Citogenetica Humana

Elaboró: Olga Lucia Gutierrez

Rosa Helena Romero

Revisó: Dra. Yanith Piragauta G.

Validó: Dr. Fernando Anibal

Peña Diaz

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APOYO DIAGNOSTICO GUIA DE CITOGENETICA HUMANA

GENETICA CODIGO: ADx-G-G001

VERSION: 02-2011

1. CITOGENETICA HUMANA 2. INTRODUCCIÓN La citogenética es reconocida hoy por hoy como una ciencia que va a la vanguardia en el perfeccionamiento de sus técnicas y procedimientos, para consolidarse como la herramienta básica en el diagnóstico de las diferentes anormalidades cromosòmicas. El propósito de este manual es orientar y servir de consulta a quienes trabajan en el Laboratorio de Genética, en èl se mencionan las diferentes técnicas de cultivo de linfocitos, los componentes y su importancia para el proceso, especificaciones de la muestra y todas las etapas seguidas para obtener un diagnostico útil para el medico genetista, pero sobretodo para la salud del paciente. 3. CULTIVO DE LINFOCITOS PARA LA OBTENCIÓN DE METAFASES

En estos cultivos las células crecen libres en el medio, sin adherirse a las paredes del recipiente en que se encuentran. Las condiciones de cultivo varían de acuerdo al tipo de anomalía sospechada y a las características que se deseen observar. Se pueden utilizar diferentes clases de medio, los más apropiados incluyen: RPMI 1640, Medio Esencial Mínimo (MEM) y medio TC 199; a los cuales se les adiciona suero fetal bovino (SFB) inactivado, que proporciona enriquecimiento al medio; como estimulante mitogènico se adiciona fitohemaglutinina (PHA). La PHA es una sustancia que se obtiene de las semillas del fríjol ( Phaseolus vulgaris ) ; provoca la aglutinación de los hematíes y la estimulación de los linfocitos T, de manera que estos se dividen en cultivo. En presencia de la PHA, los linfocitos pequeños se transforman en células indiferenciadas grandes, denominadas blasticas, que tienen núcleo redondo uno o dos nucleolos, citoplasma basofilo y entran en la primera mitosis a las 48 horas de cultivo. La PHA se une rápidamente a los linfocitos en cultivo y, después de una hora, la estimulación es irreversible, de manera que aunque se elimine esta sustancia del medio de cultivo, se produce la síntesis de ADN y la división de los linfocitos. Se utiliza como proteína ( forma P ) o como mucoproteina ( forma M ); ambas tiene actividad mitogenica. La forma P tiene una capacidad de aglutinación 40 veces mayor que la forma M. RPMI 1640: Es mas enriquecido, sirve también para cultivos de tejido como el corion. MEM: Tiene los requerimientos esenciales mínimos, pH óptimo 7.0 - 7.2, tiene un alto contenido de ácido fólico que favorece la división celular. TC 199: Tiene bajo contenido de ácido fólico y un pH alcalino que ayuda a que se exprese mejor el sitio frágil

del cromosoma X.

4. TOMA DE MUESTRA 4.1 HEPARINIZACION DE LA JERINGA Como anticoagulante se recomienda el empleo de heparina ( Liquemine ) que es menos toxico para las células; ya que otros como el EDTA, Citrato que son quelantes ( que atraen iones ) pueden reducir la concentración de Calcio del medio de cultivo, lo suficiente como para perjudicar la división celular, basta humedecer las paredes y el émbolo de la jeringa con la solución anticoagulante. Después de tomada la muestra es importante retroceder un poco el embolo y por inversión de la jeringa asegurarse que se realice una buena mezcla de la sangre con la solución de heparina.


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4.2 PUNCIÓN VENOSA La asepsia completa de la región escogida para la punción es un paso fundamental que nos garantiza la esterilidad de la muestra. En personas adultas y aun en niños mayores de un año, la punción en los brazos es relativamente fácil; en recién nacidos, en los cuales esta punción es difícil por el frecuente colapso de las venas, es necesario en ocasiones recurrir a la punción yugular para recoger sangre suficiente, no obstante esto depende en gran parte de la habilidad de la persona que realiza la toma de la muestra. 5. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA Toda muestra tomada debe ser correctamente identificada y conservada en la jeringa en nevera (5ªC) hasta el momento de la siembra 6-8 horas después. En ocasiones es necesario utilizar sangres de 24-48 horas de refrigeración, sin embargo, la respuesta al mitògeno no es óptima porque se observan disminuidos el índice de transformación blastica y el índice mitótico. Las muestras tomadas fuera del laboratorio deben ser transportadas en las jeringas asegurando el cobertor de la aguja y el embolo con esparadrapo para evitar que se muevan y se pierda la muestra. Durante el transporte se debe evitar el sobrecalentamiento, para lo cual es ideal el uso de neveras portátiles o cajas de icopor. Muestras empacadas de esta forma pueden ser transportadas por 6-8 horas sin que se afecte significativamente la viabilidad de los linfocitos.

6. TÉCNICA PARA CULTIVO Y PREPARACIÓN CROMOSOMICA CULTIVO DE ALTA RESOLUCIÓN

6.1 SIEMBRA: Cada muestra debe sembrarse por duplicado.

Preparar el medio de siembra con 4 ml de medio ( MEM o RPMI 1640 ), que contenga una solución de Antibióticos ( Penicilina y Estreptomicina ) al 2%, y 20% de Suero Fetal Bovino o 1 ml y 0,15 de Fitohemaglutinina M .

Agregar de 15 – 18 gotas de sangre completa heparinizada según la calidad (viscosidad) de la muestra.

Incubar a 37ºC durante 70 horas.

RPMI SFB PHA MUESTRA

CULTIVO POR

DUPLICADO


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Adicionar 0.1 ml de solución de Metotrexate 10-5

M (MTX), también llamado ametopterin; es una análogo del ácido fólico que inhibe la enzima dihidrofolato reductasa, la cual es esencial para la síntesis de novo de timidilato y purinas. Si se incluye en exceso al cultivo, puede inducir muerte celular. Este paso se lleva a cabo en la cámara de flujo laminar, bajo estrictas condiciones de esterilidad. Luego se incuba de 15-17 horas a 37ºC.

Agregar 0.1 ml de una solución de Bromodesoxiuridina 1 mg/ml (BrdU). Esta es una sustancia análoga de la timina e induce mutaciones en el ADN. Cuando la BrdU se incorpora al ADN durante dos ciclos celulares, produce la tinción diferencial de las cromátides de los cromosomas metafasicos en el momento en el que son teñidos con Hoechst 33258. Cuando se incorpora durante las ultimas horas de la Fase S del ciclo celular, produce bandas R y sirve para identificar el cromosoma X de replicación tardía que por incorporar la BrdU, presenta fluorescencia roja, mientras que las regiones que se han replicado tempranamente, no han incorporado la BrdU, tienen fluorescencia verde brillante.

Incubar a 37ºC de 5 a 5 1/2

horas .

MTX

BrdU


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6.2 COSECHA

Colocar 0.1 ml de Colchicina 0.016 %, este alcaloide soluble en agua se extrae del bulbo o de la semilla de azafrán . La colchicina se une a la tubulina e inhibe la formación del huso acromático por despolimerizaciòn de sus fibras e impide su posterior polimerización. Debido a que produce despolimerizaciòn de las fibras del huso acromático puede inducir poliploidia y endorreduplicaciòn, y provoca la formación de micronucleos cuando las células se incuban durante un tiempo prolongado en su presencia. Por eso debe ser 10 minutos exactos a 37ºC.

Pasados los 10 minutos, sacamos los tubos de la incubadora, se mezclan y entonces se unen y seguimos el proceso con un solo tubo.

Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y eliminar el sobrenadante.

Agregar lentamente 7 ml de una solución hipotónica(KCL 0.075 M a 37ºC) y mezclar continuamente con pipeta Pasteur para evitar grumos. Dejar 5 minutos en incubadora a 37ºC. Esta solución hipotónica (concentración de Na menor que la intracelular) ocasiona un arrastre de agua a traves de la membrana celular hacia el citoplasma, entonces la célula se hincha y los cromosomas se dispersan. La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales para la obtención de metafases optimas para su estudio: abiertas, fáciles de contar y con bajo numero de cromosomas sobrepuestos. Errores en estos pasos, ocasionan rupturas celulares si la concentración de sales es extremadamente baja o el tiempo de tratamiento prolongado; o metafases completamente cerradas, inadecuadas para el estudio, si la concentración de sales es cercana a la isotonia. El KCL es el mas recomendado puesto que produce menos daño en la estructura cromosomica.

Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm.

Eliminar el sobrenadante y al precipitado celular adicionar lentamente solución fijadora comúnmente llamada Carnoy, que esta constituida por 3 partes de Metanol y 1 parte de ácido

COLCHICINA

l

KCl


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acético 3:1 hasta completar 7 ml mezclar muy bien y dejar en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

El proceso de fijación también es un paso crítico en la cosecha. En el botón celular acumulado después de aplicada la solución hipotónica, se tienen también los restos de la hemólisis de los glóbulos rojos, por lo tanto, si no se efectúa una ágil y rápida resuspensión en la fijación, se forman grumos oscuros de hemoglobina que son difíciles de disolver y producen extendidos sucios y con bajo índice mitótico; estos se observan en las preparaciones como artefactos que afectan las metafases las cuales se ven muy cerradas, con restos citoplasmáticos y cromosomas poco definidos o peludos, que no responden adecuadamente a los tratamientos de bandeo.

Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante

Agregar 5 ml de una solución de Carnoy (3:1) mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante.

Agregar 5 ml de una solución de Carnoy (1:1) para mejorar la dispersión de los cromosomas, mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 5 minutos a temperatura ambiente.


Agregar 5 ml de una solución de Carnoy (6:1) para eliminar restos citoplasmáticos y producir extendidos mas limpios, mezclando suavemente con pipeta Pasteur, dejar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

3:1

1:1

6:1

3:1


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Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante hasta dejar la cantidad adecuada para gotear de 3-4 laminas (1ml aprox.).

6.3 PREPARACIÓN DE LAS LAMINAS PARA EL GOTEO Las láminas portaobjetos para preparaciones citogenéticas deben ser de optima calidad desde el punto de vista óptico, exentas de opacidad, estrías y burbujas, siempre nuevas y de aspecto translucido y nítido. Se meten en un kopling, el cual contiene Carnoy ( Metanol y Ácido Acético Glacial ). Se deben dejar preferiblemente de un día para otro. Se sacan las laminas del kopling y se limpian:

Con una gasa impregnada de Etanol

Con una gasa impregnada de Metanol

Se secan con una gasa limpia y se guardan en un kopling seco en el congelador, para mantenerlas frías y húmedas garantizando una mejor expansión de la suspensión celular y somete las células a un golpe térmico y físico al entrar en contacto con la superficie del portaobjeto.

6.4 GOTEO

Se sacan las láminas del congelador.

Con una pipeta Pasteur se toma el sedimento celular .

Con una pinza se sostiene la lámina lista para dispensar de 6 a 8 gotas de dicho sedimento.

Etanol Metanol

SEDIMENTO

KOPLING


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Las laminas goteadas se colocan sobre un soporte que tiene debajo un mechero prendido, para quitarles un poco la humedad.

Dejar secar a temperatura ambiente.

Marcar las laminas respectivamente, (con numero consecutivo y fecha) con lápiz punta de diamante.

Guardar las laminas en caja de madera para su maduración respectiva. NOTA: Si las metafases han resultado demasiado cerradas, es decir, con los cromosomas muy juntos o sobrepuestos, se recomienda dejar el cultivo en nevera durante toda la noche con fijador (6:1) para así mejorar el esparcimiento cromosómico al momento del goteo.

6.5 DIAGRAMA

RPMI + SFB + PHA + SANGRE TOTAL

72 HORAS A 37 ºC

0.1ml METOTREXATE 10-5

M 15 – 17 HORAS A 37ºC

0.1ml BROMODESOXIURIDINA 1mg/ml 5 – 5 ½ HORAS A 37ºC

SOPORTE

MECHERO

No. d/m/a


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0.1ml COLCHICINA 10’ A 37ºC CENTRIFUGAR

7 ml HIPOTÓNICA (KCL) 5’ A 37ºC CENTRIFUGAR

7 ml CARNOY (3:1) 30’ CENTRIFUGAR




GOTEO (LAMINAS HÚMEDAS Y FRÍAS)

SECADO (MECHERO)

7. TÉCNICA DE CULTIVO CONVENCIONAL PARA LA OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS EN METAFASE

7.1 SIEMBRA: Cada muestra se debe sembrar por duplicado.

Preparar el medio de siembra con 4 ml de medio RPMI, más 1 ml de SFB y 0.15 ml de PHA. Agregar de 15-18 gotas de sangre total (ver preparación de la muestra ).

Incubar durante 69 horas a 37ºC.

RPMI SFB PHA MUESTRA

CULTIVO POR

DUPLICADO


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7.2 COSECHA:

Adicionar 0.1 ml de Colchicina, incubar 15 minutos exactos a 37ºC.

Pasados los 15 minutos, sacamos los tubos de la incubadora, se mezclan y entonces se unen y seguimos con un solo tubo.


Agregar al sedimento 7 ml de solución hipotónica (KCL) por 10 minutos a 37ºC.

Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante .

Resuspender el botón celular con golpes suaves y adicionar 7 ml solución fijadora (Carnoy) 3:1. Mezclar y dejar en reposo durante 30 minutos.


Adicionar 5 ml de Carnoy (3:1) y dejar en reposo por 15 minutos.


Agregar 5 ml de solución Carnoy (1:1) dejar por 5 minutos.

COLCHICINA

l

KCl

3:1

3:1


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Adicionar 5 ml de Carnoy (6:1) y dejar reposar por 5 minutos.

Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante, dejando 1 ml aproximadamente para el goteo de 3-4 laminas.

NOTA: La preparación de las laminas para el goteo y el goteo, se realizan siguiendo la misma técnica que para Cultivos de Alta Resolución.

7.3 DIAGRAMA

RPMI + SFB + PHA + SANGRE TOTAL 69 HORAS A 37 ºC

0.1ml COLCHICINA 15’ A 37ºC CENTRIFUGAR

7 ml HIPOTÓNICA (KCL) 12’ A 37ºC CENTRIFUGAR



1:1

6:1

SEDIMENTO


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GOTEO (LAMINAS HÚMEDAS Y FRÍAS)

SECADO (MECHERO) 8. TÉCNICA DE CULTIVO PARA EXPRESIÓN DEL X FRÁGIL

Para la detección del cromosoma X Frágil, es especialmente importante tener en cuenta las condiciones especiales del cultivo que incluyen: deficiencias de ácido fólico en el medio, por lo cual se debe emplear el medio TC 199 , pH alto (mayor de 7.3 en el momento de la siembra) y bajo contenido de SFB (solamente 0.25 ml). La metodología de siembra y cosecha es idéntica a la de un cultivo corto o convencional, solo varían algunas cantidades. Ejemplo:

TC 199 4.75 ml

SFB 0.25 ml

PHA 0.25 ml

9. TÉCNICA DE CULTIVO PARA INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS I.C.H.

Se siembra igual a los cultivos cortos o convencionales, adicionándoles 0.1 ml de Bromodesoxiuridina BrdU, y se procesan igual a los cultivos cortos o convencionales. Ejemplo:

RPMI 4.0 ml.

SFB 1.0 ml.

PHA 0.25 ml.

BrdU 0.1 ml.

M 199 SFB PHA MUESTRA

CULTIVO POR

DUPLICADO

RPMI SFB PHA

MUESTRA CULTIVO POR

DUPLICADO

BrdU


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10. TÉCNICAS DE BANDEO CROMOSÓMICO En los comienzos de la Citogenética con las técnicas de tinción homogénea, un cromosoma sólo podía distinguirse por su longitud y posición del centrómero y clasificarse dentro de uno de los siete grupos nombrados de la A – G, localizando el cromosoma sexual X dentro del grupo C y el cromosoma Y en el grupo G. Durante los últimos años de la década del 60 se desarrollaron técnicas de tinción especiales ( bandeo cromosómico ) que permitieron no solo la identificación exacta de la totalidad de pares cromosómicos, sino también la detección de la mayoria de alteraciones estructurales. Las bandas Q, G y R permiten un análisis claro y preciso de la morfología de los cromosomas. Las bandas G y R presentan una ventaja sobre las bandas Q y es que son preparaciones permanentes y no requieren equipos ópticos y de iluminación especial, sin embargo las bandas Q no necesitan maduración ni procedimientos térmicos o enzimáticos. Las técnicas de tinción selectiva tiñen solo regiones especificas del cromosoma, por ejemplo las bandas C y N marcan los centrómeros y los satélites respectivamente y se utilizan cuando se requiere información adicional al respecto. 10.1 BANDAS Aquella parte de un cromosoma, la cual es claramente distinguible de un segmento adyacente por su apariencia mas clara u oscura, con una o mas técnicas de bandeo. BANDAS R: (de Reverso) Formación de un patrón de bandeo, obtenido por desnaturalización, que es el inverso del patrón usual de bandeo G producido por la coloración de Giemsa. BANDAS G: (de Giemsa) Método de coloración de cromosomas que produce patrones de bandas intensamente teñidas que son separadas de si mismas por regiones débilmente teñidas. BANDAS C: (de Centrómero) Método de coloración diferencial en el que la banda positiva muestra la localización de la Heterocromatina constitutiva. Corresponde a las estructuras que se tiñen intensamente en las regiones yuxtacentromericas, es decir, cerca al centrómero. BANDAS N: (o Regiones Organizadoras del Nucleolo-NOR) Método de coloración diferencial en la que se tiñen los satélites. 10.1.1 BANDAS R Utilizar laminas de, por lo menos, 4 dias de goteadas, de tal forma que los cromosomas hayan adquirido un envejecimiento adecuado, en caso de que sea urgente realizar la coloración, las laminas se pueden envejecer colocándolas durante toda la noche entre 37 y 42 ªC y al día siguiente proceder a colorearlas.

Colocar las laminas durante 5 minutos en un recipiente (cubierto con papel aluminio, para protegerlo de la luz), con la solución de Hoechst 33258 a temperatura ambiente. Esta solución se une a los pares de bases AT en el surco mayor de la doble hélice. Se utiliza para


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detectar regiones cromosomicas de replicación tardía en cromosomas que han incorporado BrdU, así como para detectar intercambios entre cromátides hermanas.

Enjuagar con agua destilada para remover el exceso de reactivo.

Previamente preparar las cajas de Petri (caja plástica grande) colocándole papel de filtro en la base para hacer cámara húmeda con el reactivo a utilizar.

Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solución tampón Mcllvaine sobre cada lamina y cubrir con laminillas. Cerrar la caja de Petri .

Colocar la caja con las laminas dentro de la unidad de radiación, o sea, exponiéndolas con la lámpara de mercurio o de luz negra, con una longitud de onda de 590 nm, a una distancia de 25 cm y a una temperatura de 50-53ºC durante una hora.

Retirar la caja de la unidad y dejar reposar por lo menos, 5 minutos a temperatura ambiente antes de retirar las laminillas.

BALASTRO

ENCHUFE

LAMPARA

DE Hg O LUZ

NEGRA

PUERTA

CAJA DE PETRI

CON LAMINAS

EN PROCESO


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Quitar las laminillas cuidadosamente (sin arrastrarlas sobre la lamina, ya que esto hace que se rayen las preparaciones cromosomicas).

Enjuagar suavemente con agua destilada.


Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solución 2xSSC ( Solución salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.

Llevar la caja de Petri en la estufa a un a temperatura de 50-53 ºC por 30 minutos.

Retirar la caja de Petri de la estufa y dejar reposar por lo menos 5 minutos.

Remover cuidadosamente las laminillas, sin arrastrarlas sobre la lamina y enjuagarlas con agua destilada.


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10.1.2 COLORACIÓN

Buffer pH 7.2 9.5 ml

Colorante Giemsa (filtrado) 0.5 ml l

Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 2-3 minutos.

Lavar con agua destilada.

Flamear suavemente, teniendo cuidado de no producir emisión de vapores, hasta que se seque y luego limpiar por debajo con papel.

Alistar las laminas para preparación permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una pequeña con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y luego leer.

10.1.3 DIAGRAMA

LAMINA ENVEJECIDA DE 3 A 5 DÍAS DE GOTEADA O DEJADA DE 37º-42ºC DURANTE TODA LA NOCHE

HOECHST 33258 5 MIN LAVAR

SOLUCIÓN TAMPÓN MACILVAINE CUBRIR CON LAMINILLAS

LÁMPARA DE LUZ DE MERCURIO

50 – 53 º C 1 HORA LAVAR

2XSSC CUBRIR CON LAMINILLAS LLEVAR A LA ESTUFA 50 – 53 ºC 30 MIN

LAVAR

COLORACIÓN ( SOLUCIÓN TAMPÓN FOSFATO pH 7.2 + GIEMSA)

2 – 3 min LAVAR

Esta cantidad es para 2

laminas, preparar según

cantidad de laminas


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SECADO (MECHERO)

MONTAJE

MICROSCOPIO

FOTOGRAFIA

ANÁLISIS

10.2 BANDAS G Utilizar láminas de por lo menos 5 dias de goteadas o calentarlas durante 16 horas a 60ºC.


Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solución 2xSSC (Solución salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.





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Sumergir la lamina en solución de Tripsina al 1% a 9ºC por 9 – 10 segundos.

Detener la acción de la tripsina sumergiendo las laminas en etanol (alcohol).

Lavar las laminas con agua destilada. 10.2.1 COLORACIÓN

Agua destilada 4.7 ml





Alistar las laminas para preparación permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una pequeña con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.

10.3 BANDAS C

Utilizar laminas de 4 dias de goteadas.

Sumergir las laminas en ácido clorhídrico ( HCL 0.2 N), durante 40 minutos a temperatura ambiente.


Colocar las laminas en Hidróxido de Bario ( Ba(OH)2 al 5%), o en Hidróxido de Sodio (NaOH 0.07 N), durante 8 minutos a 52-53ºC, en la estufa.


lamina, preparar según

cantidad de laminas


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NOTA: El hidróxido de Bario debe mezclarse fuertemente y filtrarse antes de utilizarlo.

Lavar rápidamente, ya que Hidróxido de Bario se precipita muy fácilmente y podría quedar residuos en la lamina.


Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 6-8 gotas de solución 2xSSC (Solución salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.

Llevar la caja de Petri en la estufa a una temperatura de 50-53 ºC por 1 hora.

10.3.1 COLORACION


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Alistar las laminas para preparación permanente, es decir, pegar 2 laminillas una grande y una pequeña con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.

10.4 BANDAS N Utilizar laminas de 4 dias de goteadas.

Preparar una solución de AgNO3 al 50% P/V en agua desionizada. Si no esta recién preparada se debe filtrar antes de utilizarla.

Previamente preparar las cajas de Petri (caja plástica grande) colocándole papel de filtro en la base para hacer cámara húmeda con agua destilada.

Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 2 gotas de la solución de AgNO3, sobre cada lamina y cubrir con laminilla completa.

Tapar la caja de Petri y sellar bien.

Llevar la caja de Petri a la estufa a una temperatura de 37 ºC por 16 horas.



cantidad de laminas

50 gr 100 ml.

X 15 ml.

X= 50 x 15 = 7.5gr + 15 ml de agua destilada

100


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Sacar las laminas de la caja de Petri y enjuagar con agua abundante destilada o agua de chorro hasta que escurra la laminilla.

Dejar secar al aire sobre una toalla de papel. 10.4.1 COLORACIÓN




Colocar sobre cada lamina aproximadamente 5 ml del colorante preparado previamente, procurando dejar la lamina cubierta con el colorante durante 10 minutos.


Alistar las laminas para preparación permanente, es decir, pegar 2 laminillas una grande y una pequeña con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y leer.

10.5 BANDAS R MODIFICADAS PARA OBTENER INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) Laminas de 2-3 horas de goteadas se calientan a una temperatura de 70-80ºC durante 30 segundos – 1 minuto. Si tienen mas de un día no se calientan.

Colocar las laminas durante 5 minutos en un recipiente (cubierto con papel aluminio, para protegerlo de la luz), con la solución de Hoechst 33258 a temperatura ambiente.



cantidad de laminas


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Enjuagar con agua destilada para remover el exceso de reactivo.


Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 8-10 gotas de solución tampón Mcllvaine sobre cada lamina y cubrir con laminillas. Cerrar la caja de Petri .

Colocar la caja con las laminas dentro de la unidad de radiación, o sea, exponiéndolas con la lámpara de mercurio o de luz negra, con una longitud de onda de 590 nm, a una distancia de 25-30 cm y a una temperatura de 50-53ºC durante 17 minutos.

Retirar la caja de la unidad y dejar reposar por lo menos, 5 minutos a temperatura ambiente antes de retirar las laminillas.

BALASTRO

ENCHUFE

LAMPARA

DE Hg O LUZ

NEGRA

PUERTA

CAJA DE PETRI

CON LAMINAS

EN PROCESO


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Quitar las laminillas cuidadosamente (sin arrastrarlas sobre la lamina, ya que esto hace que se rayen las preparaciones cromosomicas).

Enjuagar suavemente con agua destilada.


Colocar las laminas en la caja de Petri y agregar de 8-10 gotas de solución 2xSSC ( Solución salina citratada), sobre las laminas y cubrir con laminillas.




10.5.1 COLORACIÓN





laminas, preparar según

cantidad de laminas


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Flamear suavemente, teniendo cuidado de no producir emisión de vapores, hasta que se seque y luego limpiar por debajo con papel.

Alistar las laminas para preparación permanente, o sea pegar 2 laminillas una grande y una

pequeña con pegante Entellan, dejar secar bien a temperatura ambiente, para luego guardar y luego leer.

10.5.2 DIAGRAMA

LAMINA ENVEJECIDA DE 3 A 5 DÍAS DE GOTEADA O DEJADA DE 37º-42ºC DURANTE TODA

LA NOCHE

HOECHST 33258 5 MIN LAVAR

SOLUCIÓN TAMPÓN McILVAINE CUBRIR CON LAMINILLAS

LÁMPARA DE LUZ DE MERCURIO

50 – 53 º C 17 MIN LAVAR

2XSSC CUBRIR CON LAMINILLAS LLEVAR A LA ESTUFA 50 – 53 ºC 15 MIN

LAVAR

COLORACIÓN ( SOLUCIÓN TAMPÓN FOSFATO pH 7.2 + GIEMSA)

3 – 5 min LAVAR

SECADO (MECHERO) MONTAJE

MICROSCOPIO

FOTOGRAFIA

ANÁLISIS

11. COLORACIÓN GIEMSA


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GIEMSA: Colorante frecuentemente utilizado para teñir cromosomas, ya sea en forma uniforme o con bandas; está formado por tiacinas como el azul de metileno y sus productos de oxidación, azur A, B y C, en combinación con la eosina Y. La coloración clásica consiste en cubrir las laminas durante 8 min con solución de colorante Giemsa preparado de la según la tabla.

No LAMINAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BUFFER pH 6.8

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

AGUA DESTILADA

4.6 9.2 13.8 18.4 23.0 27.6 32.2 36.8 41.4 46.0

COLORANTE GIEMSA

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

Dejar secar y montar las laminas para preparación permanente.

12. MICROSCOPIA Y FOTOGRAFIA

12.1 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Se utiliza para las preparaciones cromosomicas no teñidas, principalmente como control del goteo, papa tratar de mejorar la fijación o la dispersión sobre la lamina. 12.2 MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA Se utiliza con las preparaciones teñidas con Giemsa. En la microfotografía de cromosomas se busca la obtención de la gama de grises mas que el contraste de blanco y negro, por lo tanto una película con grano fino, alto poder de resolución y contraste moderado, es la mas adecuada. Por comodidad y economía se puede disponer de ellas en latas de 100 pies que se dispensan en rollos de 20-30 fotos. El papel fotográfico también se elige de acuerdo al contraste requerido y al tipo de película al copiar. El tiempo y la intensidad de la luz en la exposición es directamente proporcional al grado del papel, sin embargo se aconseja realizar pruebas en cada caso. Las soluciones reveladoras y fijadoras se preparan y usan de acuerdo a las especificaciones del fabricante. El revelado sobre papel se puede controlar visualmente bajo luz roja o verde hasta que se adquiera la definición deseada, en este paso puede corregirse ligeramente el contraste obtenido en el negativo variando el tiempo de exposición y/o la apertura del diafragma. Si se aumenta cualquiera de estos, las áreas iluminadas se harán mayores con respecto a las áreas sombreadas, resultando en un aumento del contraste efectivo. Igualmente un revelador mas concentrado o tiempo de revelado mas largo permite obtener negativos mas contrastados y viceversa. Finalmente, es prudente anotar que la correcta alineación del sistema de iluminación y óptica es indispensable para una imagen de calidad.


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12.3 FOTOGRAFIA El formato mas usado en fotografia de cromosomas es el de 35 mm ya sea por medio de fotomicroscopios automatizados ( con cámara incluida en su sistema) o de cámaras adaptadas a microscopios convencionales. Antes de iniciar el trabajo de fotografia en el laboratorio, se recomienda tomar unas fotos de prueba, con el fin de estandarizar los tiempos de exposición y los filtros apropiados para lograr una buena calidad. Partiendo de la sensibilidad indicada de la película, tomar varias fotografías exponiendo el doble del tiempo ( bajando el valor del ASA) o la mitad del tiempo (subiendo el valor del ASA) de la foto anterior. La fotografia de blanco y negro constituye el material fotográfico de rutina en citogenética debido a que permite un mejor control de contraste, menores tiempos de exposición y resultados mas rápidos. Para la elección de la película deben tenerse en cuenta ciertas características como la sensibilidad al color, el contraste , la granularidad, el poder de resolución y la velocidad.

12.4 PROCESO PARA REVELADO DE PELÍCULAS BLANCO Y NEGRO

PELÍCULA REVELADOR LAVADO FIJADOR

KODALITE

DECKTOL 2:1 (2 AGUA Y 1 DECKTOL)

2 MIN

AGUA DE CHORRO 2 MINUTOS

SAL FIJADORA 5 MINUTOS

TIMAX DECKTOL 2:1 5 MINUTOS

AGUA DE CHORRO 2 MINUTOS

SAL FIJADORA 5 MINUTOS

12.5 PROCESO PARA COPIADO DE PELÍCULAS BLANCO Y NEGRO A PAPEL REVELADOR: DECKTOL en proporcion 2:1, 2 de agua destilada y 1 de Decktol. DETENEDOR: ACIDO ACETICO, 11ml de ac. acetico para 500 ml de agua destilada. FIJADOR: SAL FIJADORA, preparar según instrucciones del fabricante.

Colocar el rollo en la copiadora y enfocar la imagen, ajustando el diafragma.

Exponer la imagen sobre el papel con el lado brillante hacia arriba, abrir diafragma; durante 10-15 segundos (tiempo predeterminado).

Sumergir en la primera bandeja con el revelador (DECKTOL), hasta que la imagen aparezca clara y con la tonalidad deseada, sin sobrerevelar.


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Inmediatamente sumergir en la segunda bandeja con el detenedor (SLN AC. ACÉTICO), durante 2-3 segundos aproximadamente.

Seguidamente, sumergir en la tercera bandeja con el fijador (SAL FIJADORA), dejar 5-10 minutos aproximadamente.

Pasar las fotos a la cubeta para el enjuague con agua de chorro y dejarlas 5-10 minutos.

Sacar las fotos de la cubeta , escurrirlas y colocarlas sobre una toalla, dejar secar a temperatura ambiente.

Recortar los cromosomas fotografiados para armar el Cariotipo respectivo, por paciente.


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ANEXO A

13. MATERIAL BÁSICO DE LABORATORIO DE CITOGENÉTICA

EQUIPO:

Cámara de Flujo laminar

Incubadora

Centrífuga

Nevera

Microscopio con cámara fotográfica

Agitador magnético

Potenciómetro

Balanza analítica

Bomba de vacío

Cuarto de fotografia con sus implementos VIDRIERIA

Frascos esterilizables de almacenamiento

Pipetas Pasteur

Laminas portaobjetos

Laminas cubreobjetos

Probetas

Vasos de precipitado

Porta filtro de vidrio

Embudos

Kopling para coloración OTROS

Tubos de centrífuga de 15 ml graduados de polipropileno estériles

Pipetas de 1,5 y 10 ml plásticas estériles

Membrana de celulosa de 0.22 micras

Lápiz de diamante

Cinta de enmascarar

Tijeras

Papel de filtro

Cajas de Petri plásticas grandes

ANEXO B 14. CUIDADOS ESPECIALES

14.1 LIMPIEZA Y LAVADO DEL MATERIAL Todos los elementos empleados en los cultivos celulares y en la preparación de reactivos que en ellos intervengan, deben ser lavados, empacados y esterilizados de acuerdo con los procedimientos tradicionales para la preparación del material estéril. En especial se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:


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Sumergir el material usado (pipetas, frascos, etc) en una solución jabonosa conteniendo un bactericida para evitar que residuos orgánicos o químicos se adhieran al material.

Lavar con abundante agua.

Sumergir el material en bandejas con agua destilada por 12 horas efectuando recambios.

Secar el material en una estufa a 30ºC.

Empacar el material y tapar los frascos con papel para esterilización.

Adherir al material cinta indicadora de esterilidad.

Regular adecuadamente el tiempo y la presión de vapor de acuerdo con el tipo de material a esterilizar.

14.2 ESTERILIDAD DURANTE LA SIEMBRA Por regla general los microorganismos crecen mas rápidamente que las células humanas, por lo que dependiendo del grado de contaminación y del agente contaminante pueden producirse desde malas preparaciones y extendidos sucios hasta muerte celular. La contaminación puede ser de dos tipos, la proveniente de flora bacteriana normal y que puede ser introducida durante la toma de la muestra o durante la siembra por inadecuada manipulación del operario y la ambiental suspendida en el aire. Es necesario tener presente estos aspectos tanto en la siembra, como en la preparación de los reactivos. Es recomendable el uso de cabinas de seguridad biológica para reducir al máximo el riesgo de contaminación durante los procedimientos. En caso de no disponer de un modelo comercial puede elaborarse un modelo artesanal, dotado igualmente de una lámpara germicida de luz ultravioleta que debe ser prendida por lo menos una hora antes de la siembra. Es conveniente recordar los efectos esterilizantes y destructivos de este tipo de luz por lo que se debe en lo posible evitar la exposición directa especialmente sobre la retina. Antes y después de cualquier procedimiento la cámara se debe desinfectar con una solución bactericida como hipoclorito de sodio o benzal.

APÉNDICE C 15. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

15.1 MEDIO DE CULTIVO Comercialmente los medios de cultivo se consiguen en polvo e hidratados, la presentación en polvo viene en frascos o sobres para la preparación de un litro o 10 litros , de acuerdo con las necesidades de consumo individuales. Se recomienda el empleo de medios en polvo ya que son mas estables y de mas fácil almacenamiento. Las especificaciones para la rehidratación de los diferentes medios ( MEM, RPMI, TC 199) vienen claramente definidos en las instrucciones proporcionadas por las casa productoras. Una vez rehidratado el medio, debe ser esterilizado por filtración a través de una membrana de celulosa de 0.22 micras y empacado en frascos de 100 o 200 ml previamente numerados para realizar el control de esterilidad, posteriormente se procede a su almacenamiento en nevera. La incorporación de Bicarbonato de sodio al medio, puede realizarse en polvo (2.2 grs) durante la preparación del mismo, o en solución al 7.5 % p/v al momento del uso. Posteriormente se ajusta el pH a 6.9 si se trata de MEM o RPMI, o a 7.3 si se trata del medio TC 199, ya que la filtración con vacío suele subir 0.1 o 0.2 unidades. El ajuste de pH se realiza con soluciones de HCl 1 N o NaOH 0.1 N estériles, según sea el caso. 15.2 SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Las contaminaciones mas comunes en el cultivo de linfocitos suelen producirse por una amplia gama de bacterias; loa antibióticos empleados para controlar la contaminación consisten en una mezcla de


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Penicilina (5000 u/ml) para bacterias Gram positivas y Estreptomicina (5 mg/ml) para bacterias Gram negativas, preparado en agua destilada y adicionada al medio al 2%. La cantidad preparada debe calcularse con base en el consumo mensual, ya que no es conveniente su almacenamiento por un periodo de tiempo largo. Cálculos:

Penicilina ( 5000 u/ml ) 1 mg 1670 U X 5000 U X = 2.99 mgs

PENICILINA GRS VOLUMEN H2O ml

0.00299 1

0.0598 20

0.1495 50

0.299 100

0598 200

Estreptomicina ( 5000ug/ml ) 1 mg 1000 ug X 5000 ug X = 5000 mg

ESTREPTOMICINA GRS VOLUMEN H2O ml

0.005 1

0.1 20

0.25 50

0.5 100

1.0 200

Pesar cada uno por separado y mezclarlos en la cantidad de agua a preparar. Adicionar a 100 ml de medio el 2 % de los antibióticos, o a 500 ml de medio 10 ml, o 29.9 mgr de penicilina + 50 mgr de estreptomicina disuelto directamente en el medio. 15.3 FITOHEMAGLUTININA La fitohemaglutinina M se consigue comercialmente liofilizada para rehidratar en 5 ml de agua destilada estéril y usar directamente a partir de esta preparación. La fitohemaglutinina P es mucho mas pura y concentrada, que la fitihemaglutinina M, por lo cual se debe calcular la solución apropiada para que su concentración final en el cultivo no sea mayor de 10 mg/ml , concentración que corresponde al tope de su actividad mitogenica sin llegar a ser aglutinante. SOLUCIÓN MADRE Se rehidrata con 5 ml de agua destilada estéril. SOLUCIÓN USO DIARIO (U.D.): 0.35 ml de Solución Madre + 4.65 de agua destilada estéril.


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15.4 COLCHICINA Se prepara una Solución Madre al 0.16 % en agua destilada estéril. Congelada y protegida de la luz es estable por más de un año. La Solución de U.D. se prepara a partir de la Solución Madre diluyendo 1/10 y se aplica 0.1 ml por cada 5ml de cultivo. CÁLCULOS SOLUCIÓN MADRE 0.16 grs 100 ml X 50 ml X = 0.08 grs

COLCHICINA GRS VOLUMEN H2O ML

0.04 25

0.08 50

0.016 100

0.32 200

SOLUCIÓN DE USO DIARIO 1 ml de Solución Madre + 9 ml de agua destilada 0.16 mg/ml 15.5 SOLUCIÓN HIPOTÓNICA La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales para la obtención de metafases optimas para su estudio: abiertas, fáciles de contar y con bajo numero de cromosomas sobrepuestos. Existen varios tipos de soluciones hipotónicas que incluyen: suero diluido al 20 %, citrato de sodio al 1% o cloruro de potasio 0.075 M; el KCL es el mas recomendado. CÁLCULOS KCL 0.075 M 74.56 grs 1 M X 0.075 M X = 5.592 grs 1000 ML

KCL GRS VOLUMEN H2O ML

1.118 200

1.398 250

2.796 500

5.592 1000

El agua destilada debe permanecer a una temperatura mas o menos de 37 ºC antes de agregar el KCL, mezclar y guardar en la incubadora a 37ªC.


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15.6 COLORANTE GIEMSA Muchos laboratorios producen el colorante Giemsa en solución lista para su uso, sin embargo también es frecuente disponer del reactivo en polvo. Para la preparación de un litro de Giemsa se requiere:

Colorante de Giemsa certificado en polvo 7.5 grs

Metanol 650 ml

Glicerina 350 ml Mezclar el metanol y la glicerina hasta obtener una solución homogénea, agitar constantemente y adicionar el colorante. Para homogenizar la solución se recomienda el empleo de perlas de vidrio. Se puede agilizar la disolución mediante un calentamiento al baño maria a 55-60ªC por 48 horas con agitación ocasional. Una vez solubilizado el colorante se filtra en papel Whatman y se conserva en frasco oscuro cerrado herméticamente para evitar su deterioro. Es importante dejar el colorante en reposo por lo menos un mes antes de su uso para obtener una acción homogénea en la tinción. Para su uso diario se empaca en alícuotas y se filtra nuevamente antes de usar. 15.7 TAMPÓN GIEMSA PH 6.8 Consiste en una mezcla a partes iguales de Na2HPO4 0.06 M y KH2PO4 0.06M. El pH se ajusta a 6.8 agregando gotas de las mismas soluciones y se conserva en nevera. Para evitar la perdida de grandes lotes por contaminación se aconseja empacar en alícuotas de 20 – 25 ml y esterilizar por calor. CÁLCULOS SOLUCION A: KH2PO4 0.06M ( Potasio Fosfato monobásico ) P.M. 136.09 grs 1 M X 0.06M X= 8.165 grs 1000 ML

KH2PO4 GRS VOLUMEN H2O ML

0.408 50

1.633 200

2.042 250

4.08 500

8.165 1000

SOLUCIÓN B: Na2HPO4 .12 H2O Na2HPO4 P.M. 358.14 grs 1 M P.M. 142.0 grs 1 M X 0.06 M X 0.06 M X= 21.5 grs 1000 ml X= 8.52 grs 1000 ml


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Na2HPO4 .12 H2O GRS Na2HPO4 GRS VOLUMEN H2O ML

1.08 0.43 50

4.3 1.70 200

5.38 2.13 250

10.75 4.26 500

21.5 8.52 1000

SOLUCIÓN DE TRABAJO 51 ml Solución KH2PO4 + 49 ml Solucion Na2HPO4 .12 H2O o Na2HPO4. Ajustar el pH a 6.8. Una vez preparada la solución tampón, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar más de la solución tampón posteriormente. No se debe guardar por mas de dos meses.

15.8 SOLUCIÓN SALINA CITRATADA ( 2 x SSC) Es una solución salina balanceada que se emplea en las coloraciones diferenciales. Se prepara mezclando partes iguales de NaCl 0.3 M y Citrato de Sodio 0.03 M. CÁLCULOS NaCL 0.3 M + CITRATO DE SODIO 0.03 M en partes iguales NaCL P.M. 58.45 grs 1 M X 0.3 M X = 17.54 grs 1000 ml

NaCL GRS VOLUMEN H2O ML

0.88 50

3.51 200

4.39 250

8.77 500

17.54 1000

CITRATO DE SODIO P.M. 294.091 1M X 0.03 M X = 8.82 grs 1000 ml


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CITRATO DE Na GRS VOLUMEN H2O ML

0.44 50

1.76 200

2.21 250

4.41 500

8.82 1000

EJEMPLO: Mezclar 8.77 grs + 4.41 grs + 500 ml agua destilada. 15.9 TRIPSINA Se prepara una solución al 0.1 % en solución salina 0.9 % tibia (32ªC ) y se lleva a la estufa a 37 ªC por 45 min. Se filtra con papel Whatman No 1 y se empaca en alícuotas de 15 – 25 ml para almacenar congelada. Una misma alícuota puede usarse para 8 – 10 laminas, debe ser cambiado, diariamente o descartarse después de permanecer descongelada más de 3 horas. CALCULOS 0.1 grs Tripsina 100 ml de S:S 0.9% tibia llevar a la estufa a 37ªC por 45 min antes de envasar, filtrar y guardar en el congelador.

TRIPSINA GRS VOLUMEN H2O ML

0.1 100

0.25 250

0.5 500

1.0 1000

15.10 BROMODESOXIURIDINA Se prepara una solución de Brdu a una concentración de 2 mgrs por ml de agua destilada y se aplican 0.1 ml por cada 5 ml de cultivo. Esta solución protegida de la luz y guardada a –20ªC permanece estable durante varios meses. CÁLCULOS 0.004 grs Bromodesoxiuridina 1 ml de H2O o S.S. S.M. Solución Madre. 1 ml de S.M. + 3 ml H2O o S.S. U.D. Solución de Uso Diario. SOLUCIÓN MADRE

Brdu grs VOLUMEN H2O o S.S. ML

0.02 5

0.04 10


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0.06 15

0.08 20

SOLUCIÓN USO DIARIO

SOLUCIÓN MADRE VOLUMEN H2O o S.S. ML

1 3

2 6

3 9

4 12

METOTREXATE SOLUCIÓN MADRE P.M. 477.46 grs 1M X 10

-4 (0.0001) X = 0.005 grs 100 ml

1 ml de S.M. + 9 ml de S.S. U.D. Solución Uso Diario SOLUCION MADRE:

METOTREXATE GRS VOLUMEN S.S. ML

0.00025 5

0.0005 10

0.00075 15

0.001 20

HOECHST 33258 CÁLCULOS Pesar 0.005 grs por cada 100 ml de agua destilada estéril, filtrar, guardar protegido de la luz y en refrigeración. Se recomienda preparar la cantidad necesaria para la solución de Uso Diario, la cual se debe utilizar máximo de 6 a 8 veces. Si se precipita se debe filtrar de nuevo y agregarle un poquito del Reactivo en polvo.

HOECHST 33258 GRS VOLUMEN H2O ML

0.0025 50

0.005 100

0.0075 150

0.01 200

BUFFER MACILVAINE SOLUCION A:


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Na2HPO4 .12 H2O 0.1M Na2HPO4 P.M. 358.14 grs/ml P.M. 142.0 grs n M= ---------- n= 1.0M x 1 litro n= 0.1moles igual litro gr n= ------- gr= 0.1x358,4 gr=35,84 en 1 litro. gr= 14.2gr en 1 litro PM 35.814 grs 1000 ml 14.2grs 1000 ml x 500ml x 250 ml x= 17.92 ml X= 3.55 grs


1.79 0.71 50

7.16 2.84 200

8.95 3.55 250

17.91 7.1 500

35.814 14.2 1000

SOLUCION B ACIDO CITRICO 0.1M PM: 210.15 gr/ml gr n= ---------- gr= 0.1x210.15 gr= 21.015 en 1 litro. PM P.M. 21.015 grs 1000ml X 250ml X = 5.25 grs 250ml

ACIDO CÍTRICO GRS VOLUMEN H2O ML

1.050 50

4.20 200

5.25 250

10.51 500

21.015 1000

A la Solución A una vez preparada, agregarle Solución B agitando constantemente hasta ajustar pH 7.0. Una vez preparada la solución tampón, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar más de la solución tampón posteriormente. No se debe guardar por mas de dos meses. 15.11 TAMPÓN GIEMSA PH 7.2 Consiste en una mezcla de Na2HPO4 .12 H2O( SOLUCIÓN A) y NaH2PO4 (SOLUCIÓN B). Ajustar PH a 7.2 agregando gotas de las mismas soluciones y se conserva en nevera. CÁLCULOS


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SOLUCION A: Disolver 0.58 grs de Na2HPO4 .12 H2O 500 ml de H2O


0.58 0.23 500

1.16 0.46 1000

1.74 0.69 1500

SOLUCION B: Disolver 0.358 grs de Na H2PO4 500 ml de H2O

Na H2PO4 GRS VOLUMEN H2O ML

0.358 500

0.72 1000

1.1 1500

SOLUCIÓN DE TRABAJO A la Solución A una vez preparada, agregarle Solución B agitando constantemente hasta ajustar pH 7.2. Una vez preparada la solución tampón, se debe guardar en nevera, al igual que cada una de las soluciones que hayan sobrado, pues se pueden utilizar para preparar más de la solución tampón posteriormente. No se debe guardar por más de dos meses. ÁCIDO CLORHÍDRIC0 1 N (HCL) P.M. 36.46 grs Densidad 1.19gr/ml d = P/V Pureza. 37%v/v d=P/V V = P/d V = 36.46/1.19 V = 30.6 ml HCl en 100ml Pureza 30.6 ml 100ml X 37ml X = 11.32 ml en 100ml a 37% de pureza.

HCl 1 N ml VOLUMEN H2O ML

153 500

76.5 250


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11.32 37

ACIDO CLORHÍDRICO 0.2 N (HCL) P.M. 36.46 grs Densidad 1.19gr/ml Pureza. 37%v/v 36.46 grs 1N X 0.2 N X = 7.292 grs d = P/V V = P/d V = 7.292/1.19 V = 6.13 ml Pureza 6.13ml 100ml X 37ml X = 2.27 ml en 100ml a 0.2N, 37% de pureza

HCL 0.2 N ml VOLUMEN H2O ML

22.7 1000

11.35 500

2.27 100

HIDRÓXIDO DE BARIO Ba(OH)2. PM: 171.34, 5%

5gr de Ba(OH)2 100ml H2O X 500ml H2O

Ba(OH)2 5%gr/ml VOLUMEN H2O ML

25 500

12.5 250

5 100

2.5 50

Ba(OH)2 5% + 8H2O. PM: 315.50 1mol Ba(OH)2 315.50 gr/mol Ba(OH)2 + 8H2O. 5gr Ba(OH)2 x ---------------------------------------- x -------------------------------------------- = 9.2 gr Ba(OH)2 171.5 gr/mol Ba(OH)2 1 mol Ba(OH)2 + 8H2O


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Ba(OH)2+ 8H2O 5% g/ml VOLUMEN H2O ML

46 500

23 250

9.20 100

4.6 50

16. GLOSARIO

ABERRACIONES CROMOSOMICAS: Alteraciones numéricas o estructurales en los cromosomas. ABERRACIONES CROMOSOMICAS BALANCEADAS: Las que no conllevan perdida de material genético, sino solo reajustes de los cromosomas, por ejemplo, algunas translocaciones. ACROCENTRICOS: Aquellos cuyo centrómero esta localizado muy cerca de uno de los extremos y divide el cromosoma en dos brazos muy desiguales. ANAFASICOS: Los cromosomas que son visibles durante la anafase de la división celular están formados por una sola cromatide. ANILLO: Se forman por la aparición de dos roturas cromosomicas en un cromosoma y la reunión de los extremos rotos. BRAZOS DE UN CROMOSOMA: Cada una de las partes de un cromosoma que resultan al trazar un eje longitudinal por el centrómero. CARIOTIPO: Hacer una caracterización de un conjunto de cromosomas de un individuo (planta o animal) con relación a su numero, tamaño y posición del centrómero. CENTRÓMERO: Región de l cromosoma a la que se unen las fibras del huso y que es necesaria para el movimiento hacia los polos durante la anafase. CENTRÓMEROS LATENTES: Los existentes en los cromosomas con mas de un centrómero y que no son funcionales. CITOGENÉTICA: El estudio de los sistemas biológicos mediante métodos combinados citología y genética. COMPLEMENTO CROMOSÓMICO: Conjunto de cromosomas de una celula o de un individuo. CROMATIDE: La mitad de un cromosoma replicado que se encuentra unida a la otra cromatide en la región del centrómero. CROMATINA DE BARR: Masa heterocromatica existente en los núcleos de las células de las hembras de los mamíferos que corresponde al cromosoma X inactivo. Es sinónimo de cromatina sexual y cromatina X. CROMOSOMA: Cuerpos bastoniformes que aparecen durante la división celular; se tiñen intensamente con giemsa, lo que permite su visualización con el microscopio óptico y contienen los genes que determinan las características de cada especie. Los cromosomas pueden considerarse


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como las unidades discretas que resultan del empaquetamiento del material genético para facilitar su separación durante la mitosis y la meiosis. CULTIVO ASINCRÓNICO: Cultivo celular en el que hay una población mixta de células en cada fase del ciclo celular. CULTIVO SINCRÓNICO: Cultivo celular en el que una gran proporción de las células están en la misma fase del ciclo celular. DELECION: Perdida de parte de un cromosoma o molécula de ADN del genoma. DISOMIA UNIPARENTERAL: Herencia de dos copias de un locus génico, procedente de uno solo de los padres. DICENTRICOS: Los que tienen dos centrómeros. Se pueden constituir de dos maneras: 1) Mediante la formación de isocromosomas o 2) mediante la reunión de las partes centromericas de dos cromosomas que tienen una rotura cromosomica cada uno. DISYUNCIÓN: Separación de las cromatides durante la anafase de la mitosis y de los cromosomas o de las cromátides durante cada una de las dos divisiones meioticas. DUPLICACIÓN: Cambio genético que se produce por la repetición de un segmento de un cromosoma o de una secuencia de ADN. ENDORREDUPLICACIÒN: Proceso que, como consecuencia de una endomitosis, conlleva a la duplicación del numero de cromatides. Los cromosomas al quedar constituidos por 4 cromatides, se denominan diplocromosomas. EUCROMATINA: Tipo de cromatina que contiene los genes transcripcionalmente activos. En los núcleos interfasicos, a diferencia de la heterocromatina, no se tiñe diferencialmente. FOTORREACTIVACION: Mecanismo de reparación del ADN dañado por la acción de la luz UV, que tiene lugar en presencia de la luz visible. FRAGMENTO ACENTRICO: Fragmento cromosómico pareado, de longitud variable, que carece de centrómero y se origina como consecuencia de roturas cromosomicas. FUSIÓN CÉNTRICA: Unión de dos cromosomas acrocentricos por los centrómeros para dar lugar a un cromosoma metacéntrico o submetacentrico. GENOMA: Contenido total de ADN de una célula o de un organismo. HETEROCROMATINA: Cromatina del núcleo interfasico que puede estar condensada ya sea siempre (constitutiva ) o en algunas células solo en ciertas ocasiones ( facultativa ). HOMÓLOGOS : Los que tienen la misma morfología, el mismo patrón de bandas, contienen los genes que codifican para las mismas características y se emparejan durante la meiosis. IDIOGRAMA: Esquema representativo del cariotipo de una especie animal o vegetal. El idiograma se elabora mediante el estudio de las particularidades de varios cariotipos, por lo que es una abstracción de estos. ÍNDICE MITÓTICO: Proporción de células que están en división en un momento determinado en un cultivo celular o en tejido vivo.


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INVERSIÓN: Aberración cromosomica estructural consistente en el cambio de posición de una región cromosomica como consecuencia de dos roturas y del giro de 180º de la región libre. En las inversiones pericentricas, el centrómero esta incluido en la región invertida, mientras que en las paracentricas no. ISOCROMOSOMAS: Cromosomas en los que el brazo corto es idéntico al brazo largo, tanto en su longitud como en su patrón de bandas. Se originan por la escisión longitudinal del centrómero y la replicación de cada uno de los brazos. MARCADORES: Los cromosomas que tienen una morfología diferente a la de los existentes en el cariotipo normal y se encuentran presentes en un gran porcentaje de células. Se han producido por reajustes cromosómicos. METACÉNTRICOS: Los que tienen el centrómero alrededor del centro del cromosoma y lo dividen en brazos de tamaño muy similar. MONOSOMIA: Condición de una célula o individuo que presenta una copia de un cromosoma determinado en vez de las dos copias esperadas en un estado diploide, como es el caso de las mujeres 45,X con Síndrome de Turner. MOSAICO: Se presenta cuando un cultivo celular o un individuo tienen dos o mas líneas celulares con diferentes complementos cromosómicos. NO DISYUNCIÓN: Separación incorrecta de los cromosomas homólogos o de las cromatides hermanas durante la división nuclear, produciéndose células o individuos que poseen un numero aneuploide de cromosomas. PATRONES DE REPLICACIÓN: Manera secuencial de replicarse el ADN de los cromosomas de las células eucarióticas durante la fase S del ciclo celular. POLIPLOIDIA: Situación en la que hay mas de dos complementos cromosómicos en las células somáticas de un individuo. PROMETAFASE: Fase anterior a la metafase y posterior a la profase en la que los cromosomas siguen condensándose y, por lo tanto, son mas cortos y gruesos que en profase, pero, menos que en metafase. REGIONES ORGANIZADORAS DEL NUCLEOLO (NOR): Regiones particulares de lo cromosomas que originan la formación del nucleolo en la interfase y que contienen los genes ribosómicos 18S y 28S. En la especie humana, se encuentra en las constricciones secundarias de los cromosomas acrocentricos de los grupos D y G (pares 13,14,15, 21 y 22). RUPTURA CROMOSOMICA: Discontinuidad en la morfología de un cromosoma. SUBMETACENTRICOS: Los que tienen el centrómero desplazado hacia uno de los extremos y divide el cromosoma en dos brazos de longitud desigual. TRANSLOCACIÒN: Reordenamiento estructural que involucra cromosomas o segmentos de cromosomas. TRISOMIA: Condición de una célula o individuo que posee tres copias de un cromosoma particular, como es el caso de la trisomia 21 o Síndrome de Down; condición aneuploide.


Rosa Helena Romero



Peña Diaz

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17. BIBLIOGRAFÍA

SILVA, Elizabeth. CITOGENÉTICA HUMANA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS. INS. Bogotá. Noviembre. 1991. CRANE, Cecilia. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE TÉCNICAS DE ALTA RESOLUCIÓN CROMOSOMICA. INS. Bogotá. Octubre. 1998.

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