Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Ingeniería en Sistemas Ambientales

Informe Técnico Final

Enero 2006-Diciembre 2006

Proyecto:

“Aplicación del diseño factorial en la determinación de las variables que afectan la degradación de DDT”

clave SIP: 20060908

Participantes:

Dra. Blanca Estela Barragán Huerta Dra. Refugio Rodríguez Vázquez

Pasante José Alberto Hernández Morales

1

ÍNDICE GENERAL

Tema Página 1 Resumen 4

2 Introducción 5

2.1 Degradación de compuestos xenobióticos 5

2.1.1 Rutas de degradación y factores limitantes 5

2.2.2 Impacto de los metales sobre la biodegradación de contaminantes orgá-

nicos.

6

3. Parte experimental 7

3.1 Efecto de las condiciones de cultivo en la degradación del plaguicida

seleccionado (Diseño Placket-Burman)

7

7

3.1.1 Diseño de Plackett-Burman 7

3.1.2 Condiciones de cultivo 9

3.1.3 Análisis estadístico de los datos 10

4. Resultados y discusión. 13

4.1 Producción de biomasa en las diferentes condiciones de cultivo 13

4.2 Determinación de las variables significativas y del modelo estadístico

para la producción de biomasa

14

15 4.3 Degradación de DDT en las diferentes condiciones de cultivo

16 4.4 Análisis estadístico de los resultados de degradación de plaguicida

18 5 Conclusiones

18 6 Impacto

19 7. Bibliografía

20 Anexos

2

ÍNDICE DE CUADROS

PáginaNo. Nombre

1 Factores considerados en el diseño de Plackett-Burman 8

2 Matriz del diseño factorial Placket-Burman para la degradación de DDT. 12

3 Tratamientos con producción de biomasa significativamente diferente 14

4 Degradación de DDT en los 12 tratamientos 15

5 Tratamientos con degradación de DDT significativamente diferente 17

ÍNDICE DE FIGURAS

No. figura Página

1 Rutas de degradación de compuestos xenobióticos 6

2 Procedimiento para la determinación del efecto de las condiciones de

cultivo sobre el crecimiento y degradación de DDT

9

3 Curva tipo de absorbancia vs biomasa (peso seco). 13

4 Generación de biomasa en diferentes condiciones de cultivo 13

5 Degradación de DDT en los tratamientos propuestos en el diseño Plac-

kett-Burman

16

INDICE DE ANEXOS

Página

1 Análisis de varianza (ANOVA) para la variable biomasa. 20

2 Estimación de los parámetros significativos en la producción de biomasa 21

3 Análisis de comparación de medias para la variable biomasa 22

4 Análisis de varianza (ANOVA) para la variable remoción 23

5 Estimación de los parámetros significativos en remoción de DDT 24

6 Análisis de comparación de medias para la variable dependiente remo-ción.

25

3

1. RESUMEN.

La degradación de compuestos xenobióticos, involucra una serie compleja de interacciones entre

las poblaciones microbianas y el ambiente. Las poblaciones microbianas son reservorios de un

potencial catalítico a partir del cual diferentes tipos y velocidades de actividades degradativas

pueden ser expresada dependiendo de las condiciones ambientales. La interacción entre suelo,

agua y los niveles de oxígeno, controla el potencial redox, que es la que determina si los com-

puestos serán degradados por mecanismos aeróbicos o anaeróbicos. Los nutrientes minerales son

también factores muy importantes. En los casos donde los xenobióticos son degradados por co-

metabolismo, puede ser importante la presencia de cosustratos que induzcan la expresión de cier-

tas enzimas degradativas. Otro factor importante es la biodisponibilidad, xenobióticos no polares

pueden tener baja biodisponibilidad debido a su baja solubilidad acuosa (Sylvia et al., 1999). En

este trabajo se aplicará un diseño de Plackett-Burman (Montgomery, 2000 ), que analiza con 12

tratamientos el efecto de 11 variables con dos niveles de selección para cada variable, un nivel

bajo (-1) y un nivel alto (+1). Los factores bajo investigación en este estudio fueron: pH (A), tipo

de café (B), tamaño de partícula del café(C), cantidad de nitrógeno (D), cantidad de glucosa (E),

velocidad de agitación (F), cantidad de tween 80 (G), cantidad de Fe 2+(H), cantidad de DDT(I),

cantidad de Cu 2+ (J), cantidad de inóculo (K). Los experimentos se hicieron en medio líquido

colocando 50 mL de medio e incubando 7 días a 25°C y 100 rpm. Los matraces fueron inocula-

dos con Flavimonas oryzihabitans (aislada del grano de café). La variable respuesta fue la canti-

dad de plaguicida degradado cuantificada por cromatografía de GC/MS. Se determinaron las va-

riables significativas y el mejor tratamiento para la determinación de DDT. Mediante el análisis

estadístico de los resultados usando el programa SAS 6.06 para Windows.De acuerdo a los resul-

tados la mayor remoción de DDT fue del 27%. El modelo de primer orden que describe la remo-

ción de DDT en función de los parámetros evaluados es altamente significativo (P<0.0001) y es

definido por la siguiente ecuación:

Remoción (%): 13.56861+ 1.37750 nitrógeno- 2.15917 glucosa + 1.36028 agitación

+ 2.16194 Tween 80 –0.87361Fe -7.34639 DDT+ 0.66417Cu + 1.44806 inóculo

El análisis de regresión mostró que los factores que favorecen la degradación del DDT son el

nivel alto de nitrógeno, de surfactante, de cobre y de inóculo y los que la inhiben son la presencia

de glucosa, altos niveles de DDT y la presencia de fierro.

4

2. INTRODUCCIÓN

2.1 Degradación de compuestos xenobióticos.

La degradación de compuestos xenobióticos, involucra una serie compleja de interacciones entre

las poblaciones microbianas y el ambiente. Las poblaciones microbianas son reservorios de un

potencial catalítico a partir del cual diferentes tipos y velocidades de actividad degradativa puede

ser expresada dependiendo de las condiciones ambientales.

La interacción entre suelo, agua y los niveles de oxígeno, controla el potencial redox, que es la

que determina si los compuestos serán degradados por mecanismos aeróbicos o anaeróbicos. Los

nutrientes minerales son también factores muy importantes. En los casos donde los xenobióticos

son degradados por cometabolismo, puede ser importante la presencia de cosustratos que induz-

can la expresión de ciertas enzimas degradativas. Otro factor importante es la biodisponibilidad,

xenobióticos no polares pueden tener baja biodisponibilidad debido a su baja solubilidad acuosa

(Sylvia et al 1999.)

2.1.1 Rutas de degradación y factores limitantes.

Algunos compuestos xenobióticos pueden mantener el crecimiento microbiano al servir como

fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, también como fuentes de energía. El metabolismo aeró-

bico de los haloaromáticos puede proceder por varias rutas mediado por diversas enzimas. La

figura 1, ilustra mediante la ruta A1-3, la deshalogenación del anillo y muestra que este proceso

puede ser a través de reacciones oxidativas, hidrolíticas o reductivas. En la ruta B, el anillo aro-

mático es roto directamente por enzimas oxidativas produciendo compuestos alifáticos halogena-

dos. La producción de intermediarios dihidroxilados se atribuye a la acción de oxigenasas.

Otro ruta de transformación de xenobioticos es el cometabolismo, también llamado metabolismo

incidental, metabolismo fortuito o cooxidación. Algunas veces, los productos del cometabolismo

no pueden entrar a las rutas metabólicas normales y permanecen en el medio sin ser asimilados.

5

R X

R OH R

OH2O2

XX

H

X

O2

OH2

O2

R [OH]2R X

[OH]2

O2O2

X

ClCl

Cl

OH

CO2H

Cl

CO2H

O2

Producto alifático Producto alifático halogenado

Ciclo TCA

Fisión del anillo

intermediarios centrales

Bifenildioxigenasas

Acido alifático clorinado

Acido 4-cloro benzóico

1 2 3

A B

Ciclo TCA

COMETABOLISMO METABOLISMO

Figura 1. Rutas de degradación de compuestos xenobióticos (tomado de Sylvia et al 1999).

2.2.2 Impacto de los metales sobre la biodegradación de contaminantes orgánicos.

Desde el punto de vista fisiológico, los metales se agrupan en tres categorías principales: i) aque-

llos esenciales y básicamente no tóxicos. (Ca 2+ 2+ y Mg ); ii) esenciales pero peligrosos a altas

6

concentraciones (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni, y Mo); y iii) tóxicos (Hg ó Cd) (Valls M., y De Loren-

zo, V, 2002).

El cuarenta por ciento de los sitios contaminados por residuos peligrosos en EEUU están co-

contaminados con compuestos orgánicos y metales. Los metales más frecuentemente encontrados

son arsénico, bario, cadmio, cromo, plomo, mercurio, níquel, cobre y zinc, los contaminantes

orgánicos incluyen petróleo, solventes clorinados y plaguicidas

Datos obtenidos tanto en sistemas aerobios como anaerobios han demostrado que la biodegrada-

ción de los componentes orgánicos puede ser reducida por la toxicidad de los metales (Sandrin y

Maier, 2003). .

La composición del medio afecta la biodisponibilidad del metal y por ende su toxicidad. Medios

de cultivo que contienen sustancias que pueden enlazar metales (por ejemplo extracto de levadura

o materia orgánica) y precipitadores de metales (sales de fosfato o sulfato), pueden reducir la

concentración del metal en la solución.

3. PARTE EXPERIMENTAL.

3.1 Efecto de las condiciones de cultivo en la degradación del plaguicida seleccionado (Diseño

Placket-Burman).

3.1.1. Diseño de Plackett-Burman.

Este diseño estadístico se utiliza con el fin de discernir el efecto de varios componentes del medio

así como factores ambientales en un proceso dado. El diseño de Plackett-Burman (Montgomery,

2000), es un método estadístico que contempla dos niveles de selección para cada variable, un

nivel bajo (-1) y un nivel alto (+1). El cuadro 3 muestra los factores bajo investigación en este

estudio y los niveles de cada factor usados en el diseño experimental

El diseño experimental de Plackett-Burman está basado en un modelo de primer orden:

Y= βo +Σβi xi

7

Donde Y es la respuesta (biomasa o remoción de DDT), βo es el intercepto del modelo y βi es el

coeficiente estimado para cada variable o factor xi.

Cuadro 1 . Factores considerados en el diseño de Plackett-Burman

Factor Clave Nivel bajo (-1) Nivel alto (+1)

A pH 6 7

B Tipo de café Sin lavar Lavado

C Tamaño de partícula del café) Malla10/20 Malla 40/180

D Cantidad de nitrógeno 0.1 g/L 0.2 g/L

E Cantidad de glucosa 0 10 g/L

F Velocidad de agitación 0 100 rpm

G Cantidad de Tween 80 13 mg/L 50 mg/L 2+ H Cantidad de Fe 0 mg/L 15 mg/L

I Cantidad de DDT 2 mg/L 50 mg/L 2+ J Cantidad de Cu 0 mg/L 15 mg/L

K Cantidad de inóculo 5% 10%

Este modelo no describe la interacción entre factores y es usado para seleccionar y evaluar los

factores importantes que influyen en un proceso.

El máximo número de variables que puede ser evaluado en un diseño es igual al número total de

experimentos menos uno. En este trabajo se tomaron en cuenta 11 variables (A-K) a dos niveles

de variación, uno alto (+) y otro bajo(-), lo cual arroja 12 tratamientos.

Las combinaciones para este diseño son los doce experimentos que se muestran en el cuadro 2.

Cada experimento se corrió por triplicado, además de dos controles que carecían de inóculo. Se

evaluó crecimiento microbiano (biomasa en base seca) y plaguicida residual.

8

3.1.2. Condiciones de cultivo.

Se siguió el mismo protocolo de trabajo seguido en etapas anteriores. La metodología se esque-

matiza en la figura 2.

50 mL de medio mineral + fuente de carbono + DDT técnico (40 μL de acetona/etanol).

-1Inoculación con 5mL de inóculo (OD

Figura 2. Procedimiento para la determinación del efecto de las condiciones de cultivo sobre el

crecimiento y degradación de DDT.

Como ninguna de las combinaciones presentaba las mismas condiciones de cultivo que las ensa-

yadas previamente en este trabajo, se corrió un control positivo, conteniendo como fuente de car-

bono y nitrógeno 2g/L de café con malla 20 sin lavar y con 50 ppm de DDT y sin metales.

El inóculo se preparó a partir de una cepa de Flavimonas oryzihabitans aislada previamente en

este trabajo y conservada en refrigeración en en placas de agar nutritivo. El microorganismo fue

cultivado en medio líquido conteniendo 2g/L de peptona, incubado a 30°C por 24 h.

Posteriormente el medio fue centrifugado y las células lavadas con NaCl 0.85% 2 veces. La con-

centración final del inóculo se ajustó a 0.3 g/L peso seco de biomasa

Determinación de la degradación de DDT por GC-MS

600=0.6; 0; 0.3 g peso seco mL ), incubado a 100 rpm), 25°C, 7 d.

Extracción con CH2CL2. Los extractos fueron secados, evaporados y redisueltos en 5 mL metanol

Biomasa Microscopía electrónica de barrido

(Café residual)

9

10

En todos los tratamientos propuestos por el diseño de Plackett-Burman (problemas y controles),

el crecimiento microbiano se determinó como Abs 600nm . El valor de la absorbancia se interpoló

en una curva tipo elaborada previamente para determinar la biomasa en peso seco (g/L).

El plaguicida residual en cada experimento se determinó por interpolación en una curva tipo (res-

puesta del cromatógrafo vs concentración DDT. La concentración final se calculó de la siguiente

manera:

Concentración residual = Concentración DDT problema - concentración DDT en el control.

3.1.3 Análisis estadístico de los datos.

Con los resultados obtenidos en cuanto a producción de biomasa y degradación de plaguicida en

los experimentos del diseño de Plackett-Burman, se efectuó el análisis de varianza (ANOVA) y

un análisis de regresión usando el programa SAS 6.06 para Windows. Se determinaron las varia-

bles significativas y su efecto en la degradación de DDT y la producción de biomasa. Mediante

el mismo programa se determinó el modelo que describe el proceso y mediante un análisis de

medias se determinó el mejor tratamiento.

12

Cuadro 2. Matriz del diseño factorial Placket-Burman para la degradación de DDT.

• * Cantidad de café: 2 g/L; C/L= Con lavado exhaustivo con agua caliente; S/L= sin lavado. • Cantidad de inóculo : 10% (5 mL de células lavadas; en 50 mL de medio). • (-) y (+) son los valores codificados correspondientes a los valores bajos y altos de las variables independientes.

A B C D E F G H I J K Tratamiento pH Tipo

Café* Malla Cantidad de

nitrógeno g/L Cantidad de glucosa g/L

Agitación rpm

Tween 80 mg/L

Fe 2+

mg/L DDT ppm

Cu 2+

mg/L Inóculo

% 1 +

7 -

S/L +

180 -

0.1 - 0

- 0

+ 13

+ 15

+ 50

- 0

+ 10

2 + 7

+ C/L

- 20

+ 0.2

- 0

- 0

- 0

+ 15

+ 50

+ 15

- 5

3 - 6

+ C/L

+ 180

- 0.1

+ 10

- 0

- 0

- 0

+ 50

+ 15

+ 10

4 + 7

- S/L

+ 180

+ 0.2

- 0

+ 100

- 0

- 0

- 2

+ 15

+ 10

5 + 7

+ C/L

- 20

+ 0.2

+ 10

- 0

+ 13

- 0

- 2

- 0

+ 10

6 + 7

+ C/L

+ 180

- 0.1

+ 10

+ 100

- 0

+ 15

- 2

- 0

- 5

7 - 6

+ C/L

+ 180

+ 0.2

- 0

+ 100

+ 13

- 0

+ 50

- 0

- 5

8 - 6

- S/L

+ 180

+ 0.2

+ 10

- 0

+ 13

+ 15

- 2

+ 15

- 5

9 - 6

- S/L

- 20

+ 0.2

+ 10

+ 100

- 0

+ 15

+ 50

- 0

+ 10

10 + 7

- S/L

- 20

- 0.1

+ 10

+ 100

+ 13

- 0

+ 50

+ 15

- 5

11 - 6

+ C/L

- 20

- 0.1

- 0

+ 100

+ 13

+ 15

- 2

+ 15

+ 10

12 - 6

- S/L

- 20

- 0.1

- 0

- 0

- 0

- 0

- 2

- 0

- 5

4. Resultados y discusión.

4.1 Producción de biomasa en las diferentes condiciones de cultivo.

En la figura 4 se muestra la curva tipo de absorbancia contra biomasa y en la figura 4 se repre-

sentan los valores de biomasa obtenidos en cada tratamiento.

y = 2.0473x + 0.0156R2 = 0.9973

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.1 0.2 0.3

Biomasa (g/L)

Abs

600n

m

Figura 3. Curva tipo de absorbancia vs biomasa (peso seco).

Generación de biomasa en diferentes condiciones de cultivo

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tratamiento

g/L

biom

asa

(pes

o se

co)

Promedio biomasa

Desv est biom.

0.159 0.0061

0.053 0.0026

0.070 0.0122

0.174 0.0254

0.284 0.0606

0.191 0.0113

0.129 0.0064

0.023 0.0057

0.164 0.0565

0.088 0.0027

0.105 0.0113

0.148 0.0155

Figura 4. Generación de biomasa en diferentes condiciones de cultivo

13

4. 2 Determinación de las variables significativas y del modelo estadístico para la produc-

ción de biomasa.

De acuerdo al análisis de varianza (ANOVA), se obtuvo que el pH, la agitación, la cantidad de

fierro, plaguicida, cobre y de inóculo, mostraron un efecto significativo en la producción de bio-

masa (anexo 1)

El análisis de regresión (anexo 2), muestra que la producción de biomasa se ve favorecida signi-

ficativamente al nivel alto de pH (pH=7), de agitación (100rpm), y de inóculo (10%) y se inhibe

en presencia de fierro y cobre y altas concentraciones de DDT. De este mismo análisis de regre-

sión se determina el modelo de primer orden que describe la generación de biomasa y queda

definido por la siguiente ecuación:

Biomasa (g/L): 0.13233+ 0.02578 pH-+0.00939 Agit- 0.01661Fe- 0.02172 DDT-0.04689Cu+

0.02717 inóculo.

De acuerdo al análisis de comparación de medias (anexo 3) se determinó que el tratamiento 5

produce significativamente la mayor cantidad de biomasa, en cambio con el tratamiento 8 y 2 se

produjo la menor cantidad de biomasa. En el cuadro 3 se describen las condiciones que produje-

ron los valores más altos y más bajos de biomasa

Cuadro 3. Tratamientos con producción de biomasa significativamente diferente.

A B C D E F G H I J K

El pH alto, una mayor cantidad de inoculo inicial, así como la baja concentración o ausencia de

tóxicos incrementa la generación de biomasa en los medios de cultivo (tratamiento 5).

Trat. pH Tipo Café*

Malla Nitrógeno g/L

Glucosa g/L

Agitaciónrpm

Tween 80 mg/L

Fe 2+

mg/LDDTppm

Cu 2+ BiomasaInóculo mg/L % mg/L

- - - + + + - + + - + 0.284 5 0 2 0 10 7 C/L 20 0.2 10 0 13 + + + - + + - + - - - 0.053 2 15 50 15 5 7 C/L 20 0.2 0 0 0 + - + - - - + + + - + 0.023 8 15 2 15 5 6 S/L 180 0.2 10 0 13

14

El cobre es tanto un micronutriente esencial como un metal pesado tóxico para la mayoría de los

organismos vivos. Es un constituyente de muchas metaloenzimas y proteínas involucradas en

reacciones redox y de transporte electrónico (Cervantes y Gutiérrez, 1994). Los requerimientos

de cobre son satisfechos a concentraciones muy bajas de metal (1-10 μM).

El cobre a altos niveles en su forma iónica (Cu2+), es tóxico a las células microbianas, debido

principalmente a sus interacciones con los ácidos nucleicos. Por tal motivo, los compuestos que

contienen cobre son usados ampliamente como bactericidas, algicidas, funguicidas, aditivos y

para la preservación de materiales naturales y sintéticos.

Específicamente en medios que contienen fosfato (uno de los reguladores más usados en micro-

biología), cambios muy pequeños en el valor de pH, puede disminuir la solubilidad del metal,

reduciendo la concentración del metal en la solución en varios ordenes de magnitud. La adición

de agentes quelantes (incluyendo biosurfactantes), el cambio de pH y la adición de cationes diva-

lentes, han sido usados para disminuir la biodisponibilidad del metal y por lo tanto su toxicidad.

Al aumentar el pH, los metales tienden a formar óxidos metálicos y fosfatos insolubles (Sandrin y

Maier, 2003).

4.3 Degradación de DDT en las diferentes condiciones de cultivo

El porcentaje de degradación de p,p’- DDT determinado por cromatografía de gases en cada uno

de los tratamientos del diseño factorial se muestra en el cuadro 4.

Cuadro 4. Degradación de DDT en los 12 tratamientos.

Tratamiento Degradación Desviación % Estándar

1 6.91 1.662 4.96 0.873 2.16 1.294 25.83 1.415 18.82 0.196 13.17 0.507 12.05 2.508 18.90 1.199 4.97 1.7810 6.29 0.5111 27.27 2.0012 17.36 0.70

15

La figura 5 muestra en una representación de barras la degradación de DDT en los 12 tratamien-

tos.

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Tratamiento

% d

egra

daci

ón D

DT

Figura 5. Degradación de DDT en los tratamientos propuestos en el diseño Plackett-Burman

4. 4 Análisis estadístico de los resultados de degradación de plaguicida. De acuerdo al análisis de varianza (anexo 4), las variables que afectan significativamente la de-

gradación de DDT son la concentración de nitrógeno, glucosa, , surfactante, fierro, DDT, cobre ,

inóculo y la agitación.

El análisis de regresión (anexo 5), muestra que la remoción de DDT por Flavimonas oryzihabi-

tans en las condiciones de trabajo es altamente significativa al nivel alto de nitrógeno, surfactan-

te e inóculo. Estos resultados concuerdan con otros estudios donde a mayor cantidad de inóculo

mayor la degradación (Bidlan y Manonmani, 2002). En el caso de la adición de surfactantes, se

ha reportado que su adición a los medios de cultivo, incrementan la solubilidad del plaguicida y

por lo tanto su biodisponibilidad y biotransformación (You et al, 1996).

En el presente trabajo, la presencia de cobre y la agitación favorecen significativamente la remo-

ción del plaguicida. En el caso de degradación aerobia, altos niveles de oxígeno disuelto, se re-

16

quieren para la acción de las dioxigenasas, que introducen dos átomos de oxigeno a carbonos

adyacentes, eliminando los grupos halógeno y provocando la ruptura de los anillos aromáticos

(Sylvia, et al, 1998). Estas enzimas contienen cobre como cofactor.

Al igual que en el caso de crecimiento, las altas concentraciones de DDT y la presencia de Fierro

presentan un efecto negativo sobre la remoción del DDT por Flavimonas oryzihabitans.

La glucosa inhibe en su nivel alto, lo cual coincide con otros estudios donde la presencia de un

sustrato más fácilmente asimilable promueve el crecimiento pero inhibe la degradación de los

compuestos tóxicos. Por ejemplo Alcaligenes denitrificans (Ahuja et al, 2001), es capaz de de-

gradar en condiciones aerobias el 25-28% de 10 ppm de DDT en dos semanas. En este caso la

presencia de fuentes de carbono adicionales como glucosa (1 g/L), acetato o succinato incremen-

taron la masa bacterial, pero no se observa un aumento significativo de la degradación del DDT

con la adición de glucosa.

En el presente trabajo, el tipo de café (lavado o sin lavar), así como el tamaño del mismo no in-

fluyen significativamente en la remoción.

De acuerdo al análisis de comparación de medias (anexo 6), se observa que en los tratamientos

11 y 4 se presentan significativamente las mayores tasas de remoción con valores de 27.27% y

25.83% respectivamente (cuadro 5). En el tratamiento 3 se obtiene la menor tasa de remoción

(2.16%).

Cuadro 5. Tratamientos con degradación de DDT significativamente diferente

A B C D E F G H I J K

El modelo de primer orden que describe la remoción de DDT en función de los parámetros eva-

luados es altamente significativo (P<0.0001) y es definido por la siguiente ecuación:

Trat. pH Tipo Café*

Malla Nitrógeno g/L

Glucosa g/L

Agitaciónrpm

Tween 80 mg/L

Fe 2+

mg/LDDT Cu 2+ Inóculo Deg. ppm mg/L % %

+ - - + + 2.16 3 - + + - - + 6 C/L 180 0.1 10 0 0 0 50 15 10

+ - + - + 25.83 4 + - + - - + 7 S/L 180 0.2 0 100 0 0 2 15 10

- + + + 27.27 11 - + - - + - + 6 C/L 20 0.1 0 100 13 15 2 15 10

17

Remoción (%): 13.56861+ 1.37750 nitrógeno- 2.15917 glucosa + 1.36028 agitación

+ 2.16194 Tween 80 –0.87361Fe -7.34639 DDT+ 0.66417Cu + 1.44806 inóculo

De cualquier manera, la degradación obtenida usando café como sustrato es mayor que cuando se

emplea glucosa (39%±1.5) ó peptona (26.7±7.3) como fuentes de carbono.

5. CONCLUSIONES

• De acuerdo a los resultados del diseño de Placket-Burman, los factores que tienen efecto

significativo sobre la producción de biomasa son el pH del medio, la velocidad de agitación, la

presencia de fierro, la concentración de DDT, la presencia de cobre y la cantidad de inóculo.

• A mayor pH, mayor cantidad de inóculo inicial y con agitación se incrementa la producción

de biomasa en los medios de cultivo.

• Respecto a la degradación de DDT, el análisis de varianza ANOVA mostró que las varia-

bles que afectan significativamente la degradación del plaguicida son la concentración de ni-

trógeno, glucosa, , surfactante, fierro, DDT, cobre , inoculo y la agitación.

• El análisis de regresión mostró que los factores que favorecen la degradación del DDT son

el nivel alto de nitrógeno, de surfactante, de cobre y de inóculo y los que inhiben son la pre-

sencia de glucosa, altos niveles de DDT y la presencia de fierro.

6. IMPACTO

Actualmente es de gran interés el desarrollo de procesos que conduzcan a la disminución de la

contaminación ambiental en suelos, agua y aire. Una clase de contaminantes que tiene gran im-

pacto sobre el medio ambiente es la de los plaguicidas organoclorados. El diseño de procesos

biotecnologicos para la eliminación de éste tipo de contamiantes ha sido abordado por varios

grupos de investigadores, pero se ha estudiado poco acerca del efecto de las condiciones de culti-

vo sobre la remoción de plaguicidas haciendo uso del diseño factorial, por ello, de ahí que los

resultados de este trabajo proporcionan información importante acerca de los factores ambienta-

les y de cultivo que son necesarios considerar cuando se realiza la degradción de DDT.

18

7. BIBLIOGRAFÍA

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tion: Enhancement by application of surfactants and low oxidation reduction potential. Chemosp-

here. 32: 2269-2284

19

Anexo 1. Análisis de varianza (ANOVA) para la variable biomasa.

Procedimiento GLM Variable dependiente: biomasa Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 11 0.16544000 0.01504000 21.83 <.0001 Error 24 0.01653200 0.00068883 Total correcto 35 0.18197200 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE Media Biom. 0.909151 19.83297 0.026246 0.132333 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F A (pH) 1 0.02392178 0.02392178 34.73 <.0001 B (Tipo) 1 0.00146944 0.00146944 2.13 0.1571 C (Malla) 1 0.00240100 0.00240100 3.49 0.0742 D (Nitrógeno) 1 0.00267576 0.00267576 3.88 0.2162 E (Glucosa) 1 0.00069344 0.00069344 1.01 0.3257 F (Agitación) 1 0.00081069 0.00081069 1.18 0.0422 G (Tween) 1 0.00028376 0.00028376 0.41 0.8309 H (Fierro) 1 0.01233389 0.01233389 17.91 0.0009 I (DDT) 1 0.01698678 0.01698678 24.66 <.0001 J (Cobre) 1 0.07914844 0.07914844 114.90 <.0001 K (Inóculo) 1 0.02812500 0.02812500 40.83 <.0001

20

Anexo 2. Estimación de los parámetros significativos en la producción de biomasa

Procedimiento REG Modelo: MODEL1

Variable dependiente: BIOMASA

ANALISIS DE VARIANZA

Grados de Suma de Media de Fuente libertad cuadrados cuadrados F Pr > F Modelo 11 0.16544 0.01504 21.83 <.0001 Error 24 0.01653 0.00068883

Raíz MSE 0.02625 R-cuadrado 0.9092 Media dependiente 0.13233 Coeff Var 19.83297

Parámetros estimados

Parámetro Error

Variable DF Estimado estándar Valor t Pr > |t|

Término i 1 0.13233 0.00437 30.25 <.0001 A (pH) 1 0.02578 0.00437 5.89 <.0001 B (Tipo) 1 0.00639 0.00437 1.46 0.1571 C (Malla) 1 -0.00817 0.00656 -1.87 0.0742 D (Nitrógeno) 1 0.00556 0.00489 1.97 0.2162 E (Glucosa) 1 0.00439 0.00437 1.00 0.3257 F (Agitación) 1 0.00939 0.00489 1.08 0.0422 G (Tween) 1 -0-00094 0.00489 0.64 0.8309 H (Fierro) 1 -0.01661 0.00489 -4.23 0.0009 I (DDT) 1 -0.02172 0.00437 -4.97 <.0001 J (Cobre) 1 -0.04689 0.00437 -10.72 <.0001 K (Inóculo) 1 0.02717 0.00489 6.39 <.0001

21

ANEXO 3. Análisis de comparación de medias para la variable biomasa.

Alfa 0.05 Error de grados de libertad 24 Error de cuadrado medio 0.000951 Valor crítico de t 2.06390 Diferencia menos significativa 0.052

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. t Agrupamiento Media N trat A 0.28467 3 5 B 0.19033 3 6 B C B 0.17367 3 4 C B C B 0.16433 3 9 C B C B 0.15900 3 1 C B C B D 0.14800 3 12 C D C E D 0.12900 3 7 E D E D 0.10500 3 11 E D F E D 0.09700 3 3 F E F E 0.08800 3 10 F F G 0.05300 3 2 G G 0.02267 3 8

22

Anexo 4. Análisis de varianza (ANOVA) para la variable remoción.

Procedimiento GLM

Clase Niveles Valores

A 2 -1 1 B 2 -1 1 C 2 -1 1 D 2 -1 1 E 2 -1 1 F 2 -1 1 G 2 -1 1 H 2 -1 1 I 2 -1 1 J 2 -1 1 K 2 -1 1

Número de observaciones 36

Procedimiento GLM

Variable dependiente: REMOCIÓN Suma de Cuadrado de Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F Modelo 11 2541.531364 231.048306 120.42 <.0001 Error 24 46.049667 1.918736 Total correcto 35 2587.581031 R-cuadrado Coef Var Raiz MSE rem Media 0.982204 10.20874 1.385185 13.56861 Cuadrado de Fuente DF Tipo III SS la media F-Valor Pr > F A (pH) 1 1.677025 1.677025 0.87 0.3592 B (Tipo café) 1 1.357225 1.357225 0.71 0.4086 C (Malla) 1 5.736025 5.736025 2.99 0.0967 D (Nitrógeno) 1 71.631125 71.631125 37.33 <.0001 E (Glucosa) 1 167.832025 167.832025 87.47 <.0001 F (Agitación) 1 38.799694 38.799694 20.22 0.0001 G (Tweeen 80) 1 160.612227 160.612227 83.71 <.0001 H (Fe2+) 1 33.170294 33.170294 17.29 0.0009 I (DDT) 1 1942.899469 1942.899469 1012.59 <.0001 J (Cu2+) 1 15.880225 15.880225 8.28 0.0083 K (Inóculo) 1 78.183761 78.183761 40.75 <.0001

23

ANEXO 5. Estimación de los parámetros significativos en remoción de DDT.

Procedimiento REG Modelo: MODEL1 Variable dependiente: REMOCIÓN ANALISIS DE VARIANZA Grados de Suma de Media de Fuente libertad Cuadrados Cuadrados F-Valor Pr > F Modelo 11 2541.53136 231.04831 120.42 <.0001 Error 24 46.04967 1.91874 Total corregido 35 2587.58103 Root MSE 1.38518 R-cuadrado 0.9822 Media dependiente 13.56861 Adj R-Sq 0.9740 Coeff Var 10.20874

Parámetros estimados Parametro Error Variable DF Estimado Estandar Valor t Pr > |t| Independiente 1 13.56861 0.23086 58.77 <.0001 A (pH) 1 -0.21583 0.23086 -0.93 0.3592 B (Tipo café) 1 0.19417 0.23086 0.84 0.4086 C (Malla) 1 -0.39917 0.34630 -1.73 0.0967 D (Nitrógeno) 1 1.37750 0.25811 6.11 <.0001 E (Glucosa) 1 -2.15917 0.23086 -9.35 <.0001 F (Agitación) 1 1.36028 0.25811 4.50 0.0001 G (Tween 80) 1 2.16194 0.25811 9.15 <.0001 H (Fe2+) 1 -0.87361 0.25811 -4.16 0.0009 I (DDT) 1 -7.34639 0.23086 -31.82 <.0001 J (Cu2+) 1 0.66417 0.23086 2.88 0.0083 K (Inoculo) 1 1.44806 0.25811 6.38 <.0001

24

ANEXO 6. Análisis de comparación de medias para la variable dependiente remoción.

Procedimiento GLM Alfa 0.05 Error de grados de libertad 24 Error de cuadrado medio 1.918736 Valor crítico de t 2.06390 Diferencia menos significativa 2.3343

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

t Agrupamiento Media N trat A 27.267 3 11 A A 25.827 3 4 B 22.970 3 5 C 18.900 3 8 C C 17.357 3 12 D 13.170 3 6 D D 12.053 3 7 E 6.907 3 1 E E 6.287 3 10 E E 4.970 3 9 E E 4.957 3 2 F 2.160 3 3

25