CÉLULAS MADRE Y MEDICINA DE REEMPLAZO CELULAR · Las Células Madre (CM) son las responsables que aproximadamente 37,2 x 10 12 de células en un individuo promedio de 30 años en

REVISTA ACTUALIZACIONES CLÍNICA MEDS ISSN: 0719-8620, VOL 2, NUM 2, JULIO/DICIEMBRE 2018

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ARTÍCULO DE REVISIÓN

CÉLULAS MADRE Y MEDICINA DE REEMPLAZO CELULAR

Stem Cells and Replacement Cellular Medicine

Jorge E Villanueva A1. Lic, PhD.

1. Científico FreeLancer.

Recibido el 22 de julio de 2018 / Aceptado el 18 de diciembre de 2018

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RESUMEN

Las Células Madre (CM) son las responsables que aproximadamente 37,2 x 10 12 de células en un individuo promedio de 30 años en edad, con un peso de 70 Kg, 1.72m de altura y una superficie corporal de 1.85m2, provengan de una única célula: “el cigoto”1. Las CM se encuentran en todos los organismos pluricelulares y están encargadas de repoblar el tejido u órgano anfitrión durante el desarrollo, crecimiento, homeostasis, lesión y enfermedad. Debido al limitado potencial regenerativo de la naturaleza humana, se hace imperativo su estudio. En las últimas décadas ha habido un enorme avance en el conocimiento de la biología de las CM como también la habilidad de inducir la pluripotencia en células adultas, lo están permitiendo su acelerada traslación a la Medicina de reemplazo celular y terapia génica.

PALABRAS CLAVE: Células madre, Inducción de pluripotencia, Aislamiento de CM, Medicina de reemplazo celular, Terapia Génica.

ABSTRACT

Stem Cells (CM) are responsible for approximately 37.2 x 1012 cells in an average individual 30 years of age, with a weight of 70 kg, 1.72 m in height and a body surface area of 1.85m2, come from a single cell: "the zygote"1. The CM are found in all multicellular organisms and are responsible for repopulating the host tissue or organ during development, growth, homeostasis, injury and disease. Due to the limited regenerative potential of human nature, its study is imperative. In the last decades there has been an enormous advance in the knowledge of the biology of the CM as well as the ability to induce the pluripotency in adult cells, these are allowing its accelerated translation to the Medicine of cellular replacement and gene therapy. KEYWORDS: Stem cells, Pluripotency induction, CM isolation, celular replacement Medicine, Gene Therapy. Autor para correspondencia: Jorge E Villanueva A. Licenciado Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile. PhD Biochemistry, University of Southern California, USA. Email: [email protected]


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I. INTRODUCCIÓN

Históricamente el reemplazo con Células Madre (CM) se inicia a través del uso de injertos, un papiro nos indica que los egipcios lo practicaban hace 3500 años a. de C. Treinta siglos más tarde, el cirujano indio Sushruta utilizó por primera vez auto-injertos en la reconstrucción de nariz, labios y pabellón auricular. Durante el siglo XVI Gaspare Tagliacozzi, (Bologna, Italia, 1545 – 1599), considerado el “Padre de la Cirugía Plástica Reconstructiva” reconstruía la nariz a través de injertos de piel usando por primera vez la rigurosidad científica en la medicina de reemplazo2. El concepto de CM fue postulado en 1909 por el científico ruso Alexander A. Maximow3, conocido por su teoría unitaria de la célula troncal en la hematopoyesis, quien postulaba que un “poliblasto” actúa como célula inicial para dar origen a los distintos tipos de células sanguíneas. Sin embargo, la existencia de CM en un organismo pluricelular fue demostrada experimentalmente a finales de la década de los 50’s con los trabajos pioneros de trasplante de médula ósea en caninos y luego en humanos, realizados por el grupo guiado por E. Donnall Thomas4. Estas experiencias pioneras precedieron al descubrimiento de los principios de la histocompatibilidad, siendo este último el factor determinante del escaso éxito conseguido en esos años. En los 80’s se logra establecer las primeras líneas de CM embrionarias5, que se caracterizan por su elevado poder proliferativo y pluripotencia, y que permitieron develar sus propiedades tanto a nivel ontogénico, celular y molecular. Un hito reciente ha sido la capacidad de inducir la pluripotencia de células diferenciadas, abriendo nuevas avenidas en la clínica. Si a lo anterior le agregamos los protocolos de separación de CM en base a propiedades físicas o químicas, condiciones de cultivo para sostener su auto-renovación como esos

para inducir una ruta de diferenciación, el desarrollo de matrices extracelulares de distintas naturalezas, la ingeniería de tejido y la organogénesis, están permitiendo en la actualidad que el conocimiento de la biología de las CM dé sus frutos en la medicina de reemplazo celular y terapia génica. El presente artículo se refiere a las características generales de las CM y a algunas de las técnicas más usadas en la separación de ellas, se discute avances prácticos recientes de su uso en la clínica médica y los desafíos a futuro que presenta esta biotecnología para asegurar una práctica clínica segura. II. ¿QUÉ SON LAS CÉLULAS MADRE?

Las CM o troncales son un grupo de células heterogéneas, tanto por su origen ontológico como por su potencial de diferenciación, que tienen la capacidad de dividirse asimétricamente una manteniendo la característica parental que le permite un afán de auto-renovarse y la otra destinada a convertirse en progenitora que se diferenciará progresivamente en uno o varios linajes celulares6,7. Están presente en todos los organismos pluricelulares y son las encargadas de repoblar el tejido u órgano anfitrión durante el desarrollo, crecimiento, homeostasis, lesión y enfermedad. Para una mejor descripción de la troncalidad de estas células debemos tener al menos en consideración su capacidad proliferativa, naturaleza clonal y potencial de diferenciación. La mayoría de las células somáticas se replican hasta alcanzar un número no más de 80 generaciones previo al arresto definitivo del ciclo celular y posterior senescencia8, y que se conoce como el límite de Hayflick9; por el contrario, la capacidad de las CM de auto-renovarse puede superar las 160 generaciones en cultivo sin sufrir una transformación oncogénica8. La evidencia experimental nos indica que esta propiedad es válida para las CM embrionarias y algunas CM adultas tales como las células troncales


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neuronales. Algunos autores prefieren hablar de células progenitoras cuando su potencial proliferativo es restringido. El segundo parámetro considera a las CM como entidades clonogénicas; es decir, una sola célula es capaz de generar una población homogénea o clon con linaje homogéneo en cuanto a características celulares y moleculares; en términos prácticos, estas líneas celulares pueden ser congeladas por largos períodos sin perder la capacidad de volver a crecer en cultivo. Por último, otro aspecto es su potencial que refleja el número de destinos posibles de diferenciación de estas células y que varía desde las totipotentes, pluripotentes, multipotentes hasta las unipotentes. Las CM tienen la capacidad de mantenerse mitóticamente inactivas o quiescentes e ingresar al ciclo celular cuando las condiciones lo exijan, al reconocer señales químicas de su entorno inmediato o nicho celular10. Morfológicamente, al ser células indiferenciadas, presentan un citoplasma poco especializado, por ende, menos prominente (exceptuando el cigoto) y donde la relación citoplasma/núcleo es menor al de las células diferenciadas. Otras excepciones a la regla son, por ejemplo, las CM de la mucosa intestinal y de la epidermis que presentan una morfología típica de una célula epitelial. En la actualidad, la troncalidad de estas células han sido caracterizadas molecularmente en presentar ciertos antígenos de superficie, resistencia al stress mediante transportadores multi-resistentes, por la Ubiquitina y su sistema detoxificador, elevada actividad de Telomerasas necesaria para la mantención de los telómeros, respuesta a un amplio rango de factores de crecimiento y señales moleculares tales como TGF, Notch, Wnt y Jak/Stat, remodelación de cromatina por la acción de ADN metilasas o por represores transcripcionales de deacetilasas de histonas y por co-represores de la familia Groucho,

regulación post-transcripcional de ARN helicasas tipo Vasa, componentes para el arresto del ciclo celular en G0 o bien en el control de un rápido progreso, entre otros. Estos perfiles moleculares pueden variar dependiendo del tipo de célula madre, su microambiente o nicho y sus demandas fisiológicas específicas8,11. Finalmente, los experimentos de clonación por transferencia nuclear iniciados por Sir John B. Gurdon indican que la propiedad de célula madre reside en su manera de responder a los estímulos externos12.

III. ¿CUÁNTOS TIPOS DE CÉLULAS MADRE SE CONOCEN? i) De acuerdo a la fuente de origen las CM de mamíferos se pueden clasificar de la siguiente manera: 3.1. Células madre embrionarias Estas células se obtienen de embriones de corta edad, precisamente desde la masa celular interna del blastocisto o bien del epiblasto13. Ellas muestran una extensiva capacidad de auto-renovarse cuando son cultivadas “in vitro”5. Inicialmente obtenidas desde embriones de ratón, en la actualidad se disponen de otras especies de origen animal como también de humanos14,15. Al ser pluripotentes pueden diferenciarse en cualquier tipo celular de un organismo incluyendo la línea germinal; pero por lo general, no dan origen a las células del tejido extra-embrionario. Cabe destacar que en experimentos con quimeras transgénicas en ratón las CM embrionaria humanas son capaces de formar cualquier tipo celular del ejemplar adulto; sin embargo, no se ha demostrado su contribución a la línea germinal14. Las CM embrionarias presentan un cariotipo normal.


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3.2. Células madre germinales Las células germinales primordiales se encuentran inicialmente en el tejido extraembrionario cercano al epiblasto para evitar la especificación o restricción celular que ocurre durante la gastrulación temprana, luego migran y colonizan los esbozos gonadales que se encuentran en cara medial del mesonefros para dar origen posteriormente a los tejidos gonadales encargados de la gametogénesis. En cultivo dan origen a las CM germinales embrionarias mostrando un potencial de diferenciación similar a las de las CM embrionarias, pero su aislamiento resulta más difícil16. 3.3. Células madre fetales Son CM que se encuentran en fetos (8-10 o más semanas de gestación en humanos). Estas células presentan una menor potencial de generar diferentes tipos de células comparadas al de las CM embrionarias17. También las podemos encontrar en estructuras extraembrionarias tales como el líquido amniótico y cordón umbilical18. 3.4. Células madre somáticas o adultas Los tejidos de un organismo adulto, incluso en tejido del sistema nervioso central, contienen una población residente de CM adultas que pueden permitir la renovación periódica y la regeneración cuando se produce algún daño tisular. Algunas de ellas son capaces proliferar extensivamente en cultivo y producir distintos linajes celulares tales como las CM neuronales, CM mesenquimales, CM del “bulge” epitelial y CM linfo-hematopoyéticas; mientras que otras son precursoras de un solo tipo celular tales como las células satélites del músculo, CM de la piel e intestino y las CM gonadales10.

3.5. Células de carcinoma embrionario Son CM pluripotentes malignas que se encuentran en los teratocarcinoma. Un teratocarcinoma es un tumor sólido que contiene células somáticas diferenciadas además de las CM malignas; se originan a partir de células germinales, estos tumores aparecen principalmente en testículos y ovarios y en menor frecuencia en otros órganos. Estas células malignas pueden diferenciarse en cualquier tipo celular bajo condiciones adecuadas y en cultivo producen las CM de carcinoma embrionario o cancerosas. Por otro lado, los teratomas son tumores benignos que pueden contener células normales fetales o somáticas y no contienen células de carcinoma embrionario19. Se han identificado CM cancerosas (tumorales) multipotentes en tumores tales como cáncer de Cerebro, Mamas, Colon, Ovario, Próstata, Pulmón, Leucemia, Melanomas, Mielomas, entre otros. La resistencia a tratamientos por quimioterapias, entre otros, puede explicarse por la presencia de estas CM cancerosas20. Debido a su malignidad estas CM presentan un cariotipo anormal e inestable21. ii) Las CM también se pueden clasificar de acuerdo a su potencial de diferenciación o número de linajes celulares que ellas pueden producir: 3.6. Células madre totipotentes Las CM totipotenciales son capaces de producir un conceptus, es decir, generar un individuo completo incluyendo su tejido extraembrionario. Se considera al cigoto aquel que tiene la máxima potencialidad. En ratones esta característica se mantiene hasta el estadio de 2 blastómeros, en humanos hasta el estadio de 4 blastómeros y a en algunas especies inferiores hasta el estadio de 16 blastómeros. En el estadio de 8-16 blastómeros, dependiendo del mamífero, se


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considera que las células de la mórula están comprometidas a diferenciarse en trofectodermo y células de la masa interna de la blástula perdiendo su totipotencialidad22. En ocasiones, a partir de mórulas tardías y blástula temprana se pueden obtener CM con pluripotencia expandida o plenipotentes ya que pueden diferenciarse en algunas células del tejido extra-embrionarios además de las 3 líneas germinales; sin embargo, ellas son incapaces de generar por si solas estructuras embrionarias con un plan corporal coherente23,24. 3.7. Células madre pluripotentes La CM pluripotentes pueden formar todos los linajes celulares que derivan del epiblasto; es decir, de las tres capas o linajes germinales (Endodermo, Mesodermo y Ectodermo). En este grupo, encontramos a las CM embrionarias se obtienen de la masa interna del blastocisto o bien del epiblasto y su principal característica es que su capacidad pluripotente se mantiene inalterable a pesar de su cultivo prolongado “in vitro”, más allá del límite de Hayflick. Las CM embrionarias de origen humano presentan un cariotipo normal, alta actividad de Telomerasa, antígenos de superficie como también la expresión de una serie de factores de transcripción exclusivos para estas CM, entre otras características15,25. Otro ejemplo son las CM germinales. 3.8. Células madre multipotentes Por lo general son células que dan origen a varios linajes celulares que derivan de una capa germinal. En este grupo encontramos a las CM mesenquimales o estromales de la médula ósea, de origen mesodérmico, que pueden diferenciarse en osteocito, miocitos y adipocitos. Cabe destacar que en el tejido conectivo y adiposo también encontramos este tipo de CM que pueden dar origen a adipoblastos, condroblastos y osteoblastos10.

También son multipotentes las CM linfo-hematopoyéticas que dan origen a los distintos tipos celulares que componen la sangre tanto hemáticas como linfáticas. 3.9. Células madre unipotentes Células capaces de producir un solo tipo de célula diferenciada. Se encuentran en tejidos que requieren constante renovación tisular tales como la piel, epitelio intestinal y mucosas, entre otros. Las células satélites que dan origen a las fibras musculares son de este tipo CM10. Algunos autores se refieren a ellas como células progenitoras si muestran una capacidad proliferativa más restringida al de las células troncales. 3.10. Células madre pluripotentes inducidas En la actualidad se pueden inducir CM pluripotentes (CMPi) a partir de células diferenciadas fetales o adultas, gracias a los trabajos pioneros en ratón y humanos26,27. Por estos descubrimientos, el Dr Yamanaka recibió el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2012. Esta reprogramación se logró inicialmente de la siguiente manera: fibroblastos de la piel fueron infectados con virus recombinantes conteniendo 4 genes que codifican para los siguientes factores inductores: el factor de transcripción 4 de unión a octámero (Oct4), el factor de transcripción Región Y-box 2 determinante del sexo (Sox2), el factor de transcripción 4 similar a Kruppel (Klf4) y el factor de transcripción proto-oncogénico c-Myc, esenciales para la promoción de la pluripotencia. Las CMPi obtenidas se asemejan a las CM embrionarias en tener un citoplasma reducido, capaz de formar colonias en cultivo, con una habilidad proliferativa más allá del límite de Hayflick, tener naturaleza clonal, presentar marcadores de superficie específicos para CM embrionarias tales como los antígenos SSEAs, expresar los factores de transcripción Oct-3/4, Sox2 Nanog, GDF3, REX1, FGF4,


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ESG1, DPPA2, DPPA4, TERT, estabilidad de los telómeros por la presencia de una alta actividad de Telomerasa, presentar un estado epigénico en genes esenciales para la pluripotencia, entre otras propiedades. Cabe destacar que las CMPi humanas pueden producir teratomas cuando son implantadas en ratones inmune-deficientes, aunque se ha sugerido que pudiesen tener un insignificante efecto en tumorigénesis28, pero esos teratocarcinomas no han sido evaluados adecuadamente29. En 2012, Boland y colaboradores32 demostraron elegantemente la pluripotencia de los fibroblastos embrionarios inducidos de ratón. De entre 16-18 de estas CMPi fueron micro-inyectadas en blastocistos tetraploides (generados por electro-fusión celular) e implantados en los cuernos uterinos de hembras subrogantes. El componente tetraploide de estos embriones contribuyó en la formación de tejido extra-embrionario mientras que el ratón adulto derivó exclusivamente de las CMPi inyectadas. La técnica en sí tiene una eficiencia entre el 5-13% de generar cachorros vivos, rendimiento comparable al de las CM embrionarias de ratón en procedimientos similares.

IV. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE CÉLULAS MADRE El desarrollo de la tecnología con CM es crucial y esencial para la transferencia del conocimiento científico hacia la práctica médica terapéutica. Un requisito para el estudio de la biología de las CM es contar con métodos de separación que suministren estas células a gran escala, con alta pureza y viabilidad. Existen varios métodos de separación de CM33, en base a:

i. Propiedades químicas tales como la inmuno-reactividad que incluyen: selección de CM activadas por fluorescencia (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS por su

sigla en inglés) y separación de células activadas por imán (Magnetic-activated cell sorting, MACS por su sigla en inglés).

ii. Propiedades físicas tales como

densidad celular en gradiente isopícnica, selección por tamaño a través de filtración, fraccionamiento por flujo de campo (FFC) y diaeléctroforesis (DEF) de células.

4.1 Selección de CM activadas por fluorescencia (FACS) La separación de células activadas por fluorescencia hace uso de la citometría de flujo para separar un determinado tipo celular desde una población heterogénea utilizando anticuerpos marcados con un flourocromo, dirigidos hacia una proteína (antígeno) de superficie específico para las células de interés. La muestra se hace fluir por el Citómetro bajo vibración ultrasónica provocando la formación de micro-gotas conteniendo 1 sola célula. Entonces, el instrumento procede a cargar eléctricamente las células fluorescentes con una carga opuesta al de aquellas no fluorescente. Luego, las gotitas caen una tras otra a través de un sistema de deflexión electrostática que desvía las gotas a contenedores separados de acuerdo a su carga. De esta manera se puede obtener una suspensión de CM sobre un 95% de pureza. 4.2. Separación de células activadas por imán (MACS). Esta técnica también usa anticuerpos, pero unidos a nano-partículas súper-magnéticas, que reconocen antígenos de superficie específicos de la célula de interés. Estas partículas al ser tan pequeñas, no alteran la estructura ni la actividad de las células a separar; además, estos nano-magnetos son biodegradables y no son tóxicos. Luego, la mezcla se introduce en una columna con


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esferas ferromagnéticas recubiertas con un material inerte que no daña a las células y se aplica un campo magnético en base a imanes, permitiendo retener fuertemente las células marcadas paramagnéticamente en la columna, mientras las células magneto negativas son eluídas fuera de la columna. Finalmente, al retirar el imán las células antígeno positivas podrán ser rescatadas de la columna por elución con un alto grado de pureza. Las células estarán listas para ser cultivadas y/o analizadas, ya que no es necesario separar las nano-partículas. Nota: cabe mencionar que las técnicas de separación de células FACS y MACS se pueden usar en ambos sentidos. En ocasiones las células de interés son aquellas marcadas con el anticuerpo de superficie; al contrario, en otras ocasiones las células de interés son aquellas que no han sido marcadas con el anticuerpo de superficie. 4.3. Sedimentación isopícnica. La sedimentación isopícnica permite separar células en función de su densidad celular. La densidad de una célula depende de la relación entre núcleo y citoplasma toda vez que el núcleo es más denso que su citoplasma. Una célula indiferenciada, como lo son generalmente las CM, presenta un citoplasma menos desarrollado y poco especializado; por lo tanto, su densidad será mayor al de una célula diferenciada que posee un citoplasma más prominente y especializado34. Este método es ideal para separar células cuyas densidades difieren entre sí en más de 0,02 g/ml. Para ello se utilizan centrifugadoras convencionales y se aplican campos gravitatorios de baja intensidad para no dañar la estructura celular. Se distinguen dos tipos de gradientes de sedimentación isopícnica: gradientes continua y discontinua. 4.4. Separación por Dielectroforesis celular

La dielectroforesis es un proceso de separación de células, de acuerdo a sus propiedades eléctricas como también a su forma y tamaño, a través de campos eléctricos no uniformes. Cuando una célula (neutra o cargada eléctricamente) suspendida en un líquido se le aplica un campo eléctrico experimentará una polarización de sus cargas internas que redundará en un re-ordenamiento de las cargas del medio de suspensión alrededor de su membrana y el efecto neto será la formación de un dipolo inducido. La dielectroforesis puede presentarse en dos tipos: si el dipolo inducido es antiparalelo al campo eléctrico, de esta manera la célula se moverá a la región donde el campo eléctrico provoca mayor atracción (debido a que la carga del campo es más intensa), a este fenómeno se le conoce como dielectroforesis positiva. Por otro lado, si el dipolo inducido es colineal al campo eléctrico y la partícula se moverá a la región donde el campo eléctrico provoca menor repulsión, a este fenómeno se le conoce como dielectroforesis negativa. 4.5. Fraccionamiento de células por flujo de campo (FFC) El fraccionamiento por flujo de campo es una técnica de separación donde se aplica un campo perpendicular al flujo laminar de una mezcla de células que atraviesan por un canal. Este campo ocasiona que las células se separen debido a las diferencias de movilidades que existen entre ellas. El campo aplicado puede ser gravitacional o centrífugo, pero perpendiculares al flujo de la mezcla. En FFC, las células están expuestas a fuerzas inerciales o no inerciales, se mueven en función del tamaño y la morfología, y son colectadas a diferentes intervalos de tiempo. Por lo tanto, FFC puede separar diferentes tipos de células basados exclusivamente en parámetros físicos. Para cada tipo de células existirá una región en la cual la fuerza aplicada proveniente del campo y la fuerza de arrastre junto con la


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difusión se compensen, esto ocasiona que cada tipo de célula se mueva a una región diferente del flujo, i.e., a diferente altura. Cuando las CM de una población inicial tienen un tamaño y densidad distintos al resto de la población, FFC se transforma en un método de separación celular altamente eficiente. V. CÉLULAS MADRE, INGENIERÍA DE TEJIDOS, MEDICINA REGENERATIVA Y TERAPIA GÉNICA Uno de los mayores propósitos del estudio de las CM es la terapia de reemplazo celular y génica. Las CM tienen el potencial de reparar tejidos y órganos dañados por la edad, enfermedad o trauma, así como también normalizar los defectos genéticos, reestableciendo la función normal de tejidos y órganos. El estudio y uso de CM se vuelve esencial debido a la limitada capacidad regenerativa de los humanos como respuesta curativa comparada a la de los vertebrados inferiores y, a la escasa oferta de órganos y tejidos, en adición a las complicaciones inmunológicas severas que a menudo pueden presentarse. La pre- y clínica ha desarrollado diferentes estrategias que van desde el uso de células frescas o bien propagadas en cultivo, células autólogas como alogénicas, células con pluripotencia inducida, matrices biológicas acelulares, artificiales o mixtas que imiten andamios extracelulares naturales, ingeniería de tejidos, infusión de factores de crecimiento, órganos recelularizados, inducción por nano-transfección35, entre otras. La aprobación por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de EEUU, Food and Drug Administration por su sigla en inglés) y de agencias europeas hacen habituales el implante autólogo de condrocitos, el uso de CM del tejido adiposo en varios escenarios clínicos, injertos de tejidos diseñados por ingeniería celular, entre otros. La agencia

japonesa también ha permitido el uso de algunas estas técnicas en la clínica, incluso con terapia génica. 5.1. Matrices extracelulares Un tejido, además del componente celular, está formado por una matriz extracelular o andamio que funciona como soporte permitiendo a moléculas de señalización (factores de crecimiento, citoquinas, hormonas, etc.) y señales biofísicas actúen como mensajes del entorno (nicho) sobre las células y, que son necesarias para la sobrevivencia, organización, diferenciación, desarrollo y homeostasis. El avance reciente en tejidos descelularizados permiten el uso de estos andamios en medicina regenerativa. Estas matrices aceluladas se pueden obtener por tratamiento químico con detergentes, ácido/base o alcoholes, por acción enzimática y por procedimientos físicos tales como ciclos de congelamiento/descongelamiento, presurización o electroporación severa. Después de la descelularización, la forma, el tamaño, complejo estructural y propiedades de la matriz se mantienen. El material tridimensional obtenido consiste principalmente de colágeno, el mayor componente proteico de los andamios celulares. Estas matrices deben cumplir los siguientes requisitos para inducir CM y/o progenitoras: i) una superficie que promueva la adhesión, proliferación y diferenciación celular; ii) tener bio-compatibilidad; iii) alta porosidad y una alta relación superficie-área a volumen, con una red de poros interconectados para el crecimiento celular y que favorezca el transporte de nutrientes y desechos metabólicos; iv) propiedades mecánicas suficientes para soportar cualquier estrés tisular36. En 2001 se aprueba y se comercializa la primera matriz acelulada, la válvula cardíaca porcina y hasta la fecha su uso en clínica abarca matrices alogénicas y xenogénicas de


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origen porcino bovino o equino; provenientes de tejidos tales como dermis, mesotelio, fascia lata, vejiga, submucosa intestinal, aorta, pericardio, válvula cardíaca, hueso y cartílago. Como estas matrices son naturales, su degradación en el sitio a reparar provoca la liberación de factores de crecimiento y nanovesiculas que inducen la diferenciación de CM, además de producir péptidos matricrípticos que promueven mitogénesis, quimiotaxis, angiogénesis, necesarios en los procesos de reparación, y su reabsorción permiten la síntesis “de novo” de matriz extracelular por las células residentes37. Numerosas matrices análogas se han desarrollado que imitan el microambiente 3D de matrices naturales y que promueven la función celular. Estos andamios sintéticos se encuentran en un estado pre-clínico y pueden ser construidos a partir de polímeros tales como policaprolactona, polietilenglicol o ácido poliglicólico; hidrogeles derivados de ácido poliacrílico, polietilenglicol o alcohol polivinílico; cerámicas en base a hidroxiapatita o fosfato tricálcico; y a partir de biopolímeros naturales tales como alginatos, quitosano, celulosa o fibroína de seda. Como estas matrices carecen de la ultraestructura 3D y propiedades bioquímicas de matrices nativas de los mamíferos, una nueva tecnología permite el entrecruzamiento de dominios peptídicos con reconocida función biológica como por ejemplo Arg-Gli-Asp de la fibronectina y Val-Pro-Val-Gli-Val de la elastina que promueven la adhesión celular y de factores de crecimiento a esas matrices. También es posible entrecruzar sustratos para la plasmina, ciertas mataloproteasas y péptidos de adhesión celular para controlar la migración de fibroblastos o células endoteliales. Además, los hidrogeles al tener ≥ 30% de hidratación permiten incorporarles factores de crecimiento tales como la proteína morfogénica de hueso y el factor de crecimiento vascular endotelial que pueden

ser liberados en el sitio a reparar36. En otros protocolos, estos andamios extracelulares son a menudo “re-celulados” con CM previo a su implante para aceleran el proceso de curación38. El avance en el conocimiento de los biomateriales y la tecnología asociada a ella ha permitido el desarrollo de la ingeniería de tejidos funcionales y la incipiente organogénesis39,40. 5.2. “In situ” inducción de células CM y/o progenitoras. Los factores neuronales de transcripción Ascl1 Brn2 y Myt1l que se caracterizan por estar involucrados en el desarrollo, compromiso y diferenciación neuronal, son capaces orquestadamente de reprogramar fibroblastos en neuronas inducidas41. En esos experimentos pre-clínicos se detecta una sub-población expresando nectina, un indicador de célula troncal del sistema nervioso central42. Recientemente, con la ayuda de un nanochip fue posible introducir por electroporación los genes para esos 3 factores de transcripción directamente en la piel de ratones y se pudo obtener neuronas inducidas expresando β-tubulina neurona específica Clase III y neurofilamento. En similares condiciones experimentales fue posible reprogramar células de la piel usando los factores de transcripción Etv2, Foxc2 y Fli1 para obtener células endoteliales inducidas, preferentemente de origen dermal, y que fueron capaces de prevenir la necrosis en tejido isquémico43. Esta tecnología tiene la ventaja de ser no invasiva, su efecto puede alcanzar la dermis y está exenta de un régimen farmacológico. Se preparan ensayos clínicos en humanos. 5.3. Uso de células frescas o expandidas El tejido adiposo subcutáneo obtenido por liposucción puede ser utilizado como fuente de células regenerativas y que tienen un amplio uso en medicina de reemplazo. El Celution® System, aprobado por la FDA para


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su uso en clínica, proporciona un protocolo que permite el aislamiento de una subpoblación heterogénea de células que contiene alrededor de 2% de CM mesenquimales y que puede ser usado para colonizar un tejido ya sea por perfusión o inyección. Se ha determinado que la fracción vascular estromal del tejido adiposo contiene una gran cantidad de CM mesenquimales por lo que no se requiere su expansión previa “in vitro” 44. Estas células frescas han sido largamente usadas en trasplantes autólogos mediante ensayos preclínicos y clínicos en patologías tales como isquemia miocárdica crónica o aguda, isquemia renal, hipertensión pulmonar, lesión al hueso y al disco intervertebral, regeneración nervio periférico y cicatrización de heridas, reconstitución de senos, úlceras cutáneas refractarias derivadas de la exposición local a la radiación, relleno en cirugía plástica-estética facial y fístulas cripto-glandulares45,46. Carticel es otro método aprobado en 2017 por la FDA para su uso en clínica que se usa para reparar superficies de articulaciones de rodilla. Este procedimiento requiere la disección de una porción de cartílago sano del paciente para obtener condrocitos en dispersión que deben ser cultivadas “in vitro” (expansión) bajo condiciones apropiadas de cultivo. Una vez que se obtiene una cantidad adecuada de estas células se inyectan de vuelta en el paciente sobre un parche periosteal o matriz extracelular en la lesión del cartílago, con la ayuda de un pegamento en base a Fibrina47. 5.4. Células madre en tejidos fabricados “in vitro” Apligraf® es una tecnología bioterapéutica de cicatrización de heridas que fue aprobada 1998 por la FDA para su uso clínico y posteriormente por países tales como Canadá, México, Arabia Saudí, Kuwait, Sudáfrica, Singapur y Suiza. Apligraf consiste

en un dispositivo biológico fabricado a partir de Colágeno tipo I de bovino con fibroblastos y queratinocitos provenientes de prepucio neonatal; como estos 3 componentes provocan poca reactividad antigénica hacen que esta técnica terapéutica no presente en los pacientes reacciones inmunes adversas de consideración. Esta piel de reemplazo no contiene melanocitos, folículos pilosos, glándulas sudoríparas, ni vasos sanguíneos. Su uso está indicado para el tratamiento de la piel dañada en úlceras venosas de la pierna y úlceras del pie diabético que no hayan respondido adecuadamente a la terapia convencional48,49. La arquitectura de este dispositivo consiste en una capa de colágeno donde se incorporan los fibroblastos, que al crecer en cultivo reabsorberán el colágeno inicial formando su propia matriz extracelular y se encargarán de replicar la dermis de la piel artificial. Luego, sobre esta estructura tisular se siembran los queratinocitos para formar la epidermis del injerto artificial. Es posible que a través de esta tecnología se puedan obtener injertos autólogos, a partir de queratinocitos y fibroblastos propios del paciente50. Otros métodos de piel artificial usados en la clínica son Dermagraft, una dermis que se obtiene con cultivo de fibroblastos dérmicos neonatales en un andamio que consiste en una malla de poliglactina bio-degradable51 y Epicel que equivale a un injerto epidérmico autólogo manufacturado con queratinocitos proveniente del paciente co-cultivados sobre un césped de fibroblastos 3T3 mitóticamente arrestados; una vez obtenida el tejido estratificado, este se desprende enzimáticamente con la ayuda de una de gasa de petrolatum como soporte para dejar su lado basal desnudo52. Como las células 3T3 son una línea celular derivada de embrión de ratón, este último tipo de procedimiento clínico es considerado como un xenoinjerto. 5.5 Degeneración macular dependiente de la edad y CMPi


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La mácula es una región de la retina con una alta condensación de foto-receptores tanto de conos como bastones, encargada de la visión central importante para la lectura, manejo de auto y reconocimiento facial. La Degeneración macular (DM) es una enfermedad que se debe a la muerte progresiva de estos receptores cuando las células del epitelio retinal pigmentado (ERP) adyacente dejan de proporcionarles nutrientes y no eliminan sus desechos. El reemplazo por ERP sano en pacientes con DM está facilitado por el hecho que esta interacción tisular no requiere de sinapsis. Como se disponen de una variedad de protocolos confiables para la obtención de CMPi, en la diferenciación y manufactura de ERP hacen posible su uso en terapia regenerativa53,54,55. En Japón, un paciente ha sido tratado con un injerto de ERP construido con CMPi derivadas de fibroblastos de su propia piel, y que detuvo la progresión de la enfermedad56. En este caso clínico, los fibroblastos del paciente fueron inducidos por la electroporación con 2 vectores episomales no-integrativos conteniendo los genes de 5 inductores: los factores de transcripción GLIS1, L-MYC, SOX2, KLF4, OCT3/4. Luego, estas células se diferenciaron “in vitro” en células epiteliales pigmentadas de la retina para luego obtener ERP. Los análisis previos de estas células inducidas que se usaron en la confección de los injertos cumplieron altos estándares biomédicos previo su uso clínico, tales como cariotipo normal y estable, ausencia de inserción cromosomal del material episomal demostrada por secuencia total del genoma, ausencia de episomales extra-cromosomales en base a la técnica de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), no poseer potencial tumorigénico en ratas inmune-deficientes, expresión de marcadores típicos de CM embrionarias confirmados por inmuno-citoquímica, ausencia de una variedad de

patógenos (detectados por PCR y test virales), entre otros ensayos. Para el procedimiento clínico se usaron injertos con más del 95% de células pigmentadas. En mayo de 2018 el gobierno de Japón aprobó el uso de CMPi en pacientes con cardiomiopatías y que será realizada por un equipo encabezado por el profesor de Cardiología Dr. Yoshiki Sawa de la Universidad de Osaka, siendo la primera intervención clínica de este tipo en el mundo. El procedimiento consistirá en adherir al corazón de tres pacientes con miocardiopatía isquémica una lámina de músculo cardíaco diseñado a partir de células inducidas57. 5.6. Epidermólisis ampollosa juntural y Terapia Génica. La gran ventaja que tiene la terapia de reemplazo autóloga es que previene el rechazo del injerto mediado por el sistema inmune, ya que este último lo reconoce como propio. En la Terapia Génica las CMPi se usan como sustrato celular para incorporar o reemplazar un gen mutado o ausente, responsable de una enfermedad hereditaria monogénica, por su equivalente funcional. La Epidermólisis ampollosa juntural es una enfermedad hereditaria mendeliana con un patrón de transmisión autosómico recesivo que puede llegar a ser letal y que es provocada por mutaciones ya sea en uno de los tres genes que codifican para la proteína heterotrimérica Laminina-332 (conocida como Laminina 5, componente esencial de la membrana basal de la epidermis) o en genes que codifican para el colágeno XVII (proteína transmembranal involucrada en los hemidesmosomas) o para las integrinas α6β4 (receptor transmembranal de la Laminina 322). Para el caso de la Laminin-332, si la mutación provoca ausencia total de esta proteína, su efecto es letal y los portadores mueren a temprana edad. Por otro lado, si la


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mutación permite una cantidad deficiente de la Laminin-332 los portadores presentarán un cuadro clínico severo donde sufrirán de ampollas y erosiones en la piel y mucosa, que comienzan en la lámina lúcida de la membrana basal de esos tejidos y que son producidas ante el menor trauma58. Un paciente grave de 7 años de edad con Epidermólisis ampollosa juntural portador de una mutación en la subunidad β3 de la laminina322 fue intervenido usando sus propios queratinocitos, pero modificados genéticamente con la versión silvestre del gen para revertir los estragos de la mutación59. Con el cultivo de estos keratinocitos transgénicos se pudo manufacturar piel autóloga que se usó para reparar la piel dañada. El procedimiento se inició con la obtención de keratinocitos a partir de una biopsia de piel sana del paciente. Estas células fueron transducidas con un vector retroviral portando el ADN complementario para la subunidad β3 de la Laminina de 3.6 Kb de largo necesario bajo el control de MLV LTR. Análisis molecular por asociación del genoma completo (GWA por su siglo en inglés) indicó que el vector recombinante fue capaz de integrarse 1 a 3 copias por genoma dependiendo del holoclón (CM) analizado. Luego, los queratinocitos transgénicos fueron crecidos sobre un césped de fibroblastos 3T3-J2 mitóticamente inactivos por radiación y que sirven como alimentadores del cultivo de queratinocitos. Una vez que el cultivo alcanzó la confluencia, el epitelio transgénico fue enzimáticamente desprendido con Dispasa II y recolectado con la ayuda de una gasa no adherente de tal manera que su lado basal quede al desnudo para su posterior uso. Otra manera de obtener estos epitelios fue cultivando los queratinocitos sobre las células 3T3-J2 en un gel de fibronectina para promover la adhesión celular. En total se ocuparon 0,89 m2 de estos epitelios transgénicos para reparar un área del paciente equivalente al 80% de su superficie

corporal. Al tiempo de remisión del paciente se logró una puntuación de 12 en el instrumento de iscorEB. Si bien es cierto que al inicio de este protocolo se detectaron miles de distintos sitios de integración del vector recombinante ya sea en meroclones, paraclones (progenitores transitorios) y holoclones, la piel regenerada después de 8 meses mostró que fue mantenida sólo por CM, ya que el número de diferentes inserciones se redujo considerablemente a aquellas detectadas en los holoclones (CM) iniciales. VI. AVANCES EN INDUCCIÓN DE PLURIPOTENCIA CON IMPACTO EN LA CLÍNICA En rigor una CMPi se comporta como una CM embrionaria ya sea por su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo celular derivado de las 3 líneas germinales, presentar auto-renovación más allá del límite de Hayflick, capaz de formar colonias en cultivo, mostrar una naturaleza clonogénica, generar animales quiméricos, presentar antígenos propios de las CM embrionarias, poseer alta actividad de Telomerasas, entre otras características. El uso de CMPi en la clínica regenerativa tiene la ventaja que pueden ser obtenidas del propio paciente evitando reacciones inmune adversas y al no tener objeciones por regulaciones éticas (por prescindir de células embrionarias) permite su acelerado desarrollo experimental y su posterior traslación en la práctica médica. Los experimentos pioneros en la inducción de pluripotencia de células fetales o adultas abrieron una nueva avenida para la Medicina Regenerativa, sobre todo en aquellos tejidos donde la capacidad regenerativa es casi inexistente60; sin embargo, el uso del oncogén c-MYC entre los factores inductores, hacen de este protocolo no recomendable para su uso clínico por los riesgos genéticos implicados.


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En la actualidad se dispone de un protocolo para obtención de CMPi que no requiere del factor c-MYC61. Por otro lado, la transducción con los genes inductores se puede realizar por transfección a través del uso de vectores episomales no integrativos62,63 y la electroporación que son métodos menos invasivos. La transfección con elementos genéticos “extras-cromosomales” no integrativos evita inserciones no deseables en genes esenciales para la célula huésped y como el efecto inductor de los factores de transcripción se requieren en forma transitoria es posible seleccionar CMPi carentes de esos elementos extra-cromosomales, ya sea confirmados mediante PCR y secuenciación del genoma humano, una vez establecida la inducción de la pluripotencia56. Más aún, el uso de un medio de cultivo químicamente definido permite la obtención de estas células en ausencia de sueros fetales heterólogos, como también prescindir de células sostenedoras o alimentadoras, evitándose así reacciones inmune adversas y contaminación cruzada con elementos celulares no deseados62, lo que implica mejores ventajas clínicas comparado con los protocolos iniciales. Frente a los posibles efectos genotóxicos que los protocolos de inducción de pluripotencia en células diferenciadas puedan ofrecer64, otras metodologías se han desarrollado y que prometen mayor seguridad para su uso en clínica. Se ha demostrado que para la inducción de pluripotencia en fibroblastos embrionarios sólo basta con las proteínas de los 4 factores de transcripción re-programadores: Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc. Para ello se construyeron esas proteínas inductoras fusionadas a un poli-arginina en el C-terminal, producidas en bacterias mejoradas con mecanismos post-transduccionales similares a eucariontes. El poli-arginina es un péptido que facilita la penetración a través de la membrana celular y permite que esos factores de transcripción cumplan su rol dentro del núcleo de esas

células así tratadas65. Este último procedimiento no deja huella genética exógena. La presencia de las proteínas reprogramadoras es transitoria, con un tiempo suficiente para inducir la pluripotencia, pues eventualmente las proteínas serán degradadas. Por último, cabe notar que se requiere perfeccionar estos nuevos protocolos para la inducción de la pluripotencia ya que por lo general se compromete negativamente el rendimiento de la técnica en términos del número de unidades formadoras de colonias. VII. CONCLUSIONES Los humanos poseen una capacidad limitada para regenerar tejidos y órganos. Los mecanismos regenerativos naturales se consiguen a través de la activación de las CM por señales del nicho en que encuentran o bien por una dediferenciación donde células diferenciadas revierten a un estado menos diferenciados, manteniendo su linaje, para poder proliferar antes de re-diferenciarse. En la actualidad, sabemos que las CM se caracterizan por su capacidad de auto-renovarse, extensivo potencial proliferativo, carácter clonogénico, propiedades celulares, moleculares y ontogénicas únicas. Se disponen de técnicas que permiten su purificación y/o concentración, condiciones de cultivo para mantener su troncalidad o provocar su diferenciación en un determinado linaje. Recientes avances biomédicos permiten restaurar la pluripotencia en células diferenciadas por medio de un protocolo de re-programación, la inducción de la dediferenciación celular a un estado progenitor del mismo linaje sin comprometer una pluripotencia e incluso provocar que un tipo de célula se transforme otra por medio de la transdiferenciación, aunque no siempre se requiere una dediferenciación a un estado pluripotente para este último mecanismo66. En este último caso, la transversión celular


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puede ocurrir de un tipo celular a otro de un mismo linaje embrionario (de célula exocrina a una endocrina) o bien a uno diferente (fibroblastos a neuronas)67. Sin duda, la reprogramación de la pluripotencia ha abierto una avenida prometedora para la Medicina Regenerativa y Terapia Génica principalmente porque está permitiendo el uso de material biológico autólogo. Finalmente, la aplicación de matrices de diferentes naturalezas no solo ha facilitado la práctica médica sino también promete avances en la incipiente organogénesis. VIII. REFERENCIAS

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Este artículo se cita de la siguiente manera:

Villanueva J. Células Madre y Medicina de Reemplazo Celular. Rev. Actuali. Clinic. Meds. Vol. 2.

Num 2, Julio-Diciembre (2018). ISSN 0719-8620, pp 6-25.

Las opiniones, análisis, resultados y conclusiones del autor son de su exclusiva responsabilidad y

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