamic acid gallic acid caffeic acid chlorogenic acid myricetin
quercetin and kaempferol In the case of oils were identified up to 4 phenolic
compounds (depending on the type of oil) trans-cinnamic acid chlorogenic acid p-
coumaric acid and quercetin
In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that
including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and
prevent certain inflammatory disease pathology in addition to the benefits to be
gained by the other nutrients it contains such as protein fiber omega 3 and 6
II
INDICE GENERAL Paacutegina
IacuteNDICE GENERAL i
IacuteNDICE DE CUADROS iii
IacuteNDICE DE FIGURAS v
1 INTRODUCCIOacuteN
11 Caracteriacutesticas de la semilla de chiacutea
112 Cultivo
113 Usos y aplicaciones
114 Composicioacuten de las semillas de chiacutea
115 La chiacutea como fuente de aacutecidos grasos indispensables en la nutricioacuten humana 12 Antioxidantes
13 Compuestos polifenoacutelicos
131 Biosiacutentesis de compuestos fenoacutelicos
132 Actividad antioxidante de los compuestos fenoacutelicos
133 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos
14 Electroforesis capilar
141 Tipos de electroforesis
142 Flujo electroosmoacutetico 19
143 Inyeccioacuten de la muestra
15 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anaacutelisis de alimentos
16 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en alimentos mediante EC
JUSTIFICACIOacuteN
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos especiacuteficos
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia prima
22 Reactivos y materiales 32
1
1
2
3
5
7
8
10
11
14
15
16
17
23
25
25
30
31
31
31
32 32
i
ii
23 Desarrollo experimental
24 Equipo
3 MEacuteTODOS
31 Determinacioacuten de proteiacutenas
32 Determinacioacuten de humedad
33 Determinacioacuten de fibra
34 Determinacioacuten de cenizas
35 Determinacioacuten de liacutepidos
36 Determinacioacuten de carbohidratos
37 Extraccioacuten del aceite de chiacutea
38 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos de la semilla de chiacutea
39 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos presentes en el aceite de chiacutea
310 Determinacioacuten de fenoles totales
311 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de chiacutea por el meacutetodo del radical ABTS
312 Anaacutelisis de compuestos polifenoacutelicos mediante 38 electroforesis capilar
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 Anaacutelisis proximal
42 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
43 Determinacioacuten de la capacidad antioxidante por el meacutetodo del ABTS
44 Identificacioacuten de compuestos fenoacutelicos mediante 47 electroforesis capilar 441 Eleccioacuten de las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis 47
442 anaacutelisis de los extractos de aceite de chiacutea 65 5 CONCLUSIONES 92
6 BIBLIOGRAFIacuteA 94
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
36
37
38
40
40
41
45
iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
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1
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55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
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0150
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0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
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025
030
035
040
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050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
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0025
0050
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0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
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40
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U
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40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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35
40
mA
U
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0
5
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20
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40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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80m
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60
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660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
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mA
U
0
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80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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-5
0
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40
mA
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0
5
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20
25
30
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40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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0
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100
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140
160
180
mA
U
0
20
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60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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10
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50
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0
10
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50
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70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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0
5
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45
50
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5
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25
30
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40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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20
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45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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130
mA
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50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
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20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
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80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0038
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0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
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PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
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3
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
1
2 3
4
5
6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
1
2 3
7
4
5 6
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
loro
geacuteni
co
ac f
eruacutel
ico
Kaem
pfer
ol
Mir
icet
ina
Ac
p-cu
maacuter
ico
Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
afeiacute
co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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Actualidades Ornitoloacutegicas No 119
Vallejo Cordoba y Vargas Martiacutenez Mariacutea Gabriela 2007 Capillary
Electrophoresis Applications for Food Analysis Cap 30 pp 1-53
Wang H Cao G y Prior R L1996 Total Antioxidant Capacity of Fruits
Journal Agricultural Food Chemist`s 44 (3) 701-705
Wu X Beecher G R Holden JM Haytowtiz D B Gebhardt SE And Prior
RL 2006 Concentrations of Anthocyanins in Common Foods in the United
State and Stimation of Normal Consumption Journal Agricultural Food
Chemist`s 54 (11) 4609-4075
Youyuan Peng Fanghua Liu Yuyu Peng Jiannong Ye 2004 Determination
of polyphenols in apple juice and cider by capillary electrophoresis with
electrochemical detection Food Chemistry 92 169ndash175
Zuta PC Simpson BK Zhao X Leclerc L 2005 The effect of a-tocopherol on
the oxidation of mackerel oil Food Chemistry 100 (2007) 800ndash807
II
INDICE GENERAL Paacutegina
IacuteNDICE GENERAL i
IacuteNDICE DE CUADROS iii
IacuteNDICE DE FIGURAS v
1 INTRODUCCIOacuteN
11 Caracteriacutesticas de la semilla de chiacutea
112 Cultivo
113 Usos y aplicaciones
114 Composicioacuten de las semillas de chiacutea
115 La chiacutea como fuente de aacutecidos grasos indispensables en la nutricioacuten humana 12 Antioxidantes
13 Compuestos polifenoacutelicos
131 Biosiacutentesis de compuestos fenoacutelicos
132 Actividad antioxidante de los compuestos fenoacutelicos
133 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos
14 Electroforesis capilar
141 Tipos de electroforesis
142 Flujo electroosmoacutetico 19
143 Inyeccioacuten de la muestra
15 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anaacutelisis de alimentos
16 Anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en alimentos mediante EC
JUSTIFICACIOacuteN
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos especiacuteficos
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia prima
22 Reactivos y materiales 32
1
1
2
3
5
7
8
10
11
14
15
16
17
23
25
25
30
31
31
31
32 32
i
ii
23 Desarrollo experimental
24 Equipo
3 MEacuteTODOS
31 Determinacioacuten de proteiacutenas
32 Determinacioacuten de humedad
33 Determinacioacuten de fibra
34 Determinacioacuten de cenizas
35 Determinacioacuten de liacutepidos
36 Determinacioacuten de carbohidratos
37 Extraccioacuten del aceite de chiacutea
38 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos de la semilla de chiacutea
39 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos presentes en el aceite de chiacutea
310 Determinacioacuten de fenoles totales
311 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de chiacutea por el meacutetodo del radical ABTS
312 Anaacutelisis de compuestos polifenoacutelicos mediante 38 electroforesis capilar
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 Anaacutelisis proximal
42 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
43 Determinacioacuten de la capacidad antioxidante por el meacutetodo del ABTS
44 Identificacioacuten de compuestos fenoacutelicos mediante 47 electroforesis capilar 441 Eleccioacuten de las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis 47
442 anaacutelisis de los extractos de aceite de chiacutea 65 5 CONCLUSIONES 92
6 BIBLIOGRAFIacuteA 94
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
36
37
38
40
40
41
45
iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
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8 9
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1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0040
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70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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000
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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003
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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3
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9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
loro
geacuteni
co
ac f
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Kaem
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Ac
p-cu
maacuter
ico
Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
afeiacute
co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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ii
23 Desarrollo experimental
24 Equipo
3 MEacuteTODOS
31 Determinacioacuten de proteiacutenas
32 Determinacioacuten de humedad
33 Determinacioacuten de fibra
34 Determinacioacuten de cenizas
35 Determinacioacuten de liacutepidos
36 Determinacioacuten de carbohidratos
37 Extraccioacuten del aceite de chiacutea
38 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos de la semilla de chiacutea
39 Extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos presentes en el aceite de chiacutea
310 Determinacioacuten de fenoles totales
311 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de chiacutea por el meacutetodo del radical ABTS
312 Anaacutelisis de compuestos polifenoacutelicos mediante 38 electroforesis capilar
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 Anaacutelisis proximal
42 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
43 Determinacioacuten de la capacidad antioxidante por el meacutetodo del ABTS
44 Identificacioacuten de compuestos fenoacutelicos mediante 47 electroforesis capilar 441 Eleccioacuten de las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis 47
442 anaacutelisis de los extractos de aceite de chiacutea 65 5 CONCLUSIONES 92
6 BIBLIOGRAFIacuteA 94
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
36
36
37
38
40
40
41
45
iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
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012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
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1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
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1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
001
002
003
004
005
AU
001
002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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0055
AU
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
Minutes
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0035
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0045
0050
0055
AU
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
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002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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AU
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001
002
003
004
005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
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001
002
003
004
005
006
1
2 3
4
5
6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
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AU
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001
002
003
004
005
006
1
2 3
7
4
5 6
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
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005
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AU
000
001
002
003
004
005
006
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
loro
geacuteni
co
ac f
eruacutel
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Kaem
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Ac
p-cu
maacuter
ico
Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
afeiacute
co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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iii
IacuteNDICE DE CUADROS
Cuadro No Paacutegina
1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
6
2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
10
3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en
frutos
11
4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
27
5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea 40
6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea 42
7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite
45
8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
48
9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
50
10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
51
12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
52
13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
56
14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
57
15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar 58
iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
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50
60
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90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
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30
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50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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30
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50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
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70
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90
100
110
120
130
mA
U
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40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
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0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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001
002
003
004
005
006
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4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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010
011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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010
011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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018
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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012
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016
018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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018
020
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002
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012
014
016
018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
2
34
74
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016
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004
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008
010
012
014
016
018
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
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006
008
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018
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004
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008
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014
016
018
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
2
3
75
Minutes
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AU
-001
000
001
002
003
004
005
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010
AU
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010
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
2
3
76
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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006
008
010
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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005
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1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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5
6
7
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9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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-cin
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geacuteni
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illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
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co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
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Aacutec p
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aacuterico
Aacutec v
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illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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iv
16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
62
17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
64
18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
78
19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
79
20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
88
20 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos frescos
89
v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
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80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
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45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
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40
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50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
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100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
Minutes
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0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
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0035
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AU
0000
0005
0010
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0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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005
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006
007
008
009
010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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0035
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0050
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010
011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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014
016
018
020
71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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012
014
016
018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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002
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012
014
016
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
2
34
74
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004
006
008
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AU
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018
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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018
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
2
3
75
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010
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
2
3
76
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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014
AU
000
002
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006
008
010
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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AU
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002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
Minutes
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001
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003
004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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006
1
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3
4
5
6
7
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9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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-cin
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geacuteni
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illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
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co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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v
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura No Paacutegina
1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botanica 1
2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
12
3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
13
4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles
14
5 Electroferograma 18
6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
19
7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica 20
8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
21
9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga 22
10 Inyeccioacuten electrocineacutetica 24
11 Inyeccioacuten por vaciacuteo 24
12 Semilla 094 32
13 Semilla 125 32
14 Semilla 287 32
15 Semilla 301 32
16 Desarrollo experimental 33
17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico 41
18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo 43
vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
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30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
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80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
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80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
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50
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90
100
mA
U
0
10
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30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
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50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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100
110
120
130
mA
U
30
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50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
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120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
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0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
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004
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006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
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0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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001
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005
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4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
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006
007
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009
010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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0035
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010
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PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0020
0025
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0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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014
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
2
34
74
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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016
018
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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018
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
2
3
75
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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010
PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
2
3
76
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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AU
000
002
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006
008
010
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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0040
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0050
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
Minutes
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0045
0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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5 6
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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005
006
1
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3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
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geacuteni
co
ac f
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Ac
p-cu
maacuter
ico
Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
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co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
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aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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vi
19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos
44
20 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
45
21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea
47
22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares 49
23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares 53
24 Electroferogramas de cada par de estandares 54
25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares 54
26 Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial 55
27 Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar 60
28 Electroferograma de 11 estaacutendares a distintas concentraciones de buffer
61
29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
63
30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos
64
31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea 65
32 Electroferograma del aceite 094 66
33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares 66
34 Electroferograma del aceite 125 67
35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
67
36 Electroferograma del aceite 287 68
37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
68
vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
0000
0005
0010
0015
0020
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0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
AU
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
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0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0000
0005
0010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
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008
010
012
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
-001
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
AU
-001
000
001
002
003
004
005
006
007
008
009
010
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
001
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010
011
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000
001
002
003
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005
006
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008
009
010
011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
004
006
008
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014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
2
34
74
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
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3
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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008
010
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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4
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7
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9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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-cin
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geacuteni
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Ac
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ico
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illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
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co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
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aacuterico
Aacutec v
ain
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ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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vii
38 Electroferograma del aceite 301 69
39 Electroferograma de la semilla 094 70
40 Electroferograma de la semilla 125 70
41 Electroferograma de la semilla 287 71
42 Electroferograma de la semilla 301 73
43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
73
44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
74
45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
75
46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
76
47 Electroferograma del aceite fresco 094 79
48 Electroferograma del aceite fresco 125 80
49 Electroferograma del aceite fresco 287 81
50 Electroferograma del aceite fresco 301 82
51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea 83
52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco 84
53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco 85
54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco 86
55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
87
1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
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45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
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40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
AU
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
AU
0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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006
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000
001
002
003
004
005
006
Minutes
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
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0035
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0000
0005
0010
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0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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007
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009
010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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0035
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011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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014
016
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
2
34
74
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018
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018
PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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012
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018
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
2
3
75
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
2
3
76
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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006
008
010
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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003
004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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006
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3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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-cin
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geacuteni
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illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
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co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
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aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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1
1 INTRODUCCIOacuteN
La chiacutea (Salvia hispaacutenica L) es una planta herbaacutecea de la familia de las Lamiaacuteceas
junto con el lino (Linum usitatissimum) es una de las especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso alfa-linoleacutenico omega 3 conocidas hasta 2006
Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas que se utilizan molidas como
ingrediente alimenticio (Cahill 2003)
11 CARACTERIacuteSTICAS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA Es una hierba anual de hasta 1 m de altura presenta hojas opuestas de 4 a 8 cm
de largo y 3 a 5 cm de ancho Las flores son hermafroditas puacuterpuras a blancas y
aparecen en ramilletes terminales florece entre julio y agosto en el hemisferio norte
Al cabo del verano las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente
(Figura 1) La semilla es rica en muciacutelago feacutecula y aceite tiene unos 2 mm de largo
por 15 mm de ancho y es ovalada lustrosa y de color pardo grisaacuteceo a rojizo
(Cahill 2003)
Figura 1 Cultivo de chiacutea y clasificacioacuten botaacutenica
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Laacutemiales
Familia Lamiaacuteceas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Geacutenero Salvia
Especie S hispanica L
Nombre binomial S hispanica L
2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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20
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15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
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40
50
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90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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0020
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0030
0035
0040
0045
0050
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1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0048
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0052
0054
0056
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0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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004
005
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0015
0020
0025
0030
0035
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0045
0050
0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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010
011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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010
011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
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3
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
2
3
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En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
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006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
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PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
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PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
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PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
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1 2
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1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
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3
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1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
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Que
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co
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aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
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lico
kaem
pfe
rol
Miric
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aacuterico
Aacutec v
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Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
6 BIBLIOGRAFIacuteA
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2
112 CULTIVO
La chiacutea prefiere suelos ligeros a medios bien drenados no demasiado huacutemedos
como la mayoriacutea de las salvias es tolerante respecto a la acidez y a la sequiacutea pero
no soporta las heladas Requiere abundante sol y no fructifica en la sombra Antes
de la conquista de Ameacuterica la chiacutea era un alimentos baacutesico para las civilizaciones de
Ameacuterica Central y Meacutexico su cultivo era probablemente el tercero en importancia
econoacutemica superado soacutelo por el maiacutez (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris) Los
aztecas imponiacutean a sus pueblos tributarios una contribucioacuten de hasta 15000
toneladas anuales (Cahill 2003)
Desplazada por los cereales aportados por los espantildeoles el cultivo de chiacutea
desaparecioacute durante la colonia sobrevivioacute soacutelo en aacutereas montantildeosas aisladas de
Meacutexico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y
Guatemala El mayor centro productor de Meacutexico estaacute en Acatic Jalisco de donde
se exportan cantidades crecientes a Japoacuten Estados Unidos y Europa
Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios paiacuteses de Ameacuterica
Latina comenzoacute en la deacutecada de 1990 a replantar experimentalmente la chiacutea en el
norte de Argentina para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos con
resultados excelentes (Ayerza 1996)
Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 16 tha con contenidos de aceite de
hasta el 386 Se han suscrito contratos para la produccioacuten comercial de chiacutea en
las provincias de Catamarca Salta y Tucumaacuten (Argentina) exportando el producto
sobre todo a los Estados Unidos La viabilidad en los estudios piloto se estimaba
entre el 78 y el 87 (Coates 1996)
3
113 USOS Y APLICACIONES
Hay evidencia cientiacutefica que muestra que la semilla de chiacutea comenzoacute a usarse en la
alimentacioacuten humana hace 3500 antildeos AC y se convirtioacute en uno de los cultivos
baacutesicos en el centro de Meacutexico entre 1500 y 900 AC junto con el amaranto friacutejol y
maiacutez Por siglos la semilla de chiacutea fue utilizada como alimento por los indiacutegenas del
oeste y del sur de Meacutexico Los aztecas entre otros usos ofreciacutean la chiacutea a los dioses
como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas Conocida como el alimento
de caminatas su uso como un alimento de resistencia y alta energiacutea ha sido
registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas cuyos guerreros
subsistiacutean con la semilla durante sus conquistas Los indiacutegenas del suroeste ingeriacutean
muy poco no maacutes de una cucharada llena cuando saliacutean de marchas forzadas
durante 24 horas (Ayerza 1996)
Hacia el antildeo 1600 DC se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41
correspondiacutean a los medicinales y el resto eran culinarios artiacutesticos y religiosos
entre otros Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la
formulacioacuten de medicamentos eran en su mayoriacutea las semillas y en menor medida
los tallos hojas y raiacuteces las cuales se utilizaban principalmente para combatir las
infecciones respiratorias Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el
tratamiento contra fiebres diarreas estrentildeimiento regulacioacuten de la secrecioacuten biliar
infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias tambieacuten serviacutea
como estimulante y para proteger la piel Como alimento las semillas de chiacutea se
tostaban y moliacutean hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli
La harina se incorporaba en las tortillas tamales y en varias bebidas de los aztecas
llamadas Chianatoles Los usos artiacutesticos se restringieron al aceite de la semilla para
pinturas barnices cosmeacuteticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las
vasijas y platos Adicionalmente el aceite sirvioacute como componente baacutesico en la
pintura para el cuerpo y rostro (Cahill 2003)
4
En rituales religiosos las semillas le serviacutean a los aztecas como ofrenda al dios
Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill 2003)
Si se mezcla una cuchara llena de chiacutea dentro de un vaso de agua y se deja durante
aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi soacutelida La reaccioacuten que
genera el gel se debe a la fibra soluble presente El gel que se forma en el estoacutemago
crea una barrera fiacutesica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los
disuelven de manera tal que disminuye la conversioacuten de carbohidratos en azuacutecar
(Ayerza 2002)
En adicioacuten a los obvios beneficios para los diabeacuteticos esta demora en la conversioacuten
de los carbohidratos en azuacutecar genera la habilidad de crear resistencias Los
carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos La prolongacioacuten de su conversioacuten
a azuacutecar estabiliza los cambios metaboacutelicos creando asiacute una mayor duracioacuten en sus
efectos de generacioacuten de energiacutea Ademaacutes una de las cualidades excepcionales de
estas semillas son sus propiedades hidrofiacutelicas teniendo la habilidad de absorber
maacutes de 12 veces su peso en agua dicha habilidad de mantener el agua ofrece la
posibilidad de prolongar la hidratacioacuten los fluidos y electrolitos que proveen el entorno
que da vida a las ceacutelulas del cuerpo humano Con semillas de chiacutea se puede retener
la humedad regulando la absorcioacuten corporal de nutrientes y fluidos corporales
Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacioacuten de los fluidos corporales el
balance electroliacutetico se mantiene (Ayerza 2002)
En la actualidad mucha gente utiliza las semillas de chiacutea en la preparacioacuten de una
bebida refrescante y popular llamada ldquochiacutea frescardquo tambieacuten se puede preparar un
muciacutelago dejando reposar la semilla en agua para utilizarla como fibra dieteacutetica o
para antildeadirla y dar espesor a mermeladas jaleas yogures mostazas salsa taacutertara
igualmente es uacutetil en la industria cosmetoloacutegica y otras aplicaciones En el pan se
puede utilizar el gel como un imitador de grasa asiacute como para resaltar su sabor
asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible
aumentar su vida de anaquel (Beltraacuten y Romero 2003)
5
La chiacutea es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede
servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el paiacutes que los hay y
son muchos Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como foacutermulas
para bebeacutes alimento para animales barras nutritivas entre otros (Beltraacuten y Romero
2003)
Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos
con ω-3 como huevos pollos carne vacuna jamoacuten leche quesos etc Utilizada
como una fuente de aacutecidos grasos ω-3 no requiere el uso de antioxidantes
artificiales como las vitaminas sinteacuteticas El aceite esencial encontrado en las hojas
tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de
algunos insectos a la planta (Craig 1997)
114 COMPOSICIOacuteN DE LAS SEMILLAS DE CHIacuteA
La ciencia moderna ha determinado que la semilla de chiacutea contiene un 32 de aceite
y eacuteste ofrece el contenido natural conocido maacutes elevado de aacutecido α-linoleacutenico que es
aproximadamente de 587 la siguen el caacutertamo y el girasol Asimismo entre sus
componentes principales se encuentra tambieacuten el aacutecido linoleacuteico que variacutea de 17 a
26 El aacutecido graso α-linoleacutenico es un aacutecido graso insaturado ω-3 es muy
importante para la nutricioacuten humana se denomina indispensable ya que debe de
suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo Se
ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de aacutecidos grasos ω-3
reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado
con la reduccioacuten de casos de arteriopatiacutea coronaria Otras de sus funciones son que
ayudan al mantenimiento de la piel del pelo y del sistema reproductivo mejoran el
desempentildeo mental y visual asiacute como el de la regulacioacuten del metabolismo del
colesterol Consumiendo 25 g de semilla de chiacutea se alcanza la cantidad diaria de
aacutecido graso ω-3 recomendada por las organizaciones de nutricioacuten (Tosco 2004)
6
Una vez que el aceite se ha extraiacutedo de la semilla de chiacutea el material remanente
contiene un 40 de fibra de la cual un 5 es fibra soluble o dieteacutetica Los extractos
de agua y metanol de la semilla de chiacutea una vez que se ha prensado y extraiacutedo el
aceite han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltraacuten y Romero 2003)
La semilla de chiacutea contiene una cantidad de compuestos con potente actividad
antioxidante entre los maacutes importantes se encuentran el δ y γ- tocoferol y
antioxidantes fenoacutelicos tales como aacutecidos clorogeacutenico y cafeico y flavonoles
(miricetina quecetina y kaempferol) La importancia de los mismos radica en su
proteccioacuten frente a la oxidacioacuten lipiacutedica que afecta tanto la calidad de los alimentos
como la salud de los consumidores con el posible deterioro de las caracteriacutesticas
organoleacutepticas funcionales y nutricionales (Taga et al 1984)
En el Cuadro 1 se muestra la concentracioacuten de compuestos antioxidantes presentes
en la semilla de chiacutea de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por
Taga et al en 1984
Cuadro 1 Concentracioacuten de antioxidantes en extractos de semilla de chiacutea
Compuesto Concentracioacuten (molkg de semilla de chiacutea)
Aacutecido cafeico 66 x 10-3
Aacutecido clorogeacutenico 71 x 10-3
Miricetina 31 x 10-3
Quercetina 02 x 10-3
Kaempferol 11 x 10-3
Aacutecido cafeico 135 x 10-3
Fuente Taga et al 1984
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
7
115 LA CHIacuteA COMO FUENTE DE AacuteCIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIOacuteN HUMANA
Existe un grupo de aacutecidos grasos poli-insaturados que se denominan aacutecidos grasos
indispensables (AGE) los cuales son muy importantes para la nutricioacuten humana pero
no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de
la dieta Los AGE para el hombre son los aacutecidos grasos Omega-3 (aacutecido a-linoleacutenico
y sus derivados de cadena larga) y los aacutecidos grasos Omega-6 cuyo precursor es el
aacutecido linoleacuteico La evidencia sugiere que los aacutecidos grasos Omega-3 juegan un papel
importante en la membrana celular La funcioacuten de eacutestos aacutecidos grasos es aportar
mayor flexibilidad a las membranas celulares permitiendo el movimiento de
proteiacutenas en su superficie y dentro de la bicapa lipiacutedica (Lauritzen et al 2001)
Las cantidades necesarias de aacutecidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de
vida de cada persona y de su estado fisioloacutegico o patoloacutegico que pueden llevar a un
aumento en las necesidades de aacutecidos grasos Se estima en promedio que es
necesaria una ingesta del 1 de la energiacutea total de aacutecidos grasos Omega-3 y un 4
de la energiacutea total para los Omega-6 El problema radica en que el contenido de
aacutecidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacioacuten es muy bajo por lo que el consumo
diario no alcanza a superar el 05 de la energiacutea total (Harper et al 2006)
De todas las fuentes de aacutecido grasos Omega-3 soacutelo el lino (Linum usitatissimum L)
y la chiacutea tienen su origen en cultivos agriacutecolas Ambas son especies vegetales con la
mayor concentracioacuten de aacutecido graso a-linoleacutenico conocida hasta la fecha Estas
semillas fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente
alimenticio o en forma natural como suplemento dieteacutetico Las otras dos fuentes
disponibles son de origen marino las algas y el aceite de pescado (Ayerza 1995)
La oxidacioacuten de los alimentos constituye un grave problema tanto para los
consumidores como para los fabricantes de alimentos Si no se controla la oxidacioacuten
puede producir no soacutelo sabores extrantildeos sino tambieacuten promover el envejecimiento y
las enfermedades degenerativas de la edad como el caacutencer las enfermedades
8
cardiovasculares cataratas declinacioacuten del sistema inmunoloacutegico y disfuncioacuten
cerebral de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir aacutecidos
grasos ω-3 y antioxidantes (Okuyama et al 1997)
12 ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo
enzimaacutetico y nutrientes esenciales (como vitaminas pigmentos) cuya funcioacuten
principal es prevenir la formacioacuten de radicales libres e interceptar los que ya se han
generado (Shi 2001)
Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales avena soya teacute granos de cafeacute
especias arroz aceites vegetales papas frutas productos microbianos Los
antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencioacuten de
enfermedades relacionadas con el estreacutes oxidativo
Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambieacuten sinteacuteticos
elaborados por la industria y adicionados a los alimentos En particular los
antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles pueden
funcionar como compuestos reductores interrumpen la cadena de formacioacuten de
radicales libres inhiben o impiden la formacioacuten de oxiacutegenos libres e inactivan los
metales pro-oxidativos Los radicales libres se forman en el organismo mediante la
respiracioacuten aeroacutebica y existen en diferentes formas como anioacuten superoacutexido
hidroxilos peroacutexidos y alcoacutexilos Son dantildeinos ya que pueden reaccionar con
componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi 2001)
El dantildeo oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades croacutenicas
como la oxidacioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) enfermedades
cardiovasculares dantildeo oxidativo al ADN caacutencer y alteracioacuten de la visioacuten (Serrano et
al 2007)
9
Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son carotenoides
fosfoliacutepidos tocoferoles (vitamina E) vitamina C compuestos fenoacutelicos pigmentos y
sistemas enzimaacuteticos como la superoacutexido dismutasa catalasa y glutatioacuten peroxidasa
Las vitaminas E C carotenos y los cofactores (Cu Zn Mn Fe y Se) son importantes
antioxidantes que funcionan de manera sineacutergica inhibiendo la formacioacuten de
radicales libres Los compuestos fenoacutelicos interfieren con el proceso de oxidacioacuten al
reaccionar con radicales libres quelan metales cataliacuteticos y capturan el oxiacutegeno
Estos compuestos se dividen en dos grupos flavonoides y no flavonoides (Cedillo
2006)
Los polifenoles o compuestos fenoacutelicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades
croacutenicas como caacutencer degeneracioacuten neuronal relacionada con la edad y
enfermedades cardiovasculares Las plantas contienen una gran variedad de
compuestos fenoacutelicos como fenilpropanoides derivados del aacutecido benzoico taninos y
ligninas (Macheix et al 1990)
Los flavonoides que incluyen flavonas flavonoles y taninos condensados funcionan
como quelantes de metales atrapan radicales libres inhiben la xantina-oxidasa
asociada a la formacioacuten de especies reactivas del oxiacutegeno y la proliferacioacuten de
ceacutelulas canceriacutegenas en pulmones estoacutemago y colon ademaacutes previenen
enfermedades coronarias En general la actividad antioxidante aumenta cuando
existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidroacutegeno en la estructura molecular
del compuesto (Wang et al 1996)
10
13 COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS
Los compuestos fenoacutelicos o polifenoles son las sustancias que poseen un anillo
aromaacutetico unidos a uno o maacutes grupos hidroxilo incluyendo derivados funcionales
(esteres glucoacutesidos etc) (Macheix et al 1990)
En el Cuadro 2 se muestra la concentracioacuten relativa en tejidos vegetales de estos
compuestos fenoacutelicos presentes en la naturaleza se conocen aproximadamente
4000 siendo los flavonoides el grupo maacutes importante Un nuacutemero considerable de
fenoles monociacuteclicos simples quinonas fenoacutelicas lignanos xantonas se incluyen en
esta clasificacioacuten al igual que materiales polimeacutericos tales como ligninas lignanos
melaninas y taninos (Lee 1992)
Cuadro 2 Concentracioacuten relativa de compuestos fenoacutelicos en tejidos vegetales
Tejido Concentraciones relativas
Fruto aacutecidos cinaacutemicos gt catequinas
leucoantocianinas (flavan-34-dioles) gt flavonoles
Hojas flavonoles aacutecidos cinaacutemicos gt
catequinas leucoantocianinas
Tronco catequinas leucoantocianinas gt flavanoles gt
aacutecidos cinaacutemicos
Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones
Fuente Robards et al 1999
Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3 la
mayoriacutea de los cuales se pueden encontrar en las frutas siendo estos una excelente
fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al 1990) siendo la mejor
fuente algunas bebidas como el vino tinto cafeacute y teacute (Scalbert y Williamson 2000)
11
Cuadro 3 Las principales clases de compuestos fenoacutelicos en frutos
Aacutetomos de carbono
Estructura Baacutesica
Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)
7 C6 ndash C1 Aacutecido hidroxibenzoico pndash hidroxibenzoacuteico Fresa
9 C6 ndash C3 Aacutecido hidroxicinaacutemico Cumarinas
cafeico scopolina
Manzana Ciacutetricos
10 C6 ndash C4 Naftoquinonas Juglona Nuez
13 C6 ndash C1 ndash C6 Xantonas Mangiferina Mango
14 C6 ndash C2 ndash C6 Estilbenos Resveratrol Uva
15 C6 ndash C3 ndash C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos
quercetina cianidina daidzeiacutena
Cereza Frijol de soya Frutos con hueso
Fuente Macheix et al 1990
Soacutelo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma
alimentacioacuten estos compuestos son el aacutecido gaacutelico sinaacuteptico feruacutelico cafeico pndash
cumaacuterico y sus derivados asiacute como los flavonoides y sus glucoacutesidos Las
antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas
y verduras Mientras que la mayoriacutea de los polifenoles no son pigmentos son de
igual importantes pues son responsables de la peacuterdida de color principalmente el
oscurecimiento que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de
frutas y verduras formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimaacutetico y
no enzimaacutetico (Lee 1992)
131 BIOSIacuteNTESIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metaboacutelicas la ruta
del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los aacutecidos
hidroxicinaacutemicos (Figura 2 y Figura 3) y la ruta del acetato la cual produce fenoles
simples y algunas quinonas (Decker 1997)
12
Figura 2 Biosiacutentesis de los compuestos fenoacutelicos a partir de la viacutea del shikimato y fenilalanina
Fuente Harborne 1989 El grupo maacutes importante de los compuestos fenoacutelicos son los flavonoides incluyendo
flavonas isoflavonas y antocianidinas las que se forman viacutea condensacioacuten del
fenilpropano (C6 ndash C3) con la participacioacuten de 3 moleacuteculas de malonil coenzima A
la cual permite la formacioacuten de chalconas que posteriormente se ciclan en
condiciones aacutecidas Por lo que los flavonoides tienen la estructura baacutesica de los
difenilpropanoides (C6 ndash C3 ndash C6) que consiste en dos anillos aromaacuteticos unidos a 3
carbonos que forman un anillo heterociacuteclico oxigenado El estado oxidativo de esta
cadena de 3 carbonos determinan las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides incluyen antocianinas (glucoacutesidos oacute acilglucoacutesidos de las
antocianidinas) flavanoles (catequinas) flavonoles flavonas isoflavonas
flavononoles y sus derivados
13
Figura 3 Formacioacuten de fenilpropanoides estilbenos lignanos ligninas suberinas cutinas flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina FAL Fenilalanina amonio liasa
Fuente Shahidi y Naczk 2004
14
132 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENOacuteLICOS
A lo largo de los antildeos algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos
fenoacutelicos y un gran nuacutemero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y
verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de caacutencer
potencialmente a traveacutes de la actividad bioloacutegica de los compuestos fenoacutelicos asiacute
como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al 2003) Por lo que los
polifenoles pueden prevenir a la oxidacioacuten lipiacutedica la mutacioacuten del DNA y el dantildeo del
tejido (Figura 4)
Figura 4 Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente Shahidi y Naczk 2004
15
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenoacutelicos parece estar
relacionado con su capacidad para quelar metales inhibir la lipoxigenasa y captar
radicales libres aunque en ocasiones tambieacuten pueden promover reacciones de
oxidacioacuten in vitro (Decker 1997)
Para que un compuesto fenoacutelico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos
condiciones baacutesicas
1) Cuando se encuentre en una concentracioacuten baja con relacioacuten al sustrato que va a
ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacioacuten o la oxidacioacuten mediada por un
radical libre
2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones
posteriores
133 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS
Actualmente el intereacutes en los compuestos antioxidantes (fenoacutelicos) ha aumentado
debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos
antioxidantes en la salud humana Especiacuteficamente se han encontrado varios efectos
preventivos en diferentes enfermedades como la prevencioacuten de caacutencer las
enfermedades coronarias del corazoacuten los desoacuterdenes inflamatorios la degeneracioacuten
neuroloacutegica envejecimiento etc (Madhavi et al 1996)
Este intereacutes ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analiacuteticos
capaz de manejar matrices maacutes complejos en que estos compuestos se descubren
En este contexto las teacutecnicas de electroforesis capilar han surgido como las
herramientas poderosas permitiendo la separacioacuten e identificacioacuten de compuestos
que no pueden separarse faacutecilmente por los meacutetodos de HPLC tradicionales ademaacutes
de proporcionar informacioacuten complementaria y permitiendo el anaacutelisis simultaacuteneo de
diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al 2002)
Ademaacutes los meacutetodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos
de anaacutelisis maacutes cortos y eficacias superiores comparadas con otras teacutecnicas
requiriendo voluacutemenes de muestra y reactivos miacutenimos (Herrero et al 2005)
16
14 ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un meacutetodo de separacioacuten que se basa en las diferencias de
movilidades de los analitos generadas cuando estos estaacuten bajo la influencia de un
campo eleacutectrico Los analitos se encuentran en un medio conductor (electrolito
soporte o buffer) y el campo eleacutectrico es generado en el medio conductor al aplicar
una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del
tubo capilar El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a
migrar hacia uno u otro de los electrodos las moleacuteculas con una carga neta negativa
se desplazaraacuten hacia el aacutenodo (electrodo positivo) y las moleacuteculas con una carga
neta positiva migraraacuten hacia el caacutetodo (electrodo negativo) La velocidad de
migracioacuten de un ioacuten v en el seno de un campo eleacutectrico medida en cm s-1 es
(Curtis et al 1994)
v = μe E
Siendo μe la movilidad electroforeacutetica del ioacuten medida en cm2V-1s-1 y E la intensidad
del campo eleacutectrico medida en Vcm-1
La movilidad electroforeacutetica de un ioacuten es directamente proporcional a la fuerza
eleacutectrica del ioacuten ldquoFerdquo e inversamente proporcional a los factores de retardo por
rozamiento ldquoFfrdquo La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ioacuten a partir
de su tamantildeo o radio del ioacuten solvatado ldquorirdquo y de la viscosidad del medio en el que
migra ldquo rdquo siendo Q la carga ioacutenica de la sustancia
Fe= -Ff
Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi
Por lo tanto Er
Qv
i
i6
i
er
Q
6
17
Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacioacuten carga-tamantildeo
entre los diferentes analitos presentes en la muestra cuanto mayor sea esta relacioacuten
maacutes raacutepido migraraacute el ioacuten en el seno del campo eleacutectrico Para iones del mismo
tamantildeo el de mayor carga eleacutectrica migraraacute maacutes raacutepidamente Para iones con la
misma carga migraraacute maacutes aquel de menor tamantildeo ya que tendraacute una fuerza de
retardo por rozamiento de menor valor La resistencia del medio al paso del ioacuten
tambieacuten influiraacute en su movilidad electroforeacutetica siendo eacutesta mayor cuanto mayor sea
la viscosidad del medio Para hacer una separacioacuten efectiva es necesario mantener
constantes las cargas de cada especie de iones de manera que la relacioacuten carga-
tamantildeo (y por tanto la velocidad de migracioacuten) permanezcan en el intervalo maacutes
estrecho posible Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier aacutecido o
base quiere decir que las separaciones electroforeacuteticas requieren disoluciones
tampoacuten (Castanon 2006)
141 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen principalmente dos meacutetodos electroforeacuteticos ampliamente utilizados la
electroforesis convencional y la electroforesis capilar La primera se lleva a cabo
sobre papel o sobre un gel en los que se aplica la muestra directamente La
disolucioacuten tampoacuten que seraacute el medio conductivo cubre la placa de papel o de gel
Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a traveacutes de la placa
Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso
de la corriente y si es necesario las muestras se tintildeen para visualizarlas En la
segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos
capilares de diaacutemetros internos menores a 100 microm donde se disipa mejor el calor y
no es necesario el uso de geles (aunque es posible) Esto permite la aplicacioacuten de
voltajes de hasta 30 mil volts acelerando la separacioacuten
18
Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas
pueden detectarse directamente al aplicar el meacutetodo es decir la teacutecnica se puede
automatizar Se obtiene una graacutefica de la respuesta en funcioacuten del tiempo llamada
electroferograma (Figura 5) en la que cada pico representa una especie quiacutemica
separada (Albarraacuten 2000)
Figura 5 Electroferograma
Por resolucioacuten se puede entender la capacidad de una teacutecnica o meacutetodo para
separar dos componentes en una mezcla En la electroforesis capilar se define de
forma anaacuteloga a la cromatografiacutea
Resolucioacuten = Separacioacuten del pico Anchura media del pico
La separacioacuten entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades
electroforeacuteticas de las especies y por tanto seraacute la anchura de la banda la que
determine la mayor o menor resolucioacuten del meacutetodo
El flujo electroosmoacutetico es el responsable de la disminucioacuten de anchura de las
bandas Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los
cromatogramas por ello la nomenclatura utilizada para describir la separacioacuten de los
picos o bandas en cromatografiacutea se usa tambieacuten para la electroforesis capilar Sin
embargo la mayor diferencia es que la posicioacuten de los picos se determina por las
movilidades electroforeacuteticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones
19
con la fase estacionaria De manera que la eficacia (o nuacutemero de platos N) en
electroforesis capilar vendriacutea dada por
N = μeV 2D
Doacutende D es el coeficiente de difusioacuten del soluto Por tanto para aumentar la eficacia
N y por tanto la resolucioacuten es necesario aumentar lo maacuteximo posible el potencial
eleacutectrico V (Curtis et al 1994)
142 FLUJO ELECTROOSMOacuteTICO (FE)
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene
un liacutequido (electrolito) el liacutequido se mueve este movimiento se denomina flujo
electroosmoacutetico (Figura 6)
Figura 6 Distribucioacuten de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmoacutetico resultante
La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del
regulador y depende de la carga en la superficie del capilar La causa de la aparicioacuten
del flujo electroosmoacutetico es la formacioacuten de la doble capa eleacutectrica (Figura 7)
20
Figura 7 Formacioacuten de la doble capa eleacutectrica
Baacutesicamente es una separacioacuten de la carga ioacutenica una segregacioacuten de capas de
iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la
disolucioacuten Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de siacutelice fundida
A pH por encima de 3 la pared interna del capilar de siacutelice presenta carga negativa
debido a la desprotonacioacuten de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie Los
cationes de la disolucioacuten formaraacuten cerca de la superficie del capilar una primera capa
interna fija en la que los cationes inmoacuteviles estaacuten unidos fuertemente a la
superficie del capilar Una segunda capa denominada capa moacutevil o difusa formada
tambieacuten por cationes aunque unidos de manera maacutes deacutebil a la superficie del capilar
migraraacute hacia el caacutetodo (electrodo negativo) en presencia de un campo eleacutectrico
El resto de la disolucioacuten mediante capilaridad migraraacute a la misma velocidad y en la
misma direccioacuten lo que produciraacute un perfil de flujo plano a diferencia de la
cromatografiacutea que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006)
21
(a) (b)
Figura 8 Perfiles de flujo para liacutequidos (a) por presioacuten electroosmoacutetica EC y (b) por presioacuten hidrodinaacutemica HPLC
La segregacioacuten de las capas de iones produce un potencial en la superficie que
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie Este potencial ψ es
grande en la capa fija y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa
difusa El punto clave es que donde termina la capa fija auacuten existe un cierto
potencial llamado potencial zeta δ que permitiraacute el movimiento del fluido
La velocidad del flujo electroosmoacutetico es proporcional a la diferencia de potencial e
inversamente proporcional a la viscosidad del regulador ldquo rdquo La velocidad del FE y
por consiguiente la movilidad de FE ldquomicroFErdquo va a variar en funcioacuten de los cambios que
se produzcan en el regulador por ejemplo una variacioacuten del pH del tampoacuten origina
un cambio en la ionizacioacuten del capilar y un aumento de la concentracioacuten del
regulador da lugar a una disminucioacuten del flujo electroosmoacutetico asiacute como cambios en
la constante dieleacutectrica del disolvente ldquo rdquo (Castanon 2006)
FE
22
En general cualquier alteracioacuten en la disolucioacuten que modifique la carga en la
superficie del capilar modifique la viscosidad del tampoacuten o requiera un cambio en el
potencial altera la velocidad del FE Como se ha comentado el flujo electroosmoacutetico
da lugar a un perfil de flujo plano lo que reduce significativamente el
ensanchamiento de banda y por tanto mejora la resolucioacuten Ademaacutes la gran ventaja
que presenta el FE es que la separacioacuten electroforeacutetica y la deteccioacuten pueden
realizarse a la vez para cationes y aniones Sin el FE o soacutelo aniones o soacutelo cationes
migrariacutean hacia el detector El ioacuten de carga opuesta migrariacutea retrocediendo al final de
la inyeccioacuten y los compuestos neutros se quedariacutean al final y se dispersariacutean por
difusioacuten Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro
2006)
Figura 9 Deteccioacuten de moleacuteculas con distinta carga
Finalmente la velocidad de un ioacuten en la electroforesis capilar vendraacute determinada por
su velocidad electroforeacutetica y por su velocidad de flujo electroosmoacutetico
Doacutende
v = (μe + μfeo) E
V= Velocidad del ioacuten μe = Velocidad electroforeacutetica μfeo= Velocidad del flujo electroosmoacutetico
E= Campo eleacutectrico
23
En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el caacutetodo los iones
negativos tendraacuten una movilidad electroforeacutetica μe negativa y por tanto estos iones
migraraacuten maacutes lentamente que los positivos El resultado final en el electroferograma
seraacute una serie de picos que indican el siguiente orden de elucioacuten primero los
cationes maacutes raacutepidos seguidos sucesivamente de los cationes maacutes lentos todas las
especies neutras en una uacutenica zona y finalmente los aniones maacutes lentos seguidos
de los aniones maacutes raacutepidos (Pais y Knize 2000)
143 INYECCIOacuteN DE LA MUESTRA
Debido a que el volumen de liacutequido que cabe en el capilar es de 4-5 μL el volumen
de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros esto implica una serie de
dificultades al inyectar las muestras en el capilar Existen varios meacutetodos
Inyeccioacuten electrocineacutetica se retira del depoacutesito del regulador uno de los extremos
del capilar junto con el electrodo y se colocan en un pequentildeo recipiente que
contiene la muestra Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo por lo que
la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmoacutetico y a la migracioacuten
ioacutenica Despueacutes el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el
recipiente con la disolucioacuten regulador (Figura 10) Inconvenientes la muestra no es
del todo representativa ya que se introduce en el capilar maacutes cantidad de los iones
maacutes moacuteviles respecto a los maacutes lentos (Castantildeeda et al 2005)
24
Figura 10 Inyeccioacuten electrocineacutetica
Inyeccioacuten por presioacuten el extremo del capilar se coloca momentaacuteneamente en un
pequentildeo recipiente que contiene la muestra y se utiliza una diferencia de presioacuten
para conducir la muestra al interior del capilar
Esta diferencia de presioacuten proviene de aplicar vaciacuteo en el extremo del detector o de
la aplicacioacuten de presioacuten en el recipiente que contiene la muestra o bien se consigue
por elevacioacuten del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura
11) La inyeccioacuten por presioacuten no diferencia los iones seguacuten su movilidad por lo que
no es discriminativa (Castantildeeda et al 2005)
Figura 11 Inyeccioacuten por vaciacuteo
25
15 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANAacuteLISIS DE ALIMENTOS
La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anaacutelisis de
alimentos es bien reconocido y establecido actualmente Esto se confirma con las
aplicaciones en el estudio de sustancias de intereacutes de alimentos que van desde
compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que
afectan a dichos alimentos Este hecho es corroborado por los maacutes de 650 trabajos
publicados en los uacuteltimos 10 antildeos (Castantildeeda et al 2005) y manuales para el
desarrollo de meacutetodos de anaacutelisis de alimentos (Frazier et al 2000)
El alcance de las aplicaciones es muy amplia en teacuterminos de tamantildeo molecular de
los componentes de los alimentos ya que pueden analizarse desde pequentildeas
moleacuteculas como aacutecidos orgaacutenicos o aminoaacutecidos hasta el anaacutelisis de biomoleacuteculas
de gran tamantildeo como proteiacutenas hidratos de carbono o ADN (Castantildeeda et al
2005)
16 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE EC
Los compuestos fenoacutelicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas los
cuales poseen una caracteriacutestica comuacuten de las estructuras una fraccioacuten de fenol y
se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo
Los compuestos fenoacutelicos son de intereacutes debido a su posible contribucioacuten al gusto
(astringencia la amargura y acidez) y la formacioacuten de los sabores desagradables en
los alimentos incluidos el teacute cafeacute y jugos de diferentes frutas durante el
almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007)
Algunas aplicaciones recientes de la EC al anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos en teacutes
vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4 Cabe sentildealar que
no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenoacutelicos debido a que
son aromaacuteticas y por tanto presentan la absorcioacuten intensa en la regioacuten UV
26
Varios anaacutelisis han sido publicados que puede ser utilizado como una guiacutea para el
anaacutelisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al 2000) (Herrero et
al 2005)
En una revisioacuten reciente se discutieron las estrategias que se han utilizado durante
la optimizacioacuten de los meacutetodos de EC para el anaacutelisis fitoquiacutemico de los compuestos
bioactivos y se propuso el uso de muacuteltiples variables disentildeos experimentales para
simplificar esta tarea (Li et al 2006)
Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccioacuten raacutepida y
simultaacutenea de importantes antioxidantes naturales incluidos los fenoles y
antioxidantes no fenoacutelicos utilizando EC con un microchip con deteccioacuten
electroquiacutemica a traveacutes de un electrodo de carboacuten viacutetreo (Blasco et al 2005)
27
Cuadro 4 Meacutetodos para el anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos mediante EC
APLICACIOacuteN METODO DE DETECCIOacuteN
MODO
EC
BUFFER
UTILIZADO
REFERENCIA
Fraccioacuten polifenoacutelico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 93
Blasco et al 2005
Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 95
Carrasco et al 2006
Polifenoles en queso (Bromus inermis L) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 92
Strerbova et al 2006
Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUIacuteMICA MECK 20 mM boratos pH 88 Li et al 2002
Quercetina rutina kaempferol catequina en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al2003
Procianidinas despueacutes tioacutelisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al 2005
Catequinas in teacute verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al 2003
Resveratrol en vinos hierbas y en alimentos saludables ELECTROQUIacuteMICA CZE 100 mM borato pH 924 Gao et al 2002
Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio
Brandolini et al 2002
Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 84 Saenz et al 2003
Aacutecidos fenoacutelicos (derivados de aacutecido benzoico y cinaacutemico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol
Kuban et al 2006
Flavonoides y compuestos fenoacutelicos (aacutecido feruacutelico apigenina luteolinaaacutecido rosmarinico y aacutecido cafeico) en Perilla frutescens L
ELECTROQUIacuteMICA
CZE
100 mM boratos pH 87
Peng et al 2005
Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de
sodio pH105
Cortacero et al 2005
DAD detector de arreglo de diodos CZE electroforesis capilar de zona MECK Electroforesis micelar electrocineacutetica
28
Otras aplicaciones de la EC en el anaacutelisis de alimentos son mencionados por Vallejo y
Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran
Determinacioacuten de proteiacutenas de la leche (caseiacutenas α-lactoalbuacuteminas β-
lactoglobulinas)
Anaacutelisis de proteiacutenas del trigo
Determinacioacuten de carbohidratos por CZE con deteccioacuten amperomeacutetrica
mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola)
Determinacioacuten de oligosacaacuteridos mediante CZE (rafinosa estaquiosa y
verbascosa de semillas de leguminosas)
Anaacutelisis del colorsabor de los alimentos
Anaacutelisis de los flavonoides de la cantildea de azuacutecar mediante CZE
Separacioacuten de los aacutecidos del luacutepulo que dan amargor mediante CZE y MEKC
(aacutecidos α y β de extracto de luacutepulo comercial)
Anaacutelisis de compuestos orgaacutenicos en alimentos
Determinacioacuten del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de
zumo de naranja)
Comparacioacuten cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacioacuten de
aditivos en alimentos (cafeiacutena aspartamo y aacutecido benzoico en refrescos)
Determinacioacuten cuantitativa de propionato en pan mediante CZE Anaacutelisis de
iones inorgaacutenicos
Anaacutelisis cualitativo de aniones presentes en cerveza salsa de soja teacute y cafeacute
Determinacioacuten semicuantitativa de calcio sodio cloruros fosfatos y citratos en
muestras de leche
29
La versatilidad de la electroforesis capilar en el anaacutelisis de alimentos se demuestra
claramente por los numerosos y amplios meacutetodos presentados anteriormente Por otra
parte la eficiencia y la rapidez de la EC en las separaciones fueron las principales
ventajas que hacen de esta teacutecnica una alternativa atractiva en los laboratorios de
anaacutelisis de alimentos La EC auacuten estaacute lejos de ser tan bien establecida como las
teacutecnicas cromatograacuteficas aunque ciertamente ha ganado popularidad como una
alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anaacutelisis de proteiacutenas de los
alimentos muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE gran poder
de resolucioacuten y velocidad de anaacutelisis Tal vez el mayor potencial de la EC fue
encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los
alimentos (Vallejo et al 2007)
30
JUSTIFICACIOacuteN
Actualmente existe un intereacutes por el estudio de alimentos con un alto contenido en
antioxidantes naturales como son los compuestos fenoacutelicos los cuales estaacuten
ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una
disminucioacuten en la aparicioacuten de enfermedades cardiovasculares asiacute como el caacutencer y
otras enfermedades croacutenico-degenerativas que actualmente estaacuten en crecimiento
El intereacutes que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el
investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se
retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos por lo cual hace que la semilla de chiacutea
sea un alimento idoacuteneo para este estudio
Esta investigacioacuten tiene por objetivo caracterizar la semilla de chiacutea cultivada en los
estados de Puebla y Colima con relacioacuten a los compuestos polifenoacutelicos presentes en
la misma y en el aceite extraiacutedo de dicha semilla mediante la teacutecnica de electroforesis
capilar debido a que es una teacutecnica actual y muy eficiente en cuanto al anaacutelisis quiacutemico
se refiere las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad miacutenima
comparaacutendolas con otras teacutecnicas que son costosas tardadas y con menor eficiencia
31
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea y en el aceite
extraiacutedo de la misma procedente de los estados de Colima y de Puebla utilizando la
teacutecnica de electroforesis capilar asiacute como la medicioacuten de la capacidad antioxidante de
los mismos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
Cuantificacioacuten del contenido de fenoles totales en semilla y aceite de chiacutea
Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de chiacutea y del aceite de chiacutea
mediante el meacutetodo ABTS
Establecer una metodologiacutea para la identificacioacuten y cuantificacioacuten de compuestos
fenoacutelicos mediante electroforesis capilar
Identificar mediante el meacutetodo de electroforesis capilar los compuestos fenoacutelicos
presentes en la semilla y el aceite de chiacutea
32
2 MATERIALES Y MEacuteTODOS
21 Materia Prima
Semilla de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) asignaacutendoles la numeracioacuten de tres diacutegitos simplemente para evitar confusiones (094 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla cultivadas en la misma temporada del antildeo y en el mismo suelo
Figura 12 Semilla 094 Figura 13 Semilla 125 Figura 14 Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x
Semilla 301 de chiacutea (Salvia hispaacutenica L) proveniente del Estado de Colima
Figura 15 Semilla 301 Aumento 10x
22 Reactivos y materiales
Estaacutendares de polifenoles grado HPLC Aacutecido feruacutelico Aacutecido vainillinico Aacutecido trans-cinaacutemico Aacutecido p-cumaacuterico Aacutecido gaacutelico Aacutecido cafeico Aacutecido clorogeacutenico Miricetina Quercetina Kaempferol (Sigma-aldrich)
Solucioacuten reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 22rsquo-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)
(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) Aacutecido 6-hidroxi-2 3 78-tetrametilcroman-2-carboxiacutelico (TROLOX) (Sigma-
aldrich)
33
23 DESARROLLO EXPERIMENTAL
En la Figura 16 se muestra el disentildeo experimental que se seguiraacute para el desarrollo de
esta investigacioacuten
II)- ELECTROFORESIS CAPILAR
Figura 16 Desarrollo experimental
acute
acute
acute
acute
acute acute
acute acute
34
24 Equipo
Balanza analiacutetica marca Sartorius modelo H110
Balanza analiacutetica marca Mettler-Toledo modelo PB5001
Bomba de vaciacuteo marca Welch Modelo GEM 10
Cartuchos Diol SEP-PACK marca Waters
Espectrofotoacutemetro con longitud de onda visible marca Perkin Elmer
Evaporador rotatorio marca Yamato modelo BM100
Sonicador marca Sonic modelo 200
Sistema de electroforesis capilar PACEtrade marca MDQ Beckman-Coulter
3 MEacuteTODOS
31 DETERMINACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS Se determina por el meacutetodo Kjeldahl la
muestra se digirioacute en aacutecido sulfuacuterico concentrado con un catalizador el nitroacutegeno se
convierte en sulfato de amonio Se agrega hidroacutexido de sodio concentrado para
liberar amoniacuteaco que se destila en aacutecido estandarizado para su cuantificacioacuten por
titulacioacuten (AOAC 2057 1990)
El contenido de proteiacutena se calculoacute de acuerdo a la siguiente ecuacioacuten
)100()(
))(0140)()((
w
fNVproteina
Doacutende
V = Volumen gastado de HCl en la titulacioacuten
N = Normalidad del HCl
14 = Equivalente-gramo del nitroacutegeno
w = Peso de muestra en gramos
f = Factor proteico (625)
El contenido de proteiacutena puede representarse en gramos por 100g de muestra
g100g
35
32 DETERMINACIOacuteN DE HUMEDAD (AOAC 14003 1990) El contenido de
humedad se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final de una muestra
representativa sometida a una temperatura de 130ordm C
33 DETERMINACIOacuteN DE FIBRA se determinoacute el contenido de fibra cruda de
acuerdo al meacutetodo oficial de la AOAC 96209 el cual se basa en la peacuterdida de masa
que corresponde a la incineracioacuten del residuo orgaacutenico que queda despueacutes de la
digestioacuten con soluciones de aacutecido sulfuacuterico e hidroacutexido de sodio en condiciones
especiacuteficas
34 DETERMINACIOacuteN DE CENIZAS Se utilizoacute el meacutetodo de calcinacioacuten en mufla a
500ordm C (AOAC 14006 1990) El contenido de cenizas se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
)100(w
CCCcenizas
Doacutende
CC = peso inicial de la muestra
C = peso final de la muestra
w = peso de la muestra
35 DETERMINACIOacuteN DE LIacutePIDOS Se emplea el meacutetodo de Soxhlet (AOAC
7062) utilizando eacuteter de petroacuteleo anhidro como disolvente
Se emplea la siguiente ecuacioacuten para el caacutelculo de grasa
liacutepidosBS
= ( a ndash b) X 100
m
Doacutende
a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada
envuelta en papel filtro
b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante
m = peso de la muestra seca en gramos
36
36 DETERMINACIOacuteN DE CARBOHIDRATOS Los carbohidratos totales se calculan
por diferencia de porcentaje de humedad proteiacutena liacutepidos cenizas y fibra (Blanco-
Metzler et al 2009) El contenido de carbohidratos totales se calculoacute de acuerdo a la
siguiente ecuacioacuten
carbohidratos totales = 100- ( humedad + proteiacutena + grasa + cenizas + fibra)
37 EXTRACCIOacuteN DEL ACEITE DE CHIacuteA (Garciacutea et al 2003)
Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de chiacutea mediante equipo Soxhlet
empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas Los paraacutemetros
de extraccioacuten fueron temperatura 45 plusmn 2ordmC y flujo de disolvente de 30 gotas por
minuto La mezcla hexano-aceite se destiloacute a presioacuten reducida en un evaporador
rotatorio a 45 ordmC para obtener el aceite crudo el cual se envasoacute en frascos de vidrio
aacutembar con rosca y se almacenoacute a 0ordm C bajo atmoacutesfera de nitroacutegeno hasta su
posterior evaluacioacuten
38 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS DE LA SEMILLA DE CHIacuteA
(Reyes et al 2007)
Una masa de 10 g de harina de chiacutea desengrasada se mezcloacute con 100 mL de etanol
a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacioacuten mecaacutenica La mezcla fue
centrifugada a 2500 g durante 15 min El sobrenadante se evaporoacute a
40 deg C en un evaporador rotatorio de vaciacuteo El residuo seco se redisolvioacute con 15 mL
de etanol
39 EXTRACCIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHIacuteA (Carrasco-Pancorbo et al 2006) Cada muestra de aceite (10 g) se disolvioacute en 10 mL de hexano y se hicieron pasar
sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de
1mLmin posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano
37
azulVMoeamarilloVIMo
OMoWfenolNaMoOWONa4
401142
OHMoOWOOPOH
OHMoOWOOPOH
233522
233522
104143
105133
para eluir la fraccioacuten no polar del aceite finalmente se eluyoacute la fraccioacuten polar
(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de
metanol y posteriormente se llevoacute a sequedad en evaporador rotatorio al vaciacuteo a
45ordmC y el residuo seco se redisolvioacute en 2 mL de metanol
310 DETERMINACIOacuteN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi 1965)
El meacutetodo original de Folin ndash Ciocalteau se desarrolloacute en 1927 en la cual la oxidacioacuten
de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccioacuten
coloreada a λmaacutex a 745 ndash 750 nm
Este meacutetodo es simple sensible y preciso Sin embargo la reaccioacuten es lenta a un pH
aacutecido por lo que pierde especificidad Singleton y Rossi (1965) mejoraron el meacutetodo
con un reactivo heteropolianioacutenico molibdotungstofosfoacuterico que reduce los fenoles de
forma maacutes especiacutefica la λmaacutex para el producto es 765 nm
Obtencioacuten de la curva tipo
Se prepararon soluciones de 100 200 300 400 y 500 mgL de aacutecido gaacutelico o taacutenico
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones
anteriores 100μL de agua desionizada 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 08 mL
de una de solucioacuten de carbonato de sodio al 75
Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes
de tomar la lectura en el espectrofotoacutemetro a 760 nm
38
Tratamiento de la muestra
En los tubos de ensaye se adicionaron 100 μL de agua desionizada 100 μL de
muestra 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 08 mL de una solucioacuten de
carbonato de sodio al 75 Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30
minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotoacutemetro se interpoloacute en la
curva tipo y se expresoacute el contenido de fenoles totales como equivalente de aacutecido
gaacutelico (GAE) en mg por g de muestra
311 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHIacuteA MEacuteTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al 2003)
La actividad antioxidante se determinoacute usando el radical ABTS la generacioacuten del
ABTSdeg+ se llevoacute a cabo con la produccioacuten del cromoacuteforo azulverde ABTSdeg+ a traveacutes
de la reaccioacuten entre el ABTS y persulfato de amonio El ABTS se disolvioacute en agua
desionizada a una concentracioacuten 7 mM El catioacuten del radical ABTS (ABTSdeg+) se
produjo haciendo reaccionar la solucioacuten stock de ABTS con persulfato de amonio
245 mM en una relacioacuten 11 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a
temperatura ambiente (20degC) 16 horas antes de su uso Posteriormente se realizoacute
una dilucioacuten del ABTSbull+ con etanol para obtener una absorbancia de 0700 plusmn 0020 a
734 nm la cual fue de 160 Para la reaccioacuten con las soluciones estaacutendar Troloxreg y
los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 microL de muestra con 1980 microL de
ABTSbull+ y se tomoacute la absorbancia despueacutes de 6 minutos
312 ANAacuteLISIS DE COMPUESTOS POLIFENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR
Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar
equipado con un detector UV-Vis El software 32 Karat se utilizoacute para el control
instrumental y anaacutelisis de datos Las separaciones se realizaron con un capilar de
siacutelice fundida con una longitud total de 519 cm (417 cm al detector) de 50 microm de
diaacutemetro interno
39
Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacioacuten lavaacutendolos con
hidroacutexido de sodio 01 M durante 2 min agua desionizada durante 2 min y luego con
el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar
Despueacutes del uacuteltimo anaacutelisis de cada diacutea los capilares se lavaron con hidroacutexido de
sodio 01 M durante 2 min y finalmente con agua desionizada (10 min)
Los estaacutendares se disolvieron en etanol al 80 a excepcioacuten de la miricetina
quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 en etanol
Todos los estaacutendares fueron preparados a una concentracioacuten de 1000 ppm
Los extractos de las muestras de aceite de chiacutea y fraccioacuten desgrasada de semilla de
chiacutea fueron analizadas bajo las siguientes condiciones oacuteptimas de anaacutelisis
encontradas experimentalmente
Concentracioacuten de regulador de pH 50mM de Na2B4O710H2O
pH 94 (ajustado con NaOH 01N)
Voltaje 28 kV
Inyeccioacuten de muestra 05 psi durante 5 s
Temperatura de anaacutelisis 22ordmC
Longitud total de capilar 519 cm
Longitud efectiva 417 cm
Diaacutemetro interno 50 microm
Longitud de onda 200 nm
40
4 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
41 ANAacuteLISIS PROXIMAL
El anaacutelisis proximal de las diferentes muestras de semilla de chiacutea se presentan en el
Cuadro 5 se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el
tipo de semilla sin embargo en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra
siendo 2071 el valor maacutes bajo lo cual la convierte en un alimento con alto
contenido de fibra
Cuadro 5 Anaacutelisis proximal de la semilla de chiacutea MUESTRA HUMEDAD
LIacutePIDOS
a
PROTEIacuteNA
a CARBOHIDRATOS
a
FIBRA
a CENIZA
a
SEMILLA 094 584plusmn01 3036plusmn16 2198plusmn191 1640plusmn05 2071plusmn04 409plusmn01
SEMILLA 125 556plusmn01 3020plusmn14 1984plusmn213 1500plusmn09 2455plusmn08 445plusmn01
SEMILLA 287 568plusmn01 3051plusmn10 2296plusmn201 1200plusmn06 2445plusmn03 420plusmn01
SEMILLA 301 656plusmn01 3241plusmn07 2083plusmn098 1050plusmn16 2551plusmn07 392plusmn01
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado con desviacioacuten estaacutendar
De igual manera el elevado contenido de liacutepidos 30-32 la convierte en una de las
semillas con maacutes contenido de liacutepidos y seguacuten estudios realizados por Ayerza la
semilla de chiacutea es la fuente natural maacutes rica en aacutecidos grasos omega-3 comparada
con el aceite de menhaden (especie de roacutebalo) y de algas al mismo tiempo el aceite
obtenido de la semilla de chiacutea no tiene ni produce olor a pescado por lo que el
consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de chiacutea no necesitan
un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de
sabor como sucede en los productos ricos en omega 3 provenientes de pescado
para prevenir incluso los menores cambios ocasionados por el medio ambiente
Su contenido elevado de proteiacutenas 19-23 la convierten en una opcioacuten viable para
satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de proteiacutena en
comparacioacuten con productos caacuternicos como la carne de res la cual a pesar de tener
aproximadamente el mismo contenido proteiacutenico que la chiacutea es de mayor valor
econoacutemico
41
Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha
determinado que la mayoriacutea de estos forman muciacutelagos los cuales se sugiere que
pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estoacutemago se forma
un gel el cual disminuye la conversioacuten de azuacutecares y esto produce una sensacioacuten de
saciedad durante maacutes tiempo
42 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHIacuteA
En la Figura 17 se presenta la curva tipo que se utilizoacute para la cuantificacioacuten de
compuestos fenoacutelicos totales o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4
muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de chiacutea tomando como
referencia aacutecido gaacutelico
Figura 17 Curva tipo de aacutecido gaacutelico
Los resultados de la cuantificacioacuten de compuestos fenoacutelicos de los extractos de
semilla y aceite de chiacutea estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como
mg equivalentes de aacutecido gaacutelico (GAE) por 100 gramos de muestra
y = 00033x + 01116 Rsup2 = 09966
0
02
04
06
08
1
12
14
16
18
2
0 100 200 300 400 500 600
A 7
65
nm
Aacutecido gaacutelico mgL
42
Cuadro 6 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de chiacutea
Fraccioacuten de semilla desengrasada
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea extraiacutedo de la semilla
mg aacutecido gaacutelico100 g muestraa
Aceite de chiacutea prensado en friacuteo
592plusmn042
Semilla 094 110471plusmn605 Aceite 094 1149plusmn053
Semilla125 85429plusmn582 Aceite 125 247plusmn013
Semilla287 105261plusmn336 Aceite 287 380plusmn023
Semilla301 109134plusmn1333 Aceite 301 521plusmn023
a Valores expresados en base huacutemeda Anaacutelisis realizado por triplicado
Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenoacutelicos que
contiene el aceite extraiacutedo de la semilla de chiacutea y la fraccioacuten desengrasada de la
misma semilla esto se pensoacute en un principio que era posiblemente causado por el
meacutetodo de extraccioacuten del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenoacutelicos
no son solubles en disolventes no-polares se consideroacute que la cantidad que pudiera
existir de polifenoles en la semilla se quedariacutean en la fraccioacuten desengrasada y no en
el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras
Sin embargo para descartar o comprobar lo anterior se adquirioacute aceite comercial de
chiacutea el cual se obtiene por ldquoprensado en friacuteordquo de acuerdo a especificaciones del
fabricante y los resultados obtenidos mostraron que el meacutetodo de extraccioacuten del
aceite no influye en esta determinacioacuten de fenoles totales y que todas las muestras
de aceite de chiacutea obtenido por extraccioacuten con disolvente estaacuten en el mismo orden de
contenido de fenoles totales en comparacioacuten con el aceite de chiacutea obtenido por
prensado en frio
Independientemente de queacute cantidad de compuestos fenoacutelicos existen en el aceite y
la semilla de chiacutea desengrasada siacute se puede observar que existen valores desde
85429 GAE hasta los 110471 GAE entre los diferentes tipos de semillas de chiacutea lo
cual indica que posiblemente y de ser necesario se podriacutea distinguir una variedad de
otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de
semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales
43
En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de
diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et
al en 2009 y su comparacioacuten con las diferentes muestras de aceite de chiacutea es
aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de chiacutea (Figura 18) a excepcioacuten de
una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual
es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo esta diferencia es
probablemente debido al tipo de la semilla y no por el meacutetodo de obtencioacuten del
aceite
Figura 18 Fenoles totales en el aceite de chiacutea y aceite de olivo
Respecto a la cantidad de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea
desengrasada puede observarse que al ser comparados estos resultados con
diferentes muestras de cereales (quinua kantildeiwa) y amaranto se pone en evidencia la
cantidad de polifenoles que contiene la chiacutea que va desde los 90401 hasta 117272
GAE100 g mientras que los cereales de origen andino soacutelo llegan a alcanzar los
15902 mg GAE100 g en el caso de la quinua (Figura 19)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a
44
Al ser comparada la semilla de chiacutea con frutos que se sabe que tienen un alto
contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garciacutea-
Alonso (2003) se observa que de igual forma que con los cereales la semilla de chiacutea
tiene una cantidad superior de compuestos fenoacutelicos a excepcioacuten de la muestra 125
que se encuentra en el mismo orden (900 mg aacutecido gaacutelico100 g muestra)
Figura 19 Contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desgrasada con otros frutos Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
15902 9739
3455
910
98533
117272
90401
111623 11672
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mg
aacutecid
o g
aacutelic
o1
00 g
mu
estr
a h
um
ed
a
45
43 DETERMINACIOacuteN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MEacuteTODO DEL ABTS
Previamente se realizoacute una curva tipo de Trolox como compuesto estaacutendar debido a
su analogiacutea con la vitamina E las unidades en las que se realizoacute la curva tipo fueron
Absorbancia vs microM Trolox (Figura 20)
Figura 19 Curva tipo Trolox expresada como microM Trolox
Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los
resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7
Cuadro 7 Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de chiacutea y aceite Semilla desengrasada
(microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a Aceite extraiacutedo
de la semilla (microM Troloxg muestra)
a (micromol Troloxg muestra)
a
Semilla094 28328plusmn3531 5665plusmn706 Aceite 094 967plusmn079 193plusmn016
Semilla125 49367plusmn5112 9873plusmn1022 Aceite 125 739plusmn039 148plusmn008
Semilla287 22781plusmn2037 4556plusmn407 Aceite 287 659plusmn020 132plusmn004
Semilla301 36154plusmn1957 7230plusmn392 Aceite 301 2291plusmn091 458plusmn018
Aceite comercial de chiacutea prensado
1070plusmn052 214plusmn10
a Valores expresados en base huacutemeda por triplicado
y = -00292x + 06899 Rsup2 = 09904
0
01
02
03
04
05
06
07
08
0 2 4 6 8 10 12 14 16
AB
SO
RB
AN
CIA
734nm
μM TROLOX
46
La capacidad antioxidante que poseen los aceites de chiacutea del presente estudio y la
fraccioacuten desengrasada de la misma semilla muestran una relacioacuten directa con el
contenido total de fenoles es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de
chiacutea muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la
fraccioacuten desengrasada estos resultados corroboran que en el aceite de chiacutea la
cantidad de compuestos fenoacutelicos es miacutenima en relacioacuten con la fraccioacuten
desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante sin embargo al igual
que en la determinacioacuten de fenoles totales existen diferencias importantes de
actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de chiacutea lo cual es de
intereacutes debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos
fenoacutelicos que actuacutean como antioxidantes En el Figura 21 se hace la comparacioacuten de la actividad antioxidante de las semillas
de chiacutea estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos
en un estudio realizado por Garciacutea-Alonso et al (2003) bajo el mismo meacutetodo (ABTS)
Puede observarse que la muestra de chiacutea 125 presenta una mayor capacidad
antioxidante que el resto de las muestras de chiacutea e incluso de frutos que
comuacutenmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza
frambuesa manzana granada y kiwi Esto nos indica que al igual que en el aceite de
chiacutea la muestra 125 proveniente del estado de Puebla contiene un mayor poder
antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo lo cual
indica que efectivamente cada muestra de semilla de chiacutea contiene un perfil
polifenoacutelicos diferente al resto
Independientemente del distinto perfil de compuestos fenoacutelicos que contiene cada
tipo de semilla de chiacutea analizada en el presente estudio se puede observar que
todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y
en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en
antioxidantes como la frambuesa cereza manzana roja granada y kiwi (Figura 21)
lo cual convierte a la semilla de chiacutea en un alimento viable para complementar la
dieta diaria en antioxidantes
47
Figura 21 Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de chiacutea Fuente Garciacutea-Alonso et al 2003
44 IDENTIFICACIOacuteN DE COMPUESTOS FENOacuteLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR 441 ELECCIOacuteN DE LAS CONDICIONES OacutePTIMAS DE ANAacuteLISIS
Con el objetivo de identificar los compuestos fenoacutelicos presentes en las muestras de
semilla y aceite de chiacutea se realizoacute una base de datos en el equipo de electroforesis
capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estaacutendares incluyendo vainillina como
estaacutendar interno
Vainillina
Aacutecido taacutenico
Aacutecido clorogeacutenico
Aacutecido feruacutelico
Aacutecido p-cumaacuterico
Aacutecido vainillinico
Aacutecido cafeico
Aacutecido gaacutelico
84 82
69
40 38
5665
9873
4556
723
0
20
40
60
80
100
120
microm
ol T
rolo
xg
mu
est
ra
48
Todos los estaacutendares utilizados fueron grado HPLC para garantizar su pureza
El primer procedimiento fue obtener las condiciones oacuteptimas para que el meacutetodo
fuera reproducible y confiable para el posterior anaacutelisis de los extractos de las
muestras de aceite y de semilla de chiacutea desgrasada
Se procedioacute a hacer una mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente
para lo cual se tomoacute 05 mL de una solucioacuten de 1000 mgL de cada estaacutendar disuelto
en etanol al 80 y se mezcloacute en un bantildeo sonicador con el objetivo de mejorar la
disolucioacuten de la mezcla Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en
el Cuadro 8
Cuadro 8 Condiciones de anaacutelisis en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos Temperatura 25ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Diaacutemetro del capilar 75 microm
Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM
Posteriormente se tomoacute un vial y se le colocoacute una aliacutecuota de la mezcla de los
estaacutendares mencionados anteriormente sin embargo en 3 ocasiones la corriente
dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logroacute finalizar el anaacutelisis bajo esas
condiciones esta caiacuteda de corriente pudo ser provocada debido a la concentracioacuten
de metanol que conteniacutea la mezcla proveniente de la disolucioacuten de los estaacutendares en
dicho disolvente por lo anterior se procedioacute a diluir la mezcla de estaacutendares antes
de colocarla en el vial esta dilucioacuten se realizoacute con agua desionizada asiacute como todas
las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar la
dilucioacuten de la mezcla es en relacioacuten 11 para que de esta forma el metanol se
redujera un 25 y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22)
49
Tambieacuten se disminuyoacute el tiempo de inyeccioacuten de la muestra a 5 segundos en lugar
de 8 segundos que teniacutea anteriormente de este modo se redujo el volumen de
muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar Bajo estas
condiciones se logroacute obtener el electroferograma de los estaacutendares que se muestran
en la Figura 22
Figura 22 Electroferograma de la mezcla de 8 estaacutendares
Se observoacute que a pesar de que soacutelo se inyectaba una mezcla de 8 estaacutendares en el
electroferograma se detectaban nueve sentildeales (picos) lo cual haciacutea dudar de la
pureza de alguacuten estaacutendar y por consiguiente la posibilidad de tener sentildeales
ocasionadas por dichas impurezas para corroborar dicha hipoacutetesis se realizoacute el
anaacutelisis de cada estaacutendar por separado y efectivamente se observoacute que el aacutecido
taacutenico era el compuesto del cual se obteniacutea maacutes de una sentildeal y en muchas
ocasiones no era reproducible ninguna de esas sentildeales
Se realizoacute una buacutesqueda bibliograacutefica de este compuesto en artiacuteculos que hablaban
del estudio de polifenoles en diferentes muestras y no se obtuvo evidencia de que
este compuesto fuera utilizado como estaacutendar esto es probablemente por la
estructura quiacutemica del aacutecido taacutenico la cual a pesar de tener varios grupos hidroxilos
unidos a anillos aromaacuteticos (polifenoacutelicos) estos grupos se encuentran condensados
Minutes
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
AU
00475
00500
00525
00550
00575
00600
00625
00650
00675
00700
00725
00750
00775
1-Vainillina 2-Aacutecido taacutenico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Aacutecido p-cumaacuterico 6-Aacutecido vainillinico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
2
3
4
2
5
6
1
7 8
50
con otros anillos a su vez y de esta forma se forma un poliacutemero lo cual no lo hace
apto para utilizarlo como estaacutendar en el presente trabajo Por la razoacuten antes
mencionada se decide excluir de la lista de estaacutendares el aacutecido taacutenico ya que no es
considerado estrictamente un polifenol
Una vez determinados los estaacutendares que se podiacutean utilizar se procedioacute a realizar
diferentes anaacutelisis para verificar la reproducibilidad del meacutetodo Se cambioacute el capilar
y se procedioacute a acondicionarlo (lavarlo) con el procedimiento descrito en el apartado
de meacutetodos Una vez efectuado el acondicionamiento del capilar se procedioacute a
realizar el ensayo de los estaacutendares bajo diferentes condiciones
Las primeras condiciones de anaacutelisis utilizadas se muestran en el Cuadro 9
Cuadro 9 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 20 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Estas condiciones se tuvieron que ir modificando conforme se observaba el
comportamiento de las sentildeales bajo las condiciones mencionadas anteriormente se
tuvo problemas entre los cuales destacaron La caiacuteda de corriente traslape de
sentildeales baja reproducibilidad grandes tiempos de anaacutelisis (30 min
aproximadamente) Por lo cual se consideroacute volver a modificar las condiciones de
anaacutelisis Las condiciones utilizadas se muestran en el Cuadro 10
51
Cuadro 10 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 1 psi
Tiempo de inyeccioacuten 8 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con las condiciones mencionadas anteriormente se tuvo el problema de que en la
mayoriacutea de los anaacutelisis la corriente se caiacutea esto era probablemente ocasionado por
que se inyectaba demasiada muestra y esto provocaba que dentro del capilar no
existiera la cantidad suficiente de electrolito (regulador de pH) para mantener la
corriente estable y constante Sin embargo con estas condiciones de anaacutelisis se
logroacute una mejoriacutea en el tiempo de anaacutelisis reducieacutendolo de 30 min a 20 min Esto fue
provocado por el aumento de voltaje no obstante estas condiciones no eran las
oacuteptimas para realizar anaacutelisis reproducibles Las siguientes condiciones que se
utilizaron se muestran en el Cuadro 11
Cuadro 11 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 07 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Las condiciones resultaron no ser las oacuteptimas para trabajar ocasionando que la
corriente dentro del capilar aumentara y terminara por caerse por tal motivo se
decidioacute cambiar el medio conductor (amortiguador) a uno de Na2B4O710H2O de
concentracioacuten 50 mM al 75 de metanol y ajustando el pH a 94 Al cambiar el
amortiguador las condiciones de anaacutelisis tambieacuten debieron cambiar a las que se
muestran en el Cuadro 12
52
Cuadro 12 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 288 kV
Temperatura de anaacutelisis 25ordmC
Con estas condiciones se realizoacute el anaacutelisis de 7 estaacutendares pero solo se
observaron 5 sentildeales de polifenoles por lo cual se decidioacute disminuir el voltaje a 24
kV para verificar si era debido a un traslape de sentildeales que no apareciacutean todas sin
embargo tampoco se observoacute diferencia en el electroferograma Para verificar si los
estaacutendares no se habiacutean degradado se analizaron por pares para verificar que todos
dieran sentildeal
Se observoacute poca resolucioacuten en los anaacutelisis lo cual indicoacute que el problema no eran los
estaacutendares sino la concentracioacuten del regulador de pH y se optoacute por disminuir la
concentracioacuten del regulador a 30 mM con pH 94 y 75 de metanol
Posteriormente se procedioacute a realizar una mezcla de los 8 estaacutendares siguientes
aacutecido benzoico
aacutecido cafeico
aacutecido gaacutelico
aacutecido cumaacuterico
aacutecido cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico
aacutecido vainillinico
vainillina
Se analizaron en dos ocasiones a 288 kV con inyeccioacuten de 05 psi por 5 segundos
(Figura 23) observaacutendose una buena reproducibilidad del meacutetodo
53
Figura 23 Electroferograma de la mezcla de 8 estandares
Posteriormente para facilitar su identificacion de cada estandar se hicieron anaacutelisis
de pares de estos obteniendose sus electroferogramas correspondientes (Figura
24)
Minutes
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020
AU
000
002
004
006
008
010
012
014
016
018
020UV - 200nm
MEZCLASTD30mM3-31-2009 1-06-10 PMdat
UV - 200nm
mezclastd30mm3-31-2009 12-24-29 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
UV - 200nm
cin-clor30mm3-31-2009 3-51-06 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CAF-GAL30mM3-31-2009 4-13-21 PMdat
aacutecido cinaacutemico-aacutecido clorogeacutenico aacutecido cafeacuteico-aacutecido gaacutelico
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1
3 2
4
5 6
7 8
1
54
Minutes
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250UV - 200nm
8ESTANDAR30mM3-31-2009 5-17-06 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
Figura 24-Electroferogramas de cada par de estandares
Al final se comparararon todas las sentildeales obtenidas para deducir el tiempo de migracion de cada compuesto (Figura 25)
Figura 25 Electroferograma de comparacioacuten de 8 estaacutendares
Posteriormente una vez que ya se habiacutea obtenido el meacutetodo adecuado para hacer el
anaacutelisis de fenoles mediante electroforesis capilar se procedioacute a analizar una
muestra comercial de aceite de chiacutea para observar el perfil polifenoacutelico que este
mostraba (Figura 26)
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050
AU
000
005
010
015
020
025
030
035
040
045
050UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
cum-benz30mm3-31-2009 4-29-15 pmdat
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
AU
0000
0025
0050
0075
0100
0125
0150
0175
0200
0225
0250
0275
UV - 200nm
CUM-BENZ30mM3-31-2009 4-29-15 PMdat
UV - 200nm
6estandar30mm3-31-2009 4-59-43 pmdat
aacutecido cumaacuterico-aacutecido benzoico
mezcla de seis estaacutendares
1-Vainillina 2-Aacutecido clorogeacutenico 3-Aacutecido feruacutelico 4-Aacutecido p-cumaacuterico 5-Aacutecido vainillinico 6-Aacutecido benzoico 7-Aacutecido cafeico 8-Aacutecido gaacutelico
1 2 3
4
5
6
7 8
55
Fig
ura
26
E
lec
tro
fero
gra
ma
de
extr
acto
de a
ce
ite
de
co
me
rcia
l d
e c
hiacutea
56
Las condiciones utilizadas para este anaacutelisis se muestran en el Cuadro 13 Cuadro 13 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis electroforeacutetico
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi
Tiempo de inyeccioacuten 5 segundos
Voltaje de anaacutelisis 24 kV
Temperatura de anaacutelisis
25ordmC
Amortiguador 30 mM de Na2B4O710H2O con 75 de metanol ajustado a pH 94
Se puede observar que en cada anaacutelisis que se le realizoacute al extracto los resultados
no fueron reproducibles en el primer anaacutelisis se observa un par de santildeales a los 4
min aproximadamente y una sentildeal maacutes alrededor de los 18 min pero en el segundo
anaacutelisis la sentildeal de los 18 min se recorrioacute hasta los 27 min aproximadamente
Posteriormente en el tercer y cuarto anaacutelisis ya no aparece esa sentildeal al comparar
los 4 anaacutelisis se obtuvo una variacion en el tiempo de migracion de los compuestos
Analizando los resultados obtenidos se observoacute que bajo las condiciones antes
mencionadas no era reproducible el meacutetodo por lo cual no se lograba identificar los
compuestos no obstante se observan sentildeales de compuestos fenoacutelicos lo cual indica
que el aceite de chiacutea siacute conteniacutea compuestos fenoacutelicos sin embargo se necesitaba
establecer las condiciones para que el meacutetodo fuera reproducible y pudieran
obtenerse conclusiones por lo cual se volvioacute a trabajar con los estaacutendares bajo
ciertas condiciones que lograran hacer reproducible el meacutetodo
En esta ocasioacuten se modificoacute el diaacutemetro interno del capilar de 75 a 50 microm y la
concentracioacuten del regulador a 45 mM a pH 93 sin metanol otro factor que se tomoacute
en cuenta fue la temperatura de anaacutelisis la cual siempre habiacutea sido a 25ordmC y en esta
ocasioacuten se redujo a 22ordmC el voltaje aplicado fue de 28 kV y 30 kV y la inyeccioacuten de
muestra fue de 05 psi durante 8 segundos la longitud efectiva del capilar fue de 45
cm mientras que la longitud total fue de 553 cm
57
Se realizaron ensayos por pares de estaacutendares para observar si no existiacutea un
traslape entre alguno de ellos la reproducibilidad fue la mejor obtenida hasta el
momento aunque siacute existiacutea un traslape de dos sentildeales Se determinoacute que el
estaacutendar que se traslapaba era el aacutecido benzoico y se decide excluirlo de la mezcla
ya que inicialmente se decidioacute incluirlo en la muestra como estaacutendar interno pero
este se remplazoacute por vainillina por tal razoacuten se decidioacute quitarlo de la mezcla para
evitar que las sentildeales se traslaparan
Al final se analizaron los 8 estaacutendares solubles en agua aacutecido cinaacutemico aacutecido trans-
cinaacutemico aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico aacutecido vainillinico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
cumaacuterico y vainillina como estaacutendar interno Las condiciones oacuteptimas que se
encontraron experimentalmente para realizar los ensayos se muestran en el Cuadro
14
Cuadro 14 Condiciones oacuteptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 40 cm
Voltaje 30 kV Longitud total del capilar 50 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 45 mM pH 88
Una vez establecidas las condiciones se procedioacute a realizar el ensayo de la mezcla
de los 8 estaacutendares para obtener sus tiempos de migracioacuten y evaluar la repetibilidad
del meacutetodo para lo cual se calculoacute el coeficiente de variacioacuten (CV) seguacuten la siguiente
foacutermula
C V= X 100
58
En el Cuadro 15 se observan los tiempos de migracioacuten que se obtuvieron de cada
uno de los 8 estaacutendares (picos) y su desviacioacuten estaacutendar durante los cuatro ensayos
que se realizaron El coeficiente de variacioacuten no debiacutea ser mayor al 3 que es lo
deseable en cualquier meacutetodo analiacutetico
Cuadro 15 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Tiempos de migracioacuten (min)
tmicro1 tmicro2 tmicro3 tmicro4 tmicro5 tmicro6 tmicro7 tmicro8
corrida 1 534 553 574 584 638 663 992 1083
corrida 2 541 56 582 594 651 677 999 1103
corrida 3 543 563 585 596 653 68 1023 1118
corrida 4 558 579 601 611 67 698 1067 1169
MEDIA 544 564 586 596 653 680 1020 1118
STD 00875 00952 00981 00965 01138 01246 02934 03182
CV () 161 169 168 162 174 183 288 285 CV coeficiente de variacioacuten tmicro tiempo de migracioacuten STD desviacioacuten estaacutendar
Las condiciones mencionadas anteriormente resultaron uacutetiles en la separacioacuten de los
8 estaacutendares de polifenoles mencionados anteriormente sin embargo se lograron
adquirir 3 estaacutendares nuevos de polifenoles los cuales fueron miricetina quercetina
y kaempferol Debido a este cambio fue necesario hacer un anaacutelisis de cada uno de
los 11 estaacutendares Cada uno de los 11 estaacutendares fue analizado individualmente y se
hizo un barrido de cada estaacutendar con un detector de arreglo de diodos (DAD) para
obtener su espectro de absorcioacuten (Figura 27) y de esta forma facilitar la identificacioacuten
de los compuestos fenoacutelicos
59
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40566 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40587 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80m
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
660 Min
AC CLOROGENICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180883 Min
AC p-CUMARICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mA
U
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40684 Min
10STDnuevos
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180762 Min
AC FERULICO500ppm
VAINILLINA
AC TRANS-CINAacuteMICO
AC CLOROGEacuteNICO
AC P-CUMAacuteRICO
AC VAINILLIacuteNICO AC FERUacuteLICO
60
Figura 27-Espectros de absorcioacuten de cada estaacutendar estudiado
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
mA
U
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001125 Min
AC CAFEICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
501336 Min
AC GALICO500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
mA
U
15
20
25
30
35
40
45
50
911 Min
QUERCETINA500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
mA
U
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
788 Min
KAEMPFEROL500ppm
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
868 Min
MIRICETINA500ppm
AC CAFEacuteICO
AC GAacuteLICO
QUERCETINA
KAEMPFEROL
MIRICETINA
61
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
AU
000
002
004
006
008
010
012
AU
000
002
004
006
008
010
012PDA - 200nm
10STD50mM
PDA - 200nm
10std525mm
PDA - 200nm
10std55mm
PDA - 200nm
10std60mm
PDA - 200nm
10std70mm
Las condiciones oacuteptimas de separacioacuten de los estaacutendares fueron determinadas
despueacutes de hacer distintas pruebas en la concentracioacuten del regulador a 50 525 55
60 y 70 mM de Na2B4O710H2O con pH fijo de 94 e inyeccioacuten de 05 psi durante 5
segundos a 28 kV de voltaje y manteniendo la temperatura constante a 22ordmC los
electroferogramas de estas pruebas se muestran en la Figura 28
Figura 28 Electroferogramas a distintas concentraciones de regulador
Como se puede observar en la Figura 28 soacutelo los electroferogramas con
concentraciones de regulador de 50 y 55 mM muestran las sentildeales de los 11
componentes de la mezcla mientras que a maacutes altas concentraciones del regulador
solo pueden verse 10 sentildeales lo que indica que dos sentildeales de los estaacutendares se
encuentran traslapadas
50 mM
525 mM
55 mM
60 mM
70 mM
62
Se conoce muy bien que los boratos pueden formar complejos con dioles (Mazurek y
Perlin 1963) por lo que no nos sorprende que la movilidad de varios de nuestros
polifenoles se vea afectada por el cambio en la concentracioacuten de los boratos
Utilizados al formar complejos con algunos de los analitos especialmente a los que
se encuentran entre los 9 y 10 min
La concentracioacuten adecuada del regulador resultoacute ser 50 mM debido a que se obtuvo
una buena separacioacuten de los 11 estaacutendares y mostroacute una buena reproducibilidad a
diferencia de las demaacutes concentraciones en las que existiacutean sentildeales que se
traslapaban lo cual era indeseable Las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se muestran
en el Cuadro 16
Cuadro 16 Condiciones oacuteptimas de anaacutelisis halladas experimentalmente
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas de anaacutelisis se procedioacute a realizar una
mezcla de todos los estaacutendares mencionados anteriormente para lo cual se tomaron
05 mL de cada estaacutendar y se mezcloacute en un sonicador para mejorar la disolucioacuten de
la mezcla La mezcla se realizoacute con soluciones de 1000 mgL de cada estaacutendar
disuelto en etanol al 80 a excepcioacuten de miricetina quercetina y kaempferol los
cuales se disolvieron en dimetilsulfoacutexido (DMSO) al 10 en etanol Los anaacutelisis
fueron realizados bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 16
63
El electroferograma de la mezcla de los 11 estaacutendares se muestra en la Figura 29
Figura 29 Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares
Cada uno de los 11 estaacutendares fue identificado mediante su espectro de absorcioacuten
(previamente adquirido al analizarlos individualmente con un detector de arreglo
diodos) y comparaacutendolos en la mezcla analizada gracias a una funcioacuten con la que
cuenta el equipo de electroforesis capilar en la cual permite posicionarse en la sentildeal
(pico) del electroferograma y en una ventana emergente de la pantalla del equipo
nos muestra el espectro de absorcioacuten (Figura 30) de esa especie que previamente
se analizoacute individualmente y de esta forma se identifica el compuesto ademaacutes junto
con la informacioacuten del tiempo de migracioacuten de cada uno de los estaacutendares que se
muestran en el Cuadro 17
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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0035
0040
0045
0050
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1
2
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4
5
6
7
8 9
10
1-Vainillina 2-Aacutecido trans-cinaacutemico 3-Aacutecido clorogeacutenico 4-Aacutecido feruacutelico 5-Kaempferol 6-Miricetina 7-Aacutecido p-cumaacuterico 8-Aacutecido vainillinico 9-Quercetina 10-Aacutecido cafeico 11-Aacutecido gaacutelico
11
64
Figura 30 Espectros de absorcioacuten obtenidos mediante detector de arreglo de diodos Cuadro 17 Tiempos de migracioacuten de cada estaacutendar
Estaacutendar Tiempo de migracioacuten Estaacutendar Tiempo de migracioacuten
Vainillina 599 min Ac p-cumaacuterico 883 min
Ac trans-cinaacutemico 632 min Ac vainillinico 903 min
Aacutecido clorogeacutenico 660 min Quercetina 911 min
Aacutecido feruacutelico 757 min Aacutecido cafeico 1130 min
Kaempferol 787 min Aacutecido gaacutelico 1337 min
Miricetina 868 min
65
442 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE ACEITE DE CHIacuteA
Una vez establecida la base de datos de polifenoles y las condiciones oacuteptimas se
procedioacute a inyectar los extractos de los distintos tipos de muestras de aceite y semilla
de chiacutea para identificar los posibles compuestos fenoacutelicos En primer lugar se analizoacute
el aceite comercial de chiacutea el cual por especificaciones del fabricante se obtuvo por
prensado en friacuteo el electroferograma de este aceite se muestra en la Figura 31
Cabe mencionar que todos los electroferogramas mostrados a continuacioacuten fueron
obtenidos bajo las condiciones oacuteptimas mencionadas en el cuadro 16
Figura 31 Electroferograma del aceite comercial de chiacutea
Las sentildeales obtenidas de dicho aceite no coincidieron con ninguacuten tiempo de
migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados
La muestra de aceite 094 mostroacute sentildeales de posibles compuestos fenoacutelicos (Figura
32) debido a su tiempo parecido de migracioacuten en especiacutefico aacutecido clorogeacutenico y
aacutecido gaacutelico por lo cual se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de solucioacuten de cada
estaacutendar de 1000 ppm para poder confirmar o descartar la presencia de estos
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0038
0040
0042
0044
0046
0048
0050
0052
0054
0056
66
compuestos fenoacutelicos (un aumento de la intensidad de esa sentildeal indicariacutea la
presencia de dicho compuesto) (Figura 33)
Figura 32 Electroferograma del aceite 094
Figura 33 Electroferograma del aceite 094 antildeadiendo estaacutendares
Sin embargo como puede observarse los estaacutendares antildeadidos no corresponden
con el tiempo de migracioacuten de la sentildeales de la muestra de aceite lo cual indica que
dicha muestra de aceite no contiene ninguacuten compuesto fenoacutelico de los utilizados en
este trabajo
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0055
PDA - 200nm
Aacutecido gaacutelico
Aacutecido clorogeacutenico
Compuesto no
identificado
67
De igual forma la muestra de aceite 125 (Figura 34) se sospechoacute que podiacutea contener
kaempferol debido a la sentildeal que se obtuvo alrededor de los 9 min por lo cual se
antildeadioacute una aliacutecuota de la solucioacuten de estaacutendar de kaempferol para confirmar o
descartar su presencia (Figura 35)
Figura 34 Electroferograma del aceite 125
Figura 35 Electroferograma del aceite 125 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al antildeadirle la aliacutecuota de kaempferol se pudo descartar la presencia de dicho
compuesto en la muestra debido a que no coincidioacute con el tiempo de migracioacuten de la
muestra
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011
PDA - 200nm
Kaempferol
Compuesto no
identificado
68
La muestra de aceite 287 (Figura 36) al igual que la muestra 125 mostraron una
sentildeal alrededor de los 9 min indicando posiblemente la presencia de kaempferol por
lo cual se procedioacute de igual forma a antildeadir una aliacutecuota de dicho compuesto (Figura
37) para confirmar o eliminar dicha posibilidad
Figura 36 Electroferograma del aceite 287
Figura 37 Electroferograma del aceite 287 maacutes estaacutendares antildeadidos
Al igual que la muestra 125 de aceite se descartoacute la presencia de kaempferol en
esta muestra debido a que no coincidioacute el tiempo de migracioacuten con el de la muestra
de aceite
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011
PDA - 200nm
Compuesto no
identificado
Kaempferol
69
De igual forma se analizoacute la muestra de aceite 301 (Figura 38) sin embargo a pesar
de que efectivamente se observaron sentildeales todas estas no coincidieron con ninguacuten
tiempo de migracioacuten de alguno de los 11 estaacutendares utilizados en el presente trabajo
Figura 38 Electroferograma del aceite 301
543 ANAacuteLISIS DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA DE CHIacuteA
De igual forma se analizaron los extractos de la semilla de chiacutea desengrasada en el
equipo de electroforesis capilar en el extracto de la semilla 094 (Figura 39) fueron
detectados probablemente 6 compuestos fenoacutelicos los cuales podiacutean ser aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol aacutecido gaacutelico y aacutecido
cafeico
El extracto de la semilla 125 (Figura 40) mostroacute sentildeales de posibles compuestos
fenoacutelicos que debido a su tiempo de migracioacuten podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico
aacutecido clorogeacutenico kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
En el extracto de la semilla 287 (Figura 41) se detectaron compuestos que
posiblemente podiacutean ser aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
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0035
0040
0045
0050
0055
70
En el extracto de la semilla 301 (Figura 42) se detectaron las sentildeales de posibles
compuestos fenoacutelicos como el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido feruacutelico
kaempferol aacutecido cafeico y aacutecido gaacutelico
Figura 39 Electroferograma de la semilla 094
Figura 40 Electroferograma de la semilla 125
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71
Figura 41 Electroferograma de la semilla 287
Figura 42 Electroferograma de la semilla 301
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011
72
Para poder confirmar la presencia de estos compuestos fenoacutelicos en los extractos de
semilla se decidioacute antildeadir una aliacutecuota de 5 microL de cada estaacutendar del cual se
sospechaba su presencia en la muestra esto se decidioacute realizar debido a que los
tiempos de migracioacuten de las muestras sufrieron un corrimiento en comparacioacuten con la
mezcla de estaacutendares esto es ocasionado por la viscosidad de la muestra al ser
inyectada en el equipo de electroforesis capilar
Debido a este fenoacutemeno las sentildeales sufrieron un desplazamiento del orden de
segundos por lo cual fue necesario poder confirmar con la adicioacuten del estaacutendar del
cual se sospechaba su presencia y en caso de aumentar la sentildeal se confirmaba de
ese modo la presencia de dicho compuesto
Al extracto de la semilla 094 se le antildeadioacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido cafeico
Al extracto de la semilla 125 se le antildeadioacute aacutecido gaacutelico y aacutecido clorogeacutenico
Al extracto de la semilla 287 se le antildeadioacute kaempferol
Al extracto de la semilla 301 se le antildeadioacute aacutecido feruacutelico
Asiacute de esta forma se logroacute confirmar o descartar los compuestos fenoacutelicos que se
sospechaba su presencia en cada tipo de semilla debido a que los estaacutendares al
estar en la muestra iban a comportarse de la misma forma
En la semilla 094 (Figura 43) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido cafeico Estos compuestos lograron identificarse mediante la
superposicioacuten de electroferogramas de las diferentes muestras de semilla de chiacutea
que previamente se le antildeadieron estaacutendares
73
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido cafeico y aacutecido trans-cinaacutemico antildeadidos 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 43 Electroferograma de semilla 094 con estaacutendares antildeadidos
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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020PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico Aacutecido cafeico
1
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 125 (Figura 44) se lograron identificar aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico de la misma forma anteriormente mencionada
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 44 Electroferograma de semilla 125 con estaacutendares antildeadidos
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Aacutecido clorogeacutenico
1
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla 287 (Figura 45) se detectoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido 3-extracto con aacutecido clorogeacutenico antildeadido Figura 45 Electroferograma de semilla 287 con estaacutendares antildeadidos
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3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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PDA - 200nm PDA - 200nm
Aacutecido clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
1
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3
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
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PDA - 200nm PDA - 200nm
En la semilla de chiacutea 301 se identificoacute aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido gaacutelico (Figura 46)
1-extracto sin estaacutendares antildeadidos 2-extracto con aacutecido gaacutelico antildeadido 3-extracto con aacutecido trans-cinaacutemico antildeadido Figura 46 Electroferograma de semilla 301 con estaacutendares antildeadidos
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
AU
000
002
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000
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014
PDA - 200nm PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Acido gaacutelico
1
2
3
77
El uacutenico compuesto fenoacutelico que fue identificado en comuacuten en las 4 muestras de
semilla de chiacutea fue el aacutecido trans-cinaacutemico y cada tipo de semilla contiene distintos
compuestos fenoacutelicos lo cual indica que dependiendo del tipo de semilla es el
contenido de compuestos fenoacutelicos mostrando asiacute que cada variedad de semilla
tiene un perfil diferente de compuestos fenoacutelicos
Al realizar la comparacioacuten con los resultados obtenidos por Taga et al en 1984 soacutelo
se encuentra coincidencia en la presencia de aacutecido clorogeacutenico compuesto que estaacute
presente en las muestras 094 125 y 287 provenientes del estado de Puebla y aacutecido
cafeico que estaacute presente en una sola muestra (094) sin embargo es de llamar la
atencioacuten que los flavonoles miricetina quercetina y kaempferol no fueron detectados
en las muestras analizadas en el presente trabajo mientras que en el estudio
anteriormente mencionado siacute se reporta la presencia de dichos polifenoles
Sin embargo es destacable que en el estudio de comparacioacuten no indican la
procedencia o variedad de semilla de chiacutea que se estudioacute lo cual es muy comuacuten en
trabajos que se realizan con materiales vegetales en los cuales no se especifica el
tipo o procedencia de dicha muestra lo cual complica una caracterizacioacuten de
acuerdo al tipo o variedad de semilla En el presente trabajo se estudiaron 3
variedades del estado de Puebla y 1 de colima y se confirmoacute que cada variedad de
semilla de chiacutea contiene distintos compuestos fenoacutelicos
Independientemente de los compuestos fenoacutelicos que se identificaron en los distintos
extractos siacute existen distintas sentildeales con diferentes tiempos de migracioacuten que no
coinciden con alguno de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo sin embargo es
evidente que estas sentildeales son de compuestos fenoacutelicos de diferente naturaleza a
los que se adquirieron en esta investigacioacuten
En el Cuadro 18 se resume el contenido de fenoles totales la capacidad antioxidante
y los compuestos fenoacutelicos identificados en cada extracto de aceite y semilla de chiacutea
78
Cuadro 18 Contenido de fenoles totales capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar
MUESTRA FENOLES TOTALES (mg ac gaacutelico100g muestra)
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (microM Troloxg muestra)
COMPUESTO IDENTIFICADO
Semilla 094
110471plusmn605
28328plusmn3531
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido trans-cinaacutemico 3-aacutecido cafeico
Semilla 125
85429plusmn582
49367plusmn5112
1-aacutecido clorogeacutenico 2-aacutecido gaacutelico 3-aacutecido trans-cinaacutemico
Semilla 287
105261plusmn336
22781plusmn2037
1-aacutecido trans-cinaacutemico 2-aacutecido clorogeacutenico
Semilla 301
109134plusmn1333
36154plusmn1957
1-aacutecido gaacutelico 2-aacutecido trans-cinaacutemico
Aceite comercial de chiacutea
592plusmn042
1070plusmn052
ND
Aceite 094 1149plusmn053 967plusmn079 ND
Aceite 125 247plusmn013 739plusmn039 ND
Aceite 287 380plusmn023 659plusmn020 ND
Aceite 301 521plusmn023 2291plusmn091 ND
ND= No detectado
Como puede observarse en el Cuadro 6 son interesantes los valores que se
presentan en los extractos de aceite de chiacutea debido a que al analizar los extractos
estos mostraron un valor de fenoles totales y una capacidad antioxidante no
obstante al ser analizados mediante electroforesis capilar no se detectaron
compuestos fenoacutelicos
79
Esto nos dio la pauta para pensar que dichos extractos se habiacutean degradado al
momento de haber sido analizados por electroforesis capilar debido a que en ese
momento dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento bajo atmoacutesfera de
nitroacutegeno y en frascos aacutembar a 0ordmC por lo cual se decidioacute realizar pruebas con
extractos de aceite fresco (1 diacutea de almacenamiento) y comparar los
electroferogramas con los del aceite almacenado durante 120 diacuteas Los
electroferogramas se obtuvieron bajo las condiciones mencionadas en el Cuadro 19
Cuadro 19 Condiciones utilizadas en el anaacutelisis de extractos frescos de semilla y aceite de chiacutea
Tiempo de inyeccioacuten 5 seg Temperatura 22ordmC
Presioacuten de inyeccioacuten 05 psi Longitud efectiva del capilar 417 cm
Voltaje 28 kV Longitud total del capilar 519 cm
Tiempo de anaacutelisis 30 min Regulador de Na2B4O7 50 mM pH 94
En la Figura 47 se muestran las sentildeales del aceite 094 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de polifenoles y
logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico
Figura 47 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 094
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
001
002
003
004
005
AU
001
002
003
004
005
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
10std50mm
Ac trans-cinaacutemico
80
En la Figura 48 se muestran las sentildeales del aceite 125 fresco en el cual se observan
distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11 estaacutendares de
polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico y el aacutecido cafeico y tambieacuten
una sentildeal intensa alrededor de los 8 min que no coincide con ninguno de los
estaacutendares
Figura 48 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 125
En la Figura 49 se muestran las sentildeales del aceite 287 fresco en el cual se
observan distintas sentildeales y de igual forma se sobrepuso la mezcla de los 11
estaacutendares de polifenoles logrando identificar el aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico sin embargo esta muestra de aceite contuvo maacutes sentildeales
en comparacioacuten con las otras dos muestras de aceite previamente analizados
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
003
004
005
006
AU
000
001
002
003
004
005
006PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico Aacutecido cafeico
81
Figura 49 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 287
La uacuteltima muestra analizada fue la del aceite 301 (Figura 50) en el cual logroacute
identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido p-cumaacuterico y quercetina y
de igual forma se obtienen sentildeales de diferentes compuestos que no coinciden con
el tiempo de migracioacuten de los 11 estaacutendares utilizados en este trabajo Esta muestra
de aceite es la que contiene mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos y con mayor
concentracioacuten
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
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AU
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0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
Ac trans-cinaacutemico
Ac clorogeacutenico
Acido gaacutelico
82
Figura 50 Electroferograma del extracto fresco del aceite de la semilla 301
A pesar de que los 4 aceites fueron analizados en las mismas condiciones se
observoacute que cada aceite tiene un perfil distinto de compuestos fenoacutelicos (Figura 51) y
tambieacuten variacutean en la concentracioacuten de dichos compuestos siendo el aceite 301 el
que maacutes compuestos fenoacutelicos contuvo
Minutes
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AU
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0030
0035
0040
0045
0050
0055
PDA - 200nm
AAc clorogeacutenico
Ac trans-cinaacutemico
Ac p-cumaacuterico
Quercetina
83
Figura 51 Electroferograma de las 4 muestras de aceite de chiacutea
A pesar de que en los extractos de semilla desengrasada se detectaron compuestos
fenoacutelicos dichos extractos teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento por lo cual se decidioacute
volver a analizar mediante electroforesis capilar extractos de la fraccioacuten
desengrasada pero frescos ( de 1 diacutea de almacenamiento) para poder comparar los
resultados obtenidos con los extractos que teniacutean 120 diacuteas de almacenamiento y al
mismo tiempo tener un estudio completo tanto del aceite como de la fraccioacuten
desengrasada de la semilla de chiacutea
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
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005
006
AU
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001
002
003
004
005
006
PDA - 200nm
ACEITE0941
PDA - 200nm
aceite125 3 seg1
PDA - 200nm
aceite287 3 seg1
PDA - 200nm
aceite fresco espectros
Aceite 094
Aceite 125
Aceite 287
Aceite 301
84
Los resultados fueron confirmativos de que el tiempo de almacenamiento es
determinante en el contenido de compuestos fenoacutelicos al analizar el extracto fresco
de la semilla 094 se logroacute identificar aacutecido clorogeacutenico aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
cafeico (Figura 52)
Figura 52 Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco
En este extracto fue en el que se detectaron la menor cantidad de compuestos
fenoacutelicos (3) de las 4 muestras de semilla desengrasada aunque la identificacioacuten en
este caso fue maacutes sencilla comparada con la del extracto almacenado 120 diacuteas
debido a que las sentildeales se encontraron mejor definidas y esto facilitoacute la
comparacioacuten con la base de datos de polifenoles
Minutes
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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002
003
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005
006
1 2
3
1 Aacutecido clorogeacutenico 2 Aacutecido trans-cinaacutemico
3 Aacutecido cafeico
85
En la semilla 125 se logroacute identificar aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico aacutecido
feruacutelico kaempferol miricetina quercetina y aacutecido gaacutelico (Figura 53)
Figura 53 Electroferograma del extracto de la semilla 125 fresco
En este extracto se hizo evidente los distintos resultados que se obtienen con
extractos frescos y almacenados 120 diacuteas esta misma muestra cuando se analizoacute
con 120 diacuteas de almacenamiento solo lograron identificarse 3 polifenoles (aacutecido
trans-cinaacutemico aacutecido clorogeacutenico y aacutecido gaacutelico) mientras que en el extracto fresco
se identificaron 7 compuestos fenoacutelicos de la base de datos que tenemos de
comparacioacuten
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005
006
1
2 3
4
5
6 7
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
86
En el extracto de la semilla 287 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina quercetina aacutecido gaacutelico (Figura
54)
Figura 54 Electroferograma del extracto de la semilla 287 fresco
Al igual que en la muestra 125 en la muestra 287 se detectaron los mismos
compuestos fenoacutelicos lo cual es contrastante al compararse con el anaacutelisis del
extracto con 120 diacuteas de almacenamiento en el cual solo se logroacute identificar 2
compuestos fenoacutelicos (aacutecido trans-cinaacutemico y aacutecido clorogeacutenico)
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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001
002
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005
006
1
2 3
7
4
5 6
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Quercetina
7 Aacutecido gaacutelico
87
En el extracto fresco de la semilla 301 se identificaron aacutecido trans-cinaacutemico aacutecido
clorogeacutenico aacutecido feruacutelico kaempferol miricetina aacutecido vainillinico quercetina
aacutecido gaacutelico y aacutecido cafeico (Figura 55)
Figura 55 Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco
En esta muestra fue donde se identificaron mayor nuacutemero de compuestos fenoacutelicos
(9) ademaacutes de ser la que mostroacute mayor nuacutemero de sentildeales y de mayor absorbancia
lo cual nos indica que estaacuten presentes en mayor cantidad
En el Cuadro 20 se hace la comparacioacuten de los compuestos fenoacutelicos detectados en
los extractos frescos y la diferencia con los polifenoles encontrados 120 diacuteas
despueacutes de almacenados los extractos como puede observarse la diferencia es
relevante entre el tiempo de un anaacutelisis y otro por lo cual es recomendable que para
cualquier anaacutelisis de compuestos fenoacutelicos se realice lo maacutes pronto posible una vez
que se hayan extraiacutedo los compuestos fenoacutelicos de la matriz del alimento o muestra
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
AU
000
001
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006
AU
000
001
002
003
004
005
006
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 Aacutecido trans-cinaacutemico 2 Aacutecido clorogeacutenico 3 Aacutecido feruacutelico 4 Kaempferol 5 Miricetina 6 Aacutecido vainillinico 7 Quercetina 8 Aacutecido gaacutelico
9 Aacutecido cafeico
88
esto es debido a que dichos compuestos fenoacutelicos al actuar como antioxidantes se
oxidan despueacutes de cierto tiempo por la presencia de ciertos factores como la luz
calor y oxigeno del aire que aceleran las reacciones de oxidacioacuten
Cuadro 20 Comparacioacuten de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 diacuteas
Muestra
vain
illin
a (E
I)
aacutec t
rans
-cin
amic
o
ac c
loro
geacuteni
co
ac f
eruacutel
ico
Kaem
pfer
ol
Mir
icet
ina
Ac
p-cu
maacuter
ico
Ac
vain
illin
ico
Que
rcet
ina
ac c
afeiacute
co
ac g
aacutelic
o
aceite 094 almacenado
aceite 094 fresco X
aceite 125 almacenado
aceite 125 fresco X X
aceite 287 almacenado
aceite 287 fresco X X X
aceite 301 almacenado
aceite 301 fresco X X X X
semilla 094 almacenada X X X
semilla 094 fresca X X X
semilla 125 almacenada X X X
semilla 125 fresca X X X X X X X
semilla 287 almacenada X X
semilla 287 fresca X X X X X X X
semilla 301 almacenada X X
semilla 301 fresca X X X X X X X X X
A A A A A A A
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
89
En el Cuadro 21 se resume la cantidad de fenoles totales actividad antioxidante y los
compuestos fenoacutelicos identificados mediante electroforesis capilar podraacute notarse que
la fraccioacuten desgrasada de semilla de chiacutea muestra valores muy superiores de
capacidad antioxidante y fenoles totales al del aceite extraiacutedo de la misma esto se
relaciona con la cantidad de compuestos fenoacutelicos identificados en la fraccioacuten
desgrasada en el aceite 301 se lograron identificar 4 compuestos mientras que en la
fraccioacuten desgrasada se logroacute identificar hasta 9 compuestos fenoacutelicos en el caso de
la semilla 301
Cuadro 21 Contenido de compuestos fenoacutelicos en extractos de aceite y semilla frescos
Aacutec t
rans-c
inaacutem
ico
Aacutec c
loro
geacutenic
o
Aacutec f
eruacute
lico
kaem
pfe
rol
Miric
etina
Aacutec p
-cum
aacuterico
Aacutec v
ain
illin
ico
Querc
etina
Aacutec c
afe
ico
Aacutec g
aacutelic
o
Fenoles totales
(mg ac gaacutelico100g muestra)
Capacidad antioxidante
(microM Troloxg muestra)
Aceite 094 fresco
X 1149plusmn053 967plusmn079
Aceite 125 fresco
X X 247plusmn013 739plusmn039
Aceite 287 fresco
X X X 380plusmn023 659plusmn020
Aceite 301 fresco
X X X X 521plusmn023 2291plusmn091
Semilla 094 fresca
X X X 110471plusmn60 28328plusmn3531
Semilla 125 fresco
X X X X X X X 85429plusmn582 49367plusmn5112
Semilla 287 fresca
X X X X X X X 105261plusmn33 22781plusmn2037
Semilla 301 fresca
X X X X X X X X X 109134plusmn133 36154plusmn1957
Es de suma importancia mencionar que en todas las muestras de aceite y de semilla
de chiacutea existieron sentildeales en la regioacuten de los compuestos fenoacutelicos que debido a la
falta de estaacutendares no pudieron ser identificados
90
Sin embargo debe tomarse en cuenta que dichas sentildeales nos indican la presencia
de distintos compuestos fenoacutelicos que le confieren cierta capacidad antioxidante y
contenido de fenoles totales
Puede observarse que el aceite 301 es el que contiene una mayor capacidad
antioxidante y un mayor contenido de compuestos fenoacutelicos identificados con 4
compuestos curiosamente no resultoacute ser el de mayor valor de fenoles totales en lo
que respecta a la semilla de chiacutea sucedioacute algo similar la semilla que contiene una
mayor capacidad antioxidante fue la 125 sin embargo el contenido de fenoles
totales resultoacute ser el menor un comportamiento similar al que se presentoacute en los
extractos de aceite La semilla con mayor contenido de compuestos fenoacutelicos
identificados mediante EC fue la semilla 301 con 9 compuestos aunque como se
mencionoacute anteriormente existieron compuestos fenoacutelicos que no se identificaron por
falta de estaacutendares de polifenoles
En el aceite 301 fue en el que se logroacute identificar el mayor nuacutemero de compuestos
fenoacutelicos con 4 siendo este aceite el que mostroacute la mejor capacidad antioxidante
aunque no fue el que contuvo mayor cantidad de fenoles totales esto es ocasionado
posiblemente por el efecto sineacutergico que existe entre los compuestos fenoacutelicos Por
el comportamiento anteriormente descrito seriacutea interesante determinar la capacidad
antioxidante de cada uno de los estaacutendares a utilizar en futuros trabajos y en
mezclas de los mismos ya que la sinergia que existe entre los distintos compuestos
fenoacutelicos juega un papel fundamental en la determinacioacuten de la capacidad
antioxidante
Los fenoles en los extractos de aceite y semilla de chiacutea separados e identificados
mediante electroforesis capilar en general no coincidieron con un reporte hecho por
taga et al en 1984 en el cual reporta aacutecido cafeico aacutecido clorogeacutenico miricetina
quecetina y kaempferol no obstante no puede ser del todo comparable ya que en
dicho trabajo no se menciona de que regioacuten de Meacutexico provino dicha semilla
ademaacutes de que el meacutetodo de identificacioacuten no es comparable al utilizado en el
presente trabajo
91
Es importante mencionar que trataacutendose de semillas la composicioacuten quiacutemica de sus
metabolitos estaacute determinada casi siempre por el suelo donde se cultiva y en algunos
casos tambieacuten por el genotipo de la misma es por ello la importancia de saber de
doacutende proviene dicho alimento de lo contrario resulta complicado la comparacioacuten de
resultados de diferentes trabajos aunado a esto en lo que respecta a la identificacioacuten
de compuestos fenoacutelicos presentes en la semilla de chiacutea no existen artiacuteculos con los
cuales se pueda comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo cabe
mencionar que esta situacioacuten fue una de las razones por las cuales se planteoacute esta
investigacioacuten ademaacutes de que en diferentes estudios realizados se han reportado las
excelentes cualidades nutricionales entre las cuales destacan el contenido de fibra
proteiacutenas aacutecidos grasos Ω 3 y 6 y antioxidantes de este alimento y que sin exagerar
puede ser considerado el alimento funcional por excelencia
92
5 CONCLUSIONES
La electroforesis capilar resultoacute ser una teacutecnica eficiente raacutepida y
econoacutemica de anaacutelisis y aplicable a cualquier tipo de muestra y en
especiacutefico a alimentos
El tiempo de almacenamiento de los extractos de aceite y semilla de chiacutea
es determinante para un resultado confiable ya que en el presente
trabajo se observoacute que despueacutes de 120 diacuteas de almacenamiento la
totalidad de compuestos fenoacutelicos se degradan esto es posiblemente
ocasionado por el alto contenido de aacutecidos grasos poliinsaturados que
contiene la chiacutea y los cuales aceleran la oxidacioacuten del misma
El estudio del contenido de fenoles totales en la semilla de chiacutea
desgrasada y en aceite extraiacutedo con hexano mostroacute que la mayor
cantidad de compuestos fenoacutelicos se mantuvieron en la fraccioacuten
desengrasada y no en el aceite
El contenido de fenoles totales de la semilla de chiacutea desengrasada
mostroacute valores por encima de algunos frutos que se consideran suacuteper-
frutos como la uva roja y fresa
El contenido de fenoles totales del aceite de chiacutea en promedio (58 mg
aacutecido gaacutelico100 g de muestra) resultoacute ligeramente inferior al del aceite
de olivo (155 mg aacutecido gaacutelico100 g de muestra)
Con relacioacuten a la capacidad antioxidante total medida por el meacutetodo del
ABTS la fraccioacuten desengrasada de la semilla de chiacutea
independientemente del tipo de semilla mostroacute una potente capacidad
antioxidante mientras que los extractos de aceite mostraron una
capacidad antioxidante menor
93
El aceite que mostroacute mejor contenido de antioxidantes fue el 301
proveniente de la semilla del estado de Puebla a pesar de no ser el que
contiene mayor contenido de fenoles totales fue el que mostroacute una
mejor capacidad antioxidante y el que contuvo mayor contenido de
compuestos fenoacutelicos al analizarse mediante electroforesis capilar
Por su parte la semilla 125 del estado de Puebla fue la semilla que se
considera la de mejor capacidad antioxidante y un buen contenido de
compuestos fenoacutelicos detectados mediante electroforesis capilar
Al igual que en muchos estudios se comprueba que el contenido de
compuestos fenoacutelicos estaacute determinado por el suelo donde se cultiva la
semilla y por el mismo genotipo de la misma semilla el cual determina la
composicioacuten quiacutemica del alimento
En general la capacidad antioxidante total de las 4 muestras de semilla
de chiacutea desengrasada mostraron valores por arriba de algunos frutos
como granada y del kiwi valores muy cercanos a la frambuesa cereza y
manzana roja
Lo anterior convierte a la semilla de chiacutea en un excelente complemento
en la dieta diaria para poder satisfacer la ingesta diaria de antioxidantes
94
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