Upload
octavo-semestre
View
341
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Herramientas de Biología Molecular Herramientas de Biología Molecular para el diagnóstico de para el diagnóstico de
EnfermedadesEnfermedades
Prof. José Antonio Nastasi Catanese
DESNATURALIZACION.- La ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble cadena de un ácido nucleico, dando origen a dos cadenas simples, complementarias entre sí, pero separadas. Usualmente la ruptura de la doble cadena se basa en el uso de calor, elevación de pH, modificaciones de la fuerza iónica del medio o una combinación de esos factores.
RENATURALIZACION.- El proceso inverso a la desnaturalización.
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Hibridación.- La unión entre dos moléculas simples “single stranded” a traves de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (A-T;C-G) para formar una molécula doble “doble stranded”. La unión puede ser entre ADN-ADN; ADN-ARN; ARN-ARN. La estabillidad de la doble molécula formada dependerá de la perfección de la complementaridad entre las bases de las dos cadenas. La rapidez y precisión de la formación de la doble cadena dependerá de la concentración de las cadenas simples y de las condiciones del medio (pH; Fuerza iónica, etc.)
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.- Enzimas de origen bacteriano, que reconocen secuencias específicas en el ADN, usualmente “secuencias palindrómicas” y lo cortan a ese nivel. Pueden dar origen o no a “extremos pegajosos”. Por ejemplo, EcoRI es una enzima aislada a partir de Escherichia coli que reconoce la secuencia 5’-GAATTC-3’ y corta ambas “hebras” del ADN entre los nucleótidos G y A.
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Enzimas de Restricción
Enzima deRestricción
Fuente Secuencia dereconocimiento
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5’-G GATC C-3’3’-C CTAG G-5’
EcoRI Escherichia coli RY 13 G AATT CC TTAA C
HaeIII Haemophilus aegytius GG CCCC GG
HindIII Haemophilus influenzae Rd A AGCT TT TCGA A
NotI Nocardia otitidis-cavarium GC GGCC GCCG CCGG CG
Sau3A Staphylococcus aureus 3A GATC CTAG^
SstII Streptomyces stanford CC GC GGGG CG CC
EcorRI
1
2
3
45
6
---G A A T T C---
---C T T A A G---
A A T T C------G G------C T T A A
EcorRI
1
2
3
45
6
1
2
3
4
5
6
EcorRI
1
2
3
45
6
1
2
3
4
5
6
GAATACCT TATG
5+6
12
3
4
5
65+6
12
3
4
5
6
12
3
4
5
6
12
3
4
5
65+6
?
VECTOR.- Una molécula de ADN que se puede replicar de forma autónoma en un huesped (bacteria o levadura), del cual puede ser posteriormente aislada en forma pura. En su molécula se puede insertar otras moléculas de ADN de origen distinto al del vector y replicar asi abundantemente dicha molécula “extraña”. Los vectores pueden ser: Plásmidos, Fagos, Cósmidos, YACS, etc.
HUESPED.- El organismo que se usa para mantener y propagar una molécula de ADN recombinante. Usualmente una bacteria (Escherichia coli) o una levadura (Sacaromyces cerevisiae).
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Vectores
Vector Huesped Tipo de Clonación
Tamaño del inserto
Plasmidos Bacteria, Levadura
ADN Genómico, ADNc
Usualmente < 5 – 10 Kb
Bacteriagos lambdas
Bacteria ADN Genómico, ADNc
Hasta 20 Kb.
Cosmidos Bacteria ADN Genómico Hasta 50 Kb.
Cromosomas artificiales de bacterias
Bacterias ADN Genómico 100 a 300 kb
cromosomas artificiales de levaduras
Levadura ADN Genómico 100 a 1000 Kb.
CLONE.- Una molécula de ADN recombinante, usualmente un vector, que contiene un gene u otra secuencia de interés.
CLONAR.- Generar un clone.
BIBLIOTECA GENOMICA.- Una colección de clones que contienen gran parte o todo el genoma de una célula, tejido o cromosoma original. Ejemplo. Una biblioteca de “DNAg humana” , Una biblioteca de ” genoma humano”.
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Crecimiento selectivo
VectorADN ligasa
ADN Humano o porción de ADN a Clonar (inserto)
Aislamiento en grandes cantidades
Inserción en Huésped
Clonación Molecular
SONDA.- Una molécula de ADN o ARN, natural o sintética de secuencia conocida o no, “marcada” con sustancias radioactivas, fluorescentes o enzimáticas, usada para detectar su secuencia complementaria por hibridización molecular.
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Detección de Mutaciones
PrimerSitio de una mutación
Oligonucleótido tipo salvaje
Oligonucleótido mutante
Sano Het Mut
TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR
SOUTHERN BLOT.- Técnica para transferir ADN desde un gel de Agarosa o poliacrilamida a una membrana, usualmente de Nylon, a fin de poder utilizar dicho ADN en procesos de desnaturalización, hibridización y renaturalización que serían imposibles de realizar en los geles.
Muestra de ADNDigestión con una Enzima de restricciónColocar muestras en cada pozo de un gel de agarosa
-
+
1 2 3 4 Migración
Alto peso molecular
Bajo peso molecular
1 2 3 4
Revelar
Hibridar en el ADN inmobilizado
Denaturar por calor
Sonda de ADN
Adicionar la sonda radiactiva
Transferir el ADN a la membrana.
Lavar el Exceso de sonda y colocar placa de rayos X
Procedimientos de Blotting
Método delBlot
Materialanalizado
fraccionamiento Detección
Southern ADN Electroforesis Hibridizaciónde AcidosNucleicos
Northern ARN Electroforesis Hibridizaciónde AcidosNucleicos
Western oInmunoblot
Proteínas Electroforesis Inmunológico
TECNICAS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA.- Técnica que permite la amplificación de un determinado segmento de ADN. El segmento especificado es copiado repetidas veces y a partir de una sola molécula original pueden obtenerse millones de copias al final de la reacción.
ADN Molde
1er Paso: Desnaturalización. 2do. Paso: Alineación.
+Taq. PolimerasaDNTPsPrimers
3er. Paso: Extensión.
PCR
PCR
Al cabo de 1 cicloAl cabo de 1 ciclo
PCR
230=1.073.741.824
TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR
SECUENCIACION DE ADN.- Técnicas que permiten determinar la secuencia nucleotídica de una molécula de ADN. Desarrolladas independientemente por Walter Gilbert y Fred Sanger , quienes compartieron el premio Nobel en 1980 por su descubrimiento.
Secuenciación del ADN
T A G T C G C A G T T A T G GA T C A G C G T C A A T A C C
A T C A G C G T C A A T A C C
Las hebras se separan
1G
2A+G
3T+C
4C
Un agente químico destruye una o dos bases de el total de cuatro
bases nitrogenadas
Más grande
Más pequeño
G AG TC C
Secuencia
ATCAGCGTCAATACC
MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT
Secuenciación del ADN
A T C A G C G T C A A T A C C
Se colocan en el termociclador, luego se separan con una electroforesis de
ácidos nucleicos.
Más grande
Más pequeño
G A T C
Secuencia
TAGTCGCAGTT
MÉTODO DE SANGER
A T G G
1ddGTP
ADN Polimerasa4 dNTP(dTTP, dCTP, dATP, dGTP
2ddATP
3ddTTP
4ddCTP
HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR
Electroforesis de ácidos nucleicos.- Migración de moléculas de ácidos nucleicos en un campo eléctrico y en un medio (Agarosa o poliacrilamida) que los separa de acuerdo a su tamaño (Peso molecular)
APLICACIONES DE LA HERRAMIENTAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
MAPEO DE GENES DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
GENÉTICAS MICROBIANAS
SUSCEPTIBILIDADES A ENFEREMEDADES PROYECTO GENOMA HUMANO (HUGO) IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS TERAPIA GÉNICA CLONACIÓN
MOLECULAR INDIVIDUAL
ANIMALES TRANSGENICOS.
Detección de Mutaciones
TAGCCAGTAACGTTAGCAGTCCTGGAGTACGTATCGGTCACTGCAATCG
ATCGGTCACTGCAATC T
TAGCCAGTAACGTTAGAAGTCCTGGAGTACGTATCGGTCACTGCAATCT
TAGCCAGTAACGTTAGATCAGGACCTCATGCAATCGGTCACTGCAATC
G
TAGCCAGTAACGTTAGATCAGGACCTCATGCAX X
Primer tipo salvaje
Primer mutante
Normal Heterocigoto Mutante
1 2 3
Primer
Sitio de Restricción creado por una mutación
Detección de Mutaciones
Detección de Mutaciones
PrimerSitio de una mutación
Oligonucleótido tipo salvaje
Oligonucleótido mutante
Sano Het Mut
Aplicaciones: Medicina Forense
15
18
20
23
Madre Padre Hijo
Exclusión
15
18
20
Madre Padre Hijo
Inclusión
Aplicaciones: Medicina Forense
13
16
21
23
Víctima Semen Sangre Piel Victimario
Inclusión
13
16
21
23
Víctima Semen Sangre Piel Victimario
Exclusión28
Proyecto Genoma
Organismo Tamaño Secuenciado % finalizado
Microbios 4.2 4.2 100
E. Coli 4.6 4.6 100
Levadura 13 13 100
Nematodo 100 71 71
Drosofila 130 8 6
Raton 3000 6 0.2
Humano 3000 60 2
Genomas Secuenciados para Septiembre de 1997.
Aplicaciones: Diagnóstico de microorganismos.
Tomado de cualquier tejido corporal
Primers Específicos para el agente
Amplifica millones de veces el ADN o ARN viral, siendo, posteriormente detectado muy fácil y rápidamente. Incluso simultáneamente se puede detectar el serotipo o cualquier variante del virus.
27 de febrero SE CLONO AL PRIMER MAMÍFERODOLLY
CLONACIÓN
Los cinco primeros cerdos clonados
CLONACIÓN
Lily, Daffodil, Crocus, Forsyhtia y Rose son las cuatro vacas clonadas en
Estados Unidos, cuyas células se ven más jóvenes
que lo normal.
CLONACIÓN
Animales y vegetales transgénicos.
Susceptibilidad genética