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Centro de Biología Molecular y Celular
Estudios estructurales de los fragmentosamino terminal de los canales de potasio
tipo Shaker B nativo (ShB) y mutado (ShBL7E)
Posible topología de los segmentos transmembrana de cada
una de las subunidades de un canal de K+ tipo Shaker.
OBJETIVOS
1.- Explicar la diferente capacidad funcional de los péptidos ShB y ShBL7E en términos estructurales, confrontándolos con una diana modelo que contenga elementos que imiten los sitios de unión de la bola inactivante en el canal.
2.- Postular un modelo estructural del péptido inactivante ShB cuando se encuentra unido a la diana modelo.
3.- Explorar la posible regulación de la actividad de estos péptidos, y consecuentemente de los canales de potasio que los contienen, a través de modificaciones post-traduccionales que introduzcan cambios semejantes a los que diferencian al péptido ShB del péptido mutante ShBL7E.
4.- Sintetizar y caracterizar adecuadamente un análogo fotoactivable del péptido ShB, diseñado para marcar covalentemente por fotoafinidad el sitio de la proteína canal al que se une la “bola” inactivante.
200 220 240200 220 240-20
-10
0
10
20
30
0 4 0 8 0
-12
-8
-4
0
Longitud de onda (nm)
1
7
1
7
% TFE
2
20
[] M
.R.M
. x 1
0-3 (g
rad
o. c
m2 .d
mo
l-1) A B
Fig. 1: Espectros de dicroismo circular de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) tomados en H2O (1), TFE (7) y en mezclas H2O/ TFE.
1700 1650 1600 1700 1650 1600
Número de onda, cm-1
A B
Fig. 2: Espectros de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E tomados en distintos tampones acuosos: efecto de la fuerza iónica (A) y bandas componentes (B).
Temperatura, ºCNúmero de onda, cm-1
1700 1650 1600
1700 1650 1600
30 45 60 7560
70
80
90
100
163
3/1
64
3 c
m-1
(%)
A
B
C
Fig. 4: Efecto del colato 5 mM (A) y 20 mM (B) sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E. ShB presenta componentes de estructura , muy estables a la temperatura (C).
- 38.
9
15
ShBL7E- 3
4
- 39
ShB
ShB + Tripsina
- 44
ShBL7E + Tripsina
Tiempo (min)30 45 60 750
Fig. 5: Cromatogramas de HPLC de los péptidos ShB y ShBL7E y los fragmentos resultantes de la hidrólisis con tripsina de estos.
Fig. 6: Efecto de la tripsina sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) en presencia de vesículas de PG: pérdida de los componentes de estructura .
Número de onda, cm-1
1760 1680 1600
A
1760 1680 1600
B
Control
Digestióntripsina
Fragmento1-14 purificado
por HPLC
Fig. 7: Banda amida I del espectro de FTIR del péptido ShB en presencia de vesículas de PG en distintas situaciones experimentales: gran estabilidad de los componentes de estructura .
1700 1650 1600
Número de onda, cm-1
Control
100 mM EDTA
1 M NaCl
2 % n-octil--glucopiranósido
1700 1650 1600 1700 1650 1600
pD=7.4 pD=8.9
PA/PC
PG/PC
PA/PC
PG/PC
ShB
ShBL7E
G)
E)
C)
A) B)
D)
F)
H)
100%90%50%30%
Número de onda, cm-1
Fig. 10: La adopción de estructura requiere una gran densidad de carga negativa superficial.
Tabla I: Máximos de emisión de fluorescencia (max) y coeficiente de partición superficial que presentan los péptidos marcados con NBD en presencia de vesículas de fosfolípido.
max (nm) K p* x 10
-4 (M
-1)
Nombre del
péptidopH tampón PC PA PG PC PA PG
ShB -NBD
ShBL7E-NDB
ShB -NBD
ShBL7E-NBD
7 555 551 531 531 no unión 77.1±11.6 2.80±1.1
7 554 551 533 534 no unión 3.05±1.45 0.72±0.2
8.5 552 --- 530 536 --- 1.95±0.65 0.64±0.09
8.5 553 --- 536 552 --- 0.62±0.025 0.05
Fig. 13: Ni el péptido ShB ni el ShBL7E se unen a vesículas de PC. Sin embargo, ambos péptidos se unen con gran eficiencia y de forma saturable a vesículas de PA y, en menor medida, de PG.
42
1
2
3
x 10 (M) 8fC *
Xb
* x
103
ShB
Fosfolípido/péptido (M/M)
Flu
ore
scen
cia
de
Em
isió
n a
530
nm
(un
idad
es a
rbit
rari
as)
0 2000 4000 6000
ShBL7E
PA
PA
PG
PG
PC
PC
Fig. 14: El péptido ShB estabiliza la forma dianiónica del PA.
pKa = 7.66
5 6 7
20
40
100
8 9 10 11
0
60
80
pKa = 8.0
pKa = 7.45
PA
PA + ShBPA + ShBL7E
pH
Áre
a 98
0 cm
-1/1
180
cm-1 n
orm
aliz
ada
Fig. 15: Inserción del péptido ShB en vesículas fosfolipídicas aniónicas.
2
4
6
2
4
6
0 .0 0 .1 0 .2 0 .30 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1.0
A
B
C
Razón molar (péptido/lípido)0.00 0.05 0.10 0.15
Razón molar (péptido/lípido)
ShBL7E
ShBL7E
ShB
ShB
H/
H0
H(K
ca
l/mo
l líp
ido
)
DMPG
DMPA
Tabla II: Secuencia de aminoácidos de derivados del péptido ShB (con el extremo C-terminal amidado) y sus análogos marcados con una sonda fluorescente.
# nombre delpéptido
grado demarcaje
secuencia del péptido
1 5 10 15 20
1 ShB M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q
2 ShBL7E M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q
3 ShB-21C M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C
4 ShBL7E-21C M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C
5 ShB-21C-NBD 89 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD
6 ShBL7E-21C-NBD 88 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD
7 ShB-21C-Rho 76 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho
8 ShBL7E-21C-Rho 73 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho
9 ShB-21C-Pyr 75 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr
10 ShBL7E-21C-Pyr 94 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr
Fig. 16: La inserción del péptido ShB en la bicapa aniónica es dependiente del pH.
1
2
3
4
5
6
7
pH
5.0 6.0 7.0 8.0
H(K
cal/
mo
l)DMPA
DMPA + ShB
DMPA + ShBL7E
Fig. 22: Esquema de reacción entre el 1-(p-azidosalicilamido)-4-(iodoacetamido)butano (ASIB) y un péptido que contenga cisteina para dar lugar a un péptido derivatizado con ASIB.
Péptido-SH + 2 222I CH C N CH CH CH CH N C2
H O
O HHO
3N
ASIB
2 222 CH C N CH CH CH CH N C2H O
O HHO
3NPéptido-S+HI
ASIB-péptido
Longitud de onda (nm)
Ab
so
rban
cia
250 275 300 325 350 375 4000.0
1.0
1.5
0.5
péptido ShBL7E-21C-ASIBpéptido ShB-21C-ASIB
péptido ShBASIB
Fig. 24: Ningún péptido alteró la velocidad de activación del canal Shaker4-46.
potencial de membrana (mV)
Canal ShB4-46 (5)+ péptido ShBL7E (6)+ péptido ShBL7E-ASIB (5)+ péptido ShB (5)+ péptido ShB-ASIB (5)
-20 -10 0 10 20 30 401
2
3
4
5
6
t 1/2 a
cti
vac
ión
(m
s)
Fig. 25: El péptido ShB-ASIB es un análogo funcional del péptido ShB.
+ péptido ShBL7E
+ péptido ShBL7E-ASIB
+ péptido ShB + péptido ShB-ASIB
ShB4-46 ShB4-46
Inactivación tipo-N
Inactivación tipo-C50 ms
500 ms
ShB4-46+ péptido ShBL7E
+ péptido ShBL7E-ASIB
A B
C
Fig. 30: El péptido ShBY8(P) se comporta estructuralmente como ShBL7E.
1700 1650 1600
PG
23 º C70 º C
23 º C
Número de onda, cm-11700 1650 1600
PA
23 º C
70 º C
23 º C
Número de onda, cm-1
PC
1700 1650 1600
23 º C70 º C
23 º C
Número de onda, cm-1
Tabla III: Efecto de diferentes péptidos sobre el curso temporal de la activación e inactivación de corrientes de K+ en canales ShB6-46. La constante de activación (1/2) se mide como el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la amplitud máxima de la corriente a diferentes potenciales. El valor de la constante de inactivación () se estima ajustando el tramo de disminución de la corriente a una función exponencial de caida simple. Media desviación estándar (n).
t1/2 activación (ms) t1/2 inactivación (ms)
Péptido 0 mV Control (sin péptido) 5.631.12 (7) 3.280.43 (8) 2.320.21 (8) 1300160 (6)ShB 4.910.95 (5) 3.170.39 (7) 2.220.23 (6) 21548 (6)ShB-Y8(P) 5.871.03 (5) 3.390.47 (5) 2.380.36 (5) 76687 (6)ShB-Y8(P)(Quinasa Src)
5.650.89 (4) 3.350.32 (4) 2.170.29 (4) 63481 (5)
-20 mV +20 mV +20 mV
Fig. 32: El péptido ShBY8(P) presenta componentes de estructura que dependen de la relación lípido-péptido.
1700 16001650
PA
1700 16001650
Razón molarShB-Y8(P)/fosfolípido
0.13
0.06
0.03
23 ºC
70 ºC
22 ºC
Número de onda, cm-1
PG
Fig. 33: El péptido ShBY8(P) no se inserta en vesículas fosfolipídicas.
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
Razón molar (péptido/PLs)
H
(Kca
l/mol
lípi
do)
DMPC
DMPG DMPA
Razón molar (péptido/PLs)
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
PéptidoShB-Y8(P)
Razón molar (péptido/PLs)
PéptidoShB
PéptidoShB-Y8(P)
PéptidoShB
PéptidoShB-Y8(P)
PéptidoShB
H(K
cal/m
ol lí
pido
)
H
(Kca
l/mol
lípi
do)
Fig. 34: Propuesta de dos modelos alternativos de estructura en “horquilla “ para el péptido ShB insertado en vesículas fosfolipídicas aniónicas. El giro necesario para que se forme esta estructura puede tener lugar a partir de dos secuencias de tetrapéptido: VAGL (panel A) y AGLY (panel B).
456
12
7
8 5
12
67
A
B
Porcentajes de unión de los péptidos marcados con NBD a distintos fosfolípidos.
Po
rcen
taje
de
pép
tid
ou
nid
o a
PL
s
Relación molar PLs/péptido
pH 7.0 pH 8.5
100
80
60
40
20
0
0 1400 2800 4200 5600 0 1400 2800 4200 5600
100
80
60
40
20
0
PA/ShB
PG/ShBPA/ShBL7E
PG/ShBL7E
PA/ShB
PG/ShB
PA/ShBL7E