Curso IIQ2693 Biotecnología Molecular Clase 2-3: Fundamentos

Profesor Daniel Garrido Ingeniería Química y Bioprocesos

Clases 2 y 3 Contenidos 1. Revisión prueba diagnóstico

2. Replicación

3. Transcripción

4. Traducción

Primer aminoácido en una proteína Una bacteria Gram negativa Una bacteria Gram positiva Un codón de término Polímero usado para separar fragmentos de DNA. Polímero usado para separar proteínas Bacteria usada normalmente para insertar genes en plantas

El nucleótido uracilo se aparea con? Proceso que convierte una hebra de RNA en proteína Quiénes describieron (y recibieron el premio nobel por) la estructura del DNA? Enzima usada en biología molecular para amplificar exponencialmente DNA Mencione las tres etapas del PCR Dibuje la estructura del enlace peptídico Escriba el reverso complementario de la secuencia GCCCTTAGCGCGT

Transferencia de información génica

Dogma central de Biología Molecular

Estructura del DNA

Purinas

Pirimidinas

Complementariedad de bases

Fosfato 5´y OH 3´ Enlace fosfodiéster Bases nitrogenadas dentro de la cadena

Doble hélice

Replicación del DNA

NTP

oriC: Origin of chromosome replication Tenedores de replicación: Complejos enzimáticos. Replicación sólo actúa en la dirección 5´-3 Replicación en bacteria es regulada por cuántas veces se inicia la replicación en oriC.

1. Iniciación Replicación es bidireccional y semiconservativa

1. Iniciación

DnaA: Señal inicio. DnaB: Helicasa. DnaC: Soporte a DnaB. SSB: Single strand binding protein

DNA girasa = topoisomerasa II Introducción de giros negativos en el DNA Base de kits de clonación

2. Elongación

DNA polimerasa III en bacteria. 1 error por cada 10 billones bp. ( 8 millones de páginas sin un error) La enzima tiene actividad: 5´-3´ polimerasa 3´-5´ exonucleasa (proofreading o edición) Otras DNA polimerasas participan en la reparación del DNA. DNA pol. I tiene además actividad 5´-3´ exonucleasa

DnaB: Helicasa DnaG primasa: Síntesis de primers de RNA

3. Terminación: En los sitios terC

DNA ligasa Ligación del DNA, requiere ATP.

http://www.nature.com/scitable/content/replication-7689643 http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

Transcripción del DNA

• Decodificación de la información genética

• RNA polimerasa dependiente de DNA

• Enzima que cataliza la extensión por enlaces fosfodiéster de una hebra de RNA a partir de una hebra templado de DNA en la dirección 5´-3´ usando ribonucleótidos trifosfatos (ATP, etc).

Transcripción del DNA

Tipos de RNA mRNA tRNA rRNA sRNA siRNA aRNA tmRNA miRNA

Sintetizados por la misma enzima en procariontes Distintas RNApols en eucariontes.

RNAP: α2ββ´σ

• Factores σ reconocen el promotor • Unidades α y β son la maquinaria de

transcripción

Transcripción en procariontes

Secuencias de promotores son únicas. Promotores fuertes o débiles: Dado mayormente por su secuencia Factores σ se expresan en distintas fases de crecimiento, y unen distintas secuencias promotoras. σ70 en E. coli se expresa durante el crecimiento vegetativo, otros factores responden a stress.

1. Iniciación Ensamble RNAP y factores de transcripción Burbuja de transcripción

2. Elongación Liberación factor σ Unión NTP, enlace fosfodiéster y movimiento de RNAP Factores Nus: Regulación transcripción Policistrónica: Operón

3. Terminación Rho-independiente: Secuencia rica en GC al final del operón Rho-dependiente: Factor rho desestabiliza RNAP cuando pausa por más de 10 segundos

En una bacteria: rRNA: 90% tRNA: 5% mRNA: 5%

rRNA: Número de copias distinto en bacterias

Ribosomas: Compuestos de RNA (16S-23S-5S), y varias proteínas ribosomales Subunidad

Transcripción en eucariontes

Exones: 150-300 bp Intrones: 40-10000bp. Secuencias consenso

Transcripción en eucariontes

Splicing alternativo

http://www.nature.com/scitable/content/transcription-7689663

Traducción de proteínas

Acoplada con la transcripción en bacteria

Aminoacyl-tRNA-sintetasas

ATP+aa+tRNA →aminoacyl-tRNA+AMP+PPi

Traducción de proteínas

Eucariontes Traducción separada de la transcripción

Redundancia del código genético: 20 aa, 64 codones. Un codón codifica sólo para un aminoácido tRNAs son traductores del código genético a proteínas

Código genético

Diferentes usos del código genético Distintas abundancias de tRNAs que reconocen codones específicos

Inicio de la traducción

Procariontes Eucariontes

SD: Shine-Dalgarno (Secuencia 8 bp)

Elongación

translocación del ribosoma

Terminación

Qué pasa cuando el ribosoma encuentra un codón de término? No hay tRNAs para estos codones Si hay proteínas que los reconocen: factores de liberación Separación del complejo

http://www.nature.com/scitable/content/translation-6656905

Procesamiento de proteínas

1. Modificaciones post-traduccionales

Péptidos señales: Dirigen la proteína que se está ensamblando a translocación Cortados después del proceso Se pueden predecir por bioinformática

Procesamiento de proteínas

Plegamiento de proteínas

Asistido por chaperonas

Translocación y secreción de proteínas

1. Bacterias Gram +

SRP: Signal recognition particle Complejo Sec: Canal de translocación de proteínas Plegamiento proteínas secretadas ocurre en la pared celular Complejo Sec: Vía de secreción general

Translocación y secreción de proteínas

2. Bacterias Gram -

a) Uso de la vía Sec

b) Secreción tipo II

(mayor parte de las proteínas secretadas) c) Secreción tipo III

Translocación y secreción de proteínas

3. Eucariontes

REGULACION DE LA TRANSCRIPCION

Factores sigma en E. coli

Regulación de la transcripción en bacteria

Operador

Activación de la transcripción R: Represor E: Efector Mecanismo más común en bacteria

Operón lac

Represión de la transcripción IR: Inactive Repressor C: Corepressor

Regulones y modulones

Regulación de la transcripción en procariontes

Altamente regulada, a distintos niveles

Regulación de la transcripción en eucariontes

RNA polimerasa no puede iniciar la transcripción por sí sola: Requiere de factores de transcripción Regulación tiende más a la activación que a la represión Elementos de respuesta Secuencias enhancer: Unión de factores de transcripción

An activator protein bound to DNA at an upstream enhancer sequence can attract proteins to the promoter region that activate RNA polymerase (green) and thus transcription. The DNA can loop around on itself to cause this interaction between an activator protein and other proteins that mediate the activity of RNA polymerase.

Transferencia génica en bacterias

• No necesario para la reproducción bacteriana

• Sólo se intercambian pequeñas cantidades de DNA

• Evento raro en la naturaleza, pero replicable en el laboratorio

• Tres formas de transferencia en bacterias • Transformación • Transducción • Conjugación

1. Transformación natural

• Bacterias son competentes en ciertas condiciones del crecimiento

• Captura de DNA del ambiente • Sólo DNA similar al del

huésped puede ser adquirido

2. Transformación artificial

Electroporación Química

2. Transducción

Errores en ensamblaje de viriones bacterianos Un virus transporta DNA de una bacteria a otra

3. Conjugación

Recombinación homóloga

Recombinación homóloga

Uniones de Holiday: Sólo una produce hebras recombinantes Proceso mediado por la vía de recombinación RecBCD en bacteria

Uniones de Holiday