1. INTRODUCCIN

En la naturaleza los microorganismos usualmente existen en biofilms grupos de diferentes microorganismos organizados en cepas sobre una superficie cooperatividad y competencia.

El crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes celulares de un organismo y no solamente de alguno de ellos, que puede tener como resultado el incremento de su tamao o del aumento de la poblacin.

2. FUNDAMENTO TERICO

2.1 Saccharomyces cerevisiae

Las Levaduras comprenden a la actualidad, 39 gneros y 350 especies. Se identifican y clasifican basndose en caractersticas morfolgicas y fisiolgicas .Entre los aspectos morfolgicos considerados, se encuentran el tamao y las formas de las clulas, en medio slido y liquido especificados ya que pueden presentar Dimorfismo, el modo de reproduccin y si forma velo en la superficie o sedimenta en un medio lquido. Dentro de las caractersticas fisiolgicas consideradas, se encuentra si puede crecer y fermentar en un determinado carbohidrato y si puede usar o no determinadas fuentes de nitrgeno como los nitratos. Las clulas de levadura pueden ser ovales, esfricas, tener forma de limn o de cigarro puro, pueden dividirse mediante gemacin. La levaduras Saccharomyces cerevisiae son hongos unicelulares Eucariticos, hetertrofos, osmotrficos (no ingieren sus alimentos lo absorben por digestin externa del sustrato empleando exoenzimas) se reproducen por gemacin. Los Hongos son un grupo aparte no son consideradas clulas animales por que presentan pared celular externa que la recubre compuesta polisacridos de celulosa y quitina, tampoco son consideradas clulas vegetales ya que carecen de cloroplastos y no realizan fotosntesis. Una clula de una levadura de cerveza tpica tiene, cuando se halla completamente desarrollada entre 8 y 14 m de dimetro y una masa de materia seca de aproximadamente 40pg. Por tanto 1012 clulas desecadas pesan unos 40g. En vivo prensado, ese nmero de clulas pesan unos 200g. TUBB y HAMMOND en (1987) definieron las caractersticas ms importantes para una levadura de cervecera: - Una fermentacin rpida pero sin exceso de crecimiento en biomasa de la levadura - Una buena conversin de la maltosa y de la maltotriosa en etanol - Resistencia al etanol - Resistencia a la presin osmtica - Perfiles aromticos equilibrados y reproductibles - El carcter de flocular eventualmente - Una buena estabilidad gentica a lo largo del tiempo.

2.2 Enzimas

Todas las reacciones que se efectan en los seres vivos son catalizadas por enzimas. Estas hacen posible que las reacciones metablicas se desarrollen a un ritmo razonable, compatible con la vida. El trmino catalizador se emplea para referirse a cualquier sustancia que acelera el transcurso de una reaccin qumica, sin intervenir en ella ni como reactivo ni como producto. El catalizador no provoca la reaccin solo afecta la velocidad con que ocurre la misma. Esto es posible porque los catalizadores disminuyen la energa de activacin como lo indica el siguiente grfico

Los enzimas soncatalizadores especficos: cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reaccin catalizada por un enzima:La sustancia sobre la que acta el enzima se llamasustrato.El sustrato se une a una regin concreta del enzima, llamadacentro activo. El centro activo comprende (1) un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la reaccinUna vez formados losproductosel enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin

Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan reacciones especficas. Sin embargo haydistintos grados de especificidad. El enzima sacarasa esmuy especfico: rompe el enlaceb-glucosdico de la sacarosa o de compuestos muy similares. As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es susustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa sonsustratos anlogos. El enzima acta con mxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos anlogos.Entre losenzimas poco especficosestn las proteasas digestivas como la quimotripsina, que rompe los enlaces amida de protenas y pptidos de muy diverso tipo.

2.3 Crecimiento microbiano Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y ser tratada al final de este captulo.Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este.El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrnicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn creciendo, otras que estn iniciando la divisin celular, etc. En un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo la poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrnicas.

Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayora de los casos depende de su nmero, entender cmo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.

2.4 Cultivo de microorganismos

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

2.4.1 Medios de cultivo Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es elCO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgnico.La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,Mb, Cu y Zn.La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico para los hetertrofos y como CO2 para los auttrofos, el N en forma de NH4, deNO3- o de NO2- o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; elP debe estar en forma de PO43-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO42-, etc.Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar.En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms concreta es:C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composicin puede variar ligeramente en funcin de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la frmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacin del medio de cultivo ms adecuado para el mismo.Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.).Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar).En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismosmientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao.

MTODOS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir deuna nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrnsecas en el cultivo (microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofa por ejemplo).Se estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables.Existen procedimientos de enriquecimiento del nmero de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradskique crea un microcosmos para enriquecer el nmero de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.

4.3 Crecimiento microbiano en medio lquido

Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres.En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales.

4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

4.4 Medida del crecimiento y enumeracin de microorganismos

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.Los principales, se enumeran a continuacin:1.- Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml.2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser del orden de 105 por ml.3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.4.- Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas. Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas.5.- Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN, protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.6.- Medida de actividad metablica de las bacterias como que respiran producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales como el azul de metileno).

4.3 CAMARA DE NEUBAUER IMPROVED PARA EL RECUENTO DE LEVADURAS

Consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de clulas. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras de Neubauer Improved. Est diseada de manera de contener una cantidad fija de suspensin celular lquida. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 clulas/ml.

3. DETALLES EXPERIMENTALES3.1 Materiales Cultivo puro saccharomyces cereviciae Erlenmeyer de 250,500 y 1000 mL con caldo YPG Pipetas de 1 y 10 mL Tubos de ensayo 10x70 y 13x125 mm con tapones de algodn Tubos de centrfuga Bureta Tartrato sdico 3.2 Procedimiento En un matraz de 250 conteniendo 25mL de caldo YPG inocular 4. CLCULOS EXPERIMENTALES

5. DISCUSIN DE RESULTADOS6. CONCLUSIONES7. RECOMENDACIONES8. BIBLIOGRAFIA9. APNDICE