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CARPETA DE MESA Área Microbiología
DOCENTES:
Dr. Pedro Soto
Dra. Cristina Monteavaro
Vet. Enriqueta Bottini
Vet. M. Laura Doumecq
Lic. Claudio Cacciato
Ayud. Facundo De Marco
1
Contenido
Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología ............................................... 3
Acceso ............................................................................................................... 3
Protección personal ............................................................................................ 3
Procedimientos ................................................................................................... 4
Características del diseño del laboratorio .......................................................... 5
Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo ............ 6
Mechero de Bunsen ........................................................................................... 7
Soluciones de uso corriente en el Laboratorio ................................................... 8
Conservación de portaobjetos y cubreobjetos.................................................... 8
Desinfectante para mesadas .............................................................................. 8
Descarte de portaobjetos ................................................................................... 8
Frasco “Cementerio” .......................................................................................... 8
Autoclave............................................................................................................ 9
Cultivo en anaerobiosis .................................................................................... 10
Medios de cultivo .............................................................................................. 11
Medidas de crecimiento ................................................................................... 12
Curva de crecimiento ....................................................................................... 12
Siembra en medio líquido ................................................................................. 13
Siembra en medio sólido .................................................................................. 14
Siembra en medio semisólido .......................................................................... 15
Siembra en medios inclinados (pico de flauta) ................................................. 16
Métodos alternativo de Siembra ....................................................................... 17
Metodología para la realización de extendidos ................................................ 18
Partes del microscopio óptico compuesto ........................................................ 19
Morfología bacteriana ....................................................................................... 20
Tamaños relativos de las células ..................................................................... 21
Morfología de colonias bacterianas .................................................................. 22
Crecimiento en medio semisólido ..................................................................... 23
Crecimiento en agar inclinado .......................................................................... 23
Crecimiento en caldo nutritivo .......................................................................... 24
Clasificación de las bacterias según requerimiento de oxígeno ....................... 24
Técnicas para la observación microscópica ..................................................... 25
Tinción de Gram-Hucker .................................................................................. 25
Observación microscópica en fresco partir de medios líquidos ....................... 25
2
Clasificación moderna del Reino Fungi ............................................................ 26
Eumycetes........................................................................................................ 26
Identificacion de Hongos .................................................................................. 27
Diagnóstico de laboratorio de las Micosis…………………………………………28
Diagnóstico micológico directo para MICOSIS SUPERFICIALES: ................... 29
Diagnóstico micológico directo para MICOSIS PROFUNDAS: ........................ 30
Diagnóstico micólogico para LEVADURAS: ..................................................... 31
Parámetros para la descripción de colonias de hongos ................................... 32
Anexo: Tablas de Identificación ........................................................................ 33
3
Bioseguridad en el Laboratorio de
Microbiología
Acceso
1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico
deberá colocarse en las puertas de los locales donde
se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o
superior.
2. Sólo podrán entrar en las zonas de trabajo del
laboratorio el personal autorizado.
3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas.
4. No se autorizará ni permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del
laboratorio.
5. El acceso a los locales que alberguen animales será con la autorización
correspondiente.
6. No se permitirá el acceso al laboratorio de animales que no sean objeto del
trabajo del laboratorio.
Protección personal
1. Se usarán en todo momento delantal, batas o uniformes especiales para el
trabajo en el laboratorio.
2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos
que puedan entrañar contacto directo o accidental con sangre, líquidos
corporales y otros materiales potencialmente infecciosos o animales infectados.
Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y a continuación
se lavarán las manos.
3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y
animales infecciosos, así como antes de abandonar las zonas de trabajo del
laboratorio.
4
4. Se usarán gafas de seguridad, máscaras u otros dispositivos de protección
cuando sea necesario proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y
fuentes de radiación ultravioleta artificial.
5. Estará prohibido usar las prendas protectoras fuera del laboratorio, por
ejemplo en comedor universitario, cafeterías, oficinas, bibliotecas, salas para el
personal y baños.
6. No se usará calzado sin puntera.
7. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar
cosméticos o manipular lentes de contacto.
8. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en
las zonas de trabajo del laboratorio.
Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. No se colocará ningún material en la boca.
3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca
al mínimo la formación de aerosoles.
4. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a
materiales infecciosos se comunicarán al docente a cargo del laboratorio. Se
mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes.
5. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los
derrames.
6. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos
o físicos) antes de eliminarlos por el desagüe. Puede ser necesario un sistema
de tratamiento de efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del
agente con el que se esté trabajando.
7. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de
la contaminación mientras se encuentren en éste.
5
Características del diseño del laboratorio
1. Se dispondrá de espacio suficiente para realizar el trabajo de laboratorio en
condiciones de seguridad y para la limpieza y el mantenimiento del mismo.
2. Las paredes, techos y pisos serán lisos, fáciles de limpiar, impermeables a
los líquidos y resistentes a los productos químicos y desinfectantes
normalmente utilizados en el laboratorio. Los pisos serán antideslizantes.
3. Las superficies de trabajo serán impermeables y resistentes a
desinfectantes, ácidos, álcalis, solventes orgánicos y calor moderado.
4. La iluminación será adecuada para todas las actividades. Se evitarán los
reflejos y brillos molestos.
5. El mobiliario debe ser robusto y debe quedar espacio entre mesas, armarios
y otros muebles, así como debajo de los mismos, a fin de facilitar la limpieza.
6. Habrá espacio suficiente para guardar los artículos de uso inmediato,
evitando así su acumulación desordenada sobre las mesas de trabajo y en los
pasillos.
7. Se preverán espacio e instalaciones para la manipulación y el
almacenamiento seguros de solventes, material radiactivo y gases comprimidos
y licuados.
8. En cada sala del laboratorio habrá lavabos, a ser posible con agua corriente,
instalados de preferencia cerca de la salida.
9. En el nivel de bioseguridad 2 se dispondrá de una autoclave u otro medio de
descontaminación debidamente próximo al laboratorio.
10. Los sistemas de seguridad deben comprender medios de protección contra
incendios y emergencias eléctricas, así como duchas para casos de urgencia y
lavaojos.
6
Clasificación de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo
Principios generales Teniendo en cuenta el grado de riesgo potencial de los agentes infecciosos con
que se trabaja, la OMS ha establecido 4 Grupos de Riesgo. Ellos constituyen
una guía general ya que cada país puede hacer su propia clasificación teniendo
en cuenta los huéspedes del agente, el modo de transmisión, la patogenicidad
del agente, la existencia de medidas preventivas y/o tratamiento efectivo, etc.
Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades
en el ser humano o los animales. Ejemplos: E. coli, Bacillus cereus, Virus
distemper canino.
Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales
pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el
personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La
exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es
limitado. Ejemplos: Staphylococus spp., Streptococus spp., Clostridium spp.,
Salmonella thyphi, Listeria monocytogenes.
Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales
graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Ejemplos: Brucella spp.,
Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia spp., Virus de la Rabia.
Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser
humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro,
directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y
terapéuticas eficaces. Ejemplos: Virus de Junín, Virus Lassa, Virus de la fiebre
aftosa, Virus Machupo.
7
Mechero de Bunsen
8
Soluciones de uso corriente en el
Laboratorio
Conservación de portaobjetos y cubreobjetos
Se colocan limpios en un frasco de vidrio con tapa a rosca y se cubren con
alcohol 96°.
Desinfectante para mesadas
Alcohol 70 %
Por cada 1000 mL de alcohol
Alcohol 96°……….. 700 mL
Agua destilada…… 300 mL
Descarte de portaobjetos
Se descartan en frascos de vidrio con tapa a rosca con solución Sulfocrómica.
Por cada 1000 mL de solución:
Bicromato de potasio……. 10 g
Agua corriente……………. 900 mL
Ácido sulfúrico……………. 100 mL
Luego sigue el proceso habitual de lavado y secado.
Frasco “Cementerio”
Son frascos de vidrio, grandes y de boca ancha, con algodón en el fondo y que
contienen una solución de hipoclorito de sodio (lavandina) al 10%.
Se utilizan para descartes de pipetas, trozos de algodón, tapones, hisopos,
filtros descartables, capilares, tips, etcétera.
9
Autoclave
10
Cultivo en anaerobiosis
11
Medios de cultivo
Composición química
Deben contener nutrientes mínimos:
Una fuente de Carbono
Una fuente de Nitrógeno y Azufre
Sales y Agua
Clasificación
Según sus cualidades físicas, se distinguen:
Líquidos o Caldos
Semisólidos (agar al 0,3%)
Sólidos (agar al 1,5%)
Según su origen:
Naturales
Sintéticos
Semisintéticos
Según su criterio de uso:
Medio mínimo, nutritivo o común: Agar nutritivo, agar tripteina soya, agar
columbia
Medio enriquecido: Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar Suero
Medio selectivo y diferenciales: Agar Manitol Salado, Agar Mac-Conkey.
Eosin Metilen Blue (EMB)
Medio especial: Agar PPLO, Agar Lowestein-Jensen, Agar Stonebrink, Agar
Edwards, Agar Baird-Parker, Fletcher, etc.
Medio especial para anaerobios: Caldo Tarozzi (hígado), Caldo Hibbler
(cerebro), caldo Tioglicolato
Medio de enriquecimiento: Caldo Selenito, Caldo tetrationato.
Medio de transporte (sin nutrientes): Stuart, Amnies, Cary Blair
12
Medidas de crecimiento
DIRECTOS:
Recuento de partículas (electrónico – microscópico)
INDIRECTOS
Recuento de colonias: UFC/mL
Turbidimetría
Pesada (húmedo – seco)
Determinación del Nitrógeno total
Curva de crecimiento
[Escriba una cita del
documento o el resumen de
un punto interesante. Puede
situar el cuadro de texto en
cualquier lugar del
documento. Use la ficha
Herramientas de dibujo para
cambiar el formato del
cuadro de texto de la cita.]
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Tiempo (horas)
13
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Metodología para la realización de
extendidos
Coloque 1 ó 2 gotas de solución fisiológica
Fijación para coloración de Gram, Ziehl
Neelsen, Scheafer Fulton, Azul de Metileno
19
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20
Morfología bacteriana
Bacilos incurvados
Bacilos Cocos
21
Tamaños relativos de las células
22
Morfología de colonias bacterianas
23
Crecimiento en medio semisólido
Crecimiento en agar inclinado
Filiforme Velloso Arborescente
Filiforme Difuso Arborescente Rizoide
24
Crecimiento en caldo nutritivo
Clasificación de las bacterias según
requerimiento de oxígeno
Anillo Película Flóculo Turbidez
Aerobio
estricto Aerobio
Anaerobio
facultativo
Anaerobio
Aerotolerante
Anaerobio
estricto
………………
Enzimas Presentes
Microaerófilo
(Bajos niveles)
25
Técnicas para la observación
microscópica
Tinción de Gram-Hucker Previo a la coloración, realizar el extendido y fijar con calor. Detallado en
página 18.
1. Cubrir el extendido con Cristal Violeta durante un minuto
2. Lavar con agua destilada bajo chorro suave
3. Cubrir con Lugol (solución yodo-iodurada) durante un minuto
4. Lavar con agua destilada bajo chorro suave
5. Decolorar con Alcohol-Acetona hasta que no desprenda colorante Violeta
6. Lavar rápidamente con agua destilada bajo chorro suave (de lo contrario,
continua la decoloración)
7. Cubrir el extendido con Safranina o Fucsina durante un minuto
8. Lavar con agua destilada bajo chorro suave
9. Dejar secar y luego ver al microscopio
Observación microscópica en fresco partir de medios
líquidos 1. Preparar un portaobjeto y un cubreobjeto limpios y secos
2. Colocar en el portaobjeto una anzada de cultivo líquido
3. Colocar encima el cubreobjeto
4. Observar al microscopio óptico con objetivo seco (10x, 20x, 40x) y con
condensador de fondo oscuro.
1. Aplicación de
cristal violeta 2. Aplicación de
Lugol (mordiente)
3. Aplicación de
alcohol-acetona
(decolorante)
4. Aplicación de
safranina
26
Clasificación moderna del Reino Fungi
Eumycetes
Clase Zygomycetes
Mohos de micelio filamentoso cenocítico. Reprod. asexual
por esporangios. Reprod. sexual por Zigosporas.
Clase Ascomycetes
Mohos de micelio filamentoso tabicado y micelio unicelular
(levaduras). Reprod. asexual por conidios. Reprod. sexual
por ascosporas en el interior de ascos.
Clase Basidiomycetes
Mohos de micelio filamentoso tabicado y micelio unicelular
(levaduras). Reprod. sexual por basidiosporos.
Clase Deuteromycetes
Mohos de micelio filamentoso tabicado y micelio unicelular
(levaduras). Reproducción asexual por conidios. Reprod.
sexual, si se encuentra puede ser por ascosporos o
basidiosporos.
27
Identificacion de Hongos
Desarrollo in vitro:
Estudio del tipo de colonia
Estudio del tipo de micelio
Estudio de las esporas de reproducción
Tipo de desarrollo (si posee estructuras
especiales en el micelio)
DIAGNOSTICO de LABORATORIO de las MICOSIS:
DIAGNOSTICO ANATOMOPATOLOGICO
DIAGNOSTICO MICOLOGICO
La Identificación de los hongos se basa en la
morfología de colonias, la morfología de las
estructuras microscópicas y las lesiones producidas.
La Identificación de GÉNERO y ESPECIE FÚNGICA
es por estudio de los caracteres
MACROMORFOLOGICOS y MICROMORFOLOGICOS.
28
Diagnóstico de laboratorio de las micosis:
DIAGNOSTICO ANATOMOPATOLOGICO
DIAGNOSTICO MICOLOGICO
Diagnóstico micológico
INDIRECTO (Serología)
DIRECTO (Caracteres Morfológicos) :
Macromorfológicos
Micromorfológicos
29
Diagnóstico micológico directo para MICOSIS
SUPERFICIALES:
MUESTRAS: Escamas, Pelo, Uñas.
MICROSCOPIA DIRECTA Con K(OH) al 40%
CULTIVO Medios: Sabouraud, Lactrimel, Agar Papa.
con y sin ATB, por 21 días a 28ºC.
CARACTERES MACROMORFOLÓGICOS:
Morfología de Colonias
CARACTERES MICROMORFOLÓGICOS:
(coloración vital) MICROSCOPIA con AZUL de
LACTOFENOL o GUEGUEN
30
Diagnóstico micológico directo para MICOSIS
PROFUNDAS:
MUESTRAS: Exudado, pus de absceso, biopsias,
hisopados, LCR)
MICROSCOPIA DIRECTA con sol. fisiológica
con azul de lactofenol o gueguen.
CULTIVO Medios: Sabouraud, Lactrimel, Agar Papa.
con y sin ATB, por 21 días a 28ºC y 37ºC.
CARACTERES MACROMORFOLÓGICOS:
Morfología de Colonias
CARACTERES MICROMORFOLÓGICOS:
(coloración vital) MICROSCOPIA con AZUL de
LACTOFENOL o GUEGUEN
31
Diagnóstico micólogico para LEVADURAS:
MUESTRA
MICROSCOPIA DIRECTA con sol. fisiológica
Tinción (Giemsa, Gram)
CULTIVO Medios: Sabouraud, Lactrimel, Agar
Sangre.
Incubación en aerobiosis 28 y 37ºC (hongos
dimórficos).
MORFOLOGIA DE COLONIAS para LEVADURAS
Caracteres Macromorfológicos: forma, tamaño,
pigmento.
Caracteres Micromorfológicos (observación
microscópica con Azul de Lactofenol): morfología,
brotación, tubo germinal, filamentación, pseudohifa.
Pruebas Nutricionales:
Fermentación de hidratos de carbono
Utilización de fuentes de nitrógeno
Zimograma
Con los caracteres micro y macromorfologicos, utilizar las
tablas de identificación, para arribar a GÉNERO y
ESPECIE.
32
Parámetros para la descripción de
colonias de hongos
LEVADURAS
TAMAÑO: diámetro en mm
ASPECTO DEL ANVERSO: húmeda/ seca- brillante/
opaca – membranosa – mucoide – elevada - plana-
convexa – lisa – cerosa – rugosa - cerebriforme.
MOHOS
TAMAÑO: diámetro en cm
ANVERSO:
COLOR
ASPECTO: lanosa – terrosa- flocosa- aterciopelada –
algodonosa – “de peluche” - granulosa – cerosa –
plegada
(Observar periferia, a veces radiada, desflecada)
REVERSO:
COLOR
ASPECTO: liso – radiado – plegado.
33
An
ex
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