Universidad de Talca

Facultad de Cs. de la salud

Dpto. Bioqumica Clnica e Inmunohematologa

Espectrofotometra y Control Instrumental

Prof. TM. Mg Cs. Roxana Orrego C.

Marzo- 2014

Espectrofotometra

Trmino que se refiere al uso de la radiacin

electromagntica (REM) para

medir las concentraciones una sustancia.

Historia

Antes de 1940 la mayora de las determinaciones en qumica

clnica era de tipo volumtricas, gravimtricas y por comparacin

de colores. resultados semicuantitativos.

En la dcada del 50 se comienza a utilizar el espectrofotmetro en

USA,

Resultados: cuantitativos, confiables, reproducibles.

Mejora la precisin y la exactitud.

El espectrofotmetro es un instrumento muy til, por su

sencillez, rapidez, especificidad * y sensibilidad*.

* Dado en su mayor parte por la metodologa

estandarizada

1940

ANTECEDENTES

Todo tomo y molcula es capaz de absorber energa (bajo

ciertas limitaciones).

La energa puede proporcionarse en forma de REM luz

El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molcula esta

relacionada con su estructura.

As mismo la cantidad de REM absorbida est relacionada con el

nmero de molculas que interaccionan con ella.

Antecedentes tericos La REM se desplaza describiendo una onda, mientras ms pequea es

la longitud de onda () mayor energa que posee y viceversa.

La longitud de onda ( ) es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y

se mide comnmente en nm.(nanmetros)

La frecuencia ( ) es el nmero de ondas que pasan por un punto en una unidad de tiempo s-1= Hertz (Hz).

Antecedentes tericos

La espectrofotometra en qumica clnica slo trabaja con la REM

ultravioleta cercana y la visible.

Long de onda (nm) Color de la luz

absorbida

Color

complementario

trasmitido

380-420 Violeta Amarillo verdoso

420-440 Azul-violeta Amarillo

440-470 Azul Anaranjado

470-500 Verde azulado Rojo

500-520 Verde Prpura

520-550 Amarillo verdoso Violeta

550-580 Amarillo Azul-violeta

580-620 Anaranjado Azul

680-780 Prpura Verde

1. Fuente estable de E radiante (Lmpara)

2. Hendidura de entrada para enfoque de la luz

3. Selector de longitud de onda (sistema monocromador o filtros )

4. Hendidura de salida para enfoque de la luz

5. Dispositivo para mantener el recipiente que contendr la solucin

(porta cubeta)

6. Detector de energa radiante (fototubos)

7. Dispositivo para leer seal elctrica

0.05

Instrumentacin Espectrofotmetro de haz simple

1 +2

1

Lmparas:

Tungsteno fuente de radiacin de los 380 - 780 nm. Las ms empleadas en qumica clnica son las de yoduro de

tungsteno que tiene una vida til aprox. 3000 h.

Deuterio e hidrgeno en el intervalo de 220 - 360 nm. (UV)

Mercurio proporcionan slo espectros discontinuos de 313, 365, 405, 436 y 546 nm (slo tiles para calibracin)

Distribucin espectral de lmparas

Selector

de

longitud

de onda

Filtro

Monocromador

Absorcin

Interferencia

De corte

De banda

Prismas

Redes De transmisin

De reflexin

Selectores de longitud de onda

Filtros : Dispositivos sencillos, formados por un solo material y

trasmite energa en la deseada , absorbiendo el resto de

las .

Filtros con absorcin-transmisin selectiva (filtros de vidrio y Wratten)

Filtros de interferencia

Monocromadores: producen un haz de radiacin de gran

pureza espectral y permiten variar de forma continua y en un

gran intervalo la . La E radiante es dispersada por un prisma

o una red de difraccin, estos

dan rangos ms estrechos de .

Filtro de interferencia

Prismas: generan dispersin de la REM

basado en el fenmeno de refraccin de la

luz. El grado de desviacin depende de la . Para la regin visible se usa prisma de vidrio

Para la regin UV se usa prisma de cuarzo

Rejillas o redes de difraccin o reflexin:

Superficie lisa, en la cual se graban gran n de

surcos.

Regiones UV-visible poseen

(300-2000 surcos x mm).

Los surcos estn muy prximos entre s, cuando

la luz es reflejada por la rejilla, cada estra se

comporta como una fuente de radiacin.

*Dispersin de la luz en es lineal.

* Dispersin Luz es no lineal

Ancho de banda espectral (ABE) La luz que sale del sistema monocromador no es una sola , sino que comprende un intervalo de . Ancho de Banda: intervalo de que pasan a travs de hendidura de salida del sistema monocromador, medida en la del flujo saliente

detectado.

Celdas o porta muestras Existen de todos tamaos y formas.

Tienen un espesor (o trayectoria ptica) de 1,00 cm.

* Normalizacin de Abs= Abs leda x 1/camino ptico en cm.

Detectores : convierten energa radiante en seal

elctrica

(clulas fotovoltaicas, fototubos, fotodiodo, tubo

fotomultiplicadores, termopares y bolometros)

El detector ideal debe:

Poseer elevada sensibilidad en la regin espectral

de estudio

Dar respuesta lineal para la energa radiante

Tener un tiempo de respuesta pequeo

Ser utilizable en amplio intervalo de

Dar una mnima seal de salida ante ausencia de

radiacin.

Fotomultiplicador: seal ms intensa

Los electrones emitidos por una superficie fotosensible

inciden en una segunda superficie, llamada dnodo,

la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible

Fundamento de mediciones espectrofotomtricas.

Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (P P 0) donde P0 es la energa que sale del monocromador.

La ley que explica la relacin entre la absorcin y la concentracin de una sustancia es conocida comnmente como

ley de Beer o Lambert-Beer.

Si T es la transmitancia, es decir la radiacin que pasa al travs del cuerpo entonces T=P/P0 , por lo que T solo puede tener valores

que van desde 0 a 1.

T= P ; %T = P x 100

P0 P0

P0 P

C

b

Cuando no se absorbe luz P= P0 A = 0.

Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se transmite, es decir, P=1/P0 A = 1.

Al absorberse el 99% de la luz, se transite el 1% A = 2.

T

C

T

C

T= 10 k*C T= 10 k*b

A = b c Ley de Lambert-Beer

Reales = verdadero n (n2 +2)2

Instrumentales

Qumicas

Personales

Radiacin no monocromtica

Radiacin errtica o parsita

Errores de lectura

Influencia del equilibrio

Influencia del disolvente

Influencia de la temperatura

Impurezas de los reactivos

Interaccin entre especies absorbentes

(Interferencias espectrales)

Dimerizaciones

Rxs. AcidoBase Complejos

Clasificacin de las desviaciones de la ley de Lambert-Beer

Variabilidad Metrolgica La variabilidad metrolgica debida a variaciones sistemticas

del procedimiento de medida se cuantifica mediante el error sistemtico Error sistemtico: Se estima calculando la diferencia entre la

medida de un gran n de mediciones repetidas y el valor

verdadero. En todo sistema de medidas se producen

alteraciones que llevan a errores sistemticos que pueden ser de

tipo constante, proporcional o mixto.

1. Error constante: ser aquel valor que se mantiene en

la misma magnitud numrica en todas las mediciones.

2. Error proporcional: es aquel valor que har cambiar el

valor verdadero incrementando o disminuyendo la

magnitud de la medida.

3. Error mixto: afectan al valor verdadero tanto en forma

constante como proporcional simultneamente.

R = 1

R = 0,9996

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 100 200

absorbancia

ideal

absorbancia

medida

R = 1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 50 100 150 200

absorbancia

ideal

absorbancia

medida

R = 1

R = 1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 50 100 150 200

absorbancia

ideal

absorbancia

medida

La calibracin de los espectrofotmetros

comprende:

1. Calibracin de la escala fotomtrica

2. Calibracin de la escala de la longitud de onda

Calibracin de escala fotomtrica: se certifica la transmitancia y

absorbancia entregadas por el equipo

Se usan filtros con diferentes niveles de transmitancia

(alcance de : 340 -900 nm)

Calibracin de longitud de onda

Mtodos para la calibracin de la longitud de onda en el

visible y UV:

Mtodo n1 (ms adecuado) Uso de lmparas de con fuertes lneas

de emisin de bien definidas.

Las lmparas de mercurio producen fuertes lneas de emisin a 313, 365, 405, 436 y 546 nm.

Lmpara de hidrgeno (o deuterio) con lneas de emisin entre 486 y 656 nm.

Mtodo n 2 Uso de filtros de compuestos de tierras

raras (xido de holmio y didimio)

El espectro de absorcin del xido de holmio posee fuertes lneas de absorcin a 241, 279,

287, 333, 361, 418, 453, 536 y 636 nm. (rango 240-650)

El didimio tiene bandas de absorcin mucho ms anchas 573, 586, 685, 741 y 803. (rango 380-900nm)

Control de calidad de los espectrofotmetros

Es necesario realizar peridicamente pruebas

para verificar el instrumento.

Estas pruebas implicar evaluar :

1. Exactitud de longitud de onda

2. Linealidad de la respuesta del detector

3. Radiacin errtica(luz errtica o luz parsita)

4. Exactitud y precisin fotomtrica.

5. Estabilidad fotomtrica

Mtodo para evaluar y controlar la calibracin

Se debe evaluar la concordancia entre la longitud de

onda que indica el seleccionador y la longitud de

onda de referencia y sta se expresa en nm.

Mtodo del Punto Isosbstico.** Cuando una sustancia presenta diferentes espectros en forma

cida y bsica, stas pueden presentar un mismo punto donde

se cruzan, este punto grfico es conocido como PI. Estos son fijos

por lo que permiten verificar la exactitud de la longitud de onda.

**La limitacin de este procedimiento es que se debe hacer el

barrido espectrofotomtrico para cada una de las formas de

dicha sustancia.

Soluciones ms usadas Solucin cida-alcalina de cromato de potasio.(405-500 nm) Solucin cida- alcalina de rojo congo (520-570 nm)

Desventajas del uso de soluciones reactivas como estndar secundario:

picks de absorcin generalmente anchos cambios espectrales por contaminacin y/o envejecimiento errores en la preparacin del reactivos

Grfico punto isosbstico Rojo Congo

El mtodo consta de 3 pasos:

1. Preparacin de formas alcalinas y cidas del

colorante

2. Realizacin del barrido espectrofotomtrico

3. Interpretacin de resultados: grfico del espectro

para encontrar el PI.

Si el punto isosbstico experimental difiere del terico ,

estamos frente a un corrimiento de la longitud de onda.

Clculo de corrimiento(nm): PI experimental PI terico

Limites de aceptabilidad:

Intervalo ptimo : 2 nm

Intervalo aceptable: 3 nm

Linealidad fotomtrica Un espectrofotmetro que trabaje adecuadamente debe mostrar una

relacin lineal entre la cantidad de energa radiante absorbida y la

lectura del indicador.

Soluciones ms usadas:

La oxihemoglobina a 415 nm. p-nitrofenol a 405 nm. Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm. Sulfato de cobre 650 nm Colorante verde vegetal a 257, 410 y 630 nm

*Grficas no lineales

pueden indicar:

Error en diluciones

Error instrumental

Lmites de aceptabilidad:

r Ideal: 1

r ptimo: 0,9995-1

r Aceptable: 0,995-0,9994

Pendiente ideal: 1

Pendiente ptima: 0.98 - 1,02

Pendiente aceptable: 0.97 1.03

Evaluacin

Coeficiente de correlacin(r) y pendiente

Luz errtica:

Luz que llega al detector sin pasar por la muestra Se genera en los extremos de los intervalos espectrales. Produce

desviacin negativa de la ley de L-B.

Mtodos para evaluarla:

Uso de filtros o soluciones que posean alta transmisin sobre

una porcin del espectro, pero opacos por debajo de la lmite.

Soluciones ms usadas:

Li2CO3 < 250 nm

NaBr 0,1 M < 240 nm

Acetona < 320 nm

Limites de aceptabilidad

L.E ptima:

Exactitud fotomtrica Definicin: Grado de concordancia entre el valor de absorbancia

real y el obtenido.

As el error al leer una absorbancia respecto a una referencia se

denomina inexactitud fotomtrica.

Mtodo: medicin de absorbancia de soluciones, las que se

comparan con los valores de referencia.

Soluciones ms usadas:

340 nm: dicromato de potasio en cido perclrico 0,001 N H2SO4 0,01 N.

405 nm: p-nitrofenol en NaOH 0,1 N; soluciones de sales de nquel Ni(H2O) 6

+2 con Abs certificada

505 nm: soluciones de sales de cobalto Co(H2O)6+2 en H2SO4 0,47 N.

con Abs certificada.

540 nm: solucin de cianmetahemoglobina con Abs certificada

Evaluacin de la exactitud fotomtrica

Se debe calcular la inexactitud fotomtrica del instrumento

como la diferencia entre la absorbancia promedio

encontrada y el valor de referencia.

% Inexactitud fotomtrica: (Abs encontrada-Abs referencia)

Abs referencia

Limites de aceptabilidad:

Exactitud fotomtrica ptima : Inexactitud 2%

Exactitud fotomtrica aceptable: Inexactitud 3%

Ejemplo:

505 nm

Temperatura: 30oC

Medida 1= 0.315 Abs Medida 2= 0,313 Abs

Abs referencia 505 nm, 30oC = 0,323

Precisin fotomtrica

Def: grado de repetibilidad de medidas, siendo una medida de

dispersin de una serie de mediciones de %T o A alrededor del

valor medio y se expresa como coeficiente de variacin

porcentual.

Se puede usar cualquier solucin, lo importante es que esta

permanezca estable el tiempo que duren las mediciones.

Mnimo 10 mediciones

Impresin fotomtrica=CV % = DE x 100

X

Lmites de aceptabilidad

Precisin ptima: CV%< 0,5%

Precisin aceptable: CV% 0,5-1%

Estabilidad

fotomtrica

Capacidad del instrumento

de mantener constante la

Abs en funcin del tiempo.

Si observamos variaciones

constantes y continuas a

valores altos o bajos de Abs

tendremos deriva fotomtrica.

Si observamos variaciones

al azar de la Abs,

tendremos ruido fotomtrico

Calculo de la deriva: este parmetro es la pendiente de la curva de Abs v/s tiempo y se expresa como porcentaje.

Deriva: (Abs final- Abs inicial) x 100

Abs inicial

Calculo de Ruido: refleja la dispersin de los valores de los valores alrededor del valor medio de Abs multiplicado por 100 para expresarlo

en %.

Ruido: DE x 100

Abs promedio

Lmites de aceptabilidad:

Estabilidad ptima: Ruido + deriva < 0,5 %

Estabilidad aceptable: Ruido + deriva 0,5-1 %

Cuadro resumen de control fotomtrico

Tipo de control Espectrofotmetros

.

Fotmetros autoanalizadores

Control de

exactitud si si si

Control de

precisin si si si

Control de

linealidad si si si

Control de

estabilidad si si si

Control de

exactitud de

longitud de

onda

si no no

Control de luz

errtica o

parsita

si si si

Parmetro/ Frecuencia mensual trimestral semestral

Exactitud de X

Precisin X

Exactitud X

Luz parsita X

Estabilidad fotomtrica X

Cronograma recomendado para control fotomtrico

Referencias

1. Frings CS. & Broussard LA. (1979). Calibration and Monitoring of

Spectrometers and Spectrophotometers. Clin Chem 25/6, 1013-1017

2. Korzun WJ. & Miller G. (1986). Monitoring the Stability of Wavelength

Calibration of Spectrophotometers. Clin Chem. 32/1, 162-165.

3. Kaplan LA and Pesce AJ. (1996). Clinical Chemistry: theory, analyses and correlation. 3rd Edition

4. Duymovich C. Acheme R, Sesini S & Maziotta D. (2005)

Espectrofotmetros y fotocolormetros. Gua prctica de

actualizacin. Acta Bioquim Clin Latinoam; 39(4):529-39.

ANEXO

Controles de equipos de un laboratorio clnico

Instrumental

Espectrofotmetros

Fotocolormetros Balanzas

Centrfugas

Lectores de placas

Volumtrico Material de vidrio

Pipetas y

micropipetas

Dispensadores

Termomtrico

Termmetros

Baos termorregulados

Cubetas termostatizadas

Estufas

Refrigeradores

Congeladores