ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

COLONIZACIÓN MICORRÍCICA POR HONGOS VESÍCULO ARBUSCULARES EN HYPERICUM, Y

CONTROL DEL NEMATODO NODULADOR Meloidogyne incognita.

PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE:

INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

ELABORADO POR:

ERIKA GABRIELA CARVAJAL PORRAS

SANGOLQUÍ, 10 de junio de 2009

iii

DEDICATORIA

A mi familia:

A Matilde y Jorge mis padres, a Patricio mi hermano y mi tío Raúl, porque ellos han infundido en mi el espíritu del estudio y comparten conmigo la alegría y la

satisfacción de materializar este sueño, ya que esto también les pertenece porque son parte escencial de mi vida.

Erika G. Carvajal P.

iv

AGRADECIMIENTO

Siempre que se avanza en el camino de la vida, es necesario agradecer a quienes nos han acompañado para descubrir sus huellas al lado de las

nuestras en ese trecho.

Este trabajo ha sido posible gracias a la oportunidad que me brindara la empresa Hilsea Investments donde realicé la parte experimenta, muy

especialmente al Ing. Pablo Viteri y a la Dra. María Laban a más de todo el equipo del Laboratorio de Diagnóstico y Biopropagación.

También quero agradecer por al entusismo y el apoyo de mi familia y muy especialmente el esfuerzo de mis padres Matilde y Jorge y mi hermano Patricio

a quienes quiero expresar mi más sentida gratitud.

Por otro lado no puedo dejar de mencionar el apoyo incondicional de mis tios Angélica y Marco Antonio, Raúl, Herminia y a mis primos Xime, Nelly,

Sebastian, Rommel y Marco.

A la Msc. Alma Koch, Dra. Karina Proaño y al Ing. Gabriel Suárez profesores de la Escuela Politécnica del Ejército, quienes con paciencia han revisado en varias ocasiones esta tesis y con sus atinados comentarios han contribuído a

mejorarla.

Erika G. Carvajal P.

v

ÍNDICE DE CONTENIDOS

Dedicatoria ......................................................................................................... iii

Agradecimiento .................................................................................................. iv

Índice de contenidos ........................................................................................... v

Índice de cuadros ................................................................................................ x

Índice de tablas .................................................................................................. xi

Índice de figuras ............................................................................................... xiii

Índice de anexos .............................................................................................. xix

Resumen ......................................................................................................... xxii

Abstract ........................................................................................................... xxiii

CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN .......................................................................... 1

1.1 Formulación del problema.......................................................................... 1

1.2 Justificación del problema .......................................................................... 3

1.3 Objetivos de la investigación ...................................................................... 4

1.4 Marco teórico ............................................................................................. 5

1.4.1 Las Micorrizas ..................................................................................... 5

1.4.1.1 Clasificación de las micorrizas ......................................... 5

1.4.1.2 Micorrizas vesículo arbusculares (VAM) .......................... 8

1.4.1.3 Factores que afectan el crecimiento de los hongos

vesículo arbusculares ..................................................... 11

1.4.2 Hypericum ......................................................................................... 12

1.4.2.1 Clasificación taxonómica y descripción botánica ............ 13

1.4.2.2 Importancia económica .................................................. 14

1.4.2.3 Cultivo de Hypericum en campo ..................................... 14

vi

1.4.2.4 Manejo del cultivo ........................................................... 16

1.4.3 Patógenos que atacan el cultivo de Hypericum ................................. 17

1.4.3.1 Roya (Puccinia sp.) ........................................................ 18

1.4.3.2 Gusano trozador (Agrotis ipsilon) ................................... 19

1.4.3.3 Nematodos fitopatógenos ............................................... 20

CAPÍTULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................... 26

2.1 Participantes ............................................................................................ 26

2.2 Descripción del lugar ............................................................................... 26

2.3 Periodo de tiempo de investigación ......................................................... 27

2.4 Diseño estadístico de las fases de la investigación ................................. 28

2.4.1 Micorrización de plantas de Hypericum ............................................ 28

2.4.2 Interacción con Meloidogyne incognita ............................................. 30

2.4.3 Sistema de hipótesis ........................................................................ 33

2.4.3.1 Micorrización de plantas de Hypericum ......................... 33

2.4.3.2 Interacción con Meloidogyne incognita .......................... 33

2.5 Materiales y métodos ............................................................................... 34

2.5.1 Micorrización de plantas de Hypericum ............................................. 34

2.5.1.1 Aislamiento de la micorriza nativa ................................. 34

2.5.1.2 Propagación de la micorriza nativa para la multiplicación de la micorriza .......................................... 37

2.5.1.3 Cultivo de Hypericum .................................................... 40

2.5.1.4 Manejo del cultivo de Hypericum ................................... 42

2.5.2 Interacción con Meloidogyne incognita ............................................. 43

2.5.1.2 Inoculación del nematodo nodulador

Meloidogyne incognita .................................................... 37

2.6 Análisis de datos ...................................................................................... 44

vii

2.6.1 Micorrización de plantas de Hypericum ............................................. 44

2.6.1.1 Altura de plantas de Hypericum .................................... 44

2.6.1.2 Peso de raíz de plantas de Hypericum .......................... 44

2.6.1.3 Colonización de la micorriza nativa y las micorrizas de la formulación comercial en plantas de Hypericum .... 44

2.6.1.4 Conteo de esporas de micorriza en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum ..................................................... 45

2.6.2 Interacción con Meloidogyne incognita .............................................. 45

2.6.2.1Índice de agallamiento del sistema radicular de plantas de Hypericum. ..................................................... 45

2.6.2.2 Conteo de nematodos de Meloidogyne incognita en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum .................... 46

2.6.2.3 Conteo de esporas de micorriza en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita ................................................... 47

2.6.2.4 Colonización de la micorriza nativa y las micorrizas de la formulación comercial en plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita ........................................................................ 47

2.6.2.5 Longitud de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita. ............................ 48

2.6.2.6 Peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita ............................. 48

2.6.2.7 Altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita .................................................. 48

CAPÍTULO 3 RESULTADOS .......................................................................... 49

3.1 Micorrización de Plantas de Hypericum ................................................... 49

3.1.1 Altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial .......... 49

3.1.2 Peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ........................................................................................... 51

viii

3.1.3 Colonización micorrícica en raíces de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ..................................................................... 53

3.1.4 Número de esporas en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ........................................................................ 55

3.1.5 Caracterización morfológica de la micorriza nativa .......................... 57

3.2 Interacción con Meloidogyne incognita ................................................... 57

3.2.1 Índice de agallamiento del sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ................. 57

3.2.2 Número de nematodos de Meloidogyne incognita en el suelo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ........................................................................ 61

3.2.3 Número de esporas de micorriza nativa y de micorrizas de la formulación comercial en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum en presencia o no de Meloidogyne incognita .................................... 65

3.2.4 Colonización de la micorriza nativa y micorrizas de la formulación la formulación comercial en las raíces de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita ..................................... 69

3.2.5 Longitud de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial y la presencia o no de Meloidogyne incognita .......................................... 73

3.2.6 Peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial y la presencia o no de Meloidogyne incognita ......................................... 77

3.2.7 Altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ....................................................................... 81

CAPÍTULO 4 DISCUSIÓN ................................................................................ 85

4.1 Micorrización de Plantas de Hypericum ................................................... 85

4.1.1 Altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial .......... 85

4.1.2 Peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ........................................................................................... 86

ix

4.1.3 Colonización micorrícica en raíces de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ..................................................................... 87

4.1.4 Número de esporas en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial ........................................................................ 88

4.1.5 Caracterización morfológica de la micorriza nativa .......................... 89

4.2 Interacción con Meloidogyne incognita .................................................... 91

4.2.1 Índice de agallamiento del sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ................. 92

4.2.2 Número de nematodos de Meloidogyne incognita en el suelo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ........................................................................ 93

4.2.3 Número de esporas de micorriza nativa y de micorrizas de la formulación comercial en el suelo de cultivo de plantas de Hypericum en presencia o no de Meloidogyne incognita .................................... 94

4.2.4 Colonización de la micorriza nativa y micorrizas de la formulación la formulación comercial en las raíces de plantas de Hypericum bajo la aplicación de Meloidogyne incognita ..................................... 95

4.2.5 Longitud de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita .......................................... 96

4.2.6 Peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ......................................... 97

4.2.7 Altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de micorriza nativa y micorrizas de la formulación comercial, y la presencia o no de Meloidogyne incognita ....................................................................... 97

CAPÍTULO 5 CONCLUSIONES ...................................................................... 99

CAPÍTULO 6 RECOMENDACIONES ............................................................ 101

CAPÍTULO 7 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................... 102

ANEXOS ......................................................................................................... 109

x

ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO 2.3 ..................................................................................................... 43

Dosis de fertilización para el cultivo de Hypericum.

CUADRO 2.4 ..................................................................................................... 46

Escalas del índice de agallamiento en raíces atacadas por Meloidogyne spp

CUADRO 2.5 ..................................................................................................... 47

Escala de Meloidogyne en suelo y rangos de infestación.

xi

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA 2.1 ......................................................................................................... 28

Tratamientos de la fase de Micorrización.

TABLA 2.2 ......................................................................................................... 31

Tratamientos de la fase de Interacción con Meloidogyne incognita.

TABLA 3.1 ......................................................................................................... 49

Análisis de varianza para altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial. Hilsea, Pichincha, El Quinche, 2009.

TABLA 3.2 ......................................................................................................... 51

Análisis de varianza para peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial. Hilsea, Pichincha, El Qunche, 2009.

TABLA 3.3 ......................................................................................................... 53

Análisis de varianza para porcentaje de colonización en raíces de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial. Hilsea, Pinchincha, El Quinche, 2009.

TABLA 3.4 ......................................................................................................... 55

Análisis de varianza para número de esporas en suelo usado como sustrato para plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial. Hilsea, Pichincha, El Quinche, 2009.

TABLA 3.5 ......................................................................................................... 57

Análisis de varianza para el índice de agallamiento en el sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Transformación 1+x . Hilsea, El Quinche,Quito, Pichincha 2009.

xii

TABLA 3.6 ......................................................................................................... 61

Análisis de varianza para el número de nematodos en el suelo de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Transformación 1+x . Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

TABLA 3.7 ......................................................................................................... 65

Análisis de varianza para el número de esporas en el suelo de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita, transformación .Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

TABLA 3.8 ......................................................................................................... 69

Análisis de varianza para el porcentaje de colonización en el sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

TABLA 3.9 ......................................................................................................... 73

Análisis de varianza para la longitud de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculo de micorrizas y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

TABLA 3.10 ....................................................................................................... 77

Análisis de varianza para el peso de raíz de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

TABLA 3.11 ....................................................................................................... 81

Análisis de varianza para la altura de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorrizas y la presencia o no del nematodo nodulador Meloidogyne incognita. Hilsea, El Quinche, Quito, Pichincha 2009.

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1.1 ......................................................................................................... 6 Raíz con presencia de hifas y vesículas, colonizada por hongos formadores de micorrizas vesículo arbusculares.

FIGURA 1.2 ......................................................................................................... 7

Clasificación del Phylum Glomeromycota de los hongos vesículo arbusculares.

FIGURA 1.3 ......................................................................................................... 8

Esporas nativas de Glomus extraídas del suelo de a) cultivos trampa de Brachiaria y b) plantas de Hypericum. FIGURA 1.4 ....................................................................................................... 13

Planta de Hypericum variedad Chocolate.

FIGURA 1.5 ....................................................................................................... 15

Armado de camas para cultivo de plantas de Hypericum en campo. FIGURA 1.6 ....................................................................................................... 18

Hoja de Hypericum atacada por Roya, con presencia de pústula.

FIGURA 1.7 ....................................................................................................... 19

Ciclo de vida de Agrotis ípsilon.

FIGURA 1.8 ....................................................................................................... 20

Larva de Agrotis ípsilon.

FIGURA 1.9 ....................................................................................................... 22

Juvenil del nematodo agallador Meloidogyne incognita.

xiv

FIGURA 1.10 ..................................................................................................... 22

Raíces agalladas por ataque de Meloidogyne spp.

FIGURA 1.11 ..................................................................................................... 27

Laboratorio de Diagnóstico y Biopropagación de Hilsea en la Finca El Chivan.

FIGURA 1.12 ..................................................................................................... 29

Distribución de tratamientos de la fase de micorrización.

FIGURA 2.3 ....................................................................................................... 32

Distribución de tratamientos de la fase de interacción con Meloidogyne incognita.

FIGURA 2.4 ....................................................................................................... 37

Raíces de plantas de pasto silvestre en el proceso de tinción con azul de tripan para observación de hongos micorricicos albusculares.

FIGURA 2.5 ....................................................................................................... 38

Plantas de pasto silvestre y preparación del inóculo nativo para la propagación de micorrizas en cultivos trampa.

FIGURA 2.6 ....................................................................................................... 39

a) Potes con suelo estéril, b) semillas desinfectadas y c) establecimiento de cultivos trampa.

FIGURA 2.7 ....................................................................................................... 39

Corte de tallos de los cultivos trampa a las 16 semanas de siembra para obtención del inóculo nativo de plantas de Hypericum.

FIGURA 2.8 ....................................................................................................... 40

Invernadero del Laboratorio de Diagnóstico y Biopropagación donde se llevó a cabo el ensayo.

xv

FIGURA 2.9 ....................................................................................................... 41

Potes con inóculo nativo obtenido de los cultivos trampa para sustrato de las plantas de Hypericum.

FIGURA 2.10 ..................................................................................................... 41

Potes con plántulas de Hypericum variedad Chocolate y distribución de los tratamientos en invernadero.

FIGURA 2.11 ..................................................................................................... 42

Formulación comercial de micorrizas y preparación del inóculo para aplicación en plántulas de Hypericum a los 8 días de siembra.

FIGURA 3.1 ....................................................................................................... 50

Efecto de la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial sobre la altura de plantas de Hypercum durante las 16 primeras semanas después de la inoculación.

FIGURA 3.2 ....................................................................................................... 52

Efecto de la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial sobre el peso de la raíz en plantas de Hypericum durante las 16 primeras semanas después de la inoculación.

FIGURA 3.3 ....................................................................................................... 54

Porcentaje de colonización en raíces de plantas de Hypericum durante las 16 primeras semanas después de la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial.

FIGURA 3.4 ....................................................................................................... 56

Esporulación en suelo de plantas de Hypericum bajo la aplicación de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial, durante las 16 primeras semanas después de la inoculación.

FIGURA 3.5 ....................................................................................................... 58

Índice de agallamiento del sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial evaluadas a la cosecha.

xvi

FIGURA 3.6 ....................................................................................................... 59

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre el índice de agallamiento en el sistema radicular de plantas de Hypericum evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.7 ....................................................................................................... 60

Índice de agallamiento en el sistema radicular de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.8 ....................................................................................................... 62

Número de nematodos de Meloidogyne incognita en el suelo de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial en cuatro evaluaciones después de su inoculación.

FIGURA 3.9 ....................................................................................................... 63

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre su población en el suelo de plantas de Hypericum, en cuatro evaluaciones después de su inoculación.

FIGURA 3.10 ..................................................................................................... 64

Número de nematodos de Meloidogyne incognita en el suelo de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo en cuatro evaluaciones después de su inoculación.

FIGURA 3.11 ..................................................................................................... 66

Número de esporas en el suelo de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza en cuatro evaluaciones después de la inoculación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita.

FIGURA 3.12 ..................................................................................................... 67

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre el número de esporas en el suelo de plantas de Hypericum, en cuatro evaluaciones después de su inoculación.

xvii

FIGURA 3.13 ..................................................................................................... 68

Número de esporas en el suelo de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita en cuatro evaluaciones después de su inoculación.

FIGURA 3.14 ..................................................................................................... 70

Porcentaje de colonización del sistema radicular de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.15 ..................................................................................................... 71

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre el porcentaje de colonización en el sistema radicular de plantas de Hypericum evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.16 ..................................................................................................... 72

Porcentaje de colonización en el sistema radicular de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.17 ..................................................................................................... 74

Longitud de la raíz de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.18 ..................................................................................................... 75

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre la longitud de la raíz de plantas de Hypericum evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.19 ..................................................................................................... 76

Longitud de la raíz de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.20 ..................................................................................................... 78

Peso de la raíz de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial evaluadas a la cosecha.

xviii

FIGURA 3.21 ..................................................................................................... 79

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre el peso de la raíz de plantas de Hypericum evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.22 ..................................................................................................... 80

Peso de la raíz de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.23 ..................................................................................................... 82

Altura de plantas de Hypericum bajo la presencia de dos tipos de inóculos de micorriza: inóculo nativo y formulación comercial evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.24 ..................................................................................................... 83

Efecto de la aplicación del nematodo nodulador Meloidogyne incognita sobre la altura de plantas de Hypericum evaluadas a la cosecha.

FIGURA 3.25 ..................................................................................................... 84

Altura de plantas de Hypericum bajo el efecto conjunto: inóculos de micorriza e inóculo del nematodo nodulador Meloidogyne incognita evaluadas a la cosecha.

xix

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO A ........................................................................................................ 109

Plantas de Hypericum en invernadero a) a las cuatro semanas y b) a las veinte semanas de siembra

ANEXO B ........................................................................................................ 110

Plantas de Hypericum al final de la primera fase: Fase de micorrización. Tratamientos a) T1: Testigo, b) T2: Inóculo nativo, c) T3: Inóculo comercial

ANEXO C ........................................................................................................ 111

Raíces con presencia de hifas, vesículas y arbúsculos como resultado de la micorrización de Glomus clarum, Glomus etunicatum y Glomus manihotis, extraído de la colección INVAM.

ANEXO D ........................................................................................................ 112

Esporas de Glomus etunicatum, Glomus manihotis, y Glomus intraradices, extraídas de la colección INVAM.

ANEXO E ........................................................................................................ 113

Raíces con presencia de hifas y vesículas observadas al microscopio por tinción con azul de tripán, al final de la primera y segunda fase del ensayo: a) planta silvestre, b) Brachiaria, cultivo trampa, c), d), e) y f) Hypericum inoculadas con micorriza nativa

ANEXO F1 ...................................................................................................... 114

Esporas aisladas del suelo de a) plantas silvestres obtenidas, b) cultivos trampa inoculados con raíces y suelo de las plantas silvestres, c), d), e), f), g) y h) plantas de Hypericum inoculadas con micorriza nativa. ANEXO F2 ...................................................................................................... 115

Esporas aisladas del sustrato de plantas de Hypericum inoculadas con: e), f), g) y h) micorriza nativa.

xx

ANEXO G ........................................................................................................ 116

Raíces de plantas de Hypericum inoculadas con una formulación comercial de hongos formadores de micorrizas vesículo arbusculares; teñidas con azul de tripán y con presencia de hifas.

ANEXO H ........................................................................................................ 117

Esporas aisladas del sustrato de plantas de Hypericum inoculadas con una formulación comercial de hongos formadores de micorrizas vesículo arbusculares.

ANEXO I1 ....................................................................................................... 118

Raíces de plantas de Hypericum al final de la segunda fase de interacción con Meloidogyne incognita. a) T1: Testigo, sin micorriza, sin nematodod, b) T2: Solo nematodo, raíz completamente agallada.

ANEXO I2 ....................................................................................................... 119

Raíces de plantas de Hypericum al final de la fase de interacción con Meloidogyne incognita. c) T3: Inóculo nativo, raíz con gran cantidad de raicillas y mayor longitud, d) T4: Inóculo nativo + nematodo, raíz con un grado mínimo de agallamiento y un gran desarrollo.

ANEXO I3 ....................................................................................................... 120

Raíces de plantas de Hypericum al final de la fase de interacción con Meloidogyne incognita. e) T5: Inóculo comercial, raíz con presencia regular de raicillas pero poco desarrollada, f) T6: Inóculo comercial + nematodo, raíz con pobre presencia de raicillas y agallada por ataque del nematodo Meloidogyne incognita.

ANEXO J ......................................................................................................... 121

Raíces de Hypericum infestadas por Meloidogyne incognita, con un a) alto índice de agallamiento y b) pudrición general.

ANEXO K ........................................................................................................ 122

Estadíos de Meloidogyne observados durante el análisis de las raíces y suelo de Hypericum a) Huevos de Meloidogyne incognita, b) Hembra de Meloidogyne incognita en raíces agalladas de Hypericum, c) J2 de Meloidogyne incognita en muestra de suelo, observados al microscopio.

xxi

ANEXO L1....................................................................................................... 123

Tallos de plantas de las Hypericum a la cosecha. a) Testigo, b) Con nematodos.

ANEXO L2....................................................................................................... 124

Tallos de plantas de las Hypericum a la cosecha. c) Inóculo nativo, d) Inóculo nativo + nematodo.

ANEXO L3....................................................................................................... 125

Tallos de plantas de las Hypericum a la cosecha. e) Inóculo comercial, f) Inóculo comercial + nematodo.

ANEXO M........................................................................................................ 126

Plantas de Hypericum inoculadas con el nematodo agallador Meloidogyne incognita, con síntomas de marchitamiento general.

xxii

RESUMEN

La incorporación de microorganismos en la agricultura como manejo ecológico

que sustituye a productos químicos, se ha convertido en una de las principales

formas para el mejoramiento de los cultivos del área florícola en aras de la

producción de flores con calidad de exportación. Por esta razón, la aplicación

de microorganismos benéficos como los hongos formadores de micorrizas

vesiculo arbusculares (VAM), se ha realizado en plantas de Hypericum en la

finca Hilsea. El propósito de esta investigación son, en primer lugar, comprobar

la capacidad de los hongos para colonizar las raíces de las plantas y

posteriormente su capacidad de control del nematodo nodulador Meloidogyne

incognita. Se llevó a cabo dos fases, la primera de Micorrización y la segunda

de Interacción con Meloidogyne incognita. En la Micorrización se utilizó dos

tipos de inóculo: hongos micorrícicos nativos del género Glomus y una

formulación comercial de micorrizas del mismo género. Previamente se

establecieron cultivos trampa con plantas de Brachiaria como principal

hospedera, pero además se utilizó plantas de avena y plantas de arveja. En la

segunda fase, una vez micorrizadas las plantas de Hypericum se inoculó

nematodos de Meloidogyne. Durante el proceso, se realizó un análisis de

varianza y la prueba de Duncan al 5% para las variables estudiadas en ambas

fases. Después de 16 semanas al final de la primera fase, las plantas de

Hypericum, mostraron resultados favorables de micorrización. La colonización

de la micorriza nativa fue altamente significativa en comparación con la

colonización de la formulación comercial. Al final del ciclo, en la segunda fase,

se observó que el índice de agallamiento de raíces fue menor con el inoculo

nativo que con el comercial y se obtuvo una mejor colonización con la micorriza

nativa. La longitud de raíz, peso de raíz y altura de la planta fue mayor en las

plantas micorrizadas que en las plantas testigo. Es importante resaltar que esta

investigación apoya la idea que el uso de microorganismos nativos es mejor

que el uso de microorganismos introducidos.

xxiii

ABSTRACT

The incorporation of micro-organisms in agriculture, replacing chemical

products, as ecological management, has become one of the main ways of

improving floricultural crops in the production of export-quality flowers. For this

reason, the application of beneficial micro-organisms, such as fungi forming

vesicular-arbuscular micorrhizae (VAM), has been conducted for this work in

Hypericum plants at the Hilsea farm. The purpose of this research is to check

first the ability of fungi to colonize plant roots and, subsequently, their ability to

control the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Two phases were

carried out, Micorrhization and Interaction with Meloidogyne incognita. In

micorrhization, two inoculum types were used: native mycorrhizal fungi of the

Glomus genus and a mycorrhizae commercial formulation of the same genus.

Trap crops were previously established with brachiaria plants as main host

plant, but also oat and pea plants were utilized. In the second phase, once

Hypericum plants were mycorrhizated, Meloidogyne nematodes were

inoculated. During the process, variance analysis and Duncan test at 5% were

conducted for variables studied in both phases. After 16 weeks at the end of the

first phase, Hypericum plants showed favourable results of mycorrhization.

Native mycorrhizal colonization was highly significant compared with

colonization of the commercial formulation. At the end of the cycle, in the

second phase, it was observed that the root gall index was lower with the native

inoculum than with the commercial one, and a better colonization was obtained

with the native mycorrhizae. Root length, root weight and plant height were

larger in mycorrhizated plants compared to non-treated plants. It is worth to

emphasize that this research supports the idea that the use of native micro-

organisms is better than the use of introduced micro-organisms.

1

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

1.1 Formulación del problema

El ataque de organismos fitopatógenos a cultivos ornamentales como

hongos, bacterias y nematodos es el mayor problema al que se enfrentan las

fincas florícolas. Su forma de control y eliminación de plagas se basa en el uso

de productos químicos, nocivos no solo para los fitopatógenos sino también

para los microorganismos del suelo favorables para el desarrollo de la planta.

El campo florícola, en nuestro país, es uno de los más importantes,

debido a la extensa producción de flores de buena calidad. La exportación de

este producto ha ido incrementándose desde hace 20 años de su inicio en la

Provincia de Pichincha extendiéndose en la mayor parte de la Sierra y una

parte en la Costa (OIT, 2007).

Los sectores de mayor producción florícola en el Cantón Quito se

encuentran a lo largo de Guayllabamba, El Quinche y Checa; con un área de

cultivo de un 56,85%. La exportación de flores ha ocupado mercados como los

de Estados Unidos, Rusia, Holanda (OIT, 2007) entre otros, siendo nuestras

variedades una de las más aceptadas.

En nuestro país la empresa Hilsea considerada como la más grande

con 280 hectáreas y con una importante productividad de flores se desarrolla

en El Quinche. Esta empresa propiedad de la multinacional Esmeralda Farms,

exporta alrededor de 22 000 cajas anuales, llegando a los países Europeos con

variedades de la mejor calidad.

2

Dentro de las principales plagas que atacan a los cultivos de flores

están: trips, arañuelas, minadores, moscas blancas, ciempiés, y nematodos.

Los principales hongos patógenos son: Fusarium, Peronospora, Botrytis; se

presentan también problemas de marchitamientos, enfermedades de suelo,

roya blanca del crisantemo, enfermedades de clavel y rosa.

Uno de los patógenos que más daño causa son los nematodos, siendo

Meloidogyne incognita el nematodo agallador de mayor problema para el

cultivo de Hypericum. Existen datos que indican la abundancia de este

nematodo en más de 800 especies de plantas hospedantes. Dehne et al.

(2005) revelan que este nematodo infecta las raíces de la planta induciendo la

formación de agallas y células gigantes cuyos síntomas se ven reflejados en la

falta de crecimiento y necrosis como consecuencia también de la dificultad en

la absorción de agua y nutrientes.

Durante algún tiempo se ha observado el uso de técnicas agrícolas

como lo cita la National Academy of Sciences (NAS, 1980), que son: barbecho,

remociones periódicas del suelo e incluso el uso de nematicidas (compuestos

químicos que afectan el hábitat natural del suelo).

Existen hongos que son enemigos naturales de los nematodos y por lo

tanto su rol es importante para disminuir su crecimiento en el suelo de cultivo.

Existen varios tipos de hongos predadores que utilizan sus hifas para capturar

a los nematodos (Aggarwal, 1997). El Instiruto Nacional Autónomo de

Investigaciones Agropecuarias INIAP (Triviño, 2004) investigó el efecto de

Pasteuria penetrans para el control de Meloidogyne, observando que la

aplicación de Pasteuria en campo controló el ataque de nematodo agallador.

3

1.2 Justificación del problema

Las empresas florícolas dedicadas a la exportación de flores requieren

un producto de buena calidad. El tratamiento al que son sometidas las

plántulas desde su inicio de crecimiento hasta su cosecha, es importante sobre

todo cuando se trata de controlar o evitar el ataque de plagas en los diferentes

cultivos.

El uso frecuente de técnicas como la aplicación de fungicidas,

insecticidas, nematicidas no solo elimina hongos, insectos y nematodos sino

también microorganismos benéficos del suelo. Esto provoca un desequilibrio

debido a la pérdida de sus características y propiedades naturales que como

consecuencia deja un suelo poco viable.

Actualmente se intenta cambiar el tipo de manejo de los cultivos a

formas orgánicas mediante el uso de microorganismos. Es así que la

biotecnología ha desarrollado estudios de investigación dentro de los cuales se

incluye el uso de micorrizas en varios cultivos.

Hendrix et al. (1980), Gianinazzi et al. (1999), Ferrera & González

(1993) describen los beneficios de la aplicación de micorrizas como en el

tamaño de tallo, tamaño de hojas, peso de la planta y peso de raíz sobre

cultivos de magnolia, portainjertos de cítricos y manzana.

Existen trabajos relacionados con micorrizas vesículo arbusculares

VAM y su acción frente a nematodos como el nematodo agallador Meloidogyne

incognita. Por ejemplo, Calvet et al. (1990) inoculó estos hongos en kiwi, cuyo

crecimiento presenta un constante problema por el ataque del nematodo

4

agallador y observó que a más de incrementar la tolerancia de la planta a

Meloidogyne también aumentó el porcentaje de colonización en sus raíces.

Los resultados obtenidos hasta el momento gracias al uso de

micorrizas sugieren su aplicación en el campo florícola, ya que los problemas

que enfrentan las flores se asemejan a lo expuesto anteriormente. Por esta

razón se quizo comprobar su efectividad en plantas de Hypericum al establecer

una interacción entre hongo-nematodo con el fin de observar los efectos

favorables frente a Meloidogyne.

Para esto se realizó una parte experimental llevada a cabo en la

empresa florícola Hilsea en la Finca El Chivan, donde se ensayó con micorriza

nativa y una formulación comercial. Este tipo de inóculos fue aplicado en las

plantas para probar su capacidad de colonización y posteriormente observar su

capacidad de control del nematodo.

1.3 Objetivos de la investigación

1.3.1 Objetivo General:

Establecer la capacidad de colonización de una micorriza nativa y una

formulación comercial de micorrizas, en plantas de Hypericum y comprobar si

su presencia favorece el control al ataque de nematodos.

1.3. 2 Objetivos específicos

• Obtener al menos un género de micorriza nativa mediante su

aislamiento a partir de plantas nativas y suelo del lugar.

5

• Inocular plantas de Hypericum con la micorriza nativa aislada y la

formulación comercial de micorrrizas, para probar su capacidad de

colonización.

• Analizar la capacidad de plantas de Hypericum micorrizadas para

controlar el ataque del nematodo nodulador.

1.4 Marco Teórico

1.4.1 Las Micorrizas

Las micorrizas son asociaciones simbióticas que se dan entre las

raíces de la planta y un hongo microscópico, aportando beneficios para ambos.

El hongo se alimenta de material elaborado por la planta y ésta a su vez

absorbe nutrientes del suelo como el fósforo observándose una eficacia cuatro

veces más que las plantas no micorrizadas (Fuentes, 1999). Las micorrizas

aumentan la superficie de absorción del suelo, además de incrementar la

absorción de agua.

La prolongación de la simbiosis según Coyne (2000) depende mucho

de la fertilidad de la planta ya que si existe una baja fertilidad la infección va a

ser elevada, es decir que la planta necesita de la presencia de micorrizas para

poder crecer.

1.4.1.1 Clasificación de las micorrizas

Existen varios tipos de micorrizas pero los más importantes son:

Endomicorrizas , Ectomicorrizas y Ectoendomicorrizas (Páez, 2006).

La característica principal de las ectomicorrizas es su capacidad de

penetrar entre los espacios intercelulares de la raíz formando una capa de hifas

6

alrededor de la misma. Las endomicorrizas penetran en las células mismas de

la raíz de la planta (Alexander, 1981), mientras que las ectoendomicorrizas son

formadas por hongos que se desarrollan ya sea, en las células corticales de la

raíz o en torno a esta en la superficie pudiendo o no formar el manto fungoso

como en el caso de las ectomicorrizas (Agrios, 1998).

Las ectomicorrizas se desarrollan principalmente en especies

forestales y leñosas, los hongos que las forman son Basidiomicetes y

Ascomicetes. Así mismo, las endomicorrizas se encuentran poblando las raíces

de las plantas de las familias Ericáceas, Liliáceas y en las Orquidíaceas (Páez,

2006).

Dentro de estas últimas también se encuentran las micorrizas vesículo-

arbusculares llamadas así, por su capacidad de formar estructuras similares a

arbúsculos o vesículas (Figura 1.1) dentro de las células de la raíz. Este tipo

de micorrizas es muy abundante en la naturaleza además de caracterizarse

por ser simbiontes obligadas, requieren de una planta hospedera para su

crecimiento.

Fuente: web.catie.ac.cr/información/RMIP/rmip58/art4-b.htm Figura 1.1 Raíz con presencia de hifas y vesículas, colonizada por hongos

formadores de micorrizas vesículo arbusculares.

7

Los hongos de este tipo de micorrizas son cigomicetos y ficomicetos

recordando los géneros más importantes como: Glomus, Gigaspora,

Acaulospora, Entrophospora y Scutellospora (Coyne, 2000). Las micorrizas del

género Glomus son las micorrizas vesículo arbusculares más aisladas del

suelo, dentro de las cuales podemos nombrar a: G. fasciculatum , G. mosseae,

G. manihotis como las especies más representativas.

Glomus sp. como mayormente se la conoce se encuentra dentro del

Orden Glomales, Familia Glomeraceae y Género Glomus, como se indica en la

Figura 1.2.

Fuente: http://invam.caf.wvu.edu/

Figura 1.2 Clasificación del Phylum Glomeromycota de los hongos vesículo arbusculares.

Este género de micorrizas es el más común en el mundo y comprende

la mayor cantidad de especies. Dos tercios del total de las plantas forman

simbiosis con este tipo de hongos y son simbiontes obligados que al parecer no

son específicos con la planta hospedera.

En la agricultura el uso de micorrizas tiene gran importancia como

biofertilizante ya que ayuda a mejorar los cultivos y las plantaciones reduciendo

las posibilidades de contaminación ya que son productos biológicos. El

crecimiento de las plantas se ve favorecido en condiciones de estrés hídrico,

8

salinidad, presencia de patógenos, etc. El aporte más importante es que mejora

las condiciones nutricionales de la planta al formar simbiosis con sus raíces,

además también hace un mejor uso del fósforo del suelo (Peña & Vanegas,

2007).

1.4.1.2 Micorrizas vesículo arbusculares (VAM)

Las micorrizas de este género forman arbúsculos, vesículas e hifas

intra y extraradicales. Los arbúsculos son órganos que forman estructuras

similares a árboles, de ahí su nombre, las cuales favorecen el mutuo

intercambio entre la planta y el hongo. Las vesículas son estructuras de forma

redondeada u ovoide, actúan como almacenadores de lípidos y las hifas son

estructuras del hongo que pueden estar dentro o fuera de la raíz (Coyne,

2000). Sus esporas son redondas de color café y se las encuentra a menudo

solitarias, poseen una sola pared formada por dos capas y su superficie

presenta una textura lisa (Figura 1.3).

Fuente: Hilsea - Laboratorio D&B Finca El Chivan Figura 1.3 Esporas nativas de Glomus extraídas del suelo de cultivos

trampa de Brachiaria y plantas de Hypericum

Se sabe que la mayor parte de especies de plantas ya sea natural,

semi-natural y plantas agrícolas son susceptibles de infección con hongos

micorrícicos, lo cual es de gran interés ecológico, agrícola y económico

(Francis & Read, 1994).

9

Por ejemplo la recuperación de ecosistemas importantes como los

bosques tropicales que han sufrido daños de todo tipo por actividades mineras,

agrícolas, tala de bosques, etc, requiere de organismos micotróficos como las

micorrizas para su restablecimiento. Se pueden inocular estos hongos en

pequeños árboles en vivero para luego ser cultivados en campo. Se ha visto

que influye en gran parte la incorporación de materia orgánica para mantener

activa la viabilidad de las micorrizas en simbiosis con la planta y el suelo

(Salas, 2003).

Fuentes (1999) menciona que la simbiosis planta-hongo se basa en el

mutuo intercambio benéfico. El hongo se alimenta del material elaborado por la

planta y al mismo tiempo ésta, gracias a la presencia de hifas que actúan como

extensiones de la raíz, absorbe nutrientes del suelo como el fósforo y mejora la

absorción de agua. Las micorrizas solubilizan el fósforo mineral con el fin de

producir ácidos orgánicos y CO2 y lo mineraliza gracias a la liberación de

fosfatasas (Coyne, 2000).

El mecanismo de absorción del fósforo explicado por Jacobsen (1994)

menciona que esto se debe gracias a la presencia de un compartimento hifal

separado de otro compartimento radicular por medio de una malla fina que

permite el paso libre de las hifas del hongo.

En la actualidad la relación que se establece entre las plantas y los

hongos del Género de las Glomales es considerada como biofertilizantes,

bioprotectores y bioreguladores utilizados para el control de plagas y el manejo

de materiales biopropagados dentro del campo de la Biotecnología Vegetal

(CORPOICA , 1997). Tal como lo manifiestan Gianinazzi et al., (1999), el uso

de herramientas biológicas como los hongos VAM, constituyen un potencial en

los niveles de producción agrícola al reducir el uso de fertilizantes químicos y

10

pesticidas, lo cual ingresa dentro de las tecnologías necesarias para una

agricultura sustentable.

El uso de micorrizas a lo largo de la historia ha permitido descubrir una

gran variedad de micorrizas vesículo arbusculares, así como de las diversas

propiedades que estos poseen. Al formar simbiosis con las plantas confieren a

estas, tolerancia frente a los fitopatógenos y a su vez mejoran sus

características físicas como: altura, diámetro del tallo, número de hojas, área

foliar, peso seco de la parte aérea y volumen radical (Ferrera & González,

1993)

Algunos trabajos en cítricos (Ferrera & González, 1993), kiwi (Calvet,

et al., 1990) y banano (Jaizme & Rodriguez, 2004) han demostrado los efectos

positivos de esta simbiosis frente a organismos patógenos del suelo como

nematodos agalladores de raíces (Meloidogyne). CORPOICA (1997) menciona

en los trabajos realizados por Olivares & Barea (1991) y Fortuna et al. (1996),

que la aplicación de hongos micorrícicos en manzana y durazno mejoró la

aclimatación de las plantas micropropagadas.

En plantas ornamentales la aplicación de micorrizas vesículo

arbusculares (VAM) ha adquirido importancia debido a la gran demanda de

agua y nutrientes que estas necesitan para su crecimiento. Es así que en

plantas que se producen en vivero, donde las condiciones son más

controladas, se utiliza suelo esterilizado, medios inertes o con poco suelo, la

aplicación de micorrizas favorece su crecimiento y mejora sus condiciones

nutricionales (Ferrera & González, 1994). En cultivos ornamentales y frutales

que se realizan en sustratos con bajos contenidos de fósforo se ha observado

la disminución de la mortalidad de plantas, observándose al final muchos

beneficios con la aplicación de micorrizas del género Glomus (Mosseae,

Intraradices y Viscosum) (CORPOICA, 1997).

11

La simbiosis que ocurre entre planta-hongo depende mucho del tipo de

planta, del tipo de patógeno y del tipo de hongo que se utilice (Dehne, et al.,

2005). Hendrix et al. (1980) observó que la inoculación con Glomus

fasciculatum en magnolia causó un mayor crecimiento de la planta

acompañada de muchos beneficios después de un tiempo de su aplicación.

Auge et al., (1986) reportaron que la inoculación micorrícica en rosas

incrementó los procesos foliares de intercambio gaseoso bajo condiciones de

estrés pudiendo ser éste biótico o abiótico. Los hongos micorrícicos pueden

conferir a la planta cierta tolerancia frente al estrés abiótico como es la

salinidad del suelo al cual ciertas plantas no son resistentes. El estrés biótico

de las plantas puede ser ocasionado por la presencia de otros organismos del

suelo como hongos, bacterias y nematodos que interactúan con las micorrizas,

las cuales reducen su presencia en el suelo. (Gianinazzi et al., 1999).

Es por esta razón que la aplicación de este tipo de hongos ha sido muy

estudiada y ampliamente utilizada no solo con organismos patógenos sino

también en la recuperación de suelos áridos como en plantas frutales y

ornamentales (Gianinazzi et al., 1999).

1.4.1.3 Factores que afectan al crecimiento de los hongos vesículo

arbusculares (VAM)

Se conoce que los hongos endomicorrícicos habitan en las raíces de la

mayor parte de plantas, pero para su desarrollo hay que tomar en cuenta

muchos factores como la temperatura, el pH y la presencia de patógenos que

lo puedan atacar.

En un estudio llevado a cabo por Thompson (1994) se observó que

estos hongos arbusculares se destruían a temperaturas superiores a los 50°C.

12

Experimentos similares demostraron también que el uso de pesticidas es letal

ya que por ejemplo el bromuro de metilo y el metil isotiocianato son muy tóxicos

para los hongos VAM. El uso de fertilizantes fosfatados pueden reducir la

colonización de VAM pero su adición en suelos muy pobres en fosfato, puede

incrementar su población.

Los exudados de algunas plantas también constituyen un factor que

afecta el desarrollo y formación de los hongos VAM inhibiendo la colonización

de micorrizas y la germinación de esporas, aunque se ha descubierto que no

todos los hongos responden de la misma forma. Al realizar injertos de plantas

hospederas en no hospederas también se puede desarrollar simbiosis ya que

el problema radica solo en las raíces de algunas plantas (Bradbury & Peterson,

1999).

Otros factores que reducen la colonización de micorrizas, así como su

función es el arado, ya que destruye las esporas y rompe las hifas que se

encuentran en la superficie del suelo, además de llevar a las esporas a las

profundidades del suelo dejándolas fuera del alcance de las raíces. También la

quema de rastrojos, un drenaje pobre y la inundación de los suelos son

prácticas del mal manejo del terreno que afectan la viabilidad de las micorrizas

(Coyne, 2000).

1.4.2 Hypericum

Hypericum es una planta perenne conocida por ser una planta

medicinal. Hypericum perforatum, o también llamada Hierba de San Juan, es

originaria de Europa y ha sido introducida en Estados Unidos, Nueva Zelanda y

Australia. Se la utiliza principalmente en herboristería, farmacia, licorería, entre

otros siendo las flores y frutos las partes más usadas para dichos fines (Figura

1.4).

13

Fuente: Hilsea - Laboratorio D&B Finca El Chivan

Figura 1.4 Planta de Hypericum variedad Chocolate.

En el campo agrícola Hypericum es utilizada para su producción como

flore de verano de uso ornamental. Hypericum posee un sin número de

variedades entre las que podemos mencionar: Elite Coral, Red Wave, Green

Condor, Elite Amber, Excelent Flair, red Baron, White Condor, Pink Atraction,

Burgubdy Condor, Lemon Condor, Cream Condor y Chocolate (Orozco,

2006).

1.4.2.1 Clasificación taxonómica y descripción botánica

Esta planta pertence al Orden Theales, Familia Clusiaceae, Género

Hypericum.

Es perenne originaria de Europa, Asia y África, se desarrolla

extensamente en regiones montañosas, llega a medir aproximadamente 0,80m

de altura con tallos erguidos y leñosos en su base, ramificados y compuestos

de hojas ovaladas alternas, sésiles, con glándulas de color rojizo traslúcido.

Sus flores son de color amarillo dorado y su fruto es una cápsula (Buitrón,

1993).

14

Su ciclo de vida comprende 26 semanas de siembra y la poda se

realiza a las 23 semanas. La densidad de cultivo recomendable es de 32

plantas por m2 neto o 19,2 plantas por m2 bruto (Orozco, 2006).

1.4.2.2 Importancia económica

El cultivo de Hypericum ha ganado importancia en el mercado

internacional, es así que, en el último año Hilsea llegó a exportar alrededor de

45 millones de tallos a Europa y Estados Unidos, cada planta con un número

de tallos de 5 a 6 exportables. Pero la producción de plantas de Hypericum

debe ser de interés general sobre todo por la diversidad que ésta ofrece,

especialmente para El Grupo Esmeralda Ecuador ya que, esta Empresa

florícola ha encontrado nuevas variedades de Hypericum considerando este

factor como ventaja frente a la competencia ya que de esta manera se pueden

ofertar productos únicos y exclusivos, siempre y cuando la calidad de la flor

supere las expectativas del cliente.

Esta acogida significa compromiso y ganancia para la Empresa ya que,

requieren no solo mantener la capacidad de exportación sino superarla,

cumpliendo con la demanda de los países europeos que es donde mayor

desarrollo tiene el mercado.

1.4.2.3 Cultivo de Hypericum en campo

El cultivo y manejo de Hypericum de acuerdo a las Fichas Técnicas

(2006) realizadas por la Empresa Hilsea se realiza como se describe a

continuación:

15

1.4.2.3.1 Preparación del terreno

Consiste en remover el suelo a una profundidad de 30 cm, usando

tractores que recorran todo el terreno realizando la labor para luego incorporar

en presiembra la cantidad disponible de materia orgánica.

1.4.2.3.2 Armado de camas y marcación

En caso de que la siembra se lleve a cabo en campo abierto, se debe

humedecer el terreno para levantar las camas y colocar mangueras y/o cintas

de goteo de fertirriego, además una malla de tutores. Si la siembra se realiza

en potes se debe elegir un sustrato adecuado si no se va a utilizar suelo y

controlar el goteo y fertirriego (Figura 1.5).

Fuente: Hilsea - Finca La Mora

Figura 1.5 Armado de camas para cultivo de plantas de Hypericum en campo.

16

1.4.2.3.3 Manejo

a) Desinfección y transporte de plantas

La desinfección de las bandejas de plantas se realiza haciendo una

inmersión en tina con Vitavax 1gr/l, o Previcur 1 cc/l para luego trasladarlas

desde el sitio de la desinfección al sitio destinado para la siembra.

b) Siembra

El proceso de siembra se realiza de acuerdo a los siguientes pasos:

1. Sembrar 32 plantas por m2 o hasta 4 plantas por pote dependiendo del

volumen del mismo.

2. Introducir la planta garantizando que la parte superior del pilón quede a

nivel del suelo.

3. Garantizar que el follaje se mantenga húmedo hasta la tercera semana

de edad.

c) Pinche

Se refiere al corte pequeño que se realiza en una parte del tallo para

inducir el desarrollo de más ramas. Este paso se realiza a la tercera semana

después de la siembra. Se hace un repaso para plantas que quedaron sin

pinchar y para ramas basales inducidas hasta la quinta semana.

d) Luz

Es necesario colocar la iluminación cuando la planta tenga 35 cm de

alto hasta que el 30% de las bayas tenga color. Se usa iluminación cíclica 30

min prendido y 30 min apagados durante 6 horas, con lámparas de sodio de

17

250 y/o 400 watts. Se debe utilizar 12 horas netas de luz cuando se requiere

uniformizar cosecha y adelantar el ciclo.

e) Riego y fertilización

El fertiriego consiste en la aplicación de una solución fertilizante en el

cultivo, este fertiriego debe ser aplicado en los volúmenes de agua que

necesita la planta y se inicia a la segunda semana de siembra.

Los volúmenes de agua para fertilizar la fase de vegetativo o productivo

son de 8 a 12 litros/m2 dependiendo del estado de la planta. La fertilización se

realiza cuatro días a la semana con una conductividad eléctrica (E.C.) de 0.8 a

1,2 en el caso de riego con venturi (sistema de riego) y un adicional de nitrato

de calcio una vez por semana. En el caso de poda se debe cortar el fertiriego

una semana antes y una semana después de la misma.

f) Cosecha

La cosecha de los tallos se debe realizar cuando la baya haya

alcanzado el 100% de su color. El corte se lo debe realizar a la base del

tallo y se debe llevarlos a tachos de hidratación con una solución de pH 4,0

a 5,5.

18

1.4.3 Patógenos que Atacan al Cultivo de Hypericum

1.4.3.1 Roya (Puccinia sp.)

Los hongos de las royas son parásitos obligados ocasionados por

Bsidiomycetes. Se considera como una de las enfermedades de las plantas

más destructivas.

El ciclo de la roya comprende cuatro etapas: Espermogonio, Ecidio,

Uredosporas y Teleustoro. Para la germinación de este hongo la presencia de

agua es suficiente durante un tiempo aproximado de al menos 6 horas, para

luego pasar a la etapa de incubación que dura de 18 a 21 días (Toledo, 1999).

Esta enfermedad se caracteriza por la aparición de pústulas de color

amarillo marrón en el envés de las hojas (Figura 1.6) y puede ir acompañado

de una consecuente defoliación. La principal causa de la aparición de esta

enfermedad depende mucho de la humedad de las hojas y la temperatura del

ambiente, cuyo valor óptimo es de 22 ºC.

Fuente: Hilsea - Laboratorio D&B Finca El Chivan

Figura 1.6 Hoja de Hypericum atacada por Roya, con presencia de pústula.

19

Las royas se pueden propagar de planta a planta ya sea que las

esporas se transporten a través del viento, insectos, la lluvia o por algunos

otros animales. La mayoría de estas atacan a hospedantes específicos por lo

que son parásitos obligados, pero existen otros hongos de roya que atacan a

diferentes géneros de hospedantes, y se los considera como formas especiales

Agrios, 1998).

El control de esta enfermedad consiste en la remoción de las hojas

infectadas y la poda antes del crecimiento de las hojas nuevas. De la misma

manera se realizan varias labores dependiendo de la época del año, ya sea

mediante la poda o la eliminación del agua en la planta especialmente de las

hojas. Así mismo el uso de fungicidas es habitual como preventivos para la

aparición de Roya o cuando la enfermedad está ya muy avanzada. Entre los

fungicidas más usados están los cúpricos , mancozeb, metalaxil, entre otros

(Toledo, 1999).

1.4.3.2 Gusano trozador (Agrotis ipsilon)

El ciclo de vida de Agrotis inicia desde la formación del huevo que dura de 5 a

6 días para pasar a la formación de la larva que comprende de 24 a 30 días.

Una vez que ha terminado esta fase pasan a formar pupas de color café poco

brillosas, para luego de 15 días pasar a su estadio adulto. El número de

huevos colocados puede llegara a 1800 (Figura 1.7).

Fuente: http://ipm.ncsu.edu/ag271/peanuts/black_cutworm.html Figura 1.7 Ciclo de vida de Agrotis ípsilon: a) huevo, b) larva, c) pupa y d)

adulto

20

La larva mide aproximadamente de 30 a 45 mm de largo y 7 mm de

ancho, presentan un color gris, son segmentados y con muy pocas manchas

negras (Figura 1.8). Estos gusanos actúan en la noche alimentándose de las

hojas y tallo de plantas pequeñas, una larva puede trozar a muchas plantas

pero solo dañan una parte de ellas. En el día estas larvas se ocultan bajo el

suelo, no a distancias muy profundas por lo que es fácil encontrarlas (Bayer,

2007).

Fuente: www.redepapa.org/agrotis.html

Figura 1.8 Larva de Agrotis ípsilon.

Cuando alcanzan el estado adulto miden cerca de 25 mm de largo y

tienen 40 a 50 mm de expansión alar, son de color gris. (Bayer, 2007).

Al dañar las hojas y los tallos, las plantas pierden tejido y manifiestan

clorosis a parte de perder el vigor por lo que pueden morir sobre todo porque el

gusano trozador llega a cortar los tallos a ras del suelo.

1.4.3.3 Nematodos fitopatógenos

Los nematodos fitopatógenos son microscópicos, redondos, más o

menos transparentes, su cuerpo es liso y en algunas especies la hembra se

hincha en la madurez adquiriendo la forma de una pera. La reproducción se

21

realiza por medio de huevecillos, estos en el ciclo de vida del nematodo se

incuban y desarrollan en larvas que aumentan de tamaño pasando los cuatro

estadios larvarios que duran aproximadamente 4 semanas (Agrios, 1998).

De estas etapas la primera y segunda no son infectivas, en algunas

especies, pero al llegar a las etapas infectivas, es decir al estadio de juveniles,

el nematodo necesita de un hospedante fácil de infectar para que pueda

sobrevivir, lo cual también va a depender de factores ambientales (Agrios,

1998).

Los nematodos fitopatógenos pueden atacar a las semillas formando

agallas como el género Anguina, a las raíces como el nematodo lesionador

Pratylenchus, el nematodo agallador Meloidogyne o el nematodo formador de

la raíz achatada como Trichodorus. Estos nematodos no solo pueden ser

caracterizados por ser causantes de varios tipos de lesiones en la mayor parte

de plantas, sino también por el tipo de cultivo al que afectan, así por ejemplo

Haplolaimus ataca al maíz, caña de azúcar, algodón, alfalfa; Tylenchulus ataca

a los cítricos, la vid, el olivo (Agrios, 1998).

1.4.3.3.1 Meloidogyne incognita

Este nematodo perteneciente al Género Meloidogyne fue descubierto

por primera vez en Inglaterra al observar la formación de nódulos en raíces de

pepino y producía otro tipo de síntomas dependiendo de las condiciones

ambientales (Cepeda, 1996).

Meloidogyne incognita es una de las especies más importante dentro

de este género, ya que ataca a un gran número de plantas induciendo la

formación de agallas (Figura 1.9) al infectar las raíces de su hospedante en el

22

inicio de su segundo estadio larval. Al igual que otras especies, este nematodo

ataca a varios órganos en diferentes plantas provocando el desarrollo de varios

síntomas como: la formación de células gigantes, necrosis, acortamiento y

disminución de raíces además de interrumpir la absorción de agua y nutrientes

por parte de la planta.

Fuente:http://academic.uprm.edu/ofarrill/HTMLobj-34/NematodosDiagnosticoyCombate.pdf

Figura 1.9 Raíces agalladas por ataque de Meloidogyne spp.

Por otra parte como detallan Storer et.al (1982), citado por León

(1992), el ciclo de vida del nematodo consta de varios estadíos. El primero se

da cuando se ha formado una larva completa con estilete como resultado de la

división celular, el segundo estadio larvario (Figura 1.10) ocurre con la primera

muda y se lleva a cabo dentro del huevo, y por último la larva, que con ayuda

de su estilete rompe la cáscara del huevo, logra salir y se mueve en dirección

de la raíz atraída por los olores.

Fuente: http://deab.upc.edu/recerca/grups_de_recerca/pocio/copy_of_1/resolveUid/

Figura 1.10 Juvenil del nematodo agallador Meloidogyne incognita.

La hembra deposita los huevos dentro de la raíz de la planta, esto en

una masa gelatinosa que es donde se desarrollan, puede depositar alrededor

de 1000 huevos en cada proceso reproductivo siendo estos de 3 a 4 veces

23

(Taylor & Passer, 1983) citado por León (1992). Al llegar a su tercer estadío

larvario los juveniles salen e infectan otras raíces.

La mayoría de los nematodos atacan a las células internas de los

órganos de las plantas pero algunos también lo hacen de forma externa,

absorbiendo algunos de los nutrientes de la planta a través de su estilete, el

cual lo utilizan para penetrar la pared celular y una vez dentro de la célula este

secreta enzimas que causan ablandamiento de la pared celular (Agrios, 1998).

Para el control de este nematodo se utilizan productos químicos como

nematicidas o cultivos trampa, por ejemplo las plantas del género Crotalaria

que atrapan a las larvas de este nematodo agallador de la raíz (Agrios, 1998).

Una alternativa recomendada es también sembrar, en un terreno

infestado por M. incognita, el primer año un cereal resistente como maíz, trigo,

cebada; el segundo año, una leguminosa resistente y el tercer año cualquier

planta.

La National Academy of Science NAS (1980) cita algunas prácticas

poco utilizadas en la actualidad para eliminar este endoparasito del suelo:

• Barbecho que consiste en mantener el terreno libre de vegetación

durante largos periodos de tiempo mediante el arado, lo cual a más de

eliminar cualquier fuente de alimento para los nematodos, los expone al

calor y la desecación exponiéndolos a la luz solar al quedar en la

superficie del suelo.

• La inundación del terreno durante 12 a 22 meses puede ayudar a

controlar el ataque, posiblemente debido a la disminución de oxígeno y

24

a la formación de sustancias químicas fatales como resultado de la

rápida descomposición de la materia orgánica.

• Los cultivos de cobertura pueden ayudar al control o a la proliferación de

los nematodos de acuerdo a su resistencia, además en este tipo de

práctica se utilizan las llamadas plantas trampa donde el nematodo

ingresa a la raíz y aquí permanece en estado inmóvil.

• Temporada de siembra: consiste en sembrar las plantas en cualquier

época del año donde la actividad del nematodo sea inhibida gracias a la

baja o alta temperatura. La adición de abonos orgánicos al suelo puede

incrementar o disminuir la población de nematodos dependiendo de la

presencia de microorganismos destructores de estos endoparásitos.

• La remoción o destrucción de las plantas infectadas es un paso

importante para la destrucción de los nematodos ya que, al retirar las

raíces del suelo evitamos que los nematodos puedan alimentarse y

reproducirse, aumentando su población e infectando a los siguientes

cultivos.

• El uso de plantas trampa y antagónicas ha sido poco utilizado para el

control por infestación de nematodos; por ejemplo se siembran plantas

trampa que son susceptibles a la invasión pero que pueden seguir su

ciclo aunque el nematodo haya alcanzado su estado infeccioso, donde

muchas de las plantas mueren reduciendo al mismo tiempo la población

de nematodos. De la misma forma las plantas antagónicas liberan

exudados que son perjudiciales para algunas poblaciones debido a las

sustancias tóxicas que los conforman.

• Pero el uso de productos químicos en campo es muy amplio ya que,

existen un sinnúmero de nematicidas que actúan en los diferentes

estadios larvales pero que depende en algunos casos de las condiciones

del suelo y también del género al que pertenezca dicho nematodo.

25

• Se ha visto también que el uso de abonos orgánicos pueden resultar

perjudicial para el desarrollo de algunos nematodos nódulo radiculares

por ejemplo la descomposición de los residuos de centeno en el suelo

son tóxicos para Meloidogyne incognita.

Otro método, y quizá el más utilizado en los últimos años por los

agrónomos, es el control biológico por medio del uso de hongos, virus y plantas

trampa; estas últimas utilizadas ya que sus raíces liberan exudados que

inducen la liberación del nematodo en etapa de huevecillo y al ingresar este a

la raíz no se puede desarrollar, lo que produce su muerte (NAS, 1989).

26

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Participantes

El trabajo experimental se realizó en la Empresa florícola Hilsea

Investment finca el Chiván, con la responsabilidad científica de de La Doctora

María Labán, Jefe de Laboratorio de Diagnóstico y Biopropagación.

2.2 Descripción del lugar

La Finca el Chivan está ubicada en el sector de San Miguel de

Atalpamba, Parroquia el Quinche, Cantón Quito, Provincia de Pichincha a

00º06’00’’ Sur, 76º16’00’’ Oeste, 2416 m.s.n.m.

La Empresa Hilsea Investment perteneciente al Grupo ESMERALDA

FARM cuenta con el establecimiento de 6 Fincas en nuestro país que operan a

una rango de altitud entre 6 000 y 10 000 pies de altura: El Chivan, La Tolita,

Perucho, La Mora, La Victoria, y Flor Y Campo; las cuales desarrolan cultivos

como: Rosas, Rosas Spray , Hypericum, Lisianthus, Campanula, Ammi Majus,

Aster, Solid Aster, Delphinium, Godetia, Liatris, Limonium, Sunflowers,

Gypsophila, Mini-Gerberas y Trachelium.

Otras áreas de suma importancia con las que cuenta esta Florícola son

dos Laboratorios, uno de micropropagación Breeding and Biotechnology donde

se investiga la obtención de nuevas variedades, además de mejorar las

condiciones de cultivo y resistencia de las flores, y otro Laboratorio de

Diagnóstico y Biopropagación (Figura 2.1) donde se envían muestras de

plantas de todas las Fincas para análisis fitopatológico, así como también

muestras de suelos, soluciones de fertilización, aguas de riego, etc. Este

laboratorio cuenta con personal capacitado en varias áreas como propagación

27

de biocontroladores, preparación de sustratos y medios de cultivo, lavado de

esporas, análisis químico y fitopatológico y ensayos; de las cuales las

principales actividades a más del análisis de muestras, es la propagación de

hongos biocontroladores como Trichoderma sp., Gliolcadium sp, Verticillium

sp., Beauveria bassian, Paecilomyces lilacinus, Arthrobotrys sp., e

Hyphomycete sp. efectivos en el control al ataque de insectos, nematodos y

otros hongos fitopatógenos.

Figura 2.1 Laboratorio de Diagnóstico y Biopropagación de Hilsea en la

Finca El Chivan.

2.3 Periodo de tiempo de investigación

Fecha de inicio: 8 de Abril del 2008

Fecha de finalización: 25 de Marzo del 2009

28

2.4 Diseño Estadístico de las Fases de la Investigación

2.4.1 Micorrización de plantas de Hypericum

Para realizar esta fase experimental se utilizaron plantas de Hypericum,

las cuales fueron sometidas a dos tipos de inóculo con hongos micorrícicos.

La unidad experimental estuvo constituida por 10 potes que contenían

cada uno tres plantas. Cada tratamiento con sus seis repeticiones estuvo

formado por 60 potes dando un total de 180 potes por los tres tratamientos.

Factor en estudio:

1. Inóculo

Io: Sin inóculo

I1: Inóculo 1 (Inóculo nativo)

I2: Inóculo 2 (Formulación comercial)

Tratamientos

Del factor en estudio se tuvo un total de 3 tratamientos (Tabla 2.1).

Tabla 2.1. Tratamientos de la fase de micorrización

Tratamientos Nomenclatura Descripción

T1 Io Testigo sin inóculo

T2 I1 Inóculo 1 (Inóculo nativo)

T3 I2 Inóculo 2 (formulación comercial)

29

Diseño experimental

Se aplicó un Diseño Completamente al Azar con seis repeticiones.

Esquema del análisis de varianza

Fuentes de Variación GL

Total 17

Tratamientos 2

Error 12

Además se midió el coeficiente de variación (CV%) y se realizó una prueba de

Duncan al 5% para tratamientos en general.

La distribución de los tratamientos se indica en la Figura 2.2.

T

3

R

6

T

3

R

2

T

2

R

1

T

1

R

2

T

2

R

6

T

3

R

3

T

1

R

6

T

3

R

4

T

2

R

2

T

3

R

1

T

1

R

5

T

2

R

4

T

1

R

3

T

1

R

4

T

2

R

3

T

2

R

5

T

3

R

5

T

1

R

1

Figura 2.2 Distribución de los tratamientos de la fase de micorrización

30

Variables estudiadas

Altura de la planta

Peso de raíz

Colonización micorrícica

Número de esporas

2.4.2 Interacción con Meloidogyne incognita

Para realizar esta fase se utilizaron plantas de Hypericum micorrizadas

con dos tipos de inóculo micorrícico: nativo y comercial. De los seis

tratamientos, tres de ellos fueron inoculados con nematodos de Meloidogyne

incognita y tres no.

La unidad experimental estuvo constituida por 10 potes que contenían

cada uno tres plantas. Cada tratamiento con tres repeticiones estuvo formado

por 30 potes dando un total de 180 potes por los seis tratamientos.

Factores en estudio

1. Inóculo

Io: Sin inóculo

I1: Inóculo 1 (Inóculo nativo)

I2: Inóculo 2 (Formulación comercial)

2. Nematodo

No: Sin nematodo

N1: Con nematodo

31

Tratamientos

De la combinación de los factores en estudio se tuvieron un total de 6

tratamientos (Tabla 2.2).

Tabla 2.2 Tratamientos de la fase de interacción con Meloidogyne incognita

Tratamientos Nomenclatura Descripción

T1 IoNo Sin inóculo, sin nematodo

T2 IoN1 Sin inóculo, con nematodo

T3 I1No Inóculo 1, sin nematodo

T4 I1N1 Inóculo 1, con nematodo

T5 I2No Inóculo 2, sin nematodo

T6 I2N1 Inóculo 2, con nematodo

Diseño experimental

Se aplicó un Diseño Completamente al Azar en un arreglo factorial de 3x2 con

tres repeticiones.

Esquema del análisis de variancia

Fuentes de Variación GL

Total 17

Tratamientos 5

Inóculo (I) 2

Nematodo (N) 1

I x N 2

Error 12

32

Además se midió el coeficiente de variación (CV%) y se realizó una prueba de

Duncan al 5% para tratamientos en general, inóculos y nematodos. La

distribución de los tratamientos se indica en la Figura 2.3.

T

6

R

3

T

5

R

2

T

3

R

1

T

1

R

2

T

4

R

3

T

5

R

3

T

2

R

3

T

6

R