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POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA
T E S I S
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CHAYA (Cnidoscolus chayamansa) EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES EN RATAS WISTAR
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA
PRESENTA
GIOVANNA MARÍA DEL ROSARIO PALOS SUÁREZ
DIRECTORES:
DRA. EVA GONZÁLEZ JASSO y DR. REYNALDO CARLOS PLESS ELLING
SANTIAGO DE QUERÉTARO, QRO. NOVIEMBRE DEL 2007
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada
Unidad Querétaro
2
3
4
INDICE
ABREVIATURAS.......................................................................................................................................... 10
RESUMEN.................................................................................................................................................... 11
SUMMARY ................................................................................................................................................... 12
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 13
2 ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 14
2.1 Diabetes ............................................................................................................................. 14
2.1.1 Epidemiología..................................................................................................................... 14
2.1.2 Diagnóstico......................................................................................................................... 14
2.1.3 Factores de riesgo.............................................................................................................. 15
2.1.4 Complicaciones .................................................................................................................. 15
2.2 Insulina ............................................................................................................................... 16
2.2.1 Metabolismo de la glucosa................................................................................................. 16
2.2.2 Metabolismo lipídico........................................................................................................... 16
2.2.3 Metabolismo proteico .........................................................................................................17
2.2.4 Metabolismo de las lipoproteínas....................................................................................... 17
2.3 Modelos experimentales en animales para el estudio de la diabetes ............................... 17
2.3.1 Modelos experimentales .................................................................................................... 17
2.3.2 Inducción química ..............................................................................................................17
2.4 Tratamientos para la diabetes............................................................................................18
2.4.1 Terapia farmacológica........................................................................................................18
2.4.2 Plantas medicinales ...........................................................................................................18
2.4.3 Cnidoscolus chayamansa .................................................................................................. 19
2.5 Daño oxidativo.................................................................................................................... 20
2.6 Radicales libres .................................................................................................................. 21
2.6.1 Generalidades .................................................................................................................... 21
5
2.7 Actividad Antioxidante ........................................................................................................ 24
2.7.1 Generalidades de los antioxidantes ...................................................................................24
2.7.2 Clasificación de los antioxidantes ...................................................................................... 26
2.7.3 Estrés oxidativo .................................................................................................................. 34
2.7.4 Métodos para determinar la capacidad antioxidante ......................................................... 34
3 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................................. 37
4 OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................................... 38
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................. 38
5 MATERIAL Y MÉTODOS..................................................................................................................... 39
5.1 Animales............................................................................................................................. 39
5.1.1 Inducción de diabetes a ratas Wistar ................................................................................. 39
5.2 Materiales........................................................................................................................... 39
5.2.1 Equipo ................................................................................................................................ 39
5.3 Métodos para determinación de Capacidad Antioxidante ................................................. 40
5.3.1 Método de la Capacidad antioxidante total (TAC) con crocin (Lussignoli y col., 1998)..... 40
5.3.2 Método del potencial antioxidante de reducción del fierro (FRAP; Liu y col., 1982). ........ 41
5.3.3 Método del ABTS (Mariken y col., 2004) ........................................................................... 42
5.3.4 Determinación de Fenoles totales (Singleton, 1965) ......................................................... 43
5.3.5 Determinación de Flavonoides (Liu y col., 2002)............................................................... 43
5.3.6 Determinación sanguínea de Glucosa............................................................................... 44
5.3.7 Determinación sanguínea de Triglicéridos......................................................................... 44
5.3.8 Determinación sanguínea de Colesterol ............................................................................ 44
5.3.9 Determinación en orina de Creatinina y Microalbúmina .................................................... 45
5.4 Diseño experimental...........................................................................................................45
5.4.1 Composición proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 45
5.4.2 Primera fase (experimento subcrónico) ............................................................................. 45
5.4.3 Segunda fase (experimento subcrónico) ........................................................................... 46
6
5.4.4 Tercera fase (experimento agudo)..................................................................................... 46
5.5 Análisis estadístico............................................................................................................. 47
6 RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................................ 48
6.1 Composición proximal, fenoles totales y flavonoides ........................................................ 48
6.2 Primera fase del experimento subcrónico.......................................................................... 49
6.3 Segunda fase experimento subcrónico..............................................................................56
6.4 Tercera fase ....................................................................................................................... 63
6.4.1 Curvas hipoglucémicas ...................................................................................................... 63
6.5 Determinación de capacidad antioxidante ......................................................................... 70
6.5.1 Determinación de la capacidad antioxidante total por la técnica TAC por crocin.............. 71
6.5.2 Determinación de la capacidad antioxidante total por la técnica ABTS ............................ 74
7 CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 84
RECOMENDACIONES ................................................................................................................................ 85
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS.......................................................................................... 85
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................................. 86
ANEXO I (REACTIVOS)............................................................................................................................... 95
ANEXO II (PREPARACIÓN DE SOLUCIONES) ........................................................................................ 97
7
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido nutracéutico (Kuti y col., 1996) ..................................................................................... 19 Tabla 2 Las principales especies reactivas de oxígeno en el organismo (Castillo y col., 2001) ................. 22 Tabla 3 Función fisiológica de los antioxidantes no enzimáticos (Zamora, 2007)....................................... 26 Tabla 4 Localización y función de antioxidantes enzimáticos (Zamora, 2007)............................................ 33 Tabla 5 Composición nutrimental de la hoja de chaya ............................................................................... 48 Tabla 6 Concentración de fenoles totales y flavonoides en la hoja, extracto y licuado de chaya .............. 49 Tabla 7 Correlaciones entre grupos de diabéticas con té de chaya, diabéticas agua y sanas con té de
chaya ............................................................................................................................................................ 53 Tabla 8 Correlación entre glucosa, peso corporal, triglicéridos, colesterol total y colesterol de alta
densidad ....................................................................................................................................................... 58 Tabla 9 Correlación peso-glucosa de experimento agudo ......................................................................... 66 Tabla 10 Concentración de colesterol total y colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y
diabéticas tratadas con licuado y extracto de hoja de chaya al 6% al final del experimento de 11 días. ... 68 Tabla 12 Cantidades para preparar curva estándar de ácido gálico para determinación de fenoles totales
...................................................................................................................................................................... 99 Tabla 13 Cantidades para preparar curva estándar de catequina para determinación de flavonoides .... 100 Tabla 11 Resultados comparativos de las técnicas TAC, ABTS Y FRAP ............................................... 105
INDICE DE GRAFICAS Gráfica 1 Consumo de alimento de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el
experimento subcrónico. .............................................................................................................................. 50 Gráfica 2 Consumo de líquido de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el
experimento subcrónico. .............................................................................................................................. 51 Gráfica 3 Concentración de Glucosa de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el
experimento subcrónico. .............................................................................................................................. 52 Gráfica 4 Cambio en los niveles de triglicéridos sanguíneos, en las ratas diabéticas tratadas con té de
chaya y agua durante el experimento subcrónico........................................................................................ 53 Gráfica 5 Volumen (ml) de orina en 12 horas de las ratas diabéticas y sanas, tratadas con té de chaya y
agua.............................................................................................................................................................. 54 Gráfica 6 Cambio en los niveles de microalbúmina en orina, de las ratas diabéticas y sanas tratadas con
té de chaya y agua durante el experimento subcrónico. ............................................................................. 55 Gráfica 7 Cambio en los niveles de creatinina en la orina, de las ratas diabéticas y sanas tratadas con té
de chaya y agua durante el experimento subcrónico................................................................................... 55 Gráfica 8 Consumo de líquido de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya, antioxidante y agua.
...................................................................................................................................................................... 56
8
Gráfica 9 Niveles de glucosa sanguínea en las ratas diabéticas y sanas tratadas con té de chaya,
antioxidante y agua. ..................................................................................................................................... 57 Gráfica 10 Concentración de Glucosa sanguínea al final del experimento en ratas sanas y diabéticas
tratadas con agua, antioxidante y té de chaya, durante 49 días. ................................................................ 59 Gráfica 11 Concentración de Triglicéridos al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas
con agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días.............................................................................. 60 Gráfica 12 Concentración de Colesterol al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas con
agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días..................................................................................... 61 Gráfica 13 Concentración de Colesterol de alta densidad (HDL) al final del experimento en ratas sanas y
diabéticas tratadas con agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días. ............................................. 62 Gráfica 14 Curvas hipoglucémicas de glucosa sanguínea en ratas diabéticas y sanas. ........................... 64 Gráfica 15 Concentración de glucosa en ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6%
durante 11 días............................................................................................................................................. 65 Gráfica 16 Registro de peso de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% durante 11
días............................................................................................................................................................... 66 Gráfica 17 Concentración de glucosa sanguínea al final del experimento en ratas sanas y diabéticas,
tratadas con licuado y extracto de chaya al 6% y agua............................................................................... 67 Gráfica 18 Concentración de triglicéridos en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua al final del experimento de 11 días........................................................................... 68 Gráfica 19 Concentración de colesterol total en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y
extracto al 6% y agua durante 11 días......................................................................................................... 69 Gráfica 20 Concentración de colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas
con licuado y extracto al 6% y agua durante 11 días. ................................................................................. 69 Gráfica 21 Curvas de % de inhibición de μl de plasma de diferentes muestras de tratamientos por TAC . 71 Gráfica 22 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por TAC del experimento
subcrónico de la segunda fase..................................................................................................................... 72 Gráfica 23 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC del experimento subcrónico
de la segunda fase ....................................................................................................................................... 73 Gráfica 24 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por TAC de la tercera fase
...................................................................................................................................................................... 73 Gráfica 25 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC de la tercera fase ............. 74 Gráficas 26 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por ABTS ................................... 75 Gráfica 27 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por ABTS del experimento
subcrónico de la segunda fase..................................................................................................................... 75 Gráfica 28 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS del experimento
subcrónico de la segunda fase..................................................................................................................... 76 Gráfica 29 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por ABTS de la tercera
fase............................................................................................................................................................... 76
9
Gráfica 30 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS correspondiente a la
tercera fase................................................................................................................................................... 77 Gráfica 31 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por FRAP..................................... 78 Gráfica 32 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por FRAP del experimento
subcrónico de la segunda fase..................................................................................................................... 79 Gráfica 33 Comparativo capacidad antioxidante en μM eq de FeSO4 por FRAP del experimento
subcrónico de la segunda fase..................................................................................................................... 79 Gráfica 34 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por FRAP de la tercera
fase............................................................................................................................................................... 80 Gráfica 35 Comparativo capacidad antioxidante en μM/L de FeSO4 por FRAP de la tercera fase ............ 80 Gráfica 36 Comparativo entre técnicas para el grupo de diabéticas con extracto ..................................... 82 Gráfica 37 Comparativo de sensibilidad de las técnicas utilizadas para determinación de antioxidantes.
SE= sana extracto, DE= diabética extracto, SL= sana licuado, DL= diabética licuado DAOx, SA= sana con
agua, DA= diabética con agua, ST= sana con te, DT= diabética con te, SAOx= sana con AOx, DAOx=
diabética con AOx ........................................................................................................................................ 82 Gráfica 38 Curva estándar de ácido gálico para la determinación de fenoles totales en la hoja de chaya.99 Gráfica 39 Curva estándar de catequina en mg/ml para determinar flavonoides en la hoja de chaya. ... 100 Gráfica 40 Cinética de TAC por crocin para ácido ascórbico (mg/ml) ......................................................101 Gráfica 41 Curva estándar de ácido ascórbico por la técnica de TAC ...................................................... 101 Gráfica 42 Curva estándar de Trolox por la técnica de TAC .................................................................... 102 Gráfica 43 Curva de % de inhibición de ácido ascórbico por la técnica de ABTS....................................103 Gráfica 44 Curva de % inhibición de TROLOX por la técnica ABTS........................................................103 Gráfica 45 Curva de % de inhibición de ácido ascórbico por la técnica de FRAP .................................. 104 Gráfica 46 Curva de % de inhibición de FeSO4 por la técnica de FRAP................................................... 104
INDICE DE FIGURAS Figura 1 Hoja de Cnidoscolus chayamansa................................................................................................ 20 Figura 2 Desbalance redox (Calderón, 2007) ............................................................................................. 23 Figura 3 El sitio en la célula donde participan los principales mecanismos antioxidantes (Calderón, 2007)
...................................................................................................................................................................... 24 Figura 4 Sistema antioxidante (Calderón, 2007)......................................................................................... 25 Figura 5 Ácido úrico de antioxidante a prooxidante (Rosa y col., 2006) ..................................................... 28 Figura 6 Mecanismos de defensa contra los daños producidos por las ERO (Castillo y col., 2001). ......... 31
10
ABREVIATURAS
ABAP 2,2´-Azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro
ABTS Ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico
ADP Difosfato de adenosina
AOx Antioxidantes
ATP Trifosfato de adenosina
DPPH 2,2-difenil-1-piperihidracil
DMPO 5,5-dimetilpirrolina-N-óxido
ERN Especies reactivas de nitrógeno
EROs Especies reactivas de oxígeno
FRAP Potencial antioxidante de reducción del fierro
GSH Glutatión reducido
GSH Px Glutatión peroxidasa
MDA Malonaldehído
OMS Organización Mundial de la Salud
ORAC Capacidad de absorbancia del radical de oxígeno
RL Radicales libres
SOD Superóxido dismutasa
STZ Estreptozotocina
TAC Capacidad antioxidante total
TBARs Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
TEAC Capacidad antioxidante en equivalentes de trolox
TRAP Parámetro antioxidante de captura de radicales totales
TROLOX 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid
11
RESUMEN
La Organización Mundial de la Salud considera que la diabetes está alcanzado proporciones de epidemia
en todo el mundo. México ocupa el noveno lugar a nivel mundial con 6,8 millones de casos
diagnosticados, sin embargo es la primera causa de mortalidad a nivel nacional debido a las
complicaciones cardiovasculares. Los radicales libres (RL) juegan un rol crucial en la patología de varias
enfermedades crónico-degenerativas como el cáncer y la diabetes entre otras, debido a la alta reactividad
generada por tener uno o más electrones no apareados y que se combinan rápidamente con alguna
molécula susceptible de ataque ocasionando una reacción en cadena y la formación de otros RL. Los
antioxidantes protegen de los RL, debido a la incapacidad de los organismos biológicos de neutralizar a
los RL por si solos, los cuales se pueden obtener por medio de la dieta alimenticia y de la herbolaria.
En nuestro país se conocen alrededor de 150 plantas para el tratamiento de la diabetes, destaca la
Chaya (Cnidoscolus chayamansa) empleada principalmente como hipoglucemiante, diurético y
antihipertensivo; sin embargo, existen pocos estudios científicos que la respalden. En el presente trabajo
se evaluó el efecto de la hoja de Chaya en un modelo de diabetes inducida. Se utilizaron ratas Wistar
(280-330 g) que recibieron una dosis de estreptozotocina (45 mg/kg/ip); después de 72 h se confirmó la
hiperglucemia (glucosa ≥180 mg/dL). Se administró ad libitum la chaya en té, licuado y extracto de
manera aguda y subcrónica; se realizó: registro semanal de peso, consumo de alimento y líquidos;
niveles sanguíneos de glucosa, triglicéridos y colesterol. Los resultados indicaron que la administración
del té de Chaya no modificó el consumo de alimento y líquido, ni los niveles sanguíneos de glucosa ni
perfil de lípidos. La administración de la chaya cruda en licuado al 6% y extracto acuoso al 6% si
disminuyó los niveles de glucosa en la sangre. En el análisis proximal presenta propiedades similares a la
espinaca. La capacidad antioxidante total se
Por lo que su empleo durante la diabetes probablemente puede resultar adecuado al reducir
complicaciones cardiovasculares generadas por los altos niveles de lípidos durante esta patología.
Palabras clave: Antioxidantes, chaya, diabetes
12
SUMMARY
Evaluate the antioxidant activity of Chaya (Cnidoscolus Chayamansa) on streptozotocin induced diabetic
Wistar rats.
Key worlds: Antioxidants, chaya, diabetes.
13
1 INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónico-degenerativa con una prevalencia del 6% en los
adultos, a nivel mundial; en México es del 9-10% y en el estado de Querétaro del 7-8% de la población
padece la diabetes (INEGI, 2002; Velásquez y col., 2003). A nivel nacional, representa uno de los
principales problemas de salud pública, por el impacto económico y social que generan las
complicaciones crónicas de tipo microvascular como la retinopatía, nefropatía y neuropatía periférica que
afecta nervios de pies y manos, y de tipo macrovascular como la enfermedad cerebro-vascular y la
cardiopatía isquémica, esta última considerada la primera causa de mortalidad en nuestro país (Dorantes
y Martínez, 2004; Barquera y col., 2003).
La diabetes es resultado de las alteraciones metabólicas en la glucosa, lípidos y proteínas;
manifestándose con niveles elevados de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre. Esta alteración
metabólica es generada por el desequilibrio entre su producción por el hígado y la utilización por los
tejidos dependientes e independientes de insulina, y por una secreción deficiente o una resistencia a la
insulina (Becker, 2001; Islas, y Revilla, 2005).
Asociado a estas alteraciones, se tiene el papel del estrés oxidativo en el desarrollo de la diabetes, el cual
se caracteriza por el desequilibrio entre la producción constante de las especies reactivas de oxígeno
(ERO) y la capacidad de defensa antioxidante de las células. Diversos estudios indican que los procesos
crónicos de hiperglicemia conducen a un incremento en la producción de sustancias oxidantes como las
EROs y los radicales libres (RL) los cuales causan daño a las proteínas celulares, lípidos de membrana y
ácidos nucleicos (Halliwell, 1994).
Inicialmente la diabetes es una enfermedad silenciosa, acompañada por alteraciones bioquímicas y
manifestaciones clínicas que se caracterizan por hiperglicemia, poliuria (orina excesiva), polidipsia (sed
anormal), polifagia (hambre exagerada) y pérdida de peso. La gravedad de las complicaciones genera
gastos elevados para la población y el sector salud, por las discapacidades, terapias de rehabilitación y
medicamentos que se requieren (Islas y Revilla, 2005).
En la búsqueda de nuevas alternativas que eleven la calidad de vida del enfermo diabético y reduzcan los
efectos secundarios de los medicamentos alopáticos, se recurre a la medicina tradicional. En México, se
conocen alrededor de 150 plantas para el tratamiento de la diabetes (Alarcón-Aguilera, 1998), entre éstas
sobresale la Chaya (Cnidoscolus chayamansa), por su alto valor nutricional: es rica en proteína, calcio,
potasio, hierro, vitamina C y beta-carotenos (Kuti y Torres, 1996; Molina y col., 1997; Ross y Molina,
2002). Sin embargo, existe controversia y escasa evidencia científica sobre su efecto antidiabético y su
papel en las complicaciones derivadas de la diabetes y del estrés oxidativo (Ross y Molina, 2004). En el
presente trabajo se evaluó el efecto antioxidante de la hoja de Chaya sobre los niveles de glucosa,
colesterol y triglicéridos, así como en las manifestaciones clínicas características de la diabetes y su
actividad antioxidante en un modelo experimental de diabetes en ratas Wistar.
14
2 ANTECEDENTES
2.1 Diabetes
La diabetes mellitus (DM) se caracteriza por una hiperglicemia generada por una alteración en el
metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas. Esto es debido a una deficiencia o carencia de
insulina. Lo que afecta la captación y entrada de glucosa en el músculo y células grasas.
La diabetes Tipo 1 es conocida como diabetes juvenil ya que se desarrolla principalmente en la niñez o
adolescencia, abarcando el 10% del total de los casos. El sistema inmunológico destruye las células β
del páncreas, las cuales producen la insulina que regula la concentración de glucosa en la sangre.
La diabetes Tipo 2 comienza con resistencia a la insulina, un trastorno en el cual las células no utilizan la
insulina de manera adecuada. A medida que aumenta la necesidad de insulina, el páncreas pierde
gradualmente su capacidad de producir insulina. En ausencia de insulina, las células del tejido adiposo
intentan proveer combustible movilizando las reservas grasas. Los ácidos grasos libres se utilizan
inicialmente para la producción de energía, generando como producto de su metabolismo cuerpos
cetónicos. Estos ácidos son excretados por el riñón junto con bicarbonato de sodio, ocasionando una
caída en el pH del plasma, cuyo resultado es una acidosis (cetoacidosis diabética), lo que genera daño
renal progresivo (Greenspay y Gardner, 2005).
La diabetes, especialmente la de tipo 2, afecta ahora al 5,9% de la población adulta del mundo con casi
un 80% del total en los países en desarrollo. Las regiones con las tasas más altas son el Mediterráneo
oriental y el Oriente Medio, donde el 9,2% de la población adulta se ve afectada, y Norteamérica (8,4%).
Las cifras más elevadas, sin embargo, se encuentran en el Pacífico occidental, donde unos 67 millones
de personas tienen diabetes, seguido de Europa, con 53 millones (IDF, 2006).
2.1.1 Epidemiología
La India encabeza la lista de los diez países del mundo con el mayor número de personas con diabetes
diagnosticada, con una cifra actual de 40,9 millones, seguida de China con 39,8 millones. Por detrás
están EE.UU., Rusia, Alemania, Japón, Pakistán, Brasil, México y Egipto. La Federación Internacional de
Diabetes (IDF 2006) estima que en el mundo habrá 246 millones de personas con diabetes en este 2007.
La prevalencia (proporción de la población que padece la enfermedad) es variable en distintas
comunidades, siendo muy alta en algunos grupos étnicos como en los Polinésicos y en los indígenas
Pima de EE.UU., donde el 25% de su población presentan DM tipo 2. México es uno de los países con
mayor prevalencia de diabetes tipo 2, se calcula que ocupa el noveno lugar a nivel mundial de número de
diabéticos (Islas y Revilla, 2005).
2.1.2 Diagnóstico
Para el diagnóstico definitivo de diabetes mellitus y otras categorías de la regulación de la glucosa, se usa
el nivel de glucosa en plasma o suero. En ayunas de 10 a 12 horas, las glicemias normales se
15
caracterizan por valores < 110 mg/dL. La intolerancia a la glucosa se diagnostica cuando el sujeto
presenta un valor de glucosa en ayuno < 126 mg/dL y a los 120 minutos post sobrecarga oral de glucosa
entre 140 y 199 mg/dL.
En la prueba de tolerancia a la glucosa oral (curva de tolerancia a la glucosa), la medición en plasma se
hace dos horas posteriores a la ingesta de 75 g de glucosa en 30 ml de agua; la prueba es positiva con
cifras mayores o iguales a 200 mg/dL, además de los síntomas característicos de la diabetes como son:
poliuria, polidipsia, polifagia y pérdida de peso (Greenspay y Gardner, 2005).
2.1.3 Factores de riesgo
Los factores más importantes en la aparición de una diabetes tipo 2 son, además de una posible
resistencia a la insulina o intolerancia a la glucosa, el exceso de peso y la falta de ejercicio. Para la
diabetes tipo 1 principalmente influye la herencia genética, o bien, alguna patología que influya en el
funcionamiento del páncreas. La actividad física mejora la administración de las reservas de azúcares del
cuerpo y actúa como reguladora de las glucemias. Las reservas de glucógeno aumentan y se dosifican
mejor cuando el cuerpo está en forma, ya que las grasas se queman con más facilidad, reservando más
los hidratos de carbono para esfuerzos intensos o en caso de que la actividad sea muy larga que las
reservas aguanten más tiempo. Dos factores a destacar son la alteración en la glucosa de ayuno mayor o
igual a 110 mg/dL (pero < 126 mg/dL), y la intolerancia a la glucosa de 140 mg/dL (pero < 200 mg/dL)
medida a las 2 horas de ingerir una solución glucosada (Dorantes y Martínez, 2004).
2.1.4 Complicaciones
Independiente del tipo de diabetes mellitus, un nivel elevado de azúcar en la sangre conduce a las
siguientes enfermedades (Gill y col., 2002):
• Daño de los pequeños vasos sanguíneos (microangiopatía),
• Daño de los nervios periféricos (polineuropatía).
• Síndrome del pie diabético (heridas difícilmente curables y la mala irrigación sanguínea de los
pies, puede conducir a laceraciones y eventualmente a la amputación de las extremidades
inferiores).
• Daño de la retina (retinopatía).
• Daño renal (nefropatía).
• Hígado graso o hepatitis de hígado graso (adipohepatía).
• Daño de los vasos sanguíneos grandes (macroangiopatía): trastorno que conduce a infartos,
apoplejías y trastornos de la circulación sanguínea en las piernas.
• Hiperglucemia es la elevación del nivel de glucosa en sangre por encima de los 110 mg/dL en
ayunas o 180 mg/dL en valor postprandial.
• Hipoglucemia es la disminución del nivel de glucosa en sangre por debajo de los 50 mg/dL.
Puede ser consecuencia de ejercicio físico no habitual o sobreesfuerzo, sobredosis de insulina,
16
cambio en el lugar habitual de inyección, ingesta insuficiente de hidratos de carbono, diarreas,
etc.
• Coma diabético es la consecuencia más grave de la diabetes, pueden presentarse valores de
glucosa en la sangre de 1000 mg/dL (los valores normales de glucosa en la sangre son de 80 a
120 mg/dL), generando una sobre acidificación de la sangre (acidosis metabólica). Este coma es
ocasionado por infecciones, errores en la alimentación (demasiados carbohidratos) o por una
dosificación errónea de la insulina.
2.2 Insulina
En los islotes pancreáticos se secretan algunas hormonas, las células β producen la insulina; las células
α son productoras de glucagón (hormona hiperglucemiante o de contrarregulación), y células delta
secretan somatostatina (hormona que inhibe tanto la secreción de insulina como la de glucagón),
mientras que un pequeño número de células pancreáticas (denominadas células F) se encargan de la
producción del polipéptido pancreático. La insulina es una hormona hipoglucemiante, se sintetiza a partir
de una larga cadena precursora, o preproinsulina, la cual se fracciona para dar lugar a la molécula de
proinsulina, que tiene 86 aminoácidos. Esta última, a su vez, es procesada por enzimas de conversión,
generando insulina y una pequeña fracción peptídica (péptido C). La insulina es un polipéptido constituido
por dos cadenas de aminoácidos denominadas A y B, que están unidas por dos puentes de disulfuro
conteniendo en total 51 aminoácidos (Figueroa, 1997; Dorantes y Martínez, 2004).
La insulina actúa sobre el metabolismo de los hidratos de carbono, los lípidos y las grasas. Facilita el
transporte de glucosa a través de la membrana celular, promueve su transformación en glucosa -6-
fosfato, favorece la síntesis del glucógeno hepático y muscular; y disminuye la gluconeogénesis
(Figueroa, 1997; Dorantes y Martínez, 2004).
2.2.1 Metabolismo de la glucosa A nivel hepático la glucosa no requiere de transportador, pero la menor actividad de la glucocinasa
(esencial para la fosforilación) y de la glucógeno sintetasa, limitan la síntesis de glucógeno. A nivel
muscular, la menor actividad de la hexocinasa y del glucógeno sintetasa, tienen igual efecto sobre la
limitada cantidad de glucosa transportada. Se presenta menor captación de la glucosa por el tejido
muscular y adiposo debido al decremento de la activación del transportador de la glucosa (Glut 4) en los
tejidos dependientes, reduciendo su síntesis o interfiriendo con su translocación desde el citosol a la
membrana. Se manifiesta por un menor número de moléculas en la membrana y por una menor captación
y transporte de glucosa (Dorantes y Martínez, 2004; Greenspay y Gardner, 2005).
2.2.2 Metabolismo lipídico La insulina favorece la disminución de ácidos grasos libres circulantes (aumenta el catabolismo de los
triglicéridos en el tejido adiposo y del transporte de ácidos grasos hacia el hígado al reducir la producción
de la lipasa del tejido adiposo), a consecuencia de cuatro mecanismos (Dorantes y Martínez, 2004;
Greenspay y Gardner, 2005):
a) Inducción de la lipogénesis,
17
b) inhibición de la lipólisis,
c) disminución de la cetogénesis
d) disminución de la acidosis.
2.2.3 Metabolismo proteico
Esta relacionado con la reducción del efecto de la insulina a nivel transcripcional y post-transcripcional de
enzimas involucradas en el metabolismo de las proteínas. Existe una reducción de su síntesis e
incremento de su catabolismo especialmente a nivel hepático y muscular. Esto último está ligado a una
mayor actividad lisosomal y de proteasas no lisosomales. El resultado es un balance nitrogenado negativo
(Dorantes y Martínez, 2004; Greenspay y Gardner, 2005).
2.2.4 Metabolismo de las lipoproteínas
El déficit insulínico reduce la actividad del sistema lipasa lipoproteico periférico, ya sea por defecto de su
síntesis, translocación o activación. Esto se traduce en una reducción del catabolismo de las lipoproteínas
ricas en triglicéridos; las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones; y se detecta por incremento
de los niveles de triglicéridos séricos en ayunas y postprandiales (Greenspay y Gardner, 2005)
2.3 Modelos experimentales en animales para el estudio de la diabetes
2.3.1 Modelos experimentales
Los modelos experimentales de diabetes en animales se utilizan tanto para el estudio de la etiología de la
diabetes mellitus como para el estudio de los mecanismos involucrados en las complicaciones diabéticas
a largo plazo, ya que las características generales de la diabetes en animales son similares a las de la
diabetes humana (Fuster, 2004).
Los diferentes modelos experimentales utilizados son cuatro: los modelos que utilizan agentes químicos
para la inducción de la diabetes (diabetes química); los modelos en los que se induce la diabetes
mediante procedimientos quirúrgicos (diabetes quirúrgica); aquellos en los que la diabetes se induce por
infecciones víricas (diabetes vírica); y, por último, los modelos de diabetes espontánea.
Para este trabajo se utilizó el modelo de inducción química.
2.3.2 Inducción química
Se ha demostrado que la administración de diferentes sustancias químicas en animales provoca
situaciones experimentales similares a la diabetes. Entre estos agentes químicos, el alloxano y la
estreptozotocina (STZ) parecen ser los más efectivos y son los más comúnmente utilizados. Ambas
sustancias actúan destruyendo las células β-pancreáticas por lo que provocan los dos tipos de diabetes;
ambas sustancias pueden administrarse vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
La administración de estreptozotocina (STZ) o alloxano, en dosis altas induce severa insulinodeficiencia y
hasta cetoacidosis, mientras que las bajas dosis causan una parcial reducción de la masa de células ß, lo
18
cual puede aprovecharse para producir un estado diabético sin tendencia a la cetoacidosis. La STZ es
más utilizada por su mayor acción citotóxica, pero la sensibilidad varía según la especie animal, la línea,
el sexo, la edad y el estado nutricional. En los recién nacidos, ambas sustancias pueden ser inyectadas
alternativamente. Cuando se administran durante la primera semana de vida, provocan la enfermedad
tardíamente generando normalmente diabetes tipo 2, si la STZ es inyectada por vía intravenosa (100
mg/kg) el primer día del nacimiento, las células ß se destruyen aunque aproximadamente la mitad se
regenera gradualmente (Szkudelski, 2001; Hugués y col.., 2002; Fisher, 2003).
Frecuentemente se usa una sola dosis vía intravenosa en ratas adultas aplicando entre 40 a 60 mg/kg de
peso corporal (PC); para aplicaciones vía intraperitonial se da una dosis única de 40 a 50 mg/kg de PC.
Dos horas después de la inyección se observa la hiperglicemia con bajos niveles de insulina en la sangre
y seis horas después de la inducción se presenta una hipoglicemia junto con un incremento en los niveles
de insulina en sangre. Finalmente se desarrolla la hiperglicemia y los niveles de insulina en sangre
decrecen debido a las anormalidades que se generan en la función de las células β (Szkudelski, 2001).
Los animales tratados tanto con alloxano como con STZ presentan la mayoría de las complicaciones
asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatías, las neuropatías, las disfunciones arteriales
coronarias, las alteraciones hepáticas, traqueales, del tejido conectivo, gastrointestinales, etc. (Fuster,
2004).
2.4 Tratamientos para la diabetes
La diabetes mellitus es un proceso crónico-degenerativo que se puede controlar, los tratamientos para su
control están basados en cuatro factores: la educación e información concerniente a la enfermedad,
ejercicio físico, dieta y fármacos. Así como, la vigilancia constante de los niveles de glucemia del paciente
para evitar complicaciones.
2.4.1 Terapia farmacológica
El tratamiento farmacológico para la diabetes tiene como objetivo principal disminuir la hiperglicemia,
aunque el mecanismo a través del cual ejerce su acción varía dependiendo de la naturaleza química.
Estos se clasifican en insulina e hipoglucemiantes orales, entre estos se encuentran (Alpizar, 2001):
• Sulfonilureas que estimulan al páncreas a producir más insulina,
• Biguanidinas que disminuyen la cantidad de azúcar producida en el hígado,
• Inhibidores de la alfa-glucosidasas que retardan la absorción de glucosa del intestino,
• Tiazolidinedionas que producen mayor sensibilidad a la insulina.
2.4.2 Plantas medicinales
Considerando el alto costo de los tratamientos farmacológicos, los efectos secundarios y las
complicaciones derivadas del empleo crónico de los fármacos, se está recurriendo a la medicina
alternativa mediante el empleo de la herbolaria, en donde la utilización de plantas con propiedades
medicinales constituye un recurso para complementar los tratamientos alopáticos y mejorar la calidad de
19
vida. Se conocen a nivel mundial aproximadamente 800 plantas usadas para el control de la diabetes, de
las cuales se encuentran entre 150 a 269 plantas en México y entre estas destaca la Chaya; sin embargo
hay muy pocos estudios científicos que soporten sus efectos antidiabéticos (Alarcón y Aguilera, 1998;
Hernández y col., 2002).
2.4.3 Cnidoscolus chayamansa
La chaya es una verdura cultivada en la región Maya de Guatemala, Belice, el Sureste de México,
península de Yucatán y partes de Honduras. Aunque es poco conocida afuera de esta región, la evidencia
sugiere que la chaya era una planta importante para los antiguos Mayas de la península de Yucatán, y tal
vez en otras partes de la región Maya. Las hojas son amplias y pueden consistir en 3 o más lóbulos, sus
flores son blancas. Las semillas y la fruta madura son raras y desconocidas (McVaugh, 1994). Dada la
facilidad de cultivarla, su productividad potencial, y sobre todo su alto valor nutritivo, se ha propuesto a la
chaya como cultivo potencial para regiones afuera de Mesoamérica (Kuti y Torres, 1996; Molina y col.,
1997; Ross y Molina, 2002).
En la siguiente Tabla 1 se puede observar que la chaya presenta mayor contenido nutrimental que la
espinaca a excepción del contenido de humedad, por lo que representa una fuente alimenticia importante.
Tabla 1 Contenido nutracéutico (Kuti y col., 1996)
Componente Chaya Espinaca
Agua (%) 85.3 90.7
Proteínas (%) 5.7 3.2
Grasa (%) 0.4 0.3
Fibra (%) 1.9 0.9
Calcio (mg/100 g) 199.4 101.3
Fósforo (mg/100 g) 39.0 30.0
Potasio (mg/100 g) 217.2 146.5
Hierro (mg/100 g) 11.4 5.7
Ac. Ascórbico (mg/100 g) 164.7 48.1
Las partes comestibles de la planta de la chaya son las hojas (ver Figura 1), que se consumen en forma
similar a la espinaca. Es una fuente alimenticia importante por su alto contenido de proteínas, minerales
como calcio, potasio, hierro, fósforo, vitaminas (A, C y E), además de riboflavina y tiamina; por lo que en
términos nutricionales es superior a la acelga, lechuga, berros y col, así como con la espinaca (Kuti y
Torres, 1996; Ventura, 2004).
20
Figura 1 Hoja de Cnidoscolus chayamansa
La chaya se ha recomendado tradicionalmente para diversos padecimientos incluyendo la diabetes, la
obesidad, las piedras del riñón, hemorroides, acné, problemas visuales y de encías (Díaz-Bolio, 1975).
Las hojas de chaya se han tomado como laxante, diurético, para la circulación, para mejorar la digestión,
para estimular la lactancia y endurecer las uñas. Pero como otras plantas alimenticias como las habas y
mandioca, las hojas crudas contienen glucósidos cianogénicos, los cuales son tóxicos por formar ácido
cianhídrico (HCN), un compuesto tóxico el cual es destruido fácilmente por medio de la cocción (Molina y
col., 1999; González y col., 2003).
A la chaya se le ha atribuido un efecto hipoglucemiante de acuerdo a estudios realizados por Kuti y Torres
en 1996, en donde fue administrado de forma intragástrica el té de chaya a conejos diabéticos inducidos
con estreptozotocina, los cuales presentaron un decremento en los niveles de glucosa.
2.5 Daño oxidativo
Una gran cantidad de estudios epidemiológicos han demostrado que las personas que consumen una
dieta rica en frutas y verduras presentan un menor riesgo de desarrollar enfermedades crónicas
degenerativas como son la ateroesclerosis, hipertensión, diabetes, isquemia, artritis, colitis ulcerativa,
hipoxia, fibrosis quística y cáncer. Esto ha conducido a intentos para identificar los compuestos
específicos responsables de los efectos positivos en la salud por el consumo de alimentos ricos en
sustancias antioxidantes como vitamina C y E, carotenoides, compuestos fenólicos, flavonoides, selenio y
otros, que previenen o disminuyen el daño oxidativo (Avello y Suwalsky, 2005; Fernández y col., 2006).
El daño oxidativo se genera por cambios en los sistemas de defensa ocasionando:
• Disminución en la entrada de las moléculas antioxidantes.
• Aumento en el metabolismo de antioxidantes.
• Falla en los sistemas de reparación.
• Disminución de afinidad y concentración de moléculas que secuestran metales de transición.
21
• Aumento de enzimas oxidantes y blancos celulares
• Isoformas de enzimas que generan mas oxidantes
• Estados patológicos derivados de la generación de radicales libres (RL).
En la diabetes mellitus el incremento de RL reduce la capacidad antioxidante al activar la vía de los
polioles, que disminuyen el NAPDH, e inhiben las enzimas NADPH dependientes como la glutation
reductasa (Atalay y Laaksonen, 2002). Se habla de estrés oxidativo cuando la producción de radicales
libres supera la capacidad antioxidante del organismo (Dorantes y Martínez, 2004; Calderón, 2007).
2.6 Radicales libres
2.6.1 Generalidades
El daño oxidativo en los sistemas biológicos se debe a la generación de radicales libres (RL) los cuales
son moléculas o átomos con un electrón desapareado en su orbital externo, que lo vuelve muy inestable,
reactivo y de vida muy corta; con gran capacidad para combinarse inespecíficamente con diversas
moléculas de la célula (Halliwell, 1994).
Los RL se pueden formar en el interior o exterior de las células, o incluso diseminados por todo el
organismo, como producto de sus actividades fisiológicas normales, a partir de procesos como la hipoxia,
y de fuentes exógenas como radiaciones, fármacos, contaminantes ambientales y la dieta, entre otros.
Los RL pueden lesionar algunos componentes celulares, entre los cuales están los lípidos que presentan
peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados en membranas y organelos; los carbohidratos sufren
despolimerización de los polisacáridos; las proteínas se oxidan en los puentes sulfhidrilos de las enzimas
y los ácidos nucléicos modifican sus bases, generando mutaciones (González-Torres, 2000).
Los RL pueden provocar la acumulación de reacciones oxidativas en las moléculas de vida larga como el
colágeno y la elastina, pueden despolimerizar los mucopolisacáridos, favorecer la acumulación de
materiales como el pigmento de envejecimiento, alterar las membranas de las mitocondrias y lisosomas,
provocar una fibrosis arteriolocapilar y disminuir la actividad de algunas enzimas.
Cuando los radicales, especialmente OH.- y O2.- producen radicales alquilperóxido, facilitan la
perpetuación de la cadena de reacciones de oxidación de los lípidos, con daños similares sobre las
proteínas y los ácidos nucleicos. En el proceso de captación de un electrón o la formación de una pareja
de electrones, se produce una reacción entre moléculas y una de las moléculas puede convertirse en otro
RL y perpetuar el proceso. Aunque los radicales libres son de vida muy corta (del orden de una milésima
de segundo), son tremendamente reactivos; por ejemplo un RL puede dañar un millón de moléculas
mediante éste proceso de auto-perpetuación (Zamora, 2007).
Las mitocondrias son la fuente principal de radicales libres, son responsables de más del 90% del
consumo de oxígeno celular. En los sistemas biológicos los RL proceden principalmente del metabolismo
del oxígeno. Una consecuencia directa de este proceso es que entre los nutrientes iniciales y la
generación de energía al final del proceso, se forman varias moléculas con diferente grado de oxidación.
Este fenómeno se efectúa a nivel de la cadena de transporte de electrones, que es la última etapa de
22
producción de protones de alta energía, y cuyo pasaje a través de la membrana interna mitocondrial
genera un gradiente eléctrico que aporta la energía necesaria para formar el ATP o adenosina trifosfato
(Rodríguez y col., 2001). Otras fuentes de RL son los peroxisomas, organelos del citosol, muy ricos en
oxidasas, generan H2O2 el cual es depurado por enzimas específicas como la catalasa, y es
transformado en agua.
NADPH + 2O2 NADP+ + H+ + 2O2.-
NADH+ + 2O2 NAD+ + H+ + 2O2.-
NADH+ + 1/2O2 + ADP + P NAD+ + H+ + 2H2O + ATP La reducción del oxígeno da lugar a tres formas incompletas reducidas del oxígeno entre este y el agua,
el radical anión superóxido (O2.-), el peróxido de oxígeno (H2O2), que no es un radical pero puede
generarlos y el radical hidroxilo (˙OH). El O2 necesita del H2O2 para producir la especie oxidante (˙OH),
mientras que el H2O2 no necesita al O2 para poder hacerlo. Esto, junto con la presencia del H2O2 a
concentraciones superiores del O2, convierte al peróxido de hidrógeno en una especie muy reactiva capaz
de generar daño oxidativo aunque no sea un RL. Se ha demostrado la generación de O2 y H2O2 por parte
de enzimas y mediante la autooxidación de moléculas biológicas en casi todas las fracciones celulares
incluyendo la citosólica, mitocondrial, peroxisómica, microsómica, membrana plasmática y nuclear. La
presencia de estos dos radicales puede generar ˙OH en la mayoría de los rincones celulares (Céspedes y
Sánchez, 2000).
Las especies reactivas de oxígeno (EROs) pueden tener en nuestro organismo un origen endógeno
relacionado con el metabolismo del oxígeno y con distintas reacciones de defensa de nuestro sistema
inmunológico. Se describen a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2 Las principales especies reactivas de oxígeno en el organismo (Castillo y col., 2001)
ERO PARTICULARIDAD EN EL ORGANISMO
Anión superóxido (-O•2) Formado en reacciones de autoxidación (flavoproteínas, ciclo redox)
Radical hidroxilo (•OH) Formado en las reacciones de Fenton o en la de Haber-Weiss catalizada
por metales (hierro). Es la especie de vida media más corta y el más
reactivo de todos. Puede captar los electrones de los tioles, por lo que
interactúa con las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos, alterando
la información genética de las células. También estimula la peroxidación
lipídica, afectando a los fosfolípidos de las membranas celulares
Radical peroxilo (ROO•) Formado a partir de hidroperóxidos orgánicos o del ROOH por pérdida de
H+
Peróxido de hidrógeno
(H2O2)
Formado a partir de la dismutación del –O•2 o puede proceder
directamente del O2. Al no contener electrones despareados no puede
23
ser considerado como un auténtico radical libre
Acido hipocloroso (HOCl) Producido por acción del estallido respiratorio de las células defensivas.
Se origina a partir del H2O2 por acción de la mieloperoxidasa. Tampoco
puede ser considerado estrictamente como un radical libre
Oxido nítrico (•NO) Producido por la unión del oxígeno con el nitrógeno, induciendo
lipoperoxidación lipídica
Iones Fe+++ y Cu++ Actúan como catalizadores en la formación de radicales hidroxilo, de ahí
la importancia que adquieren las proteínas encargadas de transportar
estos iones, manteniéndolos "secuestrados"
Oxígeno singlete (1O2) Es el oxígeno molecular simple, el primer estado excitado. Se forma por
la activación del O2 (luz solar, radiaciones)
También pueden provenir de fuentes externas: tabaco, contaminación del aire, radiación ultravioleta y de
alta energía, ozono y ciertos medicamentos. Al elevarse o disminuir las concentraciones fisiológicas de
las EROs pueden acarrear importantes alteraciones funcionales como la aterosclerosis, el envejecimiento,
Parkinson, cáncer o diabetes por nombrar algunas. En la enfermedad diabética se ha encontrado una
relación directa entre el mal control metabólico y la presencia de hiperglucemia con respecto al
incremento de estrés oxidativo del organismo, con elevados niveles de EROs en todos los sistemas
estudiados. Un desbalance redox provoca el envenenamiento y alteración de todos los compuestos y
procesos enzimáticos expuestos, en la Figura 2 se muestra un ejemplo (Chihuailaf y col., 2002;
Fernández y col., 2006; Calderón, 2007).
Figura 2 Desbalance redox (Calderón, 2007)
1/2O2 + 2H+ + 2e- H2O
NADH NAD+ + H+ + 2e-
Piruvato + H+ + e- Lactato
NADH + 1/2O2 H2O
Piruvato + NADH Lactato
Negativo -0.19 0 +0.32 +0.82 Positivo
24
También se tienen radicales de tioles, que se caracterizan por contener azufre como grupo reactivo. Otros
radicales contienen carbono, fósforo o nitrógeno como centro reactivo, conocido este último como
especies reactivas de nitrógeno; otros como el hidrógeno atómico (H ), tetraclorometilo (CCl3 ) y metales
de transición como el Fe, Cu, Co, Se, Zn y Hg.
2.7 Actividad Antioxidante
2.7.1 Generalidades de los antioxidantes
El organismo dispone de mecanismos de defensa antioxidante frente a las especies reactivas de oxígeno,
que comprenden sistemas enzimáticos y no enzimáticos. Las fuentes principales son las enzimas
asociadas al metabolismo del ácido araquidónico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo
P-450 (Céspedes y Sánchez, 2000), ver Figura 3 .
Figura 3 El sitio en la célula donde participan los principales mecanismos antioxidantes (Calderón, 2007)
Las enzimas como superóxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa o glutation reductasa, neutralizan
las especies reactivas, como los aniones superóxidos y el peróxido de hidrógeno que son productos
25
secundarios importantes del metabolismo oxidativo. Los sistemas defensivos no enzimáticos abarcan una
serie de compuestos antioxidantes como albúmina, transferrina, glutatión, bilirrubina, ácido úrico,
ubiquinona o melatonina. En ciertas situaciones extremas, estas defensas no son suficientes y las
especies reactivas producen daño oxidativo, tanto en biomoléculas como en componentes celulares
(Fernández y col., 2006).
En los sistemas antioxidantes defensivos, un primer grupo trabaja sobre la cadena del radical inhibiendo
los mecanismos de activación y un segundo grupo neutraliza la acción de los radicales libres ya
formados, por tanto detiene la cadena de propagación. En este grupo pueden encontrarse enzimas
destoxificadoras notables como la superóxido dismutasa y la catalasa, que producen peroxidasas
particularmente importantes como la glutatión peroxidasa. Las enzimas utilizan en su mayoría elementos
trazas como cofactores para sus reacciones. Muchas de estas moléculas las podemos encontrar en la
fase lipídica, otras por el contrario son lipofóbicas. El la Figura 4 se encuentra el sistema antioxidante a
nivel celular, el cual protege de los efectos de los radicales libres (Céspedes y Sánchez, 2000; Calderón,
2007).
Figura 4 Sistema antioxidante (Calderón, 2007)
26
2.7.2 Clasificación de los antioxidantes
Los antioxidantes (AOx) se pueden clasificar en enzimáticos y no enzimáticos.
Los no enzimáticos constituyen un grupo heterogéneo de moléculas lipofílicas e hidrofílicas que capturan
RL y originan especies químicas menos nocivas para la integridad celular. El mecanismo de acción
involucrado es la donación de un electrón a un RL con el fin de estabilizarlo.
A continuación se pueden ver de manera general en la
Tabla 3 su función fisiológica.
Tabla 3 Función fisiológica de los antioxidantes no enzimáticos (Zamora, 2007).
ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS
FUNCION FISIOLOGICA
Vitamina E Principal antioxidante presente en la membrana celular, neutraliza el oxígeno
singlete, captura radicales libres hidroxilos y anión superóxido; neutraliza
peróxidos.
Vitamina C Efecto eliminador de radicales, neutraliza el oxígeno singlete, captura radicales
hidroxilos, anión superóxido; y regenera la forma oxidada de la vitamina E.
Acido úrico Su efecto es eliminar los radicales hidroxilo
Glutation Tiene varios efectos en la defensa antioxidante celular
Ácido lipoico Antioxidante eficaz y es un sustituto eficaz del glutatión
Carotenoides Antioxidante de lípidos
Bilirrubina Producto del metabolismo del grupo hem de la hemoglobina, tiene un efecto
antioxidante a nivel extracelular
Ubiquinonas Derivado de quinonas lipídicas solubles, cuyas formas reducidas tienen efectos
eficaces como antioxidantes
2.7.2.1 Antioxidantes no enzimáticos hidrofílicos Los AOx no enzimáticos hidrofílicos se ubican principalmente en el citosol, matriz mitocondrial y nuclear y
en fluidos extracelulares; éstos incluyen vitamina C, glutatión, ácido úrico, bilirrubina, albúmina y
flavonoides polifenólicos (Chihuailaf y col., 2002).
2.7.2.1.1 Vitamina C (Ácido Ascórbico)
Se encuentra bajo la forma de ascorbato, distribuido intra y extracelularmente. Reacciona en forma
directa con los RL superóxido, hidroxilo y varios hidroperóxidos lipídicos. Este proceso transforma el
ascorbato en el RL deshidroascorbato. El retorno a su forma nativa es por acción enzimática o por
sustratos celulares tiólicos. A pesar de su manifiesta propiedad AOx, el ascorbato puede desempeñarse
27
como un potente prooxidante en presencia de excesivas concentraciones de iones Fe+3 y Cu+2(Rodríguez
y col., 2001; Chihuailaf y col., 2002; Benítez, 2006). Hay estudios que sugieren que su acción antioxidante
contra el estrés oxidativo de la mucosa gástrica puede deberse a la vitamina C, al ser un potente
antioxidante soluble en agua atrapa y neutraliza una variedad de especies reactivas del oxígeno, como
hidroxilo, alcoxilo, peroxilo, anión superóxido, radicales hidroperóxilo y radicales reactivos del nitrógeno a
concentraciones muy bajas; además puede regenerar otros antioxidantes como el alfa-tocoferoxilo y el
beta-caroteno a partir de sus especies radicales. Otros estudios han demostrado que el ácido ascórbico
es además inhibidor de la nitrosación con potencial importancia como eliminador de nitritos in vivo,
permite disminuir los riesgos de aparición de cáncer de estómago y esófago, aumenta la función
inmunológica al aumentar las células killer naturales y la función de los linfocitos T y B, inhibe el
crecimiento de distintas células de melanoma humano e induce apoptosis en células leucémicas
promielocíticas HL-60 y en fibroblastos de seres humanos, combate el cáncer al promover la síntesis de
colágeno y prevenir así que los tumores invadan otros tejidos; y se ha sugerido que un complemento
diario de 1 g de vitamina C podría proteger a las personas contra la mutagénesis inducida por la
quimioterapia (Zamora, 2007).
2.7.2.1.2 Glutatión
Su forma reducida (GSH) es un tripéptido ((γ-glutamil-cisteinil-glicina), que presenta una distribución
tisular variable y constituye el compuesto tiólico de bajo peso molecular más abundante en las células de
mamíferos. Sus propiedades químicas le permiten actuar frente a numerosos compuestos oxidantes, tales
como peróxido de hidrógeno, superóxido, hidroxilo y especies reactivas de carbono, además reduce el
RL tocoferoxilo y el RL deshidroascorbato y los reconvierte a su forma original. Las alteraciones en el
metabolismo del glutatión juegan un papel importante en la defensa antioxidante. La reducción del
glutatión destoxifica el efecto de las especies reactivas de oxígeno como son el peróxido de hidrógeno y
la peroxidación lipídica directamente o en el metabolismo catalizado de la glutatión peroxidasa. El
glutatión también regenera a los antioxidantes en fase lipídica y acuosa como el ácido ascórbico y el
tocoferol. El glutation reducido cataliza el NADPH dependiendo de la reducción u oxidación del glutatión,
dando mantenimiento intracelular al almacenamiento de glutatión y favoreciendo al estado de reducción.
En los pacientes diabéticos tipo 2 decrece el glutatión reducido y se incrementan los niveles del glutatión
S transferasa (Atalay y Laaksonen, 2002).
2.7.2.1.3 Ácido úrico
Aunque se ha considerado un producto terminal del metabolismo de las purinas, su función como AOx
biológico, intra y extracelular, ha comenzado a reconocerse. Su mecanismo de acción aparentemente
sería prevenir la oxidación de la Vitamina C y formar complejos con los metales Fe y Cu (Rodríguez y col.,
2001). Es uno de los AOx biológicos más abundante en el organismo, por lo mismo el ácido úrico puede
cambiar su actividad química de antioxidante a prooxidante cuando penetra en la placa aterosclerótica,
contribuyendo en ese medio a oxidar las lipoproteínas en pacientes con síndrome metabólico y diabetes
28
mellitus tipo 2; esto ha conducido a proponer que la concentración de ácido úrico mayor de 4 mg/dL en
plasma es un signo de alerta en pacientes con elementos de riesgo cardiovascular, en la Figura 5 se
puede observar el ciclo en donde el ácido úrico pasa a ser un prooxidante (Rosa y col., 2006).
Figura 5 Ácido úrico de antioxidante a prooxidante (Rosa y col., 2006)
2.7.2.1.4 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son sustancias que poseen un anillo aromático unido a uno o más
constituyentes hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales (ésteres, metil ésteres, glucósidos, etc.).
Los compuestos fenólicos (catequinas, cianidinas, quercetinas) protegen a las plantas contra los daños
oxidativos y tienen el mismo efecto en el organismo humano. Estos actúan bloqueando la acción de
enzimas específicas que generan inflamación, además actúan como potentes quelantes de metales y
capturadores in vitro de EROs y especies reactivas del nitrógeno (ERN). Pueden ser liposolubles o
hidrosolubles y se localizan intra y extracelularmente. Los fenoles también modifican la aglomeración de
las plaquetas e inhiben la activación de carcinogénesis (Tunalier, 2004; Pourmorad, 2006).
2.7.2.1.5 Flavonoides
Los flavonoides contienen en su estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos y
excelentes propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran
capacidad antioxidante. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los
radicales hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de
29
peroxidación lipídica y se ha descrito su capacidad de modificar la síntesis de eicosanoides (con
respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregación plaquetaria (efectos
antitrombóticos) y de proteger a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación (prevención de la placa
de ateroma).
Se han identificado más de 5.000 flavonoides, entre los que se pueden destacar: Citroflavonoides
(quercitina, hesperidina, rutina, naranjina y limoneno), isoflavonoides (genisteína, daidzeina),
proantocianidinas, antocianidinas, ácido elágico, catequiza, kaemferol.
El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica.
Pueden unirse a los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN;
quelar iones metálicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y
depurar radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologías tales
como diabetes mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, e
inflamaciones (Martínez y col., 2002; Pérez, 2003).
Por otra parte, se ha podido conocer que también inhiben enzimas involucradas indirectamente en los
procesos oxidativos, como la fosfolipasa A, al mismo tiempo que estimulan otras con reconocidas
propiedades antioxidantes, la catalasa (CAT) y la superóxido dismutasa (SOD). De esta forma los
flavonoides interfieren en las reacciones de propagación de RL y en la formación del radical en sí (Pérez,
2003).
2.7.2.2 Antioxidantes no enzimáticos lipofílicos
Los AOx no enzimáticos de naturaleza lipofílica se ubican en membranas y, generalmente, bloquean la
formación de hidroperóxidos, o interrumpen la propagación de la peroxidación de lípidos (PL) (Chihuailaf y
col., 2002), éstos incluyen:
2.7.2.2.1 Vitamina E
Su nombre genérico hace referencia a sus ocho isómeros estructurales de tocoferol, de los cuales el α-
tocoferol es el isómero de mayor potencia AOx y, junto el γ-tocoferol, se le considera esencial en la
defensa celular. La captura de RL superóxido, hidroxilo y peroxilos lipídicos la desarrolla en membranas
celulares y subcelulares (mitocondria y retículo endoplásmico liso) y detiene la propagación de la PL.
Para estabilizar un RL, el tocoferol se convierte en el RL tocoferoxilo, este retorna a su estado original a
través de reacciones mediadas por la coenzima Q y en menor grado por las vitaminas C y A. Algunos
investigadores sostienen que una sobreproducción de ERO puede llevar a una disminución significativa
de la concentración tisular de vitamina E (Chihuailaf y col., 2002, Benitez, 2006).
Las partículas de colesterol LDL oxidadas contribuyen al desarrollo de la placa aterosclerótica, además de
que estas partículas pueden inducir la apoptosis directamente. También las partículas LDL oxidadas
pueden modificar la inflamación y los mediadores trombogénicos; por lo que la prevención de la oxidación
de las LDL con antioxidantes podría usarse para inhibir la progresión de la enfermedad. En base a lo
anterior se tienen estudios sobre la oxidación de las LDL y la capacidad protectora de la vitamina E sobre
30
los lípidos que se transportan en estas lipoproteínas. Dos componentes alimentarios que inhiben el
potencial de oxidación del colesterol LDL son el nivel de ácido linoleíco en las partículas y la
disponibilidad de antioxidantes, siendo la vitamina E el nutriente más importante. Se ha comprobado que
la vitamina E es el antioxidante más concentrado que se encuentra en las LDL, en una cantidad 20 a 300
veces mayor que cualquier otro antioxidante. In vitro la vitamina E inhibe la oxidación de las LDL y su
acción es superior si la suplementación combina ésta vitamina con la vitamina C y el beta caroteno
(Zamora, 2007).
2.7.2.2.2 Vitamina A
Es un término genérico que abarca a los compuestos de origen animal que presentan actividad biológica
de vitamina A. En los vegetales, existe como provitamina llamada β-caroteno. Por su conformación
estructural son excelentes capturadores de RL. Protegen contra la PL, sobre todo la inducida por el
sistema de la xantina oxidasa, y elimina el ión superóxido y radicales peroxilo. Al igual que la vitamina C,
tiene un comportamiento dual al actuar como prooxidante en condiciones de altas presiones parciales de
oxígeno (Chihuailaf y col., 2002).
2.7.2.2.3 Ubiquinona
También llamada coenzima- Q, es un derivado de la quinona. Su estructura es semejante al tocoferol y se
le ha identificado como un portador adicional en la cadena respiratoria. Aproximadamente 50% de la
ubiquinona celular se encuentra en la mitocondria. Aunque su función antioxidante in vivo está en
discusión, su forma reducida, el ubiquinol, tiene una fuerte actividad AOx, comparada con su forma
oxidada, llegando a consumirse antes que la vitamina E frente a una situación de exposición a RL. El
ubiquinol impide que las EROs desencadenen la PL y también participa en el reciclaje de la vitamina E en
la mitocondria. Otros compuestos sugeridos con actividad AOx son la albúmina, el fibrinógeno, la
bilirrubina y la glucosa (Chihuailaf y col., 2002).
2.7.2.3 Antioxidantes Enzimáticos
La función antioxidante desempeñada por las enzimas puede presentar ventajas frente a los compuestos
AOx en el sentido de que su actividad es regulada de acuerdo a los requerimientos celulares: pueden ser
inducidas, inhibidas o activadas por efectores endógenos. El grupo de AOx enzimáticos cataliza la
transferencia de electrones desde un sustrato hacia los RL. Los sustratos o agentes reductores
empleados en estas reacciones se regeneran para ser nuevamente activos y lo hacen a expensas del
NADPH producido en las diferentes vías metabólicas. Frente a una situación de exposición prolongada a
ERO puede ocurrir una disminución en las concentraciones del NADPH necesario en otros procesos
fisiológicos importantes, a pesar de que algunos AOx enzimáticos no consumen cofactores (Rodríguez y
col, 2001; Chihuailaf y col., 2002).
En la Figura 6 se observan los mecanismos en donde las enzimas superóxido dismutasa (SOD) junto con
la catalasa (CAT) o la glutatión peroxidasa (GSH-Px) eliminan muchos de estos compuestos. La
31
lactoferrina (que atrapa el hierro) u otros antioxidantes como la vitamina E, disminuyen los daños
producidos (Castillo y col., 2001).
Figura 6 Mecanismos de defensa contra los daños producidos por las ERO (Castillo y col., 2001).
2.7.2.3.1 Superóxido dismutasa (SOD)
La enzima superóxido dismutasa (SOD, superóxido -superóxido oxidorreductasa), es del grupo de las
metaloenzimas presentes frecuentemente en organismos aeróbicos, aerotolerantes y algunos anaerobios
obligados. Son esenciales para su defensa contra la toxicidad producida por los metabolitos parcialmente
reducidos, generados durante la reducción biológica normal del oxígeno molecular. Se conocen 3 formas
de SOD según el metal que utilizan como cofactor. Estas a su vez pueden dividirse en 2 familias
filogenéticas diferentes: CuZn-SOD y Fe/Mn-SOD. Entre ellas no existe homología de secuencias ni de
estructuras de orden superior, lo que indica que evolucionaron independientemente en respuesta a una
presión evolutiva común: la presencia del oxígeno y la amenaza de su toxicidad (García y col., 1996).
Esta enzima cataliza la conversión del radical superóxido (O2-) en peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno
molecular (O2), en una de las reacciones catalizadas por enzimas más rápida que se conoce (K= 2 x 109
32
M/s-1 para la CuZn-SOD), la función de esta consiste en eliminar el radical superóxido antes de que éste
reaccione con moléculas biológicas susceptibles u origine otros agentes tóxicos. El peróxido de hidrógeno
generado por la acción de la enzima, es eliminado por la catalasa y/o la glutatión peroxidasa. (García y
col., 1996).
2.7.2.3.2 Catalasa (CAT)
Una de las enzimas que interviene en la protección y el mantenimiento del balance oxidante/antioxidante
es la catalasa (CAT). La catalasa (peróxido de hidrógeno: peróxido de hidrógeno oxidorreductasa) es una
de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo
humano, aunque su actividad varía en dependencia del tejido; ésta resulta más elevada en el hígado y los
riñones, más baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prácticamente nula en el tejido nervioso. A nivel
celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra
en el citosol. Esta enzima es una metaloproteína tetramérica, cuyo peso molecular se encuentra en el
rango de 210-280 kD. Consta de 4 subunidades idénticas que se mantienen unidas por interacciones no
covalentes. En algunas especies la CAT contiene moléculas de nicotinamín adenín dinucleótido fosfatado
en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la enzima; así se ha demostrado que la CAT
humana y la de res están ligadas a 4 moléculas de NADPH, 1 en cada subunidad y que no existe
interacción directa entre el grupo hemo y el NADPH. El NADPH unido a la enzima no está involucrado en
su actividad catalítica o peroxidativa. Esta molécula puede intervenir en la prevención y reversión parcial
de la inactivación de la CAT por su propio sustrato tóxico y estabiliza a la enzima. Además, la CAT
constituye un reservorio de NADPH, lo cual juega un importante papel durante el estrés oxidativo
(Céspedes y col., 1996).
Cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Esta función es compartida con
la enzima glutatión peroxidasa que no requiere de cofactores. En general las bajas concentraciones de
peróxido de hidrógeno estimulan la actividad de peroxidasas, mientras que las altas concentraciones de
peróxido son preferentemente catalizadas por la catalasa (Céspedes y col., 1996).
22222 OO2HOHOH +→+
2.7.2.3.3 Glutatión peroxidasa (GSH-Px)
Es una selenoproteína que, en las células animales, se ubica en la matriz mitocondrial y en el citosol. En
presencia de GSH como agente reductor, cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno y otros
hidroperóxidos orgánicos en agua y alcohol, respectivamente. Al igual que otras selenoproteínas, el sitio
activo de GSH-Px contiene selenio (Se) bajo la forma de residuos de selenocisteína incorporada a una
cadena polipeptídica conformada por 21 aminoácidos. Se han descrito cuatro isoformas de GSH-Px que
33
difieren tanto en su ubicación como en la especificidad de sustrato, tres de las cuales presentan
estructura tetramérica. La primera de ellas, GSH-Px celular o clásica, está prácticamente en todas las
células, puede reducir el peróxido de hidrógeno e hidroperóxidos orgánicos libres y convertirlos en agua y
alcoholes. La alta correlación existente entre su actividad sanguínea y la concentración plasmática del
selenio, ha permitido emplearla como indicador para evaluar el balance metabólico nutrimental de este
mineral en diferentes especies, principalmente bovinos lecheros y ovinos. La segunda isoforma es la
GSH-Px plasmática o extracelular, es una glicoproteína purificada, caracterizada a partir de plasma
humano que se sintetiza en las células tubulares proximales del riñón. El tercer tipo es la GSH-Px
fosfolípido hidroperóxido, cuya función biológica primaria es proteger contra la PL reduciendo
hidroperóxidos de ácidos grasos en las membranas celulares y previniendo la oxidación de lipoproteínas
de baja densidad. Es la única isoforma cuya estructura es monomérica; es decir, contiene un solo residuo
de selenocisteína. El último tipo se denomina GSH-Px gastrointestinal y representa la principal
peroxidasa dependiente de glutatión en el tracto gastrointestinal. Es importante en la reducción de
hidroperóxidos de colesterol y en la protección contra la toxicidad por ingestión de hidroperóxidos lipídicos
(Cisneros y col., 1997).
(Glutatión-peroxidasa)
O2HGSSGOHGSH2 222 +→+
GSH=glutatión reducido
GSSG = glutatión oxidado
La ingesta de alimentos ricos en sustancias antioxidantes como vitaminas C y E, carotenoides o
compuestos fenólicos, previene o disminuye el desarrollo de estas enfermedades. Se cree que la dieta
aumenta la defensa antioxidante del organismo evitando el daño oxidativo (Cisneros y col., 1997).
En la Tabla 4 se presenta un resumen de la localización y su función fisiológica que tiene los
antioxidantes enzimáticos.
Tabla 4 Localización y función de antioxidantes enzimáticos (Zamora, 2007). ANTIOXIDANTES
ENZIMÁTICOS LOCALIZACIÓN FUNCIÓN FISIOLÓGICA
Superóxido
Dismutasa Citoplasma y mitocondria Disminuye los radicales superóxido
Glutation
Peroxidasa Citoplasma y mitocondria
Elimina el peróxido de hidrógeno y los
hidro-peróxidos orgánicos
Catalasa Citoplasma y mitocondria Elimina peróxido de hidrógeno
34
2.7.3 Estrés oxidativo
El desbalance entre la producción de EROs y la defensa antioxidante provoca un daño orgánico conocido
como estrés oxidativo, que lleva a una variedad de cambios fisiológicos y bioquímicos los cuales
ocasionan el deterioro y muerte celular. No podemos precisar si la alteración es por incremento de los RL
(prooxidantes) o por una disminución en la respuesta homeostática de los tejidos (defensa AOx). El
estrés oxidativo se desencadena cuando los prooxidantes exceden a la capacidad AOx de un organismo
(Rodríguez y col., 2001).
Se puede medir este daño mediante métodos directos e indirectos. Entre los primeros se tiene la
medición de agentes antioxidantes, lo cual es muy difícil por su vida media muy corta y el empleo de
equipos costosos; lo que obliga a medirlos indirectamente mediante:
a. Determinación de productos terminales de la acción oxidante sobre biomoléculas: los métodos
para medir peróxidos lipídicos son el patrón de oro cuando se trata de probar el papel de los
oxidantes en algún tipo de daño celular.
b. Medición de la concentración de antioxidante: se puede realizar por HPLC (cromatografía líquida
de alta resolución), sobre material biológico que puede ser plasma, orina o tejido. Para fines
prácticos solo se determinan niveles plasmáticos de los antioxidantes siguientes: vitaminas E,
coenzima Q (ubiquinol), glutatión y vitamina C.
c. Medición del estado oxidativo: este refleja el balance entre el sistema oxidante y prooxidante y es
beneficioso en muchas enfermedades (Rodríguez y col., 2001).
Existen diversos métodos para evaluar la actividad antioxidante de manera sencilla y práctica, ya sea in
vitro o in vivo, los cuales se describen a continuación (Rodríguez y col., 2001; Andresen y col., 2006).
Romay demostró en 1996 que personas con diabetes mellitus tienen concentraciones más altas de
lipoperóxidos, un marcador de daño oxidativo a los lípidos y menor actividad de las enzimas antioxidantes
superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y catalasa, asociados con factores prooxidantes tales como
tabaquismo, ingesta excesiva de alcohol, sedentarismo y número reducido de horas de sueño, sin
embargo los resultados no son del todo concluyentes (Rodríguez y col., 2001; Andresen y col., 2006).
2.7.4 Métodos para determinar la capacidad antioxidante
Una de las estrategias más aplicadas en las mediciones in vitro de la capacidad antioxidante total de un
compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias
cromógenas de naturaleza radical; la pérdida de color ocurre de forma proporcional con la concentración,
estas determinaciones nos dan tan sólo una idea aproximada de lo que ocurre in vivo (Kuskoskie y col.,
2005). Diversos compuestos cromógenos (ABTS, DPPH, DMPD, ABAP, DMPO y FRAP) son utilizados
para determinar la capacidad de los compuestos fenólicos que contienen los frutos para captar los
radicales libres generados, operando así en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidación,
que implican a especies reactivas de oxígeno (EROs). Los métodos más utilizados son ABTS y DPPH en
donde ambos presentan una buena estabilidad. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse
35
directamente sin una preparación previa y solo puede disolverse en medio orgánico; mientras que el
ABTS tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química (dióxido de manganeso,
persulfato de potasio, ABAP), enzimática (peroxidasa, mioglobulina), o eletroquímica y con este se puede
medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica; el DMPD solo se usa en medio
acuoso. El radical ABTS•+ tiene, además, la ventaja de que su espectro presenta máximos de
absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohólico, mientras que el DPPH presenta un pico de
absorbancia a 515 nm (Kuskoskie y col., 2005).
La capacidad antioxidante del plasma representa el balance antioxidante del organismo y valora tanto los
antioxidantes endógenos como exógenos. Se ha usado como marcador indirecto de la biodisponibilidad
de los antioxidantes presentes en los alimentos en estudios de intervención, tanto para evaluar el efecto
aislado de un alimento a corto plazo como su influencia mediante su suplementación en la dieta a largo
plazo.
Ningún compuesto fenólico excede una concentración de 1 mM en el plasma tras el consumo de 10-100
mg de alimentos con altos contenidos de antioxidantes. Estos niveles tan bajos en el plasma humano
constituyen una dificultad para su identificación y cuantificación, ya que la mayoría están por debajo de
los límites de detección de las técnicas cromatográficas actuales. Sin embargo, el incremento observado
en la capacidad antioxidante del plasma en los estudios indica que la proporción absorbida de estos
compuestos sí es suficiente para desempeñar su papel antioxidante y presentar actividad en el
organismo. Hay autores que ofrecen las concentraciones que resultan efectivas para algunos
compuestos: 0,75 mM para (-)-epigalocatequina, 1,2 mM para ácido gálico, 0,25-0,38 mM para (-)-
epicatequina, (+)-catequina, (-)-galato de epicatequina y (-)-galato de epigalocatequina, con respecto a la
inhibición de la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) al 50 %. Liu y col. en el 2002 reportaron
que la ingesta diaria de 375 mL de vino tinto durante 2 semanas produjo un aumento significativo de la
capacidad antioxidante del plasma medida con el método TBARs y en la concentración plasmática de
compuestos fenólicos y sus metabolitos glucuronidados y metilados. Por otra parte, los compuestos
antioxidantes endógenos (albúmina, bilirrubina, ácido úrico, glutatión) podrían influir en la capacidad
antioxidante del plasma, si modifican su concentración tras el consumo de vino (Fernández y col., 2006).
Los métodos ORAC-PE, FRAP, TRAP, ABTS y DPPH miden la capacidad antioxidante del compartimento
hidrofílico o acuoso del plasma donde se localizan los compuestos antioxidantes solubles en agua (ácido
ascórbico, ácido úrico y proteínas). La actividad antioxidante de los compuestos liposolubles que se
encuentran en las lipoproteínas del plasma, tales como carotenoides y tocoferoles, no influyen en las
medidas realizadas con estos métodos, y han de estimarse mediante otros ensayos.
Se ha estudiado el porcentaje de contribución de los distintos compuestos endógenos a la capacidad
antioxidante total del plasma determinada por los métodos de uso más frecuente. Así, el ácido úrico (60 y
58 % de contribución para FRAP y TRAP respectivamente) y la albúmina (27,8 y 28 % de contribución
para ORAC-PE y ABTS respectivamente), son los compuestos que más contribuyen a la capacidad
antioxidante del plasma (Fernández y col., 2006).
36
En el estudio de la capacidad antioxidante, se ha reportado el uso del plasma como del suero sanguíneo,
sin mostrar diferencias significativas. El suero se obtiene después de la eliminación del coágulo de fibrina
de la sangre a temperatura ambiente. La muestra se somete así a una mayor exposición a la luz, por lo
que posiblemente se pierden antioxidantes que son inestables en tales condiciones. Por otra parte,
durante la agregación, las plaquetas liberan EROs que pueden disminuir la capacidad antioxidante de la
muestra de suero. Esto hace aconsejable trabajar con muestras de plasma en lugar de suero para evitar
pérdidas de compuestos. La determinación clínica de compuestos endógenos que influyen
potencialmente en la capacidad antioxidante (albúmina, bilirrubina, ácido úrico) se realiza con mayor
frecuencia en muestras de plasma (Fernández y col., 2006).
37
3 JUSTIFICACIÓN
Debido al incremento de la Diabetes no solo en nuestro país sino en el mundo se deben buscar
alternativas para prevenir y mejorar la calidad de vida de las personas. México cuenta con una
diversidad de plantas que son empleadas con fines terapéuticos entre las cuales se encuentra la Chaya
(Cnidoscolus chayamansa), por lo que es importante contar con estudios científicos que evalúen las
propiedades antioxidantes de esta planta, en un modelo de diabetes experimental inducida químicamente
en ratas Wistar.
38
4 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antioxidante de la chaya (Cnidoscolus chayamansa) en un modelo experimental de
ratas diabéticas inducidas químicamente.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Cuantificar los niveles de fenoles y flavonoides en las preparaciones de la hoja de chaya cruda y
cocida empleada para los tratamientos de ratas sanas y diabéticas.
• Evaluar el efecto subcrónico del té de chaya sobre los niveles de glucosa, perfil lipídico y
parámetros de daño renal en ratas sanas y diabéticas.
• Evaluar el efecto agudo del té de chaya sobre los niveles de glucosa, perfil lipídico en ratas sanas
y diabéticas.
• Determinar la capacidad antioxidante mediante las técnicas TAC, ABTS y FRAP en plasma de
ratas sanas y diabéticas tratadas con chaya de forma subcrónica y aguda.
39
5 MATERIAL Y MÉTODOS
5.1 Animales
Se utilizaron ratas macho Wistar, provenientes del bioterio del CINVESTAV México, DF. Los animales
fueron sometidos a un periodo de adaptación de una semana en el bioterio del Posgrado en Tecnología
de alimentos de la Universidad Autónoma de Querétaro, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y con
acceso libre a comida y agua.
5.1.1 Inducción de diabetes a ratas Wistar
Los animales se sometieron a un ayuno de 15 horas, se inyectó por vía intraperitoneal una dosis única de
de 45 mg estreptozotocina (STZ) por Kg de peso corporal, disuelta en un buffer de citrato al 0.1 M a pH
4.5. Después de 72 horas, se verificaron los niveles de glucosa en ayuno en los animales. Se
consideraron dentro del grupo experimental de diabetes a los animales que tenían un nivel de glucosa en
sangre en ayuno superior a 180 mg/dL.
5.2 Materiales
Las hojas de chaya (Cnidoscolus chayamansa) fueron colectadas frescas todos los días para su
preparación en té, licuado o extracto, de un árbol de los jardines de la Universidad Autónoma de
Querétaro.
a. Preparación del té: se preparó todos los días en una concentración del 2% (p:v)en agua, se dejó
hirviendo 10 minutos dejando consumir el 10% del volumen total, se aforó para llegar al volumen
original con agua fría, se filtró y se mantuvo a temperatura ambiente.
b. Preparación de extracto: se preparó todos los días a una concentración de 6% (v:v) en solución
acuosa sin filtrar, se utilizó un extractor de jugos para las hojas crudas, posteriormente se
disolvieron 60 ml del extracto por cada en 1000 ml de agua.
c. Preparación del licuado: se preparó todos los días a una concentración de 6% (p:v) en agua, se
agregaron 60 g por cada 1000 ml de agua y se licuó todo en una licuadora casera y
posteriormente se filtró con coladera de plástico.
d. Reactivos químicos (ver anexo I).
e. Preparación de soluciones (Ver anexo II).
5.2.1 Equipo
Para las determinaciones de glucosa, perfil de lípidos y determinación de capacidad antioxidante se utilizó
un Aparato Versamax TM Tunable Absorbance microplate reader Marca Molecular Devices con intervalo
de longitud de onda 340 – 850 nm y compatibilidad con microplaca de 96 pozos (0,3 ml), utilizando el
softMax Prox como método de análisis fotométrico.
40
5.3 Métodos para determinación de Capacidad Antioxidante
5.3.1 Método de la Capacidad antioxidante total (TAC) con crocin (Lussignoli y col., 1998)
Este método está basado en la competencia de una reacción en paralelo, donde el donador de radicales
peroxilo, como el ABAP, inhibe al carotenoide crocin. Al mismo tiempo los antioxidantes inhibidos son
blanqueados al atrapar y neutralizar a los radicales. Este método ha sido empleado para la evaluación de
la capacidad antioxidante de alimentos y mezclas complejas, pero se modificó al efectuar diluciones en
serie para poder determinar la actividad antioxidante en plasma humano (Lussignoli y col., 1999; Kampa y
col., 2002; Pitsavos y col., 2005). Esta técnica se efectúa en microplaca de 96 pozos, con fondo plano,
teniendo un volumen total de 250 μl por pozo; se mide la absorbancia a 450 nm. La capacidad
antioxidante es el inverso de la capacidad de inhibición al 50% (IC50). Los resultados se expresan en
μg/ml o μmol/L y se comparan contra los estándares de ácido ascórbico, ácido úrico y Trolox.
Preparación de soluciones y muestras:
Todas las soluciones y muestras se colocaron en frascos color ámbar para que se protegen de la luz y
evitar su degradación.
Preparación de soluciones y estándares ver anexo II.
Preparación de la muestra: Los alimentos ó plantas deben ser tratados previamente para ser analizados y
se colocan en dos o tres concentraciones, utilizando PBS para disolver la muestra y llegar al volumen
correspondiente, para poder realizar el cálculo del % de inhibición. Para fluidos biológicos se debe
disolver previamente la muestra, para plasma se toman 35 μl de muestra y se disuelven en 200 μl de
PBS; de esta solución se toman varias alícuotas para colocarlas en cada pozo completando a un volumen
de 50 μl con PBS (el volumen de las alícuotas varía dependiendo de la actividad antioxidante de la
muestra), todas los estándares y muestras se evalúan por triplicado.
Método:
Se colocan 100 μl de Crocin 100 μM y 50 μl de muestra/ estándar/ PBS. La reacción se inicia con la
adición de 100 μl precalentados de ABAP (6,25 mg/ml) a 37°C y se incuba la placa en un horno
humificado por 60 min a 37°C, se toma la lectura a tiempo cero y a los 60 min, se calcula la diferencia de
absorbancias.
La absorbancia específica es calculada por el correspondiente valor del blanco y la actividad antioxidante
como la proporción (% de inhibición) = 100*(ΔAbs0-ΔAbsmuestra)/ ΔAbs0; donde ΔAbs0 es la diferencia de
absorbancia en ausencia de antioxidantes y ΔAbsmuestra es la diferencia de absorbancia en presencia de la
muestra.
Se deben de realizar a la par, las curvas estándar del ácido ascórbico y del trolox, los cuales son las
referencias comparativas. Concentraciones mayores a 6 mg/ml de ABAP se pierde la sensibilidad
(concentración en placa). En la siguiente tabla se muestra de manera condensada las cantidades que se
deben usar para la técnica de TAC.
La capacidad antioxidante es TAC= (1/IC50)
41
Crocin (μl) ABAP (μl) Buffer (μl) Muestra/Std (μl)
Blanco sin/ABAP 100 0 150 0
Blanco con/ABAP 100 100 50 0
Estándar 100 100 0 50
Muestra 100 100 0 50
5.3.2 Método del potencial antioxidante de reducción del fierro (FRAP; Liu y col., 1982).
Este método se basa en medir la potencia plasmática de reducir iones férricos, utilizando como agente
cromógeno un complejo colorimétrico de 2,4,6-tripiridil-s-triazina–ferroso (TPTZ), el cual da una coloración
azul verdosa y se leen por espectrofotometría a 595 nm, se determina en microplaca de 96 pozos de
fondo plano con un volumen total por pozo de 200 μl. La reacción se lleva a cabo durante 30 min (Liu y
col., 1982; Benzie y Strain, 1996; Bahr y Basalto, 2004; Gliszczynska – Swiglo, 2006).
Para la preparación de las soluciones ver el anexo II.
Preparación del estándar:
Se elaboran la curva con soluciones acuosas de FeII en concentraciones entre 1 – 50 μg/ml (FeII
=FeSO4·7H2O; Riedel-de Haen) para generar la gráfica.
Se elaboran soluciones acuosas como estándares con concentración conocida de ácido ascórbico, ácido
úrico, de 1-15 μg/ml. (Se pueden diluir con agua o con solución buffer acetato), se dejan reposar a
temperatura ambiente durante 30 min y después se centrifugan por 10 min a 3000 rpm, se toma el
sobrenadante.
Preparación de la muestra:
Las muestras se diluyen a concentraciones conocidas con buffer de acetato, se dejan reposar por 30 min,
posteriormente se centrifugan por 10 min y se toma el sobrenadante.
El plasma se coloca a una concentración entre 1 a 5 μl disolviendo con buffer de acetato hasta completar
el volumen de 25 μl.
El trolox se diluye en etanol o PBS, se preparan concentraciones entre 1- 25 μg/ml
Se prepara la microplaca con muestras, blanco y estándares, el reactivo FRAP se entibia a 37°C; la
reacción comienza al agregar la solución de FRAP.
Para calcular el % de inhibición se toman los valores de absorbancia a los 30 min (А 595 nm), se expresa
como % de inhibición = 100*(Abs0-Absmuestra)/ Abs0; donde Abs0 es la absorbancia del blanco, Se calcula
por interpolación el 50% de inhibición y se correlaciona contra el 50% de inhibición del estándar de Fe II.
Se reporta como mg equivalentes de FeSO4 ó μM de FeSO4. En la siguiente tabla se muestra de manera
condensada las cantidades que se deben de usar para la técnica FRAP.
42
Etanol (μl) Solución de FRAP (μl) Muestra/Std (μl)
Blanco sin/FRAP 200 0 0
Blanco con/FRAP 25 175 0
Estándar 0 175 25
Muestra 0 175 25
5.3.3 Método del ABTS (Mariken y col., 2004)
Este método se basa en atrapar aniones de vida larga como el ácido 2,2´-azino-bis(3-
etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS), el cual es generado por la actividad de la peroxidasa de la
metamioglobina en presencia del peróxido de hidrógeno y puede detectarse a 734 nm. Al encontrar un
antioxidante en el medio se retarda la formación del radical libre, resultando en una disminución de la
absorbancia. En esta técnica se utiliza al ácido (+/-)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman – 2 carboxílico
(Trolox), el cual es un análogo acuoso de la vitamina E. El radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción de
ABTS (7 mM en etanol o PBS) con persulfato potásico (2,45 mM en agua) incubados a temperatura
ambiente (± 25ºC) y en la oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con
etanol o buffer fosfato salino a pH 7.4 (PBS), hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre
0,70 (± 0,1) a 754 nm, queda entre 50 a 70 μM. Esta solución debe utilizarse inmediatamente porque se
degrada rápidamente (Mariken y col., 2004; Kuskoskie y col., 2005; Gliszczynska Swiglo, 2006). La
reacción se lleva a cabo al agregar el reactivo ABTS, a una temperatura de 30ºC. Las muestras se filtran
y se disuelven con etanol o PBS.
La placa se debe tapar de la luz durante toda la preparación. Se disuelve previamente el plasma en PBS
y se toman varias concentraciones de alícuotas para realizar la detección, se toma como blanco el etanol.
Se coloca primero el estándar o muestra o blanco y solo hasta que ya se disolvió el ABTS se agrega
rápidamente y se lee inmediatamente por 10 minutos a 734 nm; la lectura final es la que se toma para el
cálculo de % de inhibición = 100*(Abs0-Absmuestra)/ Abs0; donde Abs0 es la absorbancia del blanco. el 50%
de inhibición se calcula por interpolación. La capacidad antioxidante es el inverso del 50% de inhibición.
En la siguiente tabla se muestra de manera condensada las cantidades que se deben de usar para la
técnica ABTS.
Etanol (μl) ABTS (μl) Buffer/metanol(μl) Muestra/std (μl)
Blanco sin/ABTS 230 0 20 metanol 0
Blanco con/ABTS 20 230 0 0
Estándar 0 230 0 20
Muestra 0 230 0 20
43
5.3.4 Determinación de Fenoles totales (Singleton, 1965)
El método espectrofotométrico emplea el reactivo de Folin y Ciocalteu, para la determinación de fenoles
totales, se fundamenta en su carácter reductor y es el más empleado. El reactivo de Folin-Ciocalteu es
una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdico en medio básico, que se reducen al oxidar los
compuestos fenólicos, originando óxidos azules de wolframio (W8O23) y molibdeno (Mo8O23). La
absorbancia del color azul se mide a 750 a 760 nm (Kuskoskie y col., 2005). Los resultados se expresan
en mg equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra. Para la evaluación, las muestras se hicieron
reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteu 1N, carbonato de sodio al 7%, en microplaca de fondo plano,
colocando 200 μl por pozo, se incuba a temperatura ambiente por 30 min (Singleton, 1965; Javanmardi y
col., 2003; Tunalier, 2004).
Para realizar la curva estándar con ácido gálico se adicionan por triplicado en el siguiente orden: μl de
ácido gálico, μl de agua HPLC, μl de la solución de Folin y por último el carbonato de sodio al 7%; se
mezclan y se incuba a temperatura ambiente por 30 min y se lee a una longitud de onda de 750 nm. En
la tabla del anexo III se muestra de manera condensada las cantidades que se deben de usar para la
determinación de fenoles totales.
Para las muestras se deben de preparar previamente las diluciones, colocando en tubos para poder
centrifugar, posteriormente tomar el sobrenadante para colocar en el pozo correspondiente.
Muestra Muestra (μl) Agua HPLC (μl) Folin 1N (μl) Na2CO3 7% (μl)
Blanco - 50 25 125
Muestra/std 50 - 25 125
El contenido de fenoles totales en equivalentes de ácido gálico se toma con la interpolación o
extrapolación de la absorbancia de las muestras a la curva de estándar previamente elaborada de ácido
gálico. Se expresan en mg equivalentes de ácido gálico por gramo o ml de muestra.
5.3.5 Determinación de Flavonoides (Liu y col., 2002)
La determinación de flavonoides se efectúa por el método espectrofotométrico en microplaca de 96
pozos, fondo plano, a una longitud de onda de 510 nm. Se realiza curva estándar con catequina y los
resultados se reportan como mg equivalentes de catequina por gramo de muestra. Se prepara una
solución de catequina a 1 mg/ml disuelta en metanol. Se agrega nitrito de sodio al 5%, cloruro de
aluminio al 10% y por último hidróxido de sodio al 1 M. Para preparar la curva estándar de catequina ver
el anexo III.
Las muestras se preparan realizando varias diluciones de acuerdo a la cantidad que tenga de flavonoides.
44
Muestra/blanco
(μl)
Catequina (μl) Agua HPLC
(μl)
NaNO2 (μl) AlCl3 (μl) NaOH 1 M
(μl)
Agua HPLC
(μl)
Blanco - 50 7,5 15 50 127,5
Muestra 50 - 7,5 15 50 127,5
El llenado de la placa debe hacerse a resguardo de la luz. Se adicionan en el siguiente orden: muestra/
std, solución de catequina, agua HPLC y la solución de NaNO2 al 5%, se deja reposar a temperatura
ambiente por 6 min, posteriormente se adiciona la solución de AlCl3 al 10% dejando reposar por 5 min,
transcurrido este tiempo se adiciona NaOH 1 M y el agua HPLC correspondiente, se lee inmediatamente,
se deja incubar por 30 min y se lee la absorbancia final.
El contenido de flavonoides en equivalentes de catequina se obtiene extrapolando la absorbancia de las
muestras en la curva de estándar previamente elaborada de catequina. Se expresan en mg equivalentes
de catequina por gramo o ml de muestra.
5.3.6 Determinación sanguínea de Glucosa
La sangre obtenida de la vena caudal de las ratas en ayuno, es depositada en las tiras reactivas (Roche)
específicas para glucosa, y leídas en un glucómetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad para la
glucosa es 20-600 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio del kit para
Glucosa de la marca Randox para determinación por espectrofotometría.
La medición de la prueba se realiza por bioamperometría, que mide la corriente generada por la reacción
de la enzima glucosa deshidrogenasa de la tira reactiva al convertir la glucosa de la muestra sanguínea
en gluconolactona (Roche Diagnostics).
5.3.7 Determinación sanguínea de Triglicéridos
La sangre obtenida de la vena caudal de las ratas en ayuno, es depositada en las tiras reactivas (Roche)
específicas para triglicéridos, y leídas en un glucómetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad es
de 70-600 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio del kit para Triglicéridos
marca Randox para determinación por espectrofotometría.
Los triglicéridos son desdoblados en primer lugar por una esterasa en glicerina y ácidos grasos libres. En
dos pasos enzimáticos más se forman de glicerina hidroxiacetonafosfato y peróxido de hidrógeno. Este
último oxida, en presencia de peroxidasa, a un indicador en un colorante cuya concentración es
determinada por fotometría de reflexión.
5.3.8 Determinación sanguínea de Colesterol
La sangre obtenida de la vena caudal de las ratas en ayuno, es depositada en las tiras reactivas (Roche)
específicas para colesterol, y leídas en un glucómetro Accutrend GCT cuyo intervalo de sensibilidad es de
45
150-300 mg/dL. Al final del estudio las determinaciones se realizaron por medio de los kits para colesterol
total y colesterol de alta densidad (HDL) y leídos por espectrofotometría.
5.3.9 Determinación en orina de Creatinina y Microalbúmina
Se recolectó de manera individual por espacio de 12 hr y se analizó general de orina (por medio de tiras
reactivas multistix 10 sh, marca Bayer), y microalbúmina y creatinina (por medio de tiras reactivas para
Microalbúmina en orina, marca Bayer); se leyeron en un analizador Clinitek.
En la relación de albúmina/creatinina, la albúmina está presente normalmente en la orina en
concentraciones inferiores a 30 mg de albúmina /g de creatinina (3,4 mg de albúmina/mmol de creatinina).
La microalbúmina se indica con un resultado de la relación de 30-300 mg/g (3,4 – 33,9
mg/mmol)(Anormal) y albúmina clínica con un resultado de la relación de >300 mg/g (>33,9
mg/mmol)(Altamente anormal).
Los principios químicos de estas pruebas se basan para la albúmina, en el enlace a colorantes, usando
un colorante de sulfoneftaleína de gran afinidad. A un pH constante, el desarrollo de cualquier color azul
se debe a la presencia de albúmina. El color resultante va de verde claro a azul aguamarina. Para la
creatinina se basa en la actividad del tipo peroxidasa de un complejo de cobre-creatinina que cataliza la
reacción del dihidroxiperóxido de disopropilbenceno y la 3,3´,5, 5´-tetrametilbencidina. El color resultante
va de anaranjado a verde o azul.
5.4 Diseño experimental
5.4.1 Composición proximal, fenoles totales y flavonoides
Se realizó la determinación bromatológica, fenoles totales y flavonoides de la hoja de chaya, té, extracto y
licuado en las concentraciones administradas en los tratamientos.
5.4.2 Primera fase (experimento subcrónico)
Las ratas diabéticas fueron repartidas en 2 grupos y 1 de sanas:
- Grupo 1. Diabéticas control recibieron agua ad libitum. n=6
- Grupo 2. Diabéticas tratadas recibieron el té de chaya 2% ad libitum n=7
- Grupo 3. Sanas tratadas recibieron el té de chaya 2% ad libitum. n= 6
Todos los grupos recibieron el tratamiento 7 semanas. Cada semana se registro el control de peso
corporal, consumo de alimento y líquido; así como niveles sanguíneos de glucosa, colesterol y
triglicéridos en ayuno. Las muestras de sangre en ayuno para el control semanal, fueron tomadas de la
vena caudal, y depositadas para su análisis en un glucómetro triple (GCT- Roche).
Al final de las 7 semanas, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con éter, la sangre fue
tomada por punción cardiaca, depositadas en tubos para la separación del suero y plasma; y este fue
congelado a -20°C (en varias alícuotas) hasta el análisis de glucosa, colesterol, triglicéridos y
antioxidantes.
46
5.4.3 Segunda fase (experimento subcrónico)
Las ratas fueron repartidas en 6 grupos, cada grupo formado por 7 animales:
- Grupo 1. Diabéticas control, recibieron agua ad libitum.
- Grupo 2. Diabéticas tratadas, recibieron el té de chaya 2% ad libitum
- Grupo 3. Diabéticas tratadas, recibieron complejo vitamínico especial para diabéticos de nombre
Diabon (150 mg/kg de peso corporal (PC)).
- Grupo 4. Sanas control, recibieron agua ad libitum.
- Grupo 5. Sanas tratadas recibieron el té de chaya 2% ad libitum.
- Grupo 6. Sanas tratadas recibieron complejo vitamínico especial para diabéticos (150 mg/kg de
peso corporal (PC)).
Todos los grupos recibieron el tratamiento por 7 semanas. En cada semana se registro el control de peso
corporal, consumo de alimento y líquido; así como niveles sanguíneos de glucosa en ayuno. Se verificó
colesterol y triglicéridos por medio de tiras reactivas en la semana 4. Las muestras de sangre para
control semanal fueron tomadas de la vena caudal, y depositadas para su análisis en un glucómetro triple
(GCT- Roche).
Al final de las 7 semanas, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con éter, la sangre fue
tomada por punción cardiaca, depositadas en tubos para la separación del suero y plasma; y este
congelado a -20°C (en varias alícuotas) hasta el análisis de glucosa, colesterol, triglicéridos y
antioxidantes. Se colectó la orina de 12 hr antes del sacrificio para la determinación del examen general
de orina, microalbúmina y creatinina.
De las muestras de plasma se determinó por tres técnicas la capacidad antioxidante de los tratamientos
(TAC por crocin, ABTS y FRAP) en el lector de microplaca.
5.4.4 Tercera fase (experimento agudo)
5.4.4.1 Determinación de curvas hipoglucémicas
Se evaluó el efecto de diferentes preparaciones y concentraciones (2, 6, 10 %) de té (hoja cocida), del
extracto de la hoja fresca de chaya y del licuado de hoja fresca de chaya, sobre la actividad
hipoglucemiante, para definir la concentración óptima para la administración ad libitum del tratamiento
agudo de 11 días.
Cada grupo de ratas sanas o diabéticas se dejó en ayuno de 8 horas, posteriormente por medio de una
cánula se le administra; por vía intragástrica, la preparación (agua, té, licuado o extracto); a diferentes
dosis se tomó muestra de sangre de la vena caudal para medir la glucosa en intervalos de tiempo (0, 30,
90, 150, 210, 270 y 330 min).
47
5.4.4.2 Tratamiento agudo
Se determinan las dosis óptimas para la administración de la preparación de la hoja de chaya del estudio
agudo. Se determino una preparación de licuado al 6% (p:v) de hoja de chaya cruda y de extracto al 6%
(v:v) de hoja de chaya, para el estudio agudo ad libitum por 11 días.
Las ratas fueron repartidas en 4 grupos, 2 grupos de diabéticas y 2 grupos de sanas con 7 animales por
cada grupo:
- Grupo 1. Diabéticas tratadas, recibieron el licuado al 6%.
- Grupo 2. Diabéticas tratadas, recibieron extracto acuoso al 6%.
- Grupo 3. Sanas control, recibieron el licuado al 6%.
- Grupo 4. Sanas tratadas recibieron extracto acuoso al 6%.
Se registró el control de consumo de alimento y líquido diariamente; el peso corporal y los niveles
sanguíneos de glucosa en ayuno, al inicio, mitad y final del experimento por medio de la vena caudal.
Al final de los 11 días, todas las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia con éter, la sangre fue tomada
por punción cardiaca, se colocó en tubos para la separación del suero y plasma; y este fue guardado y
congelado a -20°C (en varias alícuotas) hasta el análisis de glucosa, colesterol, triglicéridos y
antioxidantes. Se colectó la orina de 12 horas antes del sacrificio para la determinación del examen
general de orina, microalbúmina y creatinina.
De las muestras de plasma se determinó la capacidad antioxidante de los tratamientos por tres técnicas
(TAC por crocin, ABTS y FRAP) en el lector de microplaca.
5.5 Análisis estadístico
Los resultados son expresados como la media ± desviación estándar. Los datos fueron analizados
usando el análisis de varianza (ANOVA) por los métodos de Tukey, Dunnet, Dunn´s y Holm Sidak, según
corresponda. Se realizaron las correlaciones lineales para determinar la influencia de las variables en los
tratamientos por el método de correlaciones lineales de Pearson.
Se utilizaron los paquetes estadísticos de Sigma Stat 3,5 para Windows versión 2006 y Minitab 15.
48
6 RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Composición proximal, fenoles totales y flavonoides
En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos del análisis efectuado a la hoja de chaya, extracto de
hoja fresca diluido con agua al 6% y del té preparado con hoja fresca al 6%, en el cual se puede ver que
el contenido nutrimental es mayor en la hoja cruda. Resultados similares fueron obtenidos por Kuti y col.
en 1996, con respecto a proteínas, grasas, humedad y fibra, el resto de los componentes no fueron
reportados por estos autores, los cuales además demostraron que la chaya nutrimentalmente es superior
a la espinaca, específicamente en cuanto a su contenido de proteína, calcio, potasio, hierro y ácido
ascórbico, este último en un 400%. De manera similar en el estudio efectuado por Ventura en el 2004 en
donde se compararon tres isotipos de chaya; ambos estudios mostraron valores de 17 +/- 1 mg/100 g de
chaya para la Vitamina C.
Tabla 5 Composición nutrimental de la hoja de chaya
DETERMINACION HOJA EXTRACTO 6% TE 6%
Carbohidratos (%) 10.42 0.22 0.19
Cenizas (%) 1.69 0.03 0.03
Fibra cruda (%) 1.37 0 0
Grasas (%) 0.59 0.09 0.05
Humedad (%) 79.12 99.47 99.64
Proteína (%) 6.80 0.19 0.09
Contenido energético
Kcal/100g 74.22 2.48 1.95
Sodio 115.86 mg/kg 11.88 mg/L 5.19 mg/L
Para la determinación de fenoles totales se utilizó la curva estándar del ácido gálico (ver anexo III), de la
cual se obtuvo la ecuación lineal que es y= 0,0279x + 0,049, la cual tiene una correlación de 0,99; estos
datos se tomaron como base para realizar los cálculos para la determinación de fenoles totales en las
muestras de chaya en diferentes preparaciones del presente estudio (ver Tabla 6).
Podemos observar que en el contenido de fenoles totales se obtuvo un valor mayor en la muestra de
extracto que en la de licuado, siendo de 94 y 52 mg equivalentes de ácido gálico (mg eq a. gálico)/ g de
chaya respectivamente, mientras que el más bajo se obtuvo en el té siendo este de 5,5 mg eq a. gálico.
Ventura reportó en 2004 para extracto acuoso 31 ± 1,6 mg eq a. gálico/g de chaya, para tejido fresco 87 ±
2,1 mg eq a. gálico/g de chaya y para el tejido liofilizado 149 ± 9,2 mg eq de a, gálico; resultados de la
isoforma 3 de la chaya, que es la que se utilizó en este estudio, y 12 mg eq a. gálico para la espinaca ( en
extracto acuoso), podemos ver que los resultados obtenidos en la hoja de chaya son superiores que para
la espinaca, alimento considerado nutracéutico.
49
Tabla 6 Concentración de fenoles totales y flavonoides en la hoja, extracto y licuado de chaya
FENOLES
Mg eq ácido gálico/gr Chayaa FLAVONOIDES
mg eq catequina/gr Chayaa Extracto 94 ± 0.03** 3,4 ± 0.52* Té 5.5 ± 0.02* 0,14 ± 0.05* Licuado 52 ± 0.28*** 2,2 ± 0.89**
Prueba T de Student *P=0,02, **P=0,1, ***P=0,2 a Hoja fresca de chaya
Para la determinación de flavonoides se realizó la curva estándar de catequina, la cual la podemos ver en
el anexo III, con la ecuación lineal y=0,00627x + 0,0711 y con una correlación de 0,9955, tomando la
ecuación para calcular el contenido de flavonoides reportados en mg equivalentes de catequina. Los
resultados se encuentran en la tabla 6, donde se puede observar que el contenido de flavonoides es de
3,4 mg equivalentes de catequina / g de chaya para la muestra de extracto puro de chaya, que es mayor
a lo reportado por Ventura, 2004 de 1,5 mg eq de catequina/g de espinaca, pero se tienen diferentes
valores dependiendo del estado de madurez de la hoja. En el caso del té de chaya se tiene un valor de
hay 0,14 mg eq de Catequina lo cual puede ser debido a un efecto de degradación por efecto de la
cocción.
El contenido de fenoles y flavonoides, así como de las vitaminas C y E hacen de la chaya un alimento rico
en compuestos antioxidantes cuya ingesta puede considerarse adecuada para neutralizar los radicales
libres de las especies reactivas de oxígeno generadas en los procesos patológicos como la diabetes.
Consecuentemente existe un interés en conocer los mecanismos de protección antioxidante contra el
daño inducido por los radicales libres, por lo que el plasma o suero son utilizados como un modelo para
estudiar el daño inducido por radicales libres (Avello y Suwaski, 2005, 2006; Atalay y Laaksonen, 2002 y
Andersen y col., 2006).
6.2 Primera fase del experimento subcrónico
Durante las 7 semanas del estudio, con la administración del té de chaya al 2% el consumo promedio de
alimento, en el grupo de ratas sanas que recibieron el té de chaya, se mantuvo constante (29±7
g/día/rata), durante las 7 semanas del estudio. Por el contrario, las ratas diabéticas tratadas con agua y
chaya aumentaron hasta el 25% y 35% respectivamente su propio consumo, al final del experimento
(Gráfica 1 Consumo de alimento de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el
experimento subcrónico.Gráfica 1). Sin embargo el tratamiento del té de chaya no muestra ningún efecto
sobre esta manifestación (polifagia), lo cual nos indica que posiblemente no se este controlando la
sintomatología característica de la enfermedad.
50
01020304050607080
1 2 3 4 5 6Tiempo (semanas)
Alim
ento
(g/d
ía/ra
ta)
SC DC DA
Gráfica 1 Consumo de alimento de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 * No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
La ingesta promedio de líquido, en el grupo de ratas sanas que recibieron el té de chaya fue constante
(36 ± 8 ml/día/rata), durante las 7 semanas del estudio. A diferencia de las ratas diabéticas que desde el
inicio de su hiperglicemia el consumo del líquido es marcadamente superior y se mantiene arriba durante
todo el estudio. Para las diabéticas que recibieron el té la ingesta al inicio y al final fue de 162 ± 67 a 234
± 50 ml/día y para las diabéticas que recibieron agua el consumo fue de 213 ± 82 a 328 ± 78 ml/día (ver
Gráfica 2). Significando un aumento al final del estudio de 6.6 y 9.3 veces respectivamente, en relación al
grupo control de ratas sanas. Lo que nos muestran estos resultados es que el tratamiento con té de
chaya no tiene efecto significativo en la ingesta de líquido.
**
51
0
100
200
300
400
500
1 2 3 4 5 6Tiempo (semanas)
Líqu
ido
(ml/d
ía/ra
ta)
SC DC DA
Gráfica 2 Consumo de líquido de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 * No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey En la Gráfica 3 se puede observar que los niveles de glucosa no bajaron de forma significativa durante el
tratamiento de té de chaya. Diversos estudios se han realizado con respecto al efecto hipoglucémico y
antioxidante de plantas mexicanas que son usadas en tratamientos alternativos para la diabetes.
Hernández y col. en el 2002 realizaron una recopilación de información acerca de 269 plantas originarias
de México a las cuales se les atribuyen propiedades hipoglucemiantes dentro de estas se encuentra la
Chaya, aunque falta información sobre cual es el mecanismo de acción que se ejerce en el organismo
para que se tengan efectos favorables. Por eso es importante que los resultados obtenidos en este
estudio ayuden a entender mejor que es lo que puede ayudar a aminorar las complicaciones de la
enfermedad. Vergara en el 2005 encontró que no había efecto hipoglucemiante en el té de chaya aún
con la combinación de un fármaco en el experimento subcrónico de 7 semanas, lo cual se esta
confirmando con los resultados obtenidos.
**
52
050
100150200250300350400450
1 2 3 4 5 6 7Tiempo (semanas)
Glu
cosa
(mg/
dl)
SC DC DA
Gráfica 3 Concentración de Glucosa de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 * No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey Sin embargo se debe mencionar que durante esta primera fase del experimento 2 ratas diabéticas
murieron; la primera muerta a las 3 semanas del estudio, pertenecía al grupo de diabéticas con agua; la
segunda muerta a las 6 semanas correspondiente al grupo diabética tratada con té de chaya; esto puede
ser atribuido a las complicaciones derivadas por la enfermedad.
La
*
*
*
53
Tabla 7 muestra las correlaciones entre los tres grupos, considerando la relación que existe entre el peso,
glucosa, triglicéridos, microalbúmina y creatinina por el método de Pearson. Considerando las
correlaciones mayores de 0,8 tenemos las variables que manifiestan más influencia entre si.
54
Tabla 7 Correlaciones entre grupos de diabéticas con té de chaya, diabéticas agua y sanas con té de chaya PDC PDA PSC GSC GDC GDA TSC TDC TDA MDC MDA MSC CreDC CreDA CreSC
PDC 1 0,964 -0,987 -0,048 -0,702 -0,676 0,629 0,734 0,184 0,266 0,749 -0,806 0,655 0,646 -0,299
PDA 1 -0,981 -0,005 -0,569 -0,546 0,824 0,831 0,416 0,443 0,618 -0,529 0,638 0,859 -0,029
PSC 1 -0,028 0,658 0,653 -0,755 -0,854 -0,384 -0,404 -0,783 0,66 -0,728 -0,772 0,119
GSC 1 0,283 0,0574 0,188 0,307 0,0694 -0,477 -0,078 -0,269 -0,282 -0,049 -0,455
GDC 1 0,94 -0,036 -0,127 -0,004 -0,343 -0,361 -0,391 -0,35 0,165 -0,495
GDA 1 -0,074 -0,341 -0,044 -0,136 -0,543 -0,022 -0,382 0,163 -0,153
TSC 1 0,842 0,729 0,488 0,381 -0,102 0,474 0,862 0,254
TDC 1 0,589 0,25 0,685 -0,564 0,575 0,66 -0,153
TDA 1 0,849 0,674 0,0441 0,822 0,95 0,588
MDC 1 0,588 0,292 0,833 0,818 0,827
MDA 1 -0,464 0,934 0,6 0,139
MSC 1 -0,223 -0,077 0,777
CreDC 1 0,778 0,43
CreDA 1 0,481
CreSC 1 PDC= Peso diabética con té de chaya, PDA= Peso diabética con agua, GDC= Glucosa diabética con té de chaya, GDA= Glucosa diabética con agua, GSC= Glucosa sana con té de chaya, TDC= Triglicéridos diabética con té de chaya, TDA= Triglicéridos diabética con agua, TSC= Triglicéridos sana con té de chaya, MDC= Microalbúmina diabética con té de chaya, MDA= Microalbúmina diabética con agua, MSC= Microalbúmina sana con té de chaya, CreDC= Creatinina diabética con té de chaya, CreDA= Creatinina diabética con agua, CreSC= Creatinina sana con té de chaya. En la Gráfica 4 se puede observar que los niveles de triglicéridos sanguíneos en las ratas diabéticas que
recibieron el té de chaya mostraron una disminución del 40% comparado con el 28% del grupo de ratas
diabéticas que solo recibió agua y las ratas sanas normoglicémicas tratadas con chaya también
mostraron una reducción del 30%. Sin embargo los resultados no son estadísticamente significativos
(P=0,430), por otro lado, los niveles de colesterol (datos no mostrados) no resultaron modificados en
ninguno de los grupos estudiados. Lo que indica que el tratamiento con té de chaya no tiene efecto en
disminuir los niveles lipídicos en ratas diabéticas.
-60
-40
-20
0
20
40
60
1 2 3 4 5 6Tiempo (semanas)
Δ%
Trig
licér
idos
SC DC DA
Gráfica 4 Cambio en los niveles de triglicéridos sanguíneos, en las ratas diabéticas tratadas con té de chaya y agua durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
55
De acuerdo a investigaciones realizadas por Iglesias y col., 2003, la hiperglicemia de la diabetes puede
ser la causa de las complicaciones diabéticas, debido a la alta concentración de glucosa en la orina la
cual es fundamental para el desarrollo de la nefropatía, esto aparece cuando la concentración plasmática
es elevada y la cantidad de glucosa filtrada a través de los glomérulos excede la capacidad máxima de
resorción de los túbulos renales.
Se puede observar en la Gráfica 5 el volumen de orina acumulada durante un período de 12 hr, en esta
etapa del experimento se tiene una correlación entre los grupos diabéticos de chaya y agua del 0,984,
con α=0,05 no encontrándose una diferencia significativa entre los grupos.
-10
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5 6
Tiempo (semanas)
ml d
e O
rina
SC DC DA
Gráfica 5 Volumen (ml) de orina en 12 horas de las ratas diabéticas y sanas, tratadas con té de chaya y agua. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 * No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
El marcador clínico más temprano de la enfermedad renal diabética es la microalbuminuria, definida como
presencia en la orina de 20 a 200 microgramos por minuto ó 30 a 300 miligramos por 24 hr de la proteína
más abundante en sangre, la albúmina, problema que va acompañado de un aumento en la pérdida de
agua por el efecto osmótico de la glucosa.
Al realizar las determinaciones de los niveles de microalbúmina de manera semanal se encontró que en
las ratas diabéticas con té de chaya (DC) y diabéticas con agua (DA) fueron >30 mg/dL, valores que
indican daño renal y factor de riesgo de enfermedad cardiovascular, sin embargo, para el grupo de DC los
niveles fueron menores (50%) que los DA al final del experimento (Gráfica 6). Estos resultados fueron
correlacionados con los niveles de creatinina (Gráfica 7), obteniendo que para el grupo de diabéticas con
chaya hay un coeficiente de correlación de 0.8330; en el caso de las diabéticas con agua es de 0.60; y
para las ratas sanas con chaya el coeficiente es de 0.777. En los dos casos de tratamiento con té de
chaya vemos que están relacionados la microalbúmina y la creatinina lo cual nos indica un posible daño
renal.
*
* *
56
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
1
2
3
4
5
Tiem
po (s
eman
as)
Microalbúmina (mg/dL)
SC DC DA
Gráfica 6 Cambio en los niveles de microalbúmina en orina, de las ratas diabéticas y sanas tratadas con té de chaya y agua durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
Tiempo (semanas)
Cre
atin
ina
(mg/
dL)
SC DC DA
Gráfica 7 Cambio en los niveles de creatinina en la orina, de las ratas diabéticas y sanas tratadas con té de chaya y agua durante el experimento subcrónico. SC= Sana con té de chaya, DC= Diabética con té de chaya, DA= Diabética con agua. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6-7 No existen diferencias estadísticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey Con los resultados obtenidos se tiene un posible daño renal, el comparativo entre los tratamientos no
presenta diferencias significativas entre los grupos de ratas diabéticas.
57
6.3 Segunda fase experimento subcrónico
En esta fase experimental se indujo la diabetes con STZ a tres grupos de rata, el consumo de alimento se
mantuvo constante en un 50 ± 10 g a lo largo del experimento y para las ratas sanas se mantuvo en 27 ±
6 g, existe un decremento de 23 g en el consumo de alimento entre las ratas sanas y las diabéticas. En lo
que respecta al consumo de líquido, también se puede apreciar un decremento al final del experimento
con respecto al consumo al inicio de esta fase subcrónica, en donde las ratas diabéticas disminuyeron en
promedio 55 ml para los grupos de diabéticas con agua y diabéticas con té de chaya y siendo mayor para
el grupo de diabéticas con antioxidantes en donde hubo un decremento de 75 ml como se puede ver en la
Gráfica 8, debido a los resultados no se encontraron diferencias estadísticas que sean significativas. Esto
nos refiere a una de las manifestaciones clínicas de esta patología como es la polifagia y la polidipsia la
cual es muy severa al inicio de la enfermedad (Figueroa, 1997; Dorantes, 2002 y Benítez, 2006); y en
este estudio se atenúa a lo largo del tiempo especialmente para los grupos que reciben el complejo
antioxidante y la chaya.
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6
Tiempo (semanas)
Líqu
ido
(ml/d
ía/ra
ta)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 8 Consumo de líquido de ratas sanas y diabéticas tratadas con té de chaya, antioxidante y agua. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre los grupos con misma letra (a,b), p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
La polifagia evaluada por el consumo de alimento se observó más en el grupo de las ratas diabéticas que
sólo recibieron agua que en las que recibieron el té de chaya, el cual se incrementó el 90 y 53% con
respecto al grupo de ratas sanas. Este incremento en el consumo de alimento no se reflejó en el peso
corporal de estos grupos.
a
b
58
En lo que respecta a los niveles de glucosa sanguínea a lo largo del experimento no se encontró efecto
hipoglucemiante en el tratamiento ni con té de chaya, ni antioxidante para las ratas diabéticas, para las
ratas sanas no hay variaciones en los niveles de glucosa sanguínea (ver Gráfica 9), esto comprueba los
resultados obtenidos en la primer fase experimental subcrónica así como lo efectuado por Vergara en el
2005 en donde se evaluó el efecto hipoglucemiante del té de chaya. Pero de acuerdo a lo reportado por
Kuti y col. en el 1996, en donde se observo que el té de chaya presentaba un efecto hipoglucemiante en
conejo en un experimento agudo de 6 hr, esto puede indicar que puede ser una variable la especie,
además de que en administración aguda puede ayudar posiblemente..
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1 2 3 4 5 6 7 8Tiempo (semanas)
Glu
cosa
(mg/
dL)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 9 Niveles de glucosa sanguínea en las ratas diabéticas y sanas tratadas con té de chaya, antioxidante y agua. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre los grupos de las mismas letras y con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey En la Tabla 8 podemos observar las correlaciones entre los tratamientos, en donde se puede observar
cuales son las variables y tratamientos que están presentan una relación.
a a
a
b
59
Tabla 8 Correlación entre glucosa, peso corporal, triglicéridos, colesterol total y colesterol de alta densidad
GSAOx
GSA
GDAOx GDC GDA PDC
PDAOx PDA PSC
PSAOx PSA TDC TDA
TDAOx TSC TSA
TSAOx CDA CDC
CDAOx CSA CSC
CSAOx
HDLDC
HDL DA
HDL DAOx
HDL SC
HDL SA
HDL SAOx
GSC 0,74 0,8 -0,139 -
0,204 -
0,408 0,12 -0,228 -
0,229 -
0,089 -0,123 -0,17 -
0,763 -
0,213 -0,197 -
0,805 -
0,316 -0,070 -
0,053 0,871 -0,387 -0,28 -
0,559 -0,433 -0,953 -0,362 -0,433 -0,892 -0,404 0,231 GSAOx 1 0,78 0,176 0,234
-0,126 0,078 -0,274
-0,305 0,268 0,29 0,239
-0,683 0,086 -0,024
-0,784
-0,086 -0,424
-0,202 0,752 -0,423
-0,102
-0,526 -0,117 -0,88 -0,39 0,121 -0,794 -0,361 0,295
GSA 1 0,0007 0,139 -
0,051 0,238 -0,264 -
0,274 0,191 0,183 0,097
6 -
0,707 -
0,322 -0,208 -
0,699 -
0,284 -0,129 -
0,088 0,846 -0,346 -
0,241 -
0,408 -0,389 -0,977 -0,193 -0,491 -0,858 -0,346 0,247 GDAOx 1 0,513 0,82
-0,795 -0,879
-0,897 0,907 0,889 0,909
-0,178 0,443 -0,373
-0,637
-0,685 0,487 0,542 0,235 0,263
-0,649
-0,872 0,429 0,0788 -0,511 0,492 -0,237 -0,79 0,087
GDC 1 0,661 -
0,051 -0,369 -
0,367 0,706 0,712 0,695 -0,45 0,691 -0,379 -
0,255 0,268 -0,388 -
0,624 0,238 -
0,0593 0,459 0,102 0,629 -
0,0228 -0,323 0,477 0,46 0,186 0,895
GDA 1 -
0,476 -0,649 -
0,648 0,85 0,839 0,846 0,171 0,227 -0,298 -
0,116 -
0,525 0,666 0,499 -
0,162 0,326 -
0,446 -
0,407 0,369 0,525 -0,149 0,319 0,278 -0,391 -0,00737
PDC 1 0,727 0,756 -
0,521 -0,48 -
0,509 0,103 -
0,498 0,343 0,508 0,599 -0,485 -
0,555 -
0,124 -0,332 0,604 0,817 -0,337 -0,226 0,58 -0,452 0,149 0,73 0,0401 PDAOx 1 0,996
-0,845 -0,793
-0,804 0,463
-0,179 0,646 0,832 0,859 -0,54 -0,51
-0,593 -0,271 0,76 0,906 -0,245 0,309 0,474 -0,0798 0,506 0,887 -0,239
PDA 1 -
0,849 -0,802 -
0,807 0,455 -
0,224 0,623 0,842 0,845 -0,512 -
0,516 -
0,581 -0,272 0,76 0,933 -0,266 0,295 0,505 -0,135 0,514 0,904 -0,222
PSC 1 0,994 0,989 -0,27 0,31 -0,576 -0,87 -
0,692 0,337 0,386 0,385 0,385 -
0,584 -
0,876 0,632 -0,29 -0,262 0,323 -0,394 -0,756 0,358 PSAOx 1 0,992 -0,2 0,317 -0,518
-0,894
-0,653 0,271 0,386 0,327 0,4
-0,564
-0,904 0,702 -0,316 -0,197 0,373 -0,436 -0,746 0,33
PSA 1 -0,17 0,312 -0,477 -
0,847 -0,67 0,333 0,42 0,29 0,368 -
0,579 -
0,897 0,677 -0,23 -0,205 0,379 -0,379 -0,739 0,297
TDC 1 -
0,325 0,511 0,857 0,163 0,196 0,379 -
0,931 0,416 0,012
8 0,488 0,064 0,679 0,683 0,0718 0,371 0,292 -0,731
TDA 1 -0,182 -
0,259 0,311 -0,396 -
0,416 0,065 -
0,0863 0,352 -
0,198 0,531 0,262 -0,69 0,878 0,404 0,0187 0,525 TDAOx 1 0,813 0,498
-0,0969
-0,001
-0,595 -0,552 0,301 0,492 -0,574 0,592 0,133 0,228 0,32 0,492 -0,696
TSC 1 0,619 -
0,0243 -0,13 -0,92 -0,599 0,519 0,837 -0,384 0,706 0,648 -0,0197 0,699 0,81 -0,497
TSA 1 -0,769 -
0,814 -
0,427 -0,414 0,969 0,827 0,0431 0,324 0,121 0,36 0,704 0,906 0,188 TSAOx 1 0,835
-0,049 0,207
-0,768
-0,414 -0,357 0,275 -0,0361 -0,366 -0,171 -0,502 -0,507
CDA 1 -
0,121 0,434 -0,91 -
0,597 -0,152 0,121 0,115 -0,192 -0,487 -0,701 -0,694
CDC 1 -0,216 -
0,296 -
0,612 -
0,0697 -0,838 -0,503 -0,277 -0,661 -0,525 0,587 CDAOx 1
-0,394 -0,87 0,733 -0,31 0,489 -0,106 -0,789 -0,382 -0,0227
CSA 1 0,82 0,102 0,243 0,0751 0,284 0,73 0,907 0,391
CSC 1 -0,146 0,342 0,692 -0,149 0,68 0,98 -0,0149
GDC= Glucosa diabética con té, GDAOx= Glucosa diabética con AOx, GDA= Glucosa diabética con agua, GSC= Glucosa sana con té, GSAOx= Glucosa sana con AOx, GSA=
Glucosa sana con agua; PDC= Peso diabética con té, PDAOx= Peso diabética con AOx, PDA= Peso diabética con agua, PSC= Peso sana con té, PSAOx= Peso sana con AOx,
PSA= Peso sana con agua; TDC= Triglicéridos diabética con té, TDAOx= Triglicéridos diabética con AOx, TDA= Triglicéridos diabética con agua, TSC= Triglicéridos sana con té,
TSAOx= Triglicéridos sana con AOx, TSA= Triglicéridos sana con agua; CDC= Colesterol diabética con té, CDAOx= Colesterol diabética con AOx, CDA= Colesterol diabética con
agua, CSC= Colesterol sana con té, CSAOx= Colesterol sana con AOx, CSA= Colesterol sana con agua; HDLDC= Colesterol de alta densidad diabética con té, HDLDAOx= Colesterol
de alta densidad diabética con AOx, HDLDA= Colesterol de alta densidad diabética con agua, HDLSC= Colesterol de alta densidad sana con té, HDLSAOx= Colesterol de alta
densidad sana con AOx, HDLSA= Colesterol de alta densidad sana con agua.
60
Al analizar la concentración de glucosa en suero al final del experimento, las diabéticas con té de chaya
tuvieron un valor de 373,43 ± 53,44 mg/dL, el grupo de diabéticas con agua de 360,67 ± 31,36 mg/dL,
diabéticas con antioxidantes (AOx) de 442,29 ± 63,89 mg/dL, para los grupos de ratas sanas se tiene que
la sanas con agua tienen un valor de glucosa de 100,8 ± 9,45 mg/dL, las sanas con chaya de 109 ± 11,02
mg/dL y las sanas con AOx de 100,7 ± 6,32 mg/dL. No se encontró diferencia estadística significativa
entre los dos grupos de diabéticas con agua y chaya, pero con respecto a las sanas se tiene una
diferencia significativa (ver Gráfica 10).
0
100
200
300
400
500
600
1
Tratamientos
Glu
cosa
(mg/
dL)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 10 Concentración de Glucosa sanguínea al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas con agua, antioxidante y té de chaya, durante 49 días. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) por la prueba de Tukey con p<0,05 y α=0,05 En triglicéridos para las diabéticas con té de chaya tenemos un valor de 211,83 ± 37,67 mg/dL, las
diabéticas con agua 183,47 ± 30,74 mg/dL y diabéticas con AOx 188,18 ± 30,19 mg/dL, para los grupos
de sanas se obtuvieron valores de 135,88 ± 17,62 mg/dL para sana con té de chaya, 135 ± 25,21 mg/dL
para sanas con agua y 139,17 ± 10,62 mg/dL sanas con AOx; en todos los grupos de diabéticas se tienen
valores por arriba del valor máximo que es de 150 mg/dL (ver Gráfica 11). Con respecto al análisis
estadístico no hay diferencias significativas entre los grupos diabéticas, solamente se puede observar
diferencias significativas de las diabéticas con respecto a las ratas sanas.
a a a
b
b
b
61
0
50
100
150
200
250
300
1
Tratamientos
Trig
licér
idos
(mg/
dL)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 11 Concentración de Triglicéridos al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas con agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Holm Sidak En la Gráfica 12 se muestra el comparativo de las concentraciones de colesterol total, para el grupo de
diabéticas con té de chaya se tiene 106,81 ± 12,75 mg/dL, en el grupo de diabéticas con agua de 106,95
± 7,66 mg/dL, diabéticas con AOx de 108,52 ± 26,49 mg/dL presentado una gran variabilidad en los
datos, para los grupos de sanas se obtuvieron para sanas con té de chaya 79,89 ± 5,31 mg/dL, sanas con
agua de 78,76 ± 4,16 mg/dL y sanas con AOx de 80,63 ± 8,18 mg/dL. No se encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos de diabéticas y sanas.
a a a
bb b
62
Tratamientos
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1
Col
este
rol (
mg/
dL)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 12 Concentración de Colesterol al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas con agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey En la Gráfica 13 podemos observar el comparativo correspondiente a la concentración de colesterol de
alta densidad, se considera un parámetro aceptable a valores mayores a 45 mg/dL; para el grupo de
diabéticas con té de chaya se tiene un valor de 52,41 ± 3,7 mg/dL, en diabéticas con AOx 53,01 ± 4,05
mg/dL y para las diabéticas con agua 57,80 ± 12,32 mg/dL; en los grupos de sanas los valores son para
las sanas con té de chaya 77,47 ± 2,78 mg/dL, sanas con AOx 78,28 ± 4,35 mg/dL y sanas con agua de
67,52 ± 9,63 mg/dL, todos los valores tanto para diabéticas como para sanas se encuentran dentro de los
parámetros establecidos. No hay diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos ni entre los
grupos de ratas sanas ni diabéticas.
a a a
bb b
63
Tratamientos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
Cole
ster
ol H
DL
( mg/
dL)
SA SAOx SC DA DAOx DC
Gráfica 13 Concentración de Colesterol de alta densidad (HDL) al final del experimento en ratas sanas y diabéticas tratadas con agua, antioxidantes y té de chaya, durante 49 días. SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Holm Sidak. Las manifestaciones clínicas que caracterizan la existencia de la diabetes en humanos como
hiperglicemia, pérdida de peso, polifagia, poliuria, polidipsia, se presentaron de forma similar en el modelo
experimental con STZ en ratas, como lo reportan Ravi y col., 2004. En relación a la pérdida de peso,
nuestros resultados mostraron una disminución del 15-25% similar a lo encontrado en otros reportes
(Ravi y col., 2004; Madar Z., 1983), siendo la pérdida de peso relativamente menor (15%) aunque no
significativa para el grupo que recibió el té de chaya.
Analizando los datos en conjunto podemos ver que para el grupo de sanas con té de chaya hay una
correlación entre la glucosa y los triglicéridos del -0,805 y entre glucosa y HDL de -0,892, el peso tiene
una correlación del -0,87 con respecto a los triglicéridos y con el colesterol total de -0,876; lo cual como
afecta la influencia de un alto nivel de glucosa y peso alto en los niveles lipídicos. En el tratamiento de
diabéticas con té de chaya se tiene una correlación entre los niveles lipídicos, encontrando que entre el
colesterol total y HDL existe una correlación de -0,838 y entre Colesterol total y triglicéridos es de -0,931;
lo cual nos indica que al tener un nivel muy alto de triglicéridos, los niveles de Colesterol Total y
Colesterol de alta densidad son más bajos. Para el grupo de diabéticas con AOx tenemos una relación
entre la glucosa y el peso de -0,879 lo cual nos indica que hay una influencia significativa en la que a
mayor nivel de glucosa menor peso corporal. En el grupo de sanas con AOx no hay diferencias
estadísticas significativas. En el tratamiento de sanas con agua hay una correlación positiva que indica
que cuando hay un aumento en los triglicéridos el colesterol total y el HDL se incrementan también (para
a
a a
bb b
64
los niveles de triglicéridos y colesterol total de 0,969, y entre triglicéridos y HDL de 0,906 lo que nos dice
que entre ellas hay una influencia que aumentan).
Aunque se comprueba que existen correlaciones entre las variables no se puede observar ningún efecto
hipoglucémico, ni un decremento en los niveles lipídicos tanto para el tratamiento con té de chaya como
para la administración de antioxidantes por medio de vitaminas.
6.4 Tercera fase
6.4.1 Curvas hipoglucémicas
Se efectuaron experimentos agudos con grupos de 7 ratas tanto sanas como diabéticas probando
diferentes tratamiento y diferentes dosis, administrando de manera intragástrica con previo ayuno de 8
horas. Con la administración de extracto puro sin diluir a una dosis de 0,5 g de hoja de chaya/kg de peso
corporal se presentaron convulsiones, dificultad para respirar y taquicardia en las ratas sanas,
recuperándose después de 2 hr sin tener efecto secundario detectable en días posteriores. Para el grupo
de diabéticas se llego a la dosis letal 25% (DL25), los síntomas fueron los mismos pero de manera más
severa incluso con un deceso a tan solo 2 min de haber suministrado la dosis, sangrado incluso la nariz
en un caso (se efectuó la autopsia no encontrándose algún problema aparente), y otro deceso después
de dos horas de la administración de la dosis, presentando convulsiones incontrolables, dificultad para
respirar y taquicardia, las demás se recuperaron después de 6 hr de la administración del extracto de
chaya solo presentando fatiga y somnolencia posterior a las 6 hr..
De acuerdo a los resultados obtenidos en la Gráfica 14 representados como diferencias en porcentaje de
glucosa sanguínea en los cuales se hace un comparativo por concentración. En el inciso a) el
comparativo correspondiente a la concentración al 2% (v:v) de diferentes preparaciones para ratas sanas
y diabéticas, en el inciso b) se tienen las curvas al 6% (v:v) y el inciso c) la gráfica tiene el comparativo del
10 y100% de concentración (v:v) de la diferencia porcentual de la glucosa sanguínea. El mayor efecto
hipoglucemiante se presentó es la concentración del 6% de licuado crudo de chaya tanto para las ratas
diabéticas como las sanas, por lo que se consideró esta dosis y la concentración de 6% extracto acuoso
de chaya, para administrar ad libitum por 11 días.
65
Gráfica 14 Curvas hipoglucémicas de glucosa sanguínea en ratas diabéticas y sanas. a) En concentración al 2% (v:v) de té de chaya, licuado de chaya y agua; b) En concentración al 6% (v:v) de té de chaya, licuado y extracto de chaya y agua, c) Concentración al 10% (v:v) de té de chaya, extracto y licuado de chaya , 100% de extracto de hoja de chaya y agua. SA= Sana con agua, ST2= Sana té de chaya al 2%, SL2= Sana con licuado de chaya al 2%, ST6= Sana con té de chaya al 6%, SL6= Sana con licuado al 6%, SE6= Sana con extracto al 6%, ST10= Sana té de chaya al 10%, SL10= Sana licuado de chaya al 10%, SE10= Sana extracto de chaya al 10 %, SE100=Sana extracto al 100%, DA=Diabética con agua, , DT2= Diabética con té de chaya al 2%, DL2= Diabética con licuado al 2%, DT6= Diabética con té de chaya al 6%, DL6= Diabética con licuado al 6%, DE6= Diabética con extracto al 6%, DT10= Diabética té de chaya al 10%, DL10= Diabética licuado de chaya al 10%, DE10= Diabética extracto de chaya al 10 %, DE100= Diabética extracto al 100%,
Curvas hipoglicémicas de concentraciones al 10 y 100% de chaya
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6
Tiempo (horas)
Δ %
Glu
cosa
(mg/
dL)
DE10 DL10 DE100 DT10 ST10 SE10 SL10 SE100 DA SA
Curvas hipoglicémicas de concentraciones al 2% de chaya
-60-40-20
020406080
100120
1 2 3 4 5 6
Tiempo(horas)
Δ %
Glu
cosa
(mg/
dL) DT2 DL2 SL2 ST2 DA SA
Curvas hipoglicémicas de concentraciones al 6% de chaya
-60-40-20
020406080
100120
1 2 3 4 5 6
Tiempo (horas)
Δ %
Glu
cosa
(mg/
dL)
DT6 DL6 SL6 SE6 ST6 DA SA
a)
b)
c)
66
El experimento agudo con la administración de extracto y licuado al 6% a los grupos de ratas sanas y
diabéticas se realizó durante 11 días, durante este período se realizaron tres mediciones de los
parámetros, al inicio, medio y final del tratamiento.
En la Gráfica 15 se puede observar un decremento en la concentración de la glucosa sanguínea durante
el experimento de 11 días, en las diabéticas tratadas con licuado de hoja de chaya al 6%, fue de 10.54%,
diabéticas 6% extracto de 6.92%, 14 y 7.9% para las sanas con licuado de hoja de chaya al 6% y extracto
de chaya al 6% respectivamente. Hay diferencias estadísticas significativas por la prueba de Holm Sidak
entre los grupos diabéticas a sanas tanto para extracto como licuado de p<0,001 con α=0,05. Entre las
diabéticas con extracto y diabéticas licuado existe una diferencia significativa de p=0,08 con α=0,05, pero
entre los dos grupos de sanas no hay diferencias.
1 6 110
50
100150
200250
300350
400450
Tiempo (días)
Glu
cosa
( m
g/dL
)
DL DE SL SE
Gráfica 15 Concentración de glucosa en ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% durante 11 días. SL= Sana con licuado de chaya al 6%, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a Existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas, No existen diferencias significativas entre los dos grupos de ratas sanas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
En la Gráfica 16 correspondiente al peso se puede observar que se mantuvieron muy constantes los
valores durante el experimento y presentan una diferencia estadística significativa entre los grupos de
diabéticas de P=0,108, entre sanas de P= 0,025, ambos con un α=0,05 por el método de Holm Sidak.
a
a
b b
67
1 6 110
50100150200250300350400450500
Tiempo (días)
Pes
o ( g
rs)
SL SE DL DE
Gráfica 16 Registro de peso de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% durante 11 días. SL= Sana con licuado de chaya al 6%, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas, pero si con respecto a las sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey Se realiza la correlación lineal de las mediciones hechas de peso y glucosa durante el experimento
obteniendo una matriz de correlación por el método de Pearson (ver Tabla 9), en la cual podemos
analizar el mejor tratamiento administrado de estos datos. Solo en el grupo de ratas sanas tratadas con
extracto al 6% se tiene una correlación negativa de 0,828 entre el peso y la glucosa lo que nos indica que
con el aumento de peso la glucosa disminuye con la administración del extracto.
Tabla 9 Correlación peso-glucosa de experimento agudo PDL PDE PSL PSE GDL GDE GSL GSE
PDL 1 0,996 -0,997 -0,945 0,593 0,104 0,867 0,788 PDE 1 -0,987 -0,912 0,663 0,0136 0,908 0,84 PSL 1 0,966 -0,532 -0,177 -0,828 -0,74 PSE 1 -0,296 -0,423 -0,656 -0,543GDL 1 -0,74 0,915 0,963 GDE 1 -0,406 -0,531GSL 1 0,99
PDL= Peso diabética licuado, PDE= Peso diabética extracto, PSL= Peso sana licuado, PSE= Peso sana extracto; GDL= Glucosa
diabética licuado, GDE= Glucosa diabética extracto, GSL= Glucosa sana licuado, GSE= Glucosa sana extracto. El análisis de la glucosa sanguínea al final del experimento se tiene para el grupo de diabéticas con
extracto acuoso al 6% se obtuvo un valor de 366,45 ± 21,17 mg/dL, en las diabéticas con licuado de
322,24 ± 59,38 mg/dL, para las diabéticas con agua los valores son 439,58 ± 36,09 mg/dL, para las sanas
con extracto de 116,61 ± 31,59 mg/dL, las sanas con licuado 103,61 ± 11,11 mg/dL y las sanas con agua
de 129,75 ± 7,12 mg/dL. Por el método de Tukey con p<0,001 y un α=0,05 se encuentra que si hay
diferencia estadística significativa entre los grupos de diabéticas con extracto y licuado con respecto a las
tratadas con agua. Entre los grupos de sanas no hay diferencias estadísticas significativas. Estos
aa
b
b
68
resultados nos indican que la administración de la hoja fresca de chaya, ya sea preparada como extracto
o en licuado, baja los niveles de glucosa sanguínea, comparando contra el grupo control de diabéticas
con agua, siendo un 16,63 % menor en las ratas diabéticas tratadas con extracto al 6 % y 26,69 % para
las ratas diabéticas con licuado al 6 %; al realizar la comparación con el grupo control de ratas sanas con
agua se tiene también una disminución de la glucosa del 10,13 % para las ratas sanas tratadas con
extracto al 6% y un decremento del 20,15 % para las sanas con licuado al 6%, como podemos observar
en estos resultados y los mostrados en la gráfica 17 el mejor tratamiento hipoglucémico es la
administración del licuado de hoja al 6%.
050
100150
200250300
350400
450500
1Tratamientos
Glu
cosa
(mg/
dL)
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 17 Concentración de glucosa sanguínea al final del experimento en ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto de chaya al 6% y agua SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b,c Existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas, d No existen diferencias significativas entre los grupos de ratas sanas, pero si con respecto a las ratas diabéticas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey Para triglicéridos en suero los datos se reportan como media +/- desviación estándar, para el grupo de
diabéticas con extracto se obtuvo un valor de 178,91± 16,23, en las diabéticas con licuado de 174,82±
44,90, para las sanas con extracto de 128,07± 10,68 y las sanas con licuado 132,77 ± 7,62 (ver Gráfica
18). No hay diferencias significativas entre los tratamientos p<0,05 con un α=0,05 por el método de
Dunn´s.
ba
d
dd
c
69
0
50
100
150
200
250
300
1Tratamientos
Trig
licér
idos
(mg/
dL)
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 18 Concentración de triglicéridos en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% y agua al final del experimento de 11 días. SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias significativas entre los dos grupos de ratas sanas, pero si con respecto a las ratas diabéticas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey En la Tabla 10 se observan los valores de colesterol total y colesterol de alta densidad con los diferentes
tratamientos, no encontrando diferencias significativas en ninguna de las dos variables entre los grupos
de ratas diabéticas, ni entre las ratas sanas. En la Gráfica 19 se puede observar la concentración del
colesterol total, en el cual si existe una diferencia significativa entre las ratas diabéticas con respecto a las
sanas. Todos los resultados obtenidos se encuentran dentro de los estándares establecidos para estas
variables siendo el valor máximo permisible para colesterol total 200 mg/dL.
Tabla 10 Concentración de colesterol total y colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y
diabéticas tratadas con licuado y extracto de hoja de chaya al 6% al final del experimento de 11 días. Diab Extracto* Diab Licuado* Diab Agua* Sana Extracto* Sana Licuado* Sanas Agua*Colesterol 106,3 ± 9,5 98,5 ± 5 106,95 ± 7,67 93,9 ± 4,3 93,3 ±2,2 81,11 ± 3,86 Colesterol HDL 67,8 ± 2,9 63,8 ± 5,3 57,81 ± 12,32 54,2 ± 2,9 57,6 ± 4,7 67,53 ± 9,64
Datos reportados como media ± desv std. *mg/dL
b
b
aaa
b
70
0
20
40
60
80
100
120
140
SA SE SL DA DE DLTratamientos
Col
este
rol (
mg/
dL)
Gráfica 19 Concentración de colesterol total en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% y agua durante 11 días. SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b,c Existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas, d No existen diferencias significativas entre los dos grupos de ratas sanas con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey La Gráfica 20 corresponde a la concentración del colesterol de alta densidad valor mínimo debe ser de 45
mg/dL, correspondientes al colesterol total y HDL respectivamente. No presentando diferencias
significativas en ningún tratamiento.
0102030405060708090
1
Tratamientos
Col
este
rol H
DL
(mg/
dL)
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 20 Concentración de colesterol de alta densidad en suero de ratas sanas y diabéticas, tratadas con licuado y extracto al 6% y agua durante 11 días. SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
b baa
a
b
bbaa
a b
71
Para el grupo de diabética con licuado al 6% presenta una correlación entre Colesterol de alta densidad
(HDL) y triglicéridos y colesterol total de 0,773 y 0,752 respectivamente lo que indica que estas variables
relacionadas entre si positivamente, lo que indica que cuando aumente el HDL aumentaran los
triglicéridos y el colesterol total; para el grupo de diabéticas y sanas con extracto al 6% no se
correlacionan el perfil de lípidos con la correspondiente glucosa, presentando diferencias estadísticas
significativas con p<0,001, α=0,05 por el método de Holm Sidak. En el grupo de sanas con licuado las
correlaciones son negativas e inferiores a 0,7, encontrando que entre la glucosa y el colesterol total de -
0,667 y entre triglicéridos y HDL de -0,668, los resultados presentan diferencias estadísticas significativas
de p<0,001 con α=0,05 por el método de Holm Sidak.
En el presente estudio, se evaluó el té de chaya administrado ad libitum sobre el efecto diabetogénico de
la estreptozotocina (STZ), en las ratas. La diabetes inducida por STZ en los animales de laboratorio ha
sido ampliamente utilizada para investigar sobre la misma y sus complicaciones a largo plazo, así como
para evaluar el posible efecto hipoglucémico y antihiperglicémico de nuevos compuestos sintéticos o
provenientes de plantas. La severidad de la diabetes experimental y su persistencia en las ratas depende
de la dosis empleada de STZ (Tancrede G., y col. 1983).
De acuerdo a los resultados encontrados en esta etapa la administración de extracto y licuado al 6% tiene
efecto hipoglucémico en el tratamiento de ratas diabéticas, siendo mejor tratamiento el licuado; en ambos
tratamiento no se presentan diferencias significativas para los resultados obtenidos en el perfil lipídico,
pero si existe una tendencia a influir positivamente en ellos.
6.5 Determinación de capacidad antioxidante
Existen numerosos estudios relacionados con la diabetes en los cuales las defensas antioxidantes
celulares son superadas por la producción de especies reactivas, a esto se le conoce como estrés
oxidativo. La glucosa en sangre conduce al incremento en la actividad de procesos metabólicos donde se
generan metabolitos intermediarios los cuales tienen acción pro-oxidante. Por lo que es de gran
importancia tomar en cuenta a los antioxidantes provenientes de una dieta rica en vitaminas A, E, C,
compuestos fenólicos y flavonoides como es el caso de la chaya.
El análisis de la capacidad antioxidante en el plasma es importante debido que aquí en el soluto se
encuentran el 70% de las proteínas, principalmente inmunoglobulinas (anticuerpos), albúmina,
transferrina y proteínas que ayudan a la coagulación de la sangre como el fibrinógeno. También
encontramos iones de sales inorgánicas, hormonas, vitaminas.
Es por esto que en esta etapa se realizó primero una estandarización de tres técnicas
espectofotométricas, TAC, ABTS y FRAP, con las cuales se evaluó la capacidad antioxidante total en
plasma por cada tratamiento y experimento (subcrónico y agudo).
72
6.5.1 Determinación de la capacidad antioxidante total por la técnica TAC por crocin
La capacidad antioxidante total por crocin es una técnica comúnmente utilizada para reportar la capacidad
antioxidante en fluidos biológicos, la cual se lleva a cabo por medio de una cinética incubando durante 60
min a 37ºC. En la Gráfica 40 del anexo IV ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.podemos
observar la cinética a diferentes concentraciones con la cual se calculó el % de inhibición para la
elaboración de la curva estándar de ácido ascórbico (Gráfica 41 del anexo IV).
Similarmente se corre la cinética correspondiente al trolox para elaborar la curva estándar la cual se
puede apreciar en la Gráfica 42 del anexo IV.
Posteriormente se analizaron las muestras de plasma de la segunda fase subcrónica (comparativo del té,
antioxidante y agua) y de la fase aguda (extracto y licuado de hoja de chaya al 6%); se hicieron diluciones
para generar una curva con diferentes concentraciones por cada muestra y poder interpolar el 50% de
inhibición de cada muestra por cada grupo de ratas diabéticas y sanas. A continuación se muestra unas
gráficas elaboradas en minitab 15 de diferentes curvas de concentración de plasma (ver Gráfica 21).
Gráfica 21 Curvas de % de inhibición de μl de plasma de diferentes muestras de tratamientos por TAC
a. Curva de % inhibición para rata sana 11 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
b. Curva de % inhibición para rata diabética 12 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
c. Curva de % inhibición para rata sana 12 del grupo de tratado con agua
d. Curva de % inhibición para rata sana 12 del grupo de tratado con extracto de hoja de chaya al 6%
876543210
60
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% d
e in
hib
ició
n
50
LinearQ uadratic
C ubic
Rata 11 Sana extracto por TAC
1086420
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% in
hib
ició
n50
LinearQ uadratic
Rata 12 Diabética Extracto por TAC
9876543210
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% d
e in
hibi
ción
50
Rata 12 Sana extracto por TAC
876543210
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticRata 12 Sana con agua por TAC
a) b)
c) d)
73
Con los resultados que se obtuvieron al interpolar el 50% de inhibición se calculó el valor de la capacidad
antioxidante total que es TAC = 1/IC50 y se correlaciona con el 50% de inhibición de cada una de las
curvas estándar de ácido ascórbico y trolox.
En la Gráfica 22 se tiene el comparativo correspondiente al experimento subcrónico de la segunda fase
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Tratamientos
mm
ol/L
A.A
scór
bic o
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 22 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por TAC del experimento subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6 - 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
74
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Tratamientos
mm
ol/L
Tro
lox
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 23 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC del experimento subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Tratamientos
mm
ol/l
A. A
scór
bico
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 24 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por TAC de la tercera fase
75
SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Tratamientos
mm
ol/l
Tro
lox
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 25 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por TAC de la tercera fase
SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
6.5.2 Determinación de la capacidad antioxidante total por la técnica ABTS
La técnica de ABTS se corrió por medio de una cinética la cual quedo estandarizada en tiempo en 10 min,
se hacen las curvas de % inhibición para ácido ascórbico (ver Gráfica 43 del anexo V) y trolox (ver Gráfica
44 del anexo V), los cuales fueron utilizadas para realizar los cálculos tomando el 50% de inhibición del
estándar contra el 50% de inhibición de la muestra (el cálculo de la muestra fue realizado sacando su
linealidad y posteriormente interpolando el valor).
Para el análisis por ABTS se hacen diluciones previas para cada muestra de plasma (cuatro diferentes
concentraciones, diluyendo en buffer fosfato de sodio), Con minitab 15 se generaron las gráficas la
ecuación de la curva. A continuación se muestras algunas gráficas (ver Gráficas 26).
76
Gráficas 26 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por ABTS
0
5
10
15
20
25
30
35
Tratamientos
mm
ol/L
AA
scór
bico
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 27 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por ABTS del experimento subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya.
0.80.70.60.50.40.30.20.1
90
80
70
60
50
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticRata 2 Sana Te por ABTS
0.80.70.60.50.40.30.2
80
70
60
50
40
30
20
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticRata 12 Sana Agua por ABTS
0.80.70.60.50.40.30.2
80
70
60
50
40
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticRata 13 Sana AOx por ABTS
0.80.70.60.50.40.30.2
80
70
60
50
40
30
20
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticCubic
Rata 22 Diabética Extracto por ABTS
77
Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tratamientos
mm
ol/L
Tro
lox
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 28 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS del experimento subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n =6- 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
1
0
2
4
6
8
10
12
14
Tratamientos
mm
ol/L
AA
scór
bico
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 29 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por ABTS de la tercera
fase
78
SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
1
0
5
10
15
20
Tratamientos
mm
ol/L
Tro
lox
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 30 Comparativo Capacidad antioxidante en mmol/L de trolox por ABTS correspondiente a la tercera fase SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey La última técnica estandarizada fue la del Potencial antioxidante de la reducción del fierro, en la cual se
corrieron las curvas estándar de ácido ascórbico (ver Gráfica 45 del anexo VI) y sulfato ferroso (ver
Gráfica 46).
A continuación se anexan algunas gráficas correspondientes al análisis de las muestras de plasma por
FRAP elaboradas en minitab 15 (ver Gráfica 31)
79
Gráfica 31 Curvas de plasma de diferentes muestras de tratamientos por FRAP Con los resultados obtenidos al calcular el 50% de inhibición para cada muestra de plasma por cada una
de las tres técnicas, se correlación con las curvas estándar para obtener el valor en mg equivalentes del
estándar ó en mmol/L del estándar.
1.61.41.21.00.80.60.40.2
50
40
30
20
10
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearCubicRata 13 Sana Aox por FRAP
43210
50
40
30
20
10
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearCubicRata 21 Diabética Agua por FRAP
1.81.61.41.21.00.80.60.40.2
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticCubic
Rata 25 Diabéticas licuado por FRAP
1.81.61.41.21.00.80.60.40.2
50
40
30
20
10
0
µl plasma
% in
hibi
ción
50
LinearQuadraticCubic
Rata 2 Diabética Extracto por FRAP
80
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1
Tratamiento
mm
ol/L
áci
do a
scór
bico
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 32 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por FRAP del experimento subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6 - 7 No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
100
200
300
400
500
600
1
Tratamiento
μM e
q Fe
SO4
SA SAOx ST DA DAOx DT
Gráfica 33 Comparativo capacidad antioxidante en μM eq de FeSO4 por FRAP del experimento
subcrónico de la segunda fase SA= Sana con agua, SAOx= Sana con antioxidante, SC= Sana con té de chaya, DA= Diabética con agua, DAOx= Diabética con antioxidantes, DC= Diabética con té de chaya. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 6- 7
81
No existen diferencias estadísticas entre grupos de letras iguales (a, b), pero si entre los grupos de letras diferentes (a,b) con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1
Tratamiento
mm
ol/L
áci
do a
scór
bico
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 34 Comparativo capacidad antioxidante en mmol/L de ácido ascórbico por FRAP de la tercera fase SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
0
100
200
300
400
500
600
700
1
Tratamiento
μM e
q Fe
SO4
SA SE SL DA DE DL
Gráfica 35 Comparativo capacidad antioxidante en μM/L de FeSO4 por FRAP de la tercera fase
82
SA= Sana con agua, SE= Sana con extracto acuosos de chaya al 6%, SL= Sana con licuado de chaya al 6%, DA= Diabética con agua, DE= Diabética con extracto acuosos de chaya al 6%, DL= Diabética con licuado de chaya al 6%. Los valores son presentados como la media ± DE, n = 7 a,b No existen diferencias estadísticas significativas entre los grupos de ratas diabéticas y sanas, con p<0,05 y α=0,05 por la prueba de Tukey
En la Tabla 13 del anexo VII se encuentran de manera condensada los resultados de los diferentes
tratamientos y experimentos (subcrónico y agudo), comparando las tres técnicas; TAC, ABTS y FRAP;
entre si.
83
En la Gráfica 36 se hace el comparativo entre las tres técnicas para ve cual es la que tiene más
sensibilidad tomando los resultados del grupo de diabéticas con extracto, reportados como mmol/L de
ácido ascórbico. Podemos observar que por la técnica de ABTS es en donde se tiene una mayor
sensibilidad para el análisis de las muestras de plasma.
Gráfica 36 Comparativo entre técnicas para el grupo de diabéticas con extracto
Al realizar el comparativo entre todos los grupos podemos apreciar que la técnica de ABTS es la más
sensible y la mayor capacidad antioxidante total en los grupos de sanas corresponde al grupo de sanas
con te seguido de las sanas con antioxidantes.
Gráfica 37 Comparativo de sensibilidad de las técnicas utilizadas para determinación de antioxidantes. SE= sana extracto, DE= diabética extracto, SL= sana licuado, DL= diabética licuado DAOx, SA= sana con agua, DA= diabética con agua, ST= sana con te, DT= diabética con te, SAOx= sana con AOx, DAOx= diabética con AOx
Comparativo de técnicas
DE - FRAP DE- TAC DE- ABTS
mm
ol/L
de
a.as
córb
ico
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20 25 30
CA
PA
CID
AD
AO
x m
mol
/L
0
10
20
30
40
COMPARATIVO DE TRATAMIENTOS POR TECNICAS FRAP, TAC Y ABTS
ABTS TAC FRAP
SE
DE SL
DL SA DA
ST
DT
SAOx
DAOx
84
Fernández y col. en el 2006 han realizado diversos estudios en los que manifiestan que la ingesta de
alimentos como espinacas, fresas, arándanos, chocolate negro, café, té negro y verde, proantocinidinas
de la uva y bebidas alcohólicas como cerveza, vino blanco y vino tinto, entre otros, generan una influencia
mediante su suplementación en la dieta a largo plazo incrementando la capacidad antioxidante del
plasma la cual representa el balance antioxidante del organismo y valora tanto los antioxidantes
endógenos como exógenos. Lo que se ha usado como marcador indirecto de la biodisponibilidad de los
antioxidantes presentes en los alimentos en estudios de intervención, tanto para evaluar el efecto aislado
de un alimento a corto plazo como su a largo plazo. No existe consenso científico sobre el más idóneo,
pues difieren en el objeto de medida y su posible significación biológica, así como en la interferencia que
puedan presentar con los componentes del plasma. Se podría escoger cualquiera de los métodos de
medida de actividad antioxidante adaptados para muestras biológicas siempre que el método esté
analíticamente validado.
Hay autores que utilizan el plasma en el estudio de la capacidad antioxidante y otros emplean suero
sanguíneo. El suero se obtiene después de la eliminación del coágulo de fibrina de la sangre a
temperatura ambiente. La muestra se somete así a una mayor exposición a la luz, por lo que
posiblemente se pierden antioxidantes que son inestables en tales condiciones. Por otra parte, durante la
agregación, las plaquetas liberan radicales que pueden disminuir la capacidad antioxidante de la muestra
de suero. Esto hace aconsejable trabajar con muestras de plasma en lugar de suero para evitar pérdidas
de compuestos. La determinación clínica de compuestos endógenos que influyen potencialmente en la
capacidad antioxidante (albúmina, bilirrubina, ácido úrico) se realiza con mayor frecuencia en muestras de
plasma.
La medida de actividades enzimáticas en el plasma es de gran utilidad para el diagnóstico de una gran
variedad de enfermedades. Salgado en el 2002 escribió que a menudo la capacidad antioxidante total
(CAT) disminuye significativamente en diversas patologías (24% en la anorexia nerviosa, 20% en la
encefalpatía VIH, 13% en la polineuropatía diabética y un 17% en la cardiomiopatía). Sin embargo en
pacientes con enfermedades renales, la CAT está significativamente elevada. La presencia de enzimas
en el plasma puede incrementarse en situaciones patológicas que supongan el aumento de la
permeabilidad de las membranas de las células que las sintetizan, o simplemente la rotura o muerte de
estas células, como ocurriría en casos de infección, hipoxia, agresión química, desarrollo tumoral, etc. La
mayor desventaja de la utilización de ensayos enzimáticos para la diagnosis del daño de tejidos es la baja
especificidad por un tejido o tipo celular concreto, ya que muchas enzimas son comunes en más de un
tejido.
85
7 CONCLUSIONES
El efecto del té de chaya en las ratas sanas es el que mayor capacidad antioxidante presenta, pero para
las ratas diabéticas se aprecia que falto una concentración mayor.
La administración del licuado y extracto de chaya presentaron valores superiores de capacidad
antioxidantes tanto en ratas sanas como en diabéticas en las tres técnicas.
La técnica de ABTS es la que presenta mayor sensibilidad.
El té de chaya no mostró actividad antihiperglicémica ni hipoglicémica en este estudio sobre los niveles de
glucosa.
El te de chaya no atenuó los niveles de triglicéridos, colesterol total y colesterol de alta densidad.
No se observó disminución en los niveles de triglicéridos y colesterol sanguíneos y la excreción de
microalbúmina en el experimento agudo.
Se observó un efecto antihiperglicémico en el estudio agudo. La administración del tratamiento con
licuado de chaya al 6% para el grupo de ratas diabéticas, bajo los niveles de glucosa en un 10,54%.
La administración del extracto y del licuado de chaya atenuó los efectos severos de la diabetes en cuanto
al consumo de líquido, alimento y disminución de peso.
Por lo que su empleo podría ser recomendado para atenuar las complicaciones generadas por la
diabetes.
86
RECOMENDACIONES
Se recomienda adquirir un lector de microplaca, el cual puede ser usado para el análisis de más muestras
en menor tiempo, con la ventaja de cuando este estandarizada una técnica el consumo de reactivos será
menor además de poder analizar parámetros con una menor cantidad de muestra. Esta limitación de
equipo generó retraso en el procesamiento de las muestras de este proyecto, así como desfasamiento en
los tiempos planteados desde el inicio del mismo.
Es recomendable que existan paquetes estadísticos para cumplir con las necesidades mínimas
requeridas para el análisis de los datos, por las limitaciones en cuanto a la falta de software o el
vencimiento de la licencia, lo que evita que se puedan utilizar todas las funciones de cada software.
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS
Para complementar los resultados presentados en el presente trabajo es recomendable que se realice un
análisis de peroxidación lipídica en plasma, y tejidos biológicos (hígado y riñones), verificando con el
ácido tiobarbitúrico para determinar malonaldehído (MDA) y óxido nítrico (NO) para verificar el grado de
un estrés oxidativo.
Correlacionar los resultados obtenidos en este estudio (capacidad antioxidante en plasma por las técnicas
TAC, ABTS y FRAP) con los que se proponen para un trabajo posterior.
87
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96
ANEXO I (REACTIVOS)
Inducción con STZ:
Estreptozotocina (STZ) al 98% hplc No. Cat.50130 de Sigma
Citrato de sodio No. Cat. S1804 de Sigma.
Acido Cítrico
Hidróxido de sodio 1N No.Cat. 3722-01 de Baker
Eter Etílico Anhidro. No. Cat. 31450 de Golden Bell.
Determinación de Glucosa:
Tiras reactivas accutrend para Glucosa
Kit para determinación de glucosa marca Randox
Determinación de Triglicéridos:
Tiras reactivas accutrend para triglicéridos
Kit para determinación de triglicéridos marca Randox
Determinación de Colesterol
Tiras reactivas accutrend para colesterol
Kit para determinación de Colesterol total marca Randox
Kit para determinación de Colesterol HDL marca Randox
Determinación de examen general de orina
Tiras reactivas para general de orina marca Bayer
Tiras reactivas para Microalbúmina y Creatinina en orina marca Bayer
Determinación de antioxidantes por TAC por crocin:
2,2´-Azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride(ABAP ó AAPH), PM= 271.2. No. Cat. 440914 de Sigma.
6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX), PM= 250.29. No. Cat. 17415BD de
Sigma - Aldrich.
Crocetin digentibiose ester (Crocin), PM= 976.98. No. Cat. 17304 de Sigma-Fluka.
Ácido ascórbico, PM= 176.12 No. Cat. A5960 de Sigma.
Ácido úrico. No. Cat U2625 de Sigma.
Cloruro de sodio. No. Cta. 3624- 05 de J.T. Baker.
Cloruro de potasio. No. Cta. 3040- 1 de J.T. Baker
Fosfato dibásico de sodio. No. Cat 3828- 01 J.T.Baker.
Fosfato monobásico de potasio. No. Cat. 3246- 01 de J.T.Baker.
97
Determinación de antioxidantes por FRAP
Acetato trihidratado de sodio. No. Cat. 236500 de Sigma Aldrich.
Ácido acético glacial. No. Cat 9507- 05 de J.T.Baker.
Ácido clorhídrico. No. Cat 9535- 05 de J.T. Baker.
Alcohol etílico absoluto. No. Cat- 9014-02 de J.T.Baker.
2,4,6-tripyridyl-triazine(TPTZ). No. Cat. 93285 de Sigma – Aldrich.
FeII =FeSO4·7H2O; Riedel-de Haen. No. Cat. F7002 de Sigma – Aldrich.
FeCl3·6H2O. No. Cat. F2877 de Sigma - Aldrich.
Determinación de antioxidantes por ABTS
Ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS). No. Cat. A1888 de Sigma.
Persulfato de potasio. No. Cat. 216224 de Sigma – Aldrich.
Determinación de compuestos fenólicos totales
Folin Ciocalteu. No. Cat. F9252 de Sigma.
Carbonato de sodio
Ácido gálico. No. Cat. G7384 de Sigma.
Determinación de flavonoides
Nitrito de sodio
Cloruro de aluminio
Hidróxido de sodio
Catequina
98
ANEXO II (PREPARACIÓN DE SOLUCIONES)
Preparación de Buffer de citrato 10 mM, pH= 4.5 Para preparar 25 ml de buffer se pesan 0.3225 gr de ácido cítrico y 0.285 gr de citrato de sodio, se
disuelven en 23 ml de agua hplc y se ajusta el pH a 4.5, se afora a 25 ml, verificar el pH y ajustarlo
nuevamente de ser necesario (el buffer se puede preparar con un día de anticipación y mantener en
frasco color ámbar en refrigeración a 4ºC).
Preparación de la Estreptozotocina (STZ): Se pesan los animales a inducir el mismo día y se calcula la cantidad de STZ total a utilizar que se inyecta
vía intraperitonial de acuerdo a una dosis de 45 mg/ kg de peso corporal (PC) de cada rata y se pesa, se
calcula el volumen total en que se disuelve la STZ de acuerdo al total de animales a inducir, se considera
un volumen de 0.5 ml a la rata que más pese y de aquí se realiza el cálculo para cada rata. Se disuelve
la STZ en el buffer, esta solución dura aproximadamente 20 min, debe dar una ligera coloración amarilla
transparente, se utilizan jeringas para insulina de 0.5 ml.
Preparación de Buffer fosfato salino (PBS): Pesar 7 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4, 0.24 g de KH2PO4 y disolver en 800 ml de agua hplc,
ajustar el pH a 7.4 y aforar a 1 lt. Colocar en frasco ambar y refrigerar a 4ºC (máximo 2 a 3 meses).
Preparación del ABAP ó AAPH: 2,2´-Azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride (ABAP) se disuelve con PBS (pH=7.4) a una
concentración de 6,25 mg/ml. (se elabora antes de usarse, queda a una concentración de 2,5 mg/ml en
placa), colocar la solución en frasco color ambar o protegida de la luz.
Preparación de la solución de crocin 100 µM: El crocin se prepara a una concentración de 200 µM, se pesa 0,01953 gr y se disuelve en 100 ml de PBS
a pH=7.4, se realiza posteriormente una dilución para que quede a 100 µM (queda a una concentración
en placa de 40 μM, se coloca en varios recipientes color ambar y se almacena a -20°C), las alícuotas de
crocin se toman cuando se requiera para el análisis (máximo dos meses).
Ácido ascórbico al 200 µg/ml: Pesar 0,002 gr, se disuelven en 10 ml de agua hplc. Se realizan varias diluciones para obtener diferentes
concentraciones de 0 a 10 µg/ml (almacenar en frascos color ambar o protegidas de la luz, máximo 10
días).
Trolox al 1000 µg/ml: Pesar 0,025 gr y disolverlos en 25 ml de PBS. Se elabora la curva estándar disolviendo a diferentes2
concentraciones desde 0 a 25 µg/ml (almacenar en frascos color ambar o protegidas de la luz, máximo 15
días).
Buffer de acetato 300 mmol/l a pH=3.6:
Se pesan 0.775 gr de C2H3NaO2·3H2O (Riedel-de Haen) en 4 ml de ácido acético, se disuelven en 200 ml
de agua hplc, se ajusta a pH=3.6, aforar con agua hplc a 250 ml (la solución es estable hasta dos meses
en refrigeración a 4ºC).
99
Solución de TPTZ 10 mmol/l: Se disuelven 0.1248 g de TPTZ en 50 ml de 40 mmol/l de HCl (la solución es estable hasta un mes).
Solución de cloruro ferrico 20 mmol/l: Se disuelven 0.270 g de FeCl3·6H2O en 50 ml de agua hplc (la solución es estable por lo menos 1 mes).
Preparación del reactivo de FRAP: Se prepara con 17 ml de buffer de acetato, 1.7 ml de solución de TPTZ y 1.7 ml de solución FeCl3·6H2O
(se prepara el mismo día que se va a utilizar).
Preparación del estándar de FeSO4: Se pesa 0.0278 g de FeSO4 y se disuelve en 50 ml para tener una solución al 2000 μM, con esta solución
se elabora la curva con soluciones acuosas de FeII en concentraciones entre 1 – 50 μg/ml (FeII
=FeSO4·7H2O; Riedel-de Haen) para generar la gráfica.
Preparación de primaria de ABTS 7 mM: Se pesa 0.01920 gr de ABTS y se disuelven en 5 ml de PBS.
Persulfato de potasio 140 mM: Se pesa 0.1892 g y se disuelven en 5 ml de agua hplc.
Solución de ABTS 7 mM: Mezclar la solución de primaria de ABTS al 7 mM con la de persulfato de potasio. La mezcla se debe de
colocar en un frasco ambar protegido de la luz y se dejan reposando a temperatura ambiente por espacio
de 16 horas para que se lleve a cabo la reacción.
Folin Ciocalteu 1 N: El reactivo se encuentra a 2 N, por lo que se procede a diluir V1C1=V2C2. Se toman 5ml de agua hplc y
5ml del reactivo de Folin Ciocalteu (almacenar en frasco ámbar a 4oC, verificar el reactivo antes de usarse
color debe ser dorado, no utilizarse si tiene un color verde olivo).
Carbonato de sodio (Na2CO3) al 7%: Pesar 0.35 g de Na2CO3 y aforar con agua hplc a 5 ml.
Ácido gálico a 1 mg/ml: Pesar 0.01 g de ácido gálico y aforar con agua hplc a 10 ml. Hacer una dilución 1:10 con agua hplc
(0.1mg/ml). Almacenar en frasco ambar, se prepara el mismo día que se usa.
Nitrito de sodio al 5%: Pesar 0.25 g de NaNO2, aforar a 5 ml de agua destilada.
Cloruro de aluminio al 10%: Pesar 0.5 g de AlCl3 y aforar a 5 ml con agua destilada.
Hidróxido de sodio 1 M: Se pesa 1 g de NaOH y se afora a 25 ml con agua destilada.
Solución estándar de catequina a 1 mg/ml:
Se pesan 10 mg de catequina y se le adicionan 10 ml de metanol, se prepara el mismo día que se usa.
100
ANEXO III (CURVAS ESTANDAR DE ÁCIDO GÁLICO Y CATEQUINA) Tabla 11 Cantidades para preparar curva estándar de ácido gálico para determinación de fenoles totales
Ácido Gálico (μl) Agua HPLC (μl) Reactivo de Folin (μl) Carbonato de sodio 7% (μl)
Blanco 0 50 25 125
1 2 48 25 125
2 4 46 25 125
3 6 44 25 125
4 8 42 25 125
5 10 40 25 125
6 12 38 25 125
7 14 36 25 125
y = 0.0279x + 0.049R2 = 0.99
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 2 4 6 8 10 12 14 15 20Concentración (mg equivalentes ácido gálico)
Abs
orba
ncia
Gráfica 38 Curva estándar de ácido gálico para la determinación de fenoles totales en la hoja de chaya.
101
Tabla 12 Cantidades para preparar curva estándar de catequina para determinación de flavonoides No. Muestra/
std/blanco
Catequina
(μl)
Agua HPLC
(μl)
NaNO2 (μl) AlCl3 (μl) NaOH 1 M
(μl)
Agua HPLC
(μl)
Blanco 0 125 7.5 15 50 52.5
1 2 125 7.5 15 50 50.5
2 4 125 7.5 15 50 48.5
3 6 125 7.5 15 50 46.5
4 8 125 7.5 15 50 44.5
5 10 125 7.5 15 50 42.5
6 12 125 7.5 15 50 40.5
7 14 125 7.5 15 50 38.5
Muestra 14 125 7.5 15 50 38.5
y = 0,00627x + 0,0711R2 = 0,9955
0,00,10,20,30,40,50,60,70,8
0 0,50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Concentración de catequina ( mg/ml)
Abs
orba
ncia
Gráfica 39 Curva estándar de catequina en mg/ml para determinar flavonoides en la hoja de chaya.
102
ANEXO IV (CURVAS ESTÁNDAR POR LA TECNICA TAC)
Cinética de ácido ascórbico (mg/ml)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)
Abs
orba
ncia
Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gráfica 40 Cinética de TAC por crocin para ácido ascórbico (mg/ml)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1001 2 3 4 6 8 10
Concentración ácido ascórbico
% in
hibi
ción
Gráfica 41 Curva estándar de ácido ascórbico por la técnica de TAC
103
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1002.4 4 8 10 12 16 20 28
Concentracion Trolox (mg/ml)
% i
nhib
ició
n
Gráfica 42 Curva estándar de Trolox por la técnica de TAC
104
ANEXO V (CURVAS ESTÁNDAR POR LA TECNICA ABTS)
0102030405060708090
1000,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2,8 3,2 4
Concentracion ácido ascórbico (mg/ml)
% d
e in
hibi
ción
Gráfica 43 Curva de % de inhibición de ácido ascórbico por la técnica de ABTS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1000.8 1.6 2.4 3.2 4 8 16 20
Concentración de Trolox ( mg/ml)
% in
hibi
ción
Gráfica 44 Curva de % inhibición de TROLOX por la técnica ABTS
105
ANEXO VI (CURVAS ESTÁNDAR POR LA TECNICA FRAP)
0
50
100
150
200
250
3000,25 0,5 1 1,5 2 2,5 4 5 6,5 7,5 10 12,5
Concentración ácido ascórbico (mg/ml)
% in
hibi
ción
Gráfica 45 Curva de % de inhibición de ácido ascórbico por la técnica de FRAP
0102030405060708090
1000.25 0.5 1 1.25 2.5 5 7.5 10 12.5 25
Concentración FeSO4 (μM)
% in
hibi
ción
Gráfica 46 Curva de % de inhibición de FeSO4 por la técnica de FRAP
106
ANEXO VII (TABLA DE RESULTADOS DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTES TOTAL POR LAS TECNICAS TAC, ABTS y FRAP)
Tabla 13 Resultados comparativos de las técnicas TAC, ABTS Y FRAP
ABTS TAC FRAP
mmol/L Trolox mmol/L A Ascórbico mmol/L Trolox mmol/L A Ascórbico μM eq de FeSO4
mmol/L A Ascórbico
Sana Agua 12,3631 +/- 1,4936 9,2595 +/- 1,1186 1,0115 +/- 0,2428 0,3178 +/- 0,0763 219,2940 +/- 23,9643 0,8048 +/- 0,0879 Sana AOx 20,4163 +/- 3,4163 15,2911 +/- 2,5587 0,7627 +/- 0,1522 0,2396 +/- 0,0478 417,9834 +/- 87,2241 1,5339 +/- 0,3201 Sana te 30,7173 +/- 10,7193 23,0061 +/- 8,0284 0,7729 +/- 0,1637 0,2428 +/- 0,0514 364,0530 +/- 111,7276 1,3360 +/- 0,4100 Diabética Agua 13,5099 +/- 2,8200 10,1184 +/- 2,1121 0,7822 +/- 0,1959 0,2458 +/- 0,0616 306,2755 +/- 78,5937 1,1240 +/- 0,2884 Diabética AOx 4,9098 +/- 0,4373 3,6773 +/- 0,3275 1,2211 +/- 0,2508 0,3837 +/- 0,0788 332,4082 +/- 78,8138 1,2199 +/- 0,2892 Diabética te 7,7876 +/- 3,0239 5,8326 +/- 2,2648 1,1447 +/- 0,2785 0,3597 +/- 0,0875 420,8538 +/- 115,8069 1,5444 +/- 0,4250
Media +/- desviación estándar
ABTS TAC FRAP
mmol/L Trolox mmol/L A Ascórbico mmol/L Trolox mmol/L A Ascórbico μM eq de FeSO4
mmol/L A Ascórbico
Sana Agua 12,3631 +/- 1,4936 9,2595 +/- 1,1186 1,0115 +/- 0,2428 0,3178 +/- 0,0763 219,2940 +/- 23,9643 0,8048 +/- 0,0879 Sana Extracto 14,2006 +/- 2,0991 10,6357 +/- 1,5721 1,5255 +/- 0,5518 0,4793 +/- 0,1734 468,7234 +/- 53,7329 1,7201 +/- 0,1972 Sana Licuado 10,1157 +/- 1,9326 7,5763 +/- 1,4474 1,5635 +/- 0,4121 0,4912 +/- 0,1295 464,1858 +/- 111,5762 1,7034 +/- 0,4095 Diabética Agua 13,5099 +/- 2,8200 10,1184 +/- 2,1121 0,7822 +/- 0,1959 0,2458 +/- 0,0616 306,2755 +/- 78,5937 1,1240 +/- 0,2884 Diabética Extracto 12,3263 +/- 1,8711 9,2319 +/- 1,4014 1,0716 +/- 0,1782 0,3367 +/- 0,0560 337,1705 +/- 71,1147 1,2373 +/- 0,2610 Diabética Licuado 14,3785 +/- 1,2955 10,7690 +/- 0,9703 1,2984 +/- 0,2054 0,4079 +/- 0,0645 389,1979 +/- 47,8862 1,4283 +/- 0,1757
