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CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
EFECTOS DE LOS HERBICIDAS ATRAZINA Y FENOXAPROP-ETIL EN LA FERTILIZACION IN VITRO DE OVOCITOS PORCINOS.
Presentado por:
Ibarra Villegas Rosa María
Asesora: Dra. Yvonne Ducolomb Ramírez
Depto. Biología Celular CBS- UAM Iztapalapa
Marzo/2006
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“EFECTOS DE LOS HERBICIDAS ATRAZINA Y FENOXAPROP-ETIL EN
LA FERTILIZACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS PORCINOS”
1. INTRODUCCION El estudio de la toxicología, está enfocado a evaluar los efectos adversos de los agentes químicos
sobre los organismos, evalúa los mecanismos de acción moleculares, bioquímicos, celulares, y la
relación dosis-respuesta para poder establecer inferencias entre el nivel de exposición y la
extensión de los efectos tóxicos en un determinado organismo. (Moreno 2003). Una de las ramas
de la toxicología, es la toxicología reproductiva que estudia los efectos deletéreos producidos por
agentes exógenos en la reproducción, y estudia las alteraciones producidas en la descendencia
como resultado de la exposición de hembras gestantes o lactantes a factores externos que
interactúan con el organismo y que son conocidos como xenobióticos. (Bonilla, et al 2001).
Entre los factores xenobióticos, están los químicos naturales como hidrocarburos y metales
pesados; sintéticos como los insecticidas y herbicidas; biológicos como virus y físicos como las
radiaciones. Todos éstos pueden afectar cualquiera de las etapas del ciclo reproductivo e interferir
con la fertilidad o desarrollo pre o postnatal de los individuos (Bonilla, et al 2001).
Entre los agentes tóxicos a los que están expuestas las poblaciones humanas se encuentran los
plaguicidas, principalmente los insecticidas y herbicidas a los que nos exponemos de manera
directa por uso domestico y de manera indirecta al ingerir alimentos contaminados debido a su
persistencia en cereales, fruta y productos animales como la leche. Hay grupos de individuos que
tienen contacto con agentes de manera directa como los trabajadores de fábricas de plaguicidas,
fumigadores agrícolas, horticultores, etc.
Durante el siglo pasado se produjeron múltiples variedades de plaguicidas, por lo que se han
comercializado más de un millar con el fin de controlar plagas. En México durante 1999 se
comercializaron 23,361 toneladas de plaguicidas para uso agrícola (INEGI, 2000) de los cuales 112
son insecticidas y 78 herbicidas registrados, y que en su mayoría representan un alto potencial
tóxico para la salud (CICLOPLAFEST 2002a).
1.1 HERBICIDAS Son compuestos químicos utilizados para destruir las malezas, que no pueden ser evitados en la
agricultura sin causar escasez de alimentos (Dési et al 1998). En la práctica agrícola el empleo de
herbicidas químicos ha aumentado en los últimos 50 años especialmente en los países en los que
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las prácticas agrícolas son mecanizadas. Del total de los plaguicidas que se usan a nivel mundial
109 toneladas son herbicidas (Tominack 2000).
Los herbicidas presentan mecanismos de acción fitoespecíficos e interfieren con los procesos
bioquímicos de la fotosíntesis, en la planta. (Labrada, et al, 1996) por lo cual no deberían ser
tóxicos en animales (Moreno, 2003). Sin embargo, pueden causar daño directo en los individuos
que ocupacionalmente están expuestos a ellos como son los fumigadores agrícolas, horticultores y
el resto de la población puede exponerse indirectamente al ingerir productos agrícolas tratados con
herbicidas. (Gómez, 2000).
Recientemente se han introducido diversos herbicidas en el mercado, entre los que se encuentran
el fenoxaprop-etil con 4 formulaciones distintas en nuestro país y la atrazina con 34 formulaciones
(CICLOPLAFEST 2002b)
1.1.2 Atrazina Nombre químico: 2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-1,3,5-triazina
Nombres comerciales: 6-cloro-N-etil-N'-(1-metiletil)-1,3,5-triazina-2,4-diamina; y 2-cloro-4-
etilamino-6-isopropilamino-s-triazina. (Figura 1)
Pertenece al grupo de las triazinas, compuestas por anillos de seis miembros que contienen tres
nitrógenos.
La atrazina es uno de los herbicidas más ampliamente utilizados debido a su efectividad y que
tienen un precio económico. Se utiliza como herbicida selectivo para
el control de malezas del maíz y de los espárragos, en el cultivo de
caña de azúcar, piña y en los viñedos (Ware 2000).
Las triazinas son fuertes inhibidores del transporte fotosintético de
electrones, inhiben el crecimiento de todos los órganos de plantas
intactas, un efecto atribuido a una deficiencia de fotosintato. El
mecanismo de acción es el bloqueo de la fotosíntesis, en el Sitio A del
Fotosistema II. (Ware 2000).
En varios países de la Unión Europea la atrazina está prohibida o severamente restringida, ya que
el herbicida y sus metabolitos (desisopropilatrazina, desetilatrazina y dialquilatrazina) se consideran
altamente tóxicos a largo plazo cuando los individuos se exponen a este plaguicida al ingerir agua
y alimentos contaminados. (OLCA 2004).
Figura 1
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1.1.3 Fenoxaprop-etil Nombre químico: etil-2-[4-(6-cloro-1,3-benzoxal-2-iloxi)]- fenoxipropanato (Figura 2)
Nombre comercial: Furore
Es un herbicida que pertenece al grupo de ácidos Ariloxifenoxialcanoicos. Esta es una de las
clases más recientes de herbicidas, que
se aplica a dosis bajas después de que
el cultivo y las malezas han emergido;
es de alta actividad contra pastos por lo
que se pueden aplicar en la mayoría de
los cultivos de hoja ancha, trigo y arroz;
con muy poco riesgo de daño a la
siembra. (Labrada, et al, 1996).
Este herbicida es inhibidor de la biosíntesis de los ácidos grasos o los lípidos en los meristemos de
las plantas y también funciona como antiauxina, o inhibidor de las auxinas. A nivel celular son
inhibidores de la carboxilasa de la acetil co-enzima A (ACCase). (Labrada, et al, 1996).
Cl O
NO
O CH CO
OH
CH3
Fenoxaprop-etil Figura 2
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2. ANTECEDENTES La atrazina, es uno de los grupos de herbicidas más utilizados en los EUA. Con respecto a su
efecto reproductivo, se ha demostrado que grupos afines a la atrazina (clorotriazinas) alteran el
control hormonal en los ciclos ováricos. Además se ha observado que funciona como un disruptor
endocrino por ser un agente exógeno que interfiere con la síntesis, secreción, transporte,
metabolismo, eliminación de hormonas en el cuerpo que son responsables de la homeostasis,
reproducción y procesos de desarrollo (Pocar, et al, 2003), por lo que altera la producción de LH y
niveles de prolactina, mediada por el hipotálamo (Cooper, et al.2000).
Se ha observado que la tasa de toxicidad de la atrazina en mamíferos es alta ya que induce la
formación de tumores mamarios y acelera la reproducción en ratas; lo que puede relacionarse con
la inhibición de la hormona luteinizante (LH). También provoca un retraso en la maduración sexual
femenina en roedores; este efecto puede estar relacionado con la inhibición hipotalámica de GnRH
(Ashby J. et al. 2002).
Estudios de laboratorio, han demostrado que la atrazina provoca alteraciones cardíacas, hepáticas
y renales, y estudios en animales de laboratorio indicaron un incremento en el desarrollo de
leucemias y linfomas, y en humanos se les asocia con la incidencia de linfomas no-Hodking.
(OLCA, 2004)
Con respecto a la reproducción, se ha mostrado que la atrazina interfiere con el metabolismo de
testosterona, y produce tumores testiculares, en ratas. Provoca cáncer de mama; en ratas y
humanos, además en mujeres produce un incremento de tumores de ovario. (OLCA, 2004). En
estudios in vivo realizados en ratones machos se observó un aumento en el peso de la próstata y
la glándula pituitaria cuando se administró una dosis de 120mg/kg de peso en un periodo de 7
días; (Simic et al, 1994). En renacuajos de Xenopus laevi, la atrazina a una concentración de 0.1 a
200 ppm produjo alteraciones en el desarrollo sexual, induciendo hermafroditismo y
masculinización de la laringe (Hayes et al, 2002)
En lo que respecta al desarrollo, se ha reportado que en E.U. hubo una mayor incidencia de
nacimientos de niños con malformaciones congénitas en algunas comunidades de Nebraska y
Iowa, que se expusieron durante largo plazo a residuos de triazinas en agua y alimentos. (OLCA,
2004)
Con respecto a la reproducción estudios in vitro, han demostrado que a dosis bajas de atrazina
(0.01, 0.1, 1 y 10 µM) no afectan la maduración ni el desarrollo embrionario de bovinos. (Graves, et
al. 2002).
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El fenoxaprop-etil, es un herbicida reciente, por lo que en la literatura no hay reportes de su efecto
sobre los animales, no hay evidencia de que sea carcinogénico o mutagénico y al parecer no tiene
efecto en la reproducción ni en la fertilidad del ser humano. (Peterson 2001). Sin embargo en un
estudio in vitro realizado con espermatozoides de cerdo se demostró que el fenoxaprop-etil en
concentraciones de 50 a 500 µM, redujo significativamente la movilidad espermática por lo que
podría tener un efecto adverso en la actividad reproductora del macho. (Betancourt et al 2004).
3. JUSTIFICACION
En los países industrializados los herbicidas se aplican en 85 al 100% de los cultivos para la
producción agrícola. México no está exento de esta práctica y se emplean grandes volúmenes
constituyendo un riesgo para la salud, por lo que existe la necesidad de conocer más sobre el
efecto que los herbicidas puedan tener sobre las funciones reproductivas.
La mayoría de los estudios de toxicología reproductiva han sido realizados in vivo en animales de
laboratorio para conocer su efecto sobre la fertilidad; aunado a esto, es importante realizar estudios
in vitro, para conocer los mecanismos por los cuales los herbicidas pueden afectar los procesos
reproductivos como son la fertilización y el desarrollo embrionario. Los modelos in vitro constituyen
una herramienta útil por su rapidez y precisión para evaluar el daño a nivel celular y el efecto
observado in vitro permitiría sugerir la forma en que estos procesos ocurren in vivo.
El uso de gametos de cerdo para realizar estudios toxicológicos in vitro es adecuado debido a que
el porcino presenta aspectos fisiológicos, anatómicos, bioquímicos y endocrinos similares al
humano además se tiene la ventaja de obtener una gran número de ovocitos a partir de ovarios
obtenidos en el rastro.
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4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de los herbicidas atrazina y fenoxaprop-etil en la Fertilización in vitro (FIV) de
ovocitos porcinos.
4.1.2 OBJETIVOS PARTICULARES
• Determinar la viabilidad de los ovocitos fertilizados in vitro en presencia de atrazina y
fenoxaprop-etil a concentraciones de 50 ,100 y 500 uM por medio de la prueba de
metiltiazoltetrazolium (MTT)
• Determinar la concentración letal 50% (CL50%)
• Evaluar el porcentaje de desarrollo de los pronúcleos masculino y femenino como
indicadores de la fertilización en ovocitos coincubados con los herbicidas
• Determinar la concentración de inhibición de FIV 50% (CI50%)
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5. HIPOTESIS
Los herbicidas constituyen agentes potencialmente tóxicos para la salud, y pueden afectar las
funciones reproductoras en los organismos in vivo. Se tiene el conocimiento de que pueden ser
disruptores endocrinos causando alteraciones a distintos niveles del aparato reproductor.
Por lo anterior, se supone que estos herbicidas empleados en el medio de fertilización in vitro
durante la coincubación de los gametos afectará la viabilidad de los ovocitos. El porcentaje de
viabilidad disminuirá a medida que aumente la concentración hasta reducirla por completo.
Se espera también que los herbicidas reduzcan los porcentajes de fertilización in vitro de los
ovocitos, conforme aumente la concentración habrá una disminución en el porcentaje de desarrollo
de los pronúcleos hasta llegar a una reducción completa.
6. METODOLOGÍA
A menos de que se especifique lo contrario todos los reactivos fueron de la marca Sigma (Sigma
Chemical Company, St Louis, MO EUA).
6.1. COLECTA Y MADURACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS Las técnicas de maduración in vitro (MIV) y FIV y la preparación de los medios de cultivo, se
realizaron de acuerdo con Abeydeera y col. (1998). Los ovarios se colectaron de cerdas prepúberes recién sacrificadas en el rastro y se transportaron
en menos de dos horas al laboratorio en solución salina de NaCl al 0.9% con 75 µg/ml de penicilina
G y 50 µg/ml de estreptomicina a una temperatura aproximada de 25°C. En el laboratorio los
ovarios se lavaron tres veces en solución salina con antibióticos. Los folículos ováricos con un
diámetro de 3 a 6 mm se puncionaron utilizando una jeringa desechable de 10 ml con una aguja
hipodérmica de 18 x 38 mm. El fluido folicular obtenido se colocó en un tubo de 50 ml, el paquete
celular se dejó sedimentar 20 min y se lavó dos veces con medio modificado de Tyrode
suplementado con lactato de sodio, Hepes y polivinil alcohol (PVA) (TL-Hepes-PVA) a un pH de 7.3
a 7.4 (Wang y Niwa, 1995).
Los complejos ovocito-células del cúmulo (COC) se seleccionaron bajo el microscopio
estereoscópico (Olympus SZ60, Olympus Optical, Japón) usando una pipeta Pasteur alargada por
calor, eligiéndose aquellos ovocitos que presentaron su citoplasma uniforme y rodeado por una
masa completa de células del cúmulo.
En cajas de Petri de 35 mm de diámetro (Nunc, Dinamarca), los COC se lavaron tres veces, en
gotas de 500 µl de medio de maduración (TCM 199 con sales de Earle y bicarbonato de sodio 26.2
mM) (In Vitro, México) libre de proteínas, suplementado con PVA al 0.1%, D-glucosa 3.05 mM,
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piruvato de sodio 0.91 mM, cisteína 0.57 mM, Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) 10 ng/ml,
0.5 µg/ml de LH y 0.5 µg /ml de FSH, cubiertas con aceite mineral (Fisher Scientific, EUA). (Wang y
Niwa, 1995).
Se transfirieron a cajas de cuatro pozos (Nunc) 40 a 50 ovocitos/pozo, que contenían gotas de
500 µl de medio de maduración cubiertas con aceite mineral (Fisher Scientific, EUA) y se incubaron
a 38.5 °C con 5% de CO2 en aire y humedad a saturación, durante 44 h. (Wang y Niwa, 1995).
6.1.2. FERTILIZACION DE OVOCITOS
6.1.2.1. Denudación de ovocitos
Después de la MIV, las células del cúmulo se removieron agregando a cada pozo 300 µl de
hialuronidasa al 0.1%, en medio de maduración. Para eliminarlas, los ovocitos se pasaron por
aspiración a través de una pipeta Pasteur alargada, con el diámetro adecuado para no dañar al
ovocito. Los ovocitos se lavaron dos veces en gotas de 500 µ l de medio de maduración y tres
veces en gotas de 500 µl de medio amortiguado con Tris modificado (TBMm), compuesto por NaCl
113.1 mM. KCl 3. mM, CaCl2 2H2O 7.5 mM, Tris 20. mM, Glucosa 11 mM, piruvato de sodio 5 mM,
albúmina sérica bovina (BSA) al 0.4% y cafeína 2.5 Mm, este medio fue utilizado como medio de
fertilización (Abeydeera et al, 1998). En cajas de 4 pozos se depositaron de a 30 a 35 ovocitos en
gotas de 50 µl de TBMm, cubiertas con aceite mineral y se incubaron aproximadamente 30 min
hasta la inseminación.
6.1.2.2. Colecta, lavado y conteo de la muestra de Semen.
La muestra de semen se obtuvo mediante el método de la mano enguantada y se transportó al
laboratorio en menos de una hora a temperatura ambiente. El eyaculado se diluyó con extensor de
Reading (Revell y Glossop, 1989) y se conservó a temperatura ambiente durante 24 h. Se evaluó
la movilidad espermática y sólo se eligieron las muestras con un mínimo de 70% de movilidad.
Cinco ml de semen se diluyeron en 5 ml de solución amortiguada de PBS-Dulbbeco (DPBS)
(Gibco, EUA), suplementado con BSA fracción V al 0.1%, 75 µg/ml de penicilina potásica G y
50 µg/ml de sulfato de estreptomicina a pH de 7.2. Esta suspensión se centrifugó a 61 x g por
5 min. Cinco ml del sobrenadante se mezclaron con 5 ml de DPBS y se centrifugaron a 1,900 x g
por 5 min. El sobrenadante se desechó, y el paquete celular, conteniendo los espermatozoides se
diluyó con 10 ml de DPBS y se centrifugó a la misma velocidad dos veces más, finalmente el
paquete celular se diluyó en 100 µl de TBMm. Después de cada lavado se verificó la movilidad
espermática para asegurarse de que se mantuviera al menos en un 70%.
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Para determinar la concentración espermática se realizó una dilución 1:1000 con agua. El conteo
de los espermatozoides se realizó observando al microscopio de contraste de fases (Olympus CX
31, Olympus Optical, Japón) a 100 aumentos en una cámara de Neubauer (Blau Brand, Alemania).
6. 1.2.3. FIV
Después del conteo espermático, se hizo la dilución necesaria para que al agregar 50 µl de la
suspensión de espermatozoides a la gota del medio de FIV con los ovocitos se obtuviera una
concentración final de 5 x 105. Las células se coincubaron durante 6 horas bajo las condiciones
antes mencionadas. (Abeydeera et al, 1998).
6.1.2.4. Coincubación con los herbicidas durante la FIV Se emplearon los herbicidas Atrazina y Fenoxaprop-etil, grado técnico (Aventis Cropscience,
México). Se preparó una solución concentrada de 10 mM, empleando etanol absoluto como
solvente; se hizo una dilución 1 mM con TBMm, y posteriormente se tomó la cantidad necesaria
para tener concentraciones de 0, 50, 100 y 500 µM de cada herbicida en la gota de fertilización de
50 µl. En estas gotas se depositaron los ovocitos. Después de la inseminación, el herbicida estuvo
en contacto con los gametos durante las seis horas de coincubación.
6.1.3. LAVADO DE OVOCITOS Y TRANSFERENCIA AL MEDIO DE DESARROLLO
Después del periodo de coincubación los ovocitos se lavaron tres veces en gotas de 50 µl de
medio de desarrollo NCSU-23 (North Carolina State University) (Petters y Wells, 1993),
suplementado con 0.4% de BSA libre de ácidos grasos para eliminar el exceso de
espermatozoides. Posteriormente se transfirieron a gotas de 500 µl del mismo medio cubiertas con
aceite mineral en cajas de 4 pozos y se incubaron por 14 horas.
Se hicieron 2 grupos de ovocitos inseminados: en el primero se evaluó la viabilidad y en el
segundo la fertilización.
6.1.4. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD Transcurrido el tiempo de incubación, para evaluar el porcentaje de viabilidad de los ovocitos, se
agregaron 200 µl de MTT 0.5 mg/ml diluido en TBMm (Metiltiazoltetrazolium Sigma Chemical
Company, EUA) a las gotas de 500 µl de medio de desarrollo. Dos horas después se evaluaron al
microscopio estereoscópico (Olympus SZ60, Olympus Optical, Japón).Se consideraron viables los
ovocitos que presentaron color violeta y no viables los que no presentaron coloración. Esta
diferencia es debida a que sólo los ovocitos vivos son capaces de transformar el MTT, por medio
de las deshidrogenasas mitocondriales, en formazán insoluble que es de color violeta.
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6.1.5. EVALUACIÓN DE LA FIV 6.1.5.1. Fijación, tinción y evaluación de los ovocitos.
Transcurrido el tiempo de incubación, los ovocitos se lavaron tres veces en gotas de 100 µl con
medio TL-Hepes-PVA modificado. Se tomaron de 15 a 20 ovocitos y de depositaron en un
portaobjetos (Fisher Scientific, EUA). Con un cubreobjetos de 22x22-2 (Fisher Scientific, EUA) se
presionaron los ovocitos hasta inmovilizarlos y se fijaron en una solución de etanol:ácido acético
(3:1 v/v) (J.T. Baker, México) durante 72 horas. (Abeydeera et al 1998). Transcurrido ese tiempo,
los ovocitos se tiñeron con una solución de orceína al 1% preparada en ácido acético glacial al
45% en agua (Abeydeera et al 1998).
La evaluación del estado de los ovocitos se llevó a cabo utilizando un microscopio de contraste de
fases a 400 aumentos y se clasificaron de acuerdo a los siguientes criterios (Abeydeera et al 1988,
Hunter y Polge, 1966; Vatzias y Hagen, 1999):
Se consideraron maduros aquellos ovocitos que mostraron cromosomas en la metafase II (MII) y el
primer cuerpo polar estuvieran o no fertilizados. Los ovocitos fertilizados monospérmicos fueron
aquellos que presentaron 2 o más pronúcleos.
Los resultados fueron analizados utilizando las siguientes relaciones:
Calidad de ovocitos Relación
Madurados Suma de ovocitos en MII + Fertilizados / Total de
ovocitos.
Fertilizados Ovocitos con 2 o más pronúcleos / Total de
ovocitos.
6.1.6. ANALISIS ESTADISTICO
Se utilizó la prueba de X2 y la correlación de Spearman, con un nivel de confianza p< 0.05. Todos
los resultados se usaron normalizados.
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7. RESULTADOS 7.1. ATRAZINA 7.1.1. Efecto de la Atrazina en la Viabilidad de los ovocitos Fertilizados.
Se hicieron cinco ensayos y se analizaron en total 403 ovocitos (97 para el grupo 0 µM; y 101, 105
y 100 para las concentraciones de 50, 100 y 500 µM respectivamente).
En el cuadro 1, se muestra el porcentaje de viabilidad de los ovocitos incubados en el medio de
fertilización. Con la concentración 500 µM de Atrazina ésta disminuyó de manera significativa con
respecto al control (7 vs 100%). En las concentraciones de 50 y 100 µM no hubo ningún efecto.
Cuadro 1. Porcentaje de viabilidad de ovocitos coincubados con Atrazina durante la FIV.
Concentración µM de Atrazina
Proporción de ovocitos vivos
vivos/total (%)
Normalización con respecto al control
0 94/97 (97)
100
50 93/101 (92)
95
100 94/105 (90)
93
500 7/100 (7)
7a a diferencia significativa, p<0.05
Para determinar la relación concentración-efecto con respecto a la viabilidad, se utilizó la prueba
de Spearman que mostró una correlación significativa entre las concentraciones estudiadas con un
valor de r= 0.93. La CL50 fue de 278 µM.
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En la figura 1 se muestran la dispersión de los valores de cada ensayo para cada concentración.
Figura 1. Se observó que sólo la concentración de 500 µM tuvo efecto significativo sobre la viabilidad en comparación con el control (p<0.05). N= 5 ensayos; la correlación de Spearman fue 0.93
Efecto de la Atrazina en la Viabilidad de ovocitos fertilizados
y = -0.2055x + 107.14
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
uM
%Vi
ab
14
7.1.2. Efecto de la Atrazina en la FIV
Para la FIV se hicieron cuatro ensayos con un total de 482 ovocitos (115 ovocitos para el grupo
control, 143, 141 y 83 para 50, 100 y 500 µM respectivamente). En todas las concentraciones la
fertilización disminuyó significativamente con respecto al control y se observó una correlación de
efecto con el aumento de concentración de plaguicida con una r = 0.46 (Cuadro 2). Se estimó que
la CIF50 fue de 1.12 µM.
Cuadro 2. Efecto de la Atrazina en la FIV
ConcentraciónµM Proporción de fertilización fertilizados/total (%)
Normalización con respecto al control
0 66/115 (57) 100
50 48/143 (34) 60a
100 22/141 (16) 28a
500 0/83 (0) 0a
a diferencia significativa, p<0.05
En la Figura 2, se muestra el porcentaje del efecto que tiene la atrazina sobre los ovocitos
fertilizados, obteniéndose una disminución conforme aumenta la concentración del herbicida.
Figura 2. Efecto de la atrazina en la fertilización. Cada punto representa el porcentaje de fertilización en cada ensayo. En la correlación de Spearman r= 0.46.
Efecto de la atrazina en la FIV
y = -7.3375Ln(x) + 50.852
020
406080
100120
0.001 0.1 10 1000
uM
%FI
V
15
7.2. FENOXAPROP-ETIL 7.2.1 Efecto del Fenoxaprop-etil en la Viabilidad de los ovocitos Fertilizados.
Se realizaron cinco ensayos con un total de 376 ovocitos (89 para el grupo control, 98, 97 y 92
para las concentraciones de 50,100 y 500 µM respectivamente).
El porcentaje de viabilidad de los ovocitos incubados en el medio de fertilización con Fenoxaprop-
etil a concentración de 500 µM disminuyó significativamente con respecto al control (Cuadro 3). El
resto de las concentraciones no tuvo efecto.
Cuadro 3. Porcentaje de viabilidad de ovocitos coincubados con Fenoxaprop-etil durante la FIV.
Concentración µM
Proporción de fertilización fertilizados/total (%)
Normalización con respecto al control
0
76/89 (85)
100
50
83/98 (85)
100
100
77/97 (79)
93
500
0/92 (0)
0a
a diferencia significativa, p<0.05.
La prueba de Spearman mostró una correlación negativa con un valor de r= 0.96. La CL50; en este
caso fue de 266 µM.
En la figura 3 se muestran la dispersión de los valores de cada ensayo para cada concentración.
Figura 3. Se observó que sólo la concentración de 500 µM tuvo efecto significativo sobre la viabilidad en comparación con el control (p<0.05). N= 5 ensayos; la correlación de Spearman fue 0.96
Efecto del F.E. en la viabilidad de los ovocitos fertilizados
y = -0.2067x + 105.09
020406080
100120140
0 100 200 300 400 500 600
uM
%VI
AB
16
7.2.2 Efecto del Fenoxaprop-etil en la FIV
Para evaluar la FIV se hicieron cuatro ensayos con un total de 327 ovocitos (95 ovocitos para el
grupo control, 88, 82 y 62 para 50, 100 y 500 µM respectivamente). En todas las concentraciones
del herbicida la fertilización disminuyó significativamente con respecto al control y tuvo una relación
directa a medida que aumentó la concentración con una r= 0.50 (Cuadro 4). La CIF50 de este
herbicida fue de 2.3 µM.
Cuadro 4. Efecto del Fenoxaprop-etil en la FIV.
Concentración µM
Proporción de Fertilización
fertilizados/total (%)
Normalización con respecto al control
0 42/101 (42) 100
50 18/99 (18)
43a
100 7/75 (9)
21a
500 0/56 (0)
0a a diferencia significativa, p<0.05
En la Figura 4, se muestra el porcentaje del efecto que tiene el fenoxaprop-etil sobre los ovocitos
fertilizados, obteniéndose una disminución conforme aumenta la concentración del herbicida.
Figura 4. Efecto de la atrazina en la fertilización. Cada punto representa el porcentaje de fertilización en cada ensayo. En la correlación de Spearman r= 0.50.
Efecto F.E en la FIV (ajustados)
y = -6.887Ln(x) + 55.721R2 = 0.8555
0
2040
60
80100
120
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
uM
%FI
V
17
8. DISCUSION
Actualmente existe una preocupación por la salud reproductiva. En los últimos años han disminuido
los índices reproductivos y se estima que una de cada cinco parejas es involuntariamente estéril.
Ha aumentado la incidencia de tumores gonadales (Nunziata, 1998) y se estima que entre 32 y
34% de los óvulos no llegan a término (Zinaman et al, 1996), además, el 3% de los niños recién
nacidos presentan algún tipo de malformación (Shepard, 1986). Estos cambios en la reproducción
humana que han ocurrido a corto plazo pueden ser suscitados por la exposición a xenotóxicos que
se encuentran en el ambiente (Nunziata, 1998). Datos publicados indican que la exposición de
hembras de poblaciones silvestres y de animales experimentales a plaguicidas pueden causar
alteraciones en la conducta reproductiva, producir infertilidad, pérdida de la preñez, defectos en el
nacimiento y daños en el ovario (Pocar et al, 2003).
Debido a que en nuestro país se producen grandes volúmenes de herbicidas y que se usan de
manera masiva en la agricultura mecanizada, existe el riesgo de contaminación directa durante su
aplicación e indirecta por medio de alimentos y agua contaminada.(Cooper et al, 2000).
La importancia de estudiar el efecto tóxico que tienen los herbicidas sobre la reproducción,
especialmente durante la maduración y fertilización in vitro, radica en la necesidad de conocer los
posibles mecanismos de acción por los cuales actúan estos herbicidas. Los ensayos in vitro,
permiten evaluar en el laboratorio de manera directa la toxicidad de estos agentes, que presentan
la ventaja de ser menos costosos que los estudios in vivo y permiten analizar los cambios
bioquímicos y moleculares durante la exposición al agente químico.
En el presente trabajo se analizó el efecto de dos herbicidas sobre dos eventos de la reproducción
que son la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. Se eligieron la Atrazina y el
Fenoxaprop-etil para este estudio debido a que en México estos herbicidas son muy utilizados
debido a su bajo costo y a su alta efectividad. Las concentraciones de los herbicidas se basaron en
ensayos previos en los que se evaluó su efecto sobre la maduración de ovocitos (Casas et al,
2004) y en diferentes patrones de la movilidad espermática in vitro en porcino (Betancourt et al,
2006). Con los dos herbicidas se observó que la pérdida de la viabilidad de los ovocitos fertilizados
ocurrió con la concentración de 500 µM, este efecto fue más claro con el Fenoxaprop-etil que la
suprimió por completo.
Los herbicidas no produjeron daño en la viabilidad del ovocito en la concentración baja e
intermedia (50 y 100 µM) esto puede deberse que a ciertas concentraciones las células pueden
presentar la capacidad para sobreponerse o reparar el daño producido.
18
Se ha demostrado que algunos herbicidas de uso frecuente como el Dicamba (ácido 2-metoxi-3,6-
diclorobenzoico) tienen un efecto nocivo en las mitocondrias de hígado de rata, este compuesto se
incorpora en la membrana mitocondrial perturbando sus propiedades estructurales y
fisicoquímicas; tiene un efecto inhibitorio en la transferencia de electrones, en los complejos redox
II y III y además provoca un incremento en la permeabilidad de la membrana interna de la
mitocondria a los protones, por lo que este tipo de herbicidas alteran las funciones vitales de las
células o impiden su supervivencia. (Peixoto et al, 2003).
Con lo que respecta a la FIV, todas las concentraciones de los herbicidas tuvieron un efecto
inhibitorio, con una caída notable desde la concentración de 50 µM. En un estudio realizado en
bovino se observó que la Atrazina a bajas concentraciones 0.01, 0.1, 1 y 10 µM no afectó el
porcentaje de la FIV de ovocitos (Graves et al, 2002).
Los herbicidas tuvieron un efecto cien veces mayor en la fertilización que en la viabilidad. Las
concentraciones baja e intermedia disminuyeron la fertilización pero no tuvieron efecto en la
viabilidad de los ovocitos. Esto coincide con un estudio realizado sobre el efecto de estos mismos
herbicidas sobre la maduración in vitro en ovocitos porcinos, en el que la maduración mostró ser
mas vulnerable a los plaguicidas que a la viabilidad (Casas et al, 2004).
El hecho de que los herbicidas hayan afectado la fertilización indica que este proceso es muy
sensible y que posiblemente éstos ejerzan su efecto no solo sobre el ovocito, sino también sobre el
espermatozoide. Se sabe que para que éste adquiera su capacidad fertilizante, se requiere de dos
procesos continuos: la capacitación y la reacción acrosomal. Los herbicidas pueden interferir en
estos procesos e impedir la fertilización. En un estudio se demostró que la Atrazina y el
Fenoxaprop-etil 500 µM, reducen la movilidad espermática (Betancourt et al, 2006), y a
concentraciones de 100 y 500 µM afectan la maduración de los ovocitos (Casas et al, 2004).
Debido a la similitud que existe en los procesos biológicos entre los gametos es de esperarse que
los herbicidas afecten tanto a los ovocitos como a los espermatozoides.
El modo de acción de la Atrazina en los vegetales ocurre mediante el bloqueo del transporte de
electrones en el fotosistema II que conduce a la destrucción de la clorofila y bloquea la fotosíntesis;
al inicio de su utilización se creyó que este herbicida no tendría efecto sobre los animales y el
humano (Freeman y Rayburn, 2004), sin embargo, la Atrazina es considerada como un disruptor
endocrino ya que altera la homeostasis del sistema endocrino, ya sea mimetizando a las
hormonas, bloqueando a sus receptores o desencadenando vías similares dando resultados
anormales (Pocar et al, 2003).
19
La exposición a disruptores endocrinos puede ocurrir por el consumo de alimentos y agua
contaminada. En renacuajos de Xenopus laevi, la Atrazina a concentraciones de 0.1 a 200 partes
por billón produjo alteraciones en el desarrollo sexual, induciendo hermafroditismo y
masculinización de la laringe, ya que probablemente altera la esteroidogénesis e induce la
conversión de testosterona a estrógeno (Hayes et al, 2002).La exposición de roedores a Atrazina
alteró la producción de LH y prolactina antes y después de la implantación del embrión (Cummings
et al, 2000). También tuvo efecto sobre el peso corporal, ciclo ovárico y en el número de camadas
(Simic et al, 1994).
En zonas agrícolas los hijos de padres aplicadores de herbicidas tuvieron mayor riesgo de nacer
con alteraciones y la frecuencia de malformaciones al nacimiento fue más alta que en otras
regiones (Garry et al, 1996).
El Fenoxaprop- etil, es un herbicida de reciente comercialización, que pertenece al grupo de los
ácidos Ariloxifenoxialcanoicos e impide la biosíntesis de los ácidos grasos en los meristemos de
plantas (Labrada et al, 1996). Ellas utilizan un sistema de síntesis de lípidos en el que la acetil CoA
carboxilasa es inhibida por este herbicida, lo que no ocurre en el caso de los animales por poseer
una enzima con características diferentes y por esto se considera que es un plaguicida
fitoespecífico; aunque existen reportes de su posible efecto en otros organismos inferiores (Waller
et al, 2003). Sin embargo, en la literatura no hay reportes de su efecto sobre animales y no existe
evidencia de que sea carcinogénico o mutagénico y al parecer no tiene efecto en la reproducción ni
en la fertilidad humana (Peterson et al, 2001).
Es importante hacer notar el efecto de estos plaguicidas sobre el proceso reproductivo; ya que el
desarrollo embrionario depende del correcto funcionamiento durante la FIV, no se puede descartar
la posibilidad de que los ovocitos fertilizados en presencia de los herbicidas, presenten daño no
detectado que pueda interferir con el desarrollo embrionario, producir embriones no viables o con
alguna alteración en el desarrollo embrionario temprano.
En este trabajo se demostró que la Atrazina y el Fenoxaprop-etil, tienen un efecto en la viabilidad,
además inhiben la fertilización del ovocito. Es necesario continuar con estudios para poder conocer
los mecanismos de acción, a nivel celular y molecular.
20
AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado parcialmente por el CONACYT convenio 5-37923-B. Se agradece al M.
en C. Filiberto Fernández su colaboración en la obtención y análisis de la muestra de semen, a la
Biol. Exp. Alicia Reséndiz por la preparación de la muestra de semen y al rastro Los Arcos de los
Reyes, México por proporcionar los ovarios de cerdo.
A mi asesora la Dra. Yvonne Claudine Ducolom por permitirme ser parte de este grupo de trabajo y
por su apoyo incondicional.
Al Dr. Miguel Betancourt, M. en C. Eduardo Casas, B. E. Guadalupe por su apoyo en este trabajo.
A mis amigos y familia que siempre estuvieron a mi lado apoyándome en todo.
Con MUCHO AMOR para “MI RICKY”.
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9. BIBLIOGRAFIA
Abeydeera, R.L., Wang, W. Prather, R.S., y Day, B.N. (1998). Maturation in vitro of pig
oocytes in protein-free culture media: Fertilization and subsecuent embryo development in
vitro. Biol. Reprod. 58: 1316-1320.
Ashby J, Tinwell H., Stevens J. Pastoor T., Brecken ridge C.B. 2002. The effects of atrazine
on the sexual maturation of female rats. Regul. Toxicol. Pharmacol. 35:468-473.
Betancourt M, Reséndiz A., Casas E. Fierro R.(2004) Efecto de dos insecticidas y dos
herbicidas sobre los patrones de movilidad espermática. Memorias AIBIR, XXIX Reunión
de la Academia de Investigación en Biología de la Reproducción AC, Oaxaca.
Bonilla. E. Altamirano, M. Casas, E., Fierro, R, Ducolomb Y Betancourt, M, (2001).
Identificación de reprotóxicos en el laboratorio. Biología de la reproducción II. (Velázquez,
J. De). PUIS-UAM, México D.F. 55-72.
Casas E., Bonilla E., Altamirano M. Ducolomb Y. Betancour M., (2004) Efecto de los
herbicidas atrazina y fenoxaprop-etil y los insecticidas malatión y diazinón en la
maduración in vitro de ovocitos de cerdo. Memorias AIBIR, XXIX Reunión de la Academia
de Investigación en Biología de la Reproducción AC, Oaxaca.
CICLOPLAFEST (2002a) Comisión Intersecretarial para el control del Proceso y uso de
plaguicidas, fertilizantes y substancias tóxicas. Catalogo Oficial de Plaguicidas
CICLOPLAFEST (2002b). Comisión Intersecretarial para el control del Proceso y uso de
plaguicidas, fertilizantes y substancias tóxicas 2000. Registro de plaguicidas en México.
Cooper R.L., Stoker TE, Tyrey L, Goldman JM, McElroy WK. 2000. Atrazine disrupts the
hypothalamic control of pituitary-ovarian function. Toxicol Sci. 53:297-307.
Cremlyn R. (1986). Plaguicidas Modernos y su Acción Bioquímica. Editorial Limusa,
México.
Desi, I., Nagymatjényi, L., Schulz, H. y Nhéz, M. (1998). Epidemiological investigations and
experimental model studies on exposure of pesticides. Toxicol. Lett. 96, 97:351-359.
22
Graves, JE. , Richardson ME., Bernard RS, Camper ND., Bridges WC. (2002). Atrazine
effects on in vitro maturation and in vitro fertilization in the bovine oocyte. J Environ Sci
Health B.; 37(2):103-12.
Gómez, UE 2000 Paraquat –Nuevo enfoque terapéutico del paciente intoxicado.
Toxicología. Diario Córdoba (editor) Manual moderno. México
Hayes TB., Collins A, Lee M., Mendoza M., Noriega N., Stuart A., Vonk A., (2002)
Hermaphroditic desmaculinized frogs alter exposure tothe herbicide atrazine at low
ecologically relevant doses. PNAS Vol. 99 No. 8.
Hunter FHF, Polge C. (1966) Maturation of follicular oocytes in the pig after injection of
human chorionic gonadotrophin. J Reprod Nutr Dev, 42:117-125.
INEGI (2000), Encuesta Industrial Mensual.
Labrada R., Caseley J.C., Parker C. (1996); Manejo de malezas para países en desarrollo;
Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación; Roma.
Moreno D. Toxicología ambiental. (2003). Mc Graw-Hill. Interamericana. España.
Nunziata A., 1998. An overview of current in vitro test procedures to reproductive
toxicology. In: Reproductive toxicology, in vitro germ cell the developmental toxicology, from
science to social and industrial demand. del Mazo, J. (Ed)., Plenum Press, New York, 171-
183.
Observatorio Latinoamericano de Conflictos Ambientales.
http://www.olca.cl/oca/plaguicidas
Peixoto F, Vicente J.A., Madeira V.M., (2003) The herbicide Dicamba (2-methoxy-3,6-
dichlorobenzoic acid) interacts with mitochondrial bioenergetic functions. Arch Toxicol
77:403-409.
Peterson DE., Regehr DL., Thompson CR, Al-Khatib K. (2001). Herbicide mode of action.
Kansas State University, USA.
Petters RM, Wells KD. (1993) Cultura of pig embryos. J Reprod Fert, 48:61-73.
23
Pocar P., brevini T.A.L., Fischer B. And Gandolfi F. (2003). The impact of endocrine
disruptors on oocyte competence. Reproduction 125, 313-325.
Revell SG, Glossop CE. (1989). A long-time ambient temperature diluint for boar semen.
Anim Prod 84: 579-584.
Shepard TH.1986. Human teratogenicity. Add. Pediátrics 33:225-268.
Simic B, Kniewald J, Kniewald Z. (1994) Effect of atrazina on reproductive performance in
the rat. JAppl Toxicol. 14:401-404.
Tominack RL. (2000). Herbicide formulations. J Toxicol Clin Toxicol. 38: 129-135.
Vatzias G, Hagen DR. (1999) Effects of porcine follicular fluid and oviductconditioned media
on maturation and fertilization of porcine oocytes in vitro. Biology of Reproduction, 60: 42-
48.
Wang, W, Niwa, K. (1995) Synergetic effects of epidermal growth factor and gonadotropins
on the cytoplasmic maturation of pigs oocytes in a serum-free medium. Zigote, 3:345-350.
Ware G., (2000), Introducción a los Herbicidas. Universidad de Minnesota
ipmworld.umn.edu/cancelado/Spchapters/Wareherb SP
Zinaman MJ., Clegg ED., Brown CC., O’Connor J., Selevan SG., (1996). Estimates of
human fertility and pregnancy loss. Fert. Steril. 65:503-509.
