Upload
yakeline-arnado-caceres
View
60
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA
SALUDESCUELA PROFESIONAL DE
TECNOLOGÍA MEDICADOCENTE : Lic. TM. David Mattos
INTEGRANTES:Yakeline Arnado Cáceres
Fabiola loayza oviedo
INTRODUCCIÓN
La citometría de flujo se inició en la década de los 60 como un importante avance en el proceso de contar y medir el tamaño de partículas o células .
DEFINICIÓN
OPoderosa técnica analítica que mide propiedades de células suspenidas en una vaina de fluido.
Permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula
ANÁLISIS CELULAR MULTIPARAMETRICO
COMPONENTESCOMPONENTES
FLuidosFLuidos
OpticoOptico
ElectrónicoElectrónico
Control de fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.
Una fuente de excitación y un sistema colección para generar y recoger las señales luminosas.
Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.
Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.
Citometría de Flujo
SISTEMA FLUÍDICO
COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA ELECTRÓNICO
Células en suspensión pasan en “fila india”a través de un volumen
iluminado, donde dispersan la luz láser
y emiten fluorescencia que es colectada,
filtrada y convertida a valores digitales que
son guardados en una computadora.
FUNDAMENTO-El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células
Se basa en hacer pasar una suspensión de
partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante
de un haz de láser focalizado.
Detector FSCDetector FSCDetector FSCDetector FSC
Detector SSCDetector SSCDetector SSCDetector SSC
LaserLaserLaserLaser
Dispersión de luzDispersión de luz
El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de
la célula y que son recogidos por distintos
detectores.
PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS O El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o
FSC)
OLa complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)
OIntensidades relativas de emisión de fluorescencia
( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)
Citometría de Flujo
FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER
-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER
Citometría de Flujo
COMO SE DETECTAN ESTAS
CARACTERISTICASEl citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :O• desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)O• emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3)
LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA INFORMACION ACERCA DEL TAMAÑO CELULAR Y
GRANULARIDAD
COMO SE DETECTAN ESTAS
CARACTERISTICASO · Generalmente proporcional al
tamaño celularO - Dispersada lateralmente es
proporcional al la complejidad de la estructura celular.
O · Luz es desviada a altos ángulosO · Proporcional a la granularidad de
la célula y su complejidadO · Detectado a 90 grados del eje de
luz incidente.
FLUORESCENCIAO Un fluorocromo es una molécula química que
absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA) Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.
Intensidad de fluorescencia y sitios de unión
Intensidad de fluorescencia FITC
Número de eventos
FITC
FITC
FITC
FITCFITC
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
Citometría de Flujo
Cómo se obtiene la luz fluorescente.
O · Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos
O · El fluorocromo absorbe energía del láser
O · El fluorocromo libera energía absorbida por :
· Vibración y disipación del calor. · Emisión de fotones a una mayor
longitud de onda llamada fluorescencia (1,2,3).
APLICACIONESO Hematología : tipificacion y conteo de células
, reticulocitos y análisis de medula ósea .O Farmacología :estudios de cinética celularO Inmunología :subpoblaciones de
linfocitos ,tipaje tisularO Oncología :Diagnostico y
pronostico ,monitores de tratamientosO Microbiología :diagnostico bacteriano y virico
,estudios de sensibilidad a los antibióticosO Genética : Cariotipo y diagnostico de
portador y diagnostico prenatal.
INMUNOTIFICACIÓNO Es el proceso para determinar
marcadores expresados en la superficie celular. Esta detección se hace empleando anticuerpos monoclonales antígeno-específicos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar.
DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO
La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometría de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos últimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular)
MicrobiologíaMicrobiología
• Determinación del contenido de ADN - ARN.• Determinación del efecto de antibióticos.• Determinación de viabilidad.
Dot Plot mostrando FSC vs Dot Plot mostrando FSC vs SSC de E. coli. SSC de E. coli. Dot Plot mostrando FSC vs Dot Plot mostrando FSC vs SSC de E. coli. SSC de E. coli.
Dot plot de FL1 vs FL3. Las Dot plot de FL1 vs FL3. Las regiones muestran las bacterias regiones muestran las bacterias vivas, dañadas y muertas.vivas, dañadas y muertas.
CFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
Después del Después del cultivocultivo
BasalBasal
M1
OBJETIVOSO • Identificar y enumerar
subpoblaciones celulares únicas y definidas.
O • Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflección electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")
O • Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas
VENTAJASO · Análisis de un número estadísticamente significativo
de células ( 1000 a más de 100.000 células).O · Múltiples marcajes de una sola célula.O · Análisis de alto numero de partículas en corto
tiempo (5.000 eventos /seg. ).O · Alta sensibilidad y objetividad.O · Medidas separadas de cada célula (no sólo el
promedio).O · Medidas cuantitativas : discriminación de las células
según la cantidad de marcador.O · Múltiples parámetros : define subpoblaciones
complejas.O · Miles de células por segundo .
DESVENTAJASO · Poca información morfológica de la célulaO · No proporciona información de la localización
celular en un tejidoO · Puede analizar solamente una cantidad limitada de
material (10 millones de células / hora)O · Necesita suspensión de células individuales .O · Costos de la tecnologíaO · Método destructivo.O · Incapacidad de visualizar las células que se
analizan.