CEEA_Tecnicas - Ratas Para Investigacion

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MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACION

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGA

CEEA

Tcnicas de obtencin e inoculacin de muestras

A. Tcnicas de obtencin de muestras1. A 2. A 3. A 4. A 5. A Extraccin de sangre de vena mandibular Extraccin de sangre de seno retro-orbital Biopsia de cola Marcaje en orejas Perfusin in vivo

B. Tcnicas de inoculacin de muestras1. B 2. B 3. B 4. B 5. B 6. B Inoculacin Subcutnea Inoculacin Intraperitoneal Inoculacin Intramuscular Inoculacin Intradrmica Inoculacin Intravenosa Inoculacin en Almohadillas Plantares

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Tcnica n1.A

Extraccin de sangre de Vena Mandibular

Anestesia: No requerida Material: Aguja 19 21 G Volumen de extraccin: Consultar Tabla I Descripcin de la tcnica: 1. Sujetar firmemente al ratn de manera que la cabeza quede alineada con el cuerpo, es decir, que no est inclinada hacia el trax o hacia los lados. 2. Comprimir ligeramente los vasos del cuello del lado opuesto al que se va a realizar la puncin. 3. Localizar la pequea zona circular desprovista de pelo situada centralmente en la mandbula inferior (puede no estar presente en algunas cepas). 4. Con una aguja de 19-21 G, dependiendo de la edad y/o tamao del ratn, realizar la puncin (inclinando dorsalmente la aguja 1-2 mm) en la zona anteriormente descrita. La profundidad ptima es de 2-3 mm. 5. Recoger la sangre en el recipiente adecuado teniendo en cuenta que el flujo ser de aproximadamente una gota (20 l) por segundo. 6. Una vez obtenida la muestra liberar al ratn. El sangrado se detendr automticamente.

http://www.univ.trieste.it/~servpoli/stabpst.m1v Tcnica n2.A Extraccin de sangre de Seno Retro-orbital

Anestesia: Obligatoria Material: Capilares tratados con anticoagulante (EDTA, heparina) Restricciones: Esta tcnica debe ser llevada a cabo nicamente cuando no exista mtodo alternativo y siempre por personal cualificado debido al elevado riesgo de daar estructuras adyacentes al globo ocular, lo que puede originar infecciones severas, ceguera etc Volumen de extraccin: Consultar Tabla I Descripcin de la tcnica: 1. Una vez anestesiado el ratn y comprobado que se ha alcanzado el plano quirrgico, sujetar al ratn estirando la piel del cuello hacia atrs asegurndose de no dificultar la respiracin 2. Insertar el capilar en el ngulo externo del ojo (2 mm aprox) y girar suavemente hasta que la sangre fluya por el mismo. 3. Recoger la muestra y retirar el capilar. 4. Oprimir ligeramente la zona de puncin con una gasa o papel para detener la hemorragia. 5. Aplicar pomada oftlmica (Lubrifilm) al ojo. 6. Comprobar que la recuperacin de la anestesia se produce adecuadamente aportando las medidas que se consideren necesarias para ello (i.e , aporte de calor )CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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7. Observar al animal los das posteriores al sangrado para detectar la aparicin de posiblescomplicaciones: protrusin de tejido adyacente al ojo, infecciones, hemorragias

Fig. 1

Tcnica n 3. A

Biopsia de cola

Anestesia: En funcin de la edad y seccin de cola que se quiera obtener. Material: Escalpelo, tijeras o cauterizador elctrico. Longitud mxima de la muestra: 5 mm Requerimientos:

1. La longitud mxima a cortar es de 5 mm. De este fragmento se obtienen unos 50 g deDNA, suficiente para mltiples ensayos de genotipado. Muestras mayores a 5 mm requerirn autorizacin expresa del Comit tico del centro. 2. La edad ptima para la realizacin de este procedimiento es de 15 a 21 das, antes de la calcificacin de las ltimas vrtebras. 3. Requerimientos de anestesia: - Ratones de menos de 28 das: anestesia no requerida. - Ratones de ms de 28 das: anestesia requerida para muestras de ms de 2 mm - Segunda biopsia: anestesia requerida independientemente de la longitud de la muestra a tomar. 4. Este procedimiento no debe ser desarrollado ms de dos veces en el mismo ratn sin permiso del Comit tico de Experimentacin Animal. Descripcin de la tcnica: 1. Inmovilizar al ratn en una mano o bien introducirlo en los cepos destinados a tal efecto. 2. Con las tijeras (previamente esterilizadas en llama), el escalpelo o cortacolas elctrico, seccionar 2 mm de la cola. 3. Presionar la zona del corte con papel para detener la hemorragia. 4. No devolver al ratn a su jaula hasta comprobar que el sangrado se detiene completamente.CORREO ELECTRNICO: CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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Tcnica n4. A

Marcaje por muescas en orejas

Anestesia: No requerida Material: Marcador de orejas Descripcin de la tcnica: 1. Inmovilizar al ratn con una mano de modo que las orejas queden perfectamente accesibles. 2. Proceder al marcado siguiendo el cdigo de marcaje elegido. En nuestro caso, el cdigo de marcas en las orejas es el siguiente: - En la oreja derecha del ratn se marcan invariablemente las unidades, desde el 1 en la zona de la oreja ms prxima al hocico, hasta el 4 en la parte ms craneal de la misma. El 2 y 3 se marcan a ambos lados de la lnea imaginaria que divide a la oreja en dos desde la zona ms interna a la ms externa; el 2 de la lnea hacia abajo (hocico) y el 3 de la lnea hacia arriba: - Los nmeros mayores de 4 se marcan segn las combinaciones siguientes: 5=4+1 6=4+2 7=4+3 8=4+3+1 9=4+3+2 Las decenas se marcan en la oreja izquierda del ratn siguiendo la misma disposicin que las unidades, es decir, desde la zona de la oreja ms prxima al hocico del animal (10) a la ms craneal (40), siendo las combinaciones para formar el 50, 60, 70, 80, y 90 exactamente igual que las utilizadas para las unidades (50 = 40 + 10 etc)

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Tcnica n 5. A

Perfusin in vivo

Anestesia: Requerida. Ketamina / Xilacina (150mg/kg : 10mg/kg), Avertina, Pentobarbital etc Material: Solucin de lavado (PBS 1x o Solucin salina) Solucin de fijado (PFA 4%, Formaldehdo 10%...) Aparato de perfusin, jeringuillas o bomba peristltica. Agujas: 22G para ratn, 20G para rata. Volmenes: Solucin de lavado: 10-25 ml (ratn) 50-100 ml (rata) Solucin de fijado: 50-100 ml (ratn) 400-600 ml (rata) Restriccin: Debido a la utilizacin de productos txicos como el formaldehdo, este procedimiento deber llevarse a cabo en una cabina de qumicos. Descripcin de la tcnica: 1. Una vez anestesiado el ratn y alcanzado el plano quirrgico (ausencia de reflejo podal) colocarlo en posicin decubito supino sobre una placa/rejilla adecuada para la recogida de los lquidos de lavado y fijacin. 2. Estirar y sujetar las extremidades. 3. Lavar la superficie del ratn con etanol 70 4. Realizar un corte en la piel a la altura del final del esternn, separar la piel y cortar las costillas en paralelo a los pulmones para exponer el corazn. 5. Insertar la aguja, bien de la jeringuilla o bien de la botella (en caso de utilizar el aparato de perfusin) que contiene la solucin de lavado, en el ventrculo izquierdo y profundizarCORREO ELECTRNICO: CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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hasta alcanzar la aorta clampando la aguja a este nivel segn se ve en el esquema siguiente: En ratones puede ser muy difcil clampar la aorta por lo que la aguja deber mantenerse sujeta mientras se realiza la perfusin.

6. Realizar una incisin en la aurcula derecha para permitir el escape de la circulacin de retorno de los lquidos de lavado. 7. Proceder al lavado con la solucin salina o PBS 1x. La velocidad de perfusin de los lquidos de lavado influir en la correcta fijacin de los rganos estimndose un tiempo mnimo de 10-20 min en ratn y 10 a 30 min en rata para los volmenes anteriormente especificados. En el caso de utilizar el sistema de perfusin por gravedad, la altura a la que deben situarse las botellas con los lquidos de lavado y fijacin es de 100 a 120 cm sobre el animal. 8. Proceder a la perfusin de la solucin de fijado 9. Una vigorosa contraccin muscular es indicativa de la correcta fijacin del animal. En este momento retirar la aguja y proceder a la extraccin de los rganos deseados.

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Tcnica n 1. B

Inoculacin Subcutnea (SC o SQ)

Anestesia: No requerida Material: Aguja 25G (ratn y rata) Volumen mximo: 2-3 ml (ratn) 5-10 ml (rata) Inoculaciones mximas: 2-3 inoculaciones por da pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7). Consultar Anexo 2. Descripcin de la tcnica:

1. Depositar al ratn sobre la rejilla permitindole agarrarse a ella con las patas delanteras y2. 3. 4. 5. 6. 7. levantar la piel de la espalda con los dedos ndice y pulgar tal y como se muestra en la figura 2. De igual manera puede hacerse en la regin inter-escapular. Insertar la aguja en la base de la zona de piel que estamos sujetando manteniendo la aguja paralela al cuerpo del ratn para evitar inocular en capas inferiores a la piel. Aspirar ligeramente para asegurarnos de no haber penetrado en algn vaso sanguneo. Inyectar el volumen de muestra a una velocidad moderada. Retirar la aguja y presionar la piel en la zona de inyeccin para evitar que el fluido salga por el punto de piel perforada. Observar que no se produce sangrado. Debido a que la muestra se deposita en la zona subcutnea, y si sta se ha desarrollado correctamente, podremos observar la formacin de un abultamiento en el lugar de inyeccin que ir desapareciendo a medida que el fluido es dispersado.

Fig. 2

Tcnica n 2. BCORREO ELECTRNICO:

Inoculacin Intraperitoneal (IP)CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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Anestesia: No requerida Material: Aguja 27-25G (ratn) 25-23G (rata) Volumen mximo: 2-3 ml (ratn) 5-10 ml (rata) pH inoculacin: Consultar Anexo 2. Descripcin de la tcnica: 1. Con el ratn correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento durante el procedimiento) inclinarlo caudalmente y trazar una lnea imaginaria que cruce su abdomen transversalmente justo sobre sus rodillas tal y como se muestra en la figura 3 (lnea negra). 2. La aguja deber ser insertada sobre esta lnea, en el lado derecho del animal y lo ms cercano posible a la lnea que divide longitudinalmente el abdomen (lnea roja). De esta manera disminuimos el riesgo de inyectar en ciego o vejiga urinaria. 3. La aguja debe alcanzar una profundidad de aproximadamente medio centmetro (ratn) y debe insertarse con una inclinacin de unos 30 con respecto a la superficie del abdomen. 4. Aspirar para asegurarse de que no se ha alcanzado ningn vaso sanguneo, ciego o vejiga urinaria. 5. Si ningn fluido es aspirado, proceder a la inyeccin de la muestra. 6. Retirar la aguja y presionar ligeramente la zona de inyeccin.

Fig. 3

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Tcnica n 3. B

Inoculacin Intramuscular (IM)

Anestesia: No requerida. Material: Aguja 27G (ratn) 25G (rata) Lugar de inoculacin de eleccin: Cuadriceps Volumen mximo: 50 l por sitio de inyeccin (ratn) 300 l por sitio de inyeccin (rata) Inoculaciones mximas: 2 inoculaciones por da pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7). Consultar Anexo 2. Descripcin de la tcnica: 1. Pueden ser necesarias dos personas para el correcto procedimiento de esta tcnica, una para sujetar al animal y otra para la inoculacin. 2. Sujetar firmemente la pata trasera del animal y proceder a la insercin de la aguja en el sitio de inoculacin. 3. Aspirar ligeramente para asegurarse de que no se ha perforado ningn vaso sanguneo. 4. El contenido de la jeringuilla debe ser expelido muy lentamente y la zona de inyeccin masajeada cuidadosamente una vez realizada la inoculacin.

Fig. 4

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Tcnica n 4. B

Inyeccin Intradrmica (ID)

Anestesia: No requerida, pero facilita el procedimiento. Material: Aguja 27G (ratn y rata) Lugar de inoculacin de eleccin: Zona dorsal Volumen mximo: 50-100 l por sitio de inyeccin (ratn y rata) Inoculaciones mximas: 6 sitios de inoculacin pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7).Consultar Anexo 2. Descripcin de la tcnica:

1. La aguja debe ser mantenida casi paralela a la superficie de la piel y avanzarcuidadosamente unos pocos milmetros dentro de ella. 2. Si se nota una perdida de resistencia al paso de la aguja es que habremos pasado a la capa subcutnea. En este caso, retirar la aguja y proceder de nuevo a la inoculacin. 3. Realizar una ligera rotacin de la aguja despus de la inoculacin y justo antes de extraerla ayudar a minimizar la prdida de compuesto inyectado.

Fig. 5

Tcnica n 5. B

Inoculacin Intravenosa (IV)

Anestesia: No requerida Material: Aguja 27G (ratn y rata) Lugar de inoculacin: Vena lateral de la cola Volmenes recomendados: 200 l -300 l (ratn) 500 l (rata). Consultar Tabla II. pH inoculacin: Consultar Anexo 2. Descripcin de la tcnica:

1. Antes de realizar la inyeccin es conveniente inducir la vasodilatacin de la vena parafacilitar su canulacin. Para ello puede recurrirse a la utilizacin de lmparas de infrarrojos (evitando que incida directamente sobre los ojos del animal o causarle quemaduras por exposicin excesiva), inmersin de la cola en agua caliente ( T no superior a 43C) o utilizacin de agentes vasodilatadores (como Xilacina o Acepromacina). 2. Las venas laterales se localizan a ambos lados de la lnea central de la cola y muy superficialmente de manera que la inyeccin debe hacerse prcticamente paralela a la superficie (figura 6)CORREO ELECTRNICO: CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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3. Si aparece sangre al aspirar, la colocacin de la aguja ser la adecuada. De todas formas es fcil comprobar que hemos accedido a la vena ya que, si la aguja ha sido alojada en el lumen de la vena, no se apreciar resistencia al presionar el mbolo de la jeringuilla de modo que la muestra fluir sin dificultad en el torrente sanguneo. 4. Una vez inoculada la muestra retirar la aguja y presionar la zona de inyeccin con un algodn para detener la hemorragia.

Fig. 6

Tcnica n 6. B

Inoculacin en Almohadillas Plantares

Anestesia: Puede ser requerida si la inoculacin la realiza una nica persona. Material: Agujas 27-30G (ratn) 27G (rata) Volmenes mximos de inyeccin: 50 l (ratn) 100 l (rata) pH de inoculacin: Fisiolgico (aporx. 7) Restricciones: Solo se utilizar esta va de administracin en aquellos casos en los que el resto de rutas de inoculacin se hayan comprobado no efectivas. Consideraciones especiales:

1.2. 3. 4.

Inocular en dos patas interfiere con la locomocin, por ello nunca se inocular en ms de una pata por animal. Limitar el volumen y concentracin del inculo a los mnimos posibles. Los animales no deben ser alojados en jaulas desprovistas de viruta (tipo jaulas metablicas). La monitorizacin del sitio de inyeccin deber ser tan frecuente como sea necesario para detectar de inmediato reacciones adversas que puedan impedir el acceso del animal a agua y comida. En caso de aparicin de las mismas se proceder con el protocolo de Determinacin del Punto Final previsto.

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Anexo 1 Tabla I. Volmenes de extraccin de sangre.Tabla I.A. Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante) Extraccin nica Extracciones mltiples

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% Vc extrado 7.5 %

Perodo de recuperacin 1 semana

% Vc extrado en 24h 7.5 %

Perodo de recuperacin 1 semana

10 %

2 semanas

10 %

2 semanas

15 %

4 semanas

15 %

3 semanas

Vc: Volumen circulanteVc ratn: 72 ml/kg Vc rata: 68 ml/kg

Tabla I.B. Volmenes de extraccin referidos a Vt (Volumen total)

Extraccin de sangreV t (ml) Ratn (25g) 7.5 % (ml) 0.1 10 % (ml) 0.2 15 % (ml) 0.3 20 % (ml) 0.4CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

1.8

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Rata (250g)

16

1.2

1.6

2.4

3.2

Vt: Volumen total: aprox. 6% del peso (en ml)

Tabla II. Volmenes de inoculacin. Rutas y volmenes de administracin (ml/kg excepto *ml/sitio) oral SC IP IM 0.05* (0.1)* 0.1* (0.2)* IV IV Bolus Perf. 5 5 (25) (20)

Ratn 10 (50)10 (40)20 (80) Rata 10 (40) 5 (10) 10 (20)

() Volmenes mximos - No ms de 2 inoculaciones IM por da - No ms de 2 3 inoculaciones SC por da - IV : no exceder 4% volumen circulante (bolus) o 4 ml/kg/h en perfusin

Anexo 2Se recomienda un rango de pH de trabajo de 4,5-8 (Waynforth and Flecknell, 1992) teniendo en cuenta que el grado de tolerancia de pH para las diferentes vas de administracin es:

Va oral > Va intravenosa > Va intraperitoneal > Va intramuscular > Va subcutnea Va intradrmicaEl pH, por s solo, no es un indicador suficiente del potencial irritante ya que la irritabilidad depende tambin de la concentracin y del punto de ionizacin (pK) del compuesto. Estos factores, as como la solubilidad, biocompatibilidad, viscosidad y esterilidad, debern ser valorados antes de proceder a la inoculacin del compuesto en cuestin por cualquiera de las vas mencionadas.CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID. CANTOBLANCO. 28049 MADRID TELFONO: 91 585 4515 / 4532 FAX: 91 585 4506

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Referencias1. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Karl-Heinz Diehl, Robin Hull, David Morton, Rudolf Pfister, Yvon Rabemampianina, David Smith, Jean-Marc Vidal, Cor Van De Vorstenbosch . J Appl Toxicol 21 15-23, 2001. 2. Refining procedures for the administration of substances. Report of the BVAAWF/ FRAME/ RSPCA/ UFAW joint working group on refinement. D.B. Mortom, M. Jennings, A. Beckwell, R. Ewbank, C. Godfrey, B. Holgayte, I. Inglis, R. James, C. Page, I. Sharman, R. Verschoyle, L. Westall and A.B. Wilson. Laboratory Animals 35, 1-41, 2001. 3. Working with the Laboratory Mouse. American Association for Laboratory Animal Science. http://www.aalas.org 4. http://labanimals.stanford.edu/Guidelines

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