Columnas ACQUITY UPLC - Desarrollos recientes · 2012. 1. 25. · Columnas ACQUITY UPLC HILIC Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN — HSS PFP Nuevas columnas 2.5 um e. X. tended

©2011 Waters Corporation 1

Columnas ACQUITY UPLC - Desarrollos recientes

24 de Enero 2012

MADRID


Agenda

Columnas ACQUITY UPLC

HILIC

Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN

— HSS PFP

Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]

Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>

Herramientas disponibles on line

http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=es_ES&cid=134618172�




Columnas Waters

Styragel®

µBondapak™

DeltaPak®

1964 1979 1973

1992

Symmetry®

Spherisorb®

Atlantis ®

Symmetry® 300

XTerra®

XTerraPrep®

1998

Nova-Pak®

ProteinPakTM

Pico-TagTM

SymmetryShield®

1984

1986

2002

1999 1994 2003

Atlantis ® HILIC Silica Prep OBD™

Intelligent SpeedTM

BioSuite™ NanoEase™

2004

ACQUITY UPLC® BEH SunFire™ Columns

PrepPak®

1976

1958

Atlantis® T3

ACQUITY UPLC® HSS T3 AccQTagTM Ultra

2006

2005

XBridge™

2007

ACQUITY UPLC ® HSS C18 and HSS C18 SB

2008

XBridge™ HILIC

2009

ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan

XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns

2010

ACQUITY UPLC® BEH200 SEC XSelect CSH HPLC columns

ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns

ProteinPak High Rs IEX

AccQTagTM

2011

ACQUITY UPLC® HSS Cyano/PFP columns

XSelectTM HSS

Cyano/PFP columns

2.5 µm XP columns


Launch Date

3 Partículas base y 14 Químicas ACQUITY UPLC, XBridge, XSelect

Jan 2008

Tipo Ligando Tamaños Partícula

Densidad Ligando

Carga Carbono

Endcapping Rango pH

Trifuncional C18 1.7,2.5,3.5,5,10 3.1 µmol/m2 18% Proprietary 1-12

Trifuncional C8 1.7,2.5,3.5,5,10 3.2 µmol/m2 13% Proprietary 1-12

Monofuncional Grupo Polar Embebido

1.7, 2.5, 3.5, 5 3.3 µmol/m2 17% TMS 2-11

Trifuncional C6 Fenilo 1.7,2.5,3.5,5,10 3.0 µmol/m2 15% Proprietary 1-12

Unbonded 1.7, 2.5, 3.5, 5 --- --- --- 1-8

Trifuncional Amide 1.7, 2.5, 3.5, 5 7.5 µmol/m2 12% None 2-11

Trifuncional C18 1.8, 2.5, 3.5, 5 1.6 µmol/m2 11% Proprietary 2-8


Trifuncional C18 1.8, 2.5, 3.5, 5 1.6 µmol/m2 8% None 2-8

Trifuncional Propilfluorofenil 1.8, 2.5, 3.5, 5 3.3 µmol/m2 7.5% None 2-8

Monofuncional Diisopropil Ciano 1.8, 2.5, 3.5, 5 2.0 µmol/m2

5.5%

None

2-8


Trifuncional Propilfluorofenil 1.7, 2.5, 3.5, 5 2.3 µmol/m2 10% None 1-8

Trifuncional C6 Fenil 1.7, 2.5, 3.5, 5 2.3 µmol/m2 14% Proprietary 1-11


La más amplia oferta en columnas UPLC

Tres partículas base [BEH 130Å y 300Å, HSS y CSH]

Todas disponibles en tamaños de partícula HPLC y UPLC

Contrastadas soluciones para aplicaciones específicas Aminoácidos, Oligonucleótidos, Péptidos, Proteínas, Glicanos

AAA, OST, PST, PrST (BEH300 C4) y Glicanos

Escalabilidad con las columnas XBridge, XSelect CSH y XSelect HSS de HPLC

Dimensiones disponibles Diámetro (1.0 mm, 2.1 mm, 3.0 mm)

Longitud (30 mm, 50 mm, 75 mm, 100 mm, 150 mm)

Tecnología eCord

Precolumnas VanGuard (<2 um únicos en el mercado)

Las primeras y únicas precolumnas desarrolladas para trabajar en rutina a presiones de hasta 15.000 psi (1.000 bar)

http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=134618172�









Agenda


HILIC


— HSS PFP








¿Qué opciones existen para mejorar la retención de compuestos polares?

Probar HILIC

Analitos Polares – Límitaciones en la Aproximación por Fase Reversa

Inferior sensibilidad en la detección por MS — Los analitos se retienen en un elevado contenido acuoso en la fase

móvil

— Más difícil desolvatar fases móviles acuosas en MS

Retención inadecuada si el analito está cargado — Los analitos con elevado pKa se retendrán menos en las fases

móviles habituales a pH ácido


¿Qué es HILIC?

HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography

Retención de compuestos altamente polares no retenidos por fase reversa

— Menor interferencia de componentes de la matriz

Selectividad complementaria a la fase reversa — Los pesticidas polares se retienen más que las interferencias

hidrofóbicas Sensibilidad superior en MS

— Fases móviles con elevado contenido orgánico (> 80% ACN) favorece la respuesta ESI-MS

— Inyección directa de extractos altamente orgánicos sin dilución — Facilita el uso de pequeños volúmenes de muestra

Elevado procesamiento de muestras

— Inyección directa de extractos de elevado contenido orgáncio que provienen de PPT, LLE o SPE sin necesidad de diluir o bien

evaporar y reconstituir


Columnas Acquity BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: Químicas HILIC

1.7 µm

UPLC

HPLC

2.5, 3.5, 5 & 10 µm

BEH HILIC — Partícula híbrida puente etileno sin funcionalizar

— Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC

XBridge]

— Rango pH: 1 – 9; Límite temp.: 45°C

— Excepcional forma de pico y retención para analitos básicos polares

BEH Amida — Selectividad alternativa para separaciones HILIC

— Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 µm [Columnas HPLC XBridge]

— Rango pH: 2 – 11; Límite temp.: 90°C

— Diseñada para la retención de analitos polares ácidos, neutros y básicos

— Columna ideal para carbohidratos/azúcares y glicanos


Análisis azúcares en columna 1.7µm BEH Amida

1) Fructose, 2) Glucose, 3) Sucrose, 4) Maltose, 5) Lactose

ACQUITY ELSD – 0.29mL/min, T= 35°C Elución isocrática 0.2%TEA en 75% ACN

Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

Patrón azúcares (1mg/mL)

1

Extracto mermelada arándanos (5mg/mL)

2

3

4

5

1

2

4

P-T

olu

am

ide


Agenda


HILIC


— HSS PFP








Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH: 2005

ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl

ACQUITY BEH C18 XBridge C18

ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18



Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, HSS: 2008





ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB

ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18

ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3


Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2010








ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C18

ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl

ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl


Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2011








ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C18

ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl

ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl Xselect CSH Fluoro-Phenyl

ACQUITY HSS CN XSelect HSS CN

ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP


Nuevos Rellenos XSelect/ACQUITY UPLC

HSS PFP —Selectividad excepcional para

isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares

HSS Ciano —Estable, compatible con RP & NP,

química CN reproducible

—Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18

©2011 Waters Corporation 17 Minutes 0.0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Condiciones : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF3COOH in H2O Mobile Phase B: 0.08% CF3COOH in ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B 0.0 92 8 6 0.1 92 8 6 4.45 50 50 7 4.86 10 90 6 5.0 92 8 6 6.0 92 8 6 Injection Volume: 1.0 µL Sample Diluent: 50:50 H2O: MeOH with 0.05% CF3COOH Sample Conc.: 100 µg/mL Temperature: 40 oC Detection: UV @ 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC®, with ACQUITY UPLC® TUV

Compuestos Ácidos 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid

UPLC® Gama Selectividad Derivados Ácido Caféico

HSS PFP

1

2

3

4

5

4

1

2

3

CSH Fluoro-Fenil 5


Agenda


HILIC


— HSS PFP








Nuevas Columnas 2.5 um XP eXtended Performance [XP]

Empaquetadas en hardware de baja dispersión – hardware UPLC

Diseñadas para trabajar hasta presiones de 18000psi

Compatibles con tecnología HPLC, UHPLC & UPLC

Configuraciones disponibles:

— Diámetros: 2.1 mm / 3.0 mm /4.6 mm

— Longitudes: 30 mm / 50 mm / 75 mm / 100 mm

— 14 Fases Estacionarias

Empaquetadas con partículas XBridge [BEH], XSelect [CSH&HSS] de 2.5 um con los siguientes ligandos: — BEH C18, Shield RP18, C8, HILIC & Amide

— CSH C18, CSH Fenil-Hexil, CSH Fluoro-Fenil

— HSS C18, T3, C18 SB, Ciano & PFP


Impacto de la Dispersión del Instrumento en el Rendimiento de la Columna

Instrumento UPLC de Ultra-baja dispersión

mejora el rendimiento de la columna, incluso con diámetros de 4.6 mm

A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido

fórmico Caudal: 1.4 mL/min

Mezcla NSAID (50-100 ug/mL) Detección UV a 270 nm

Gradiente (2.5µm): 35%B mantenido durante 2.37 min, rampa al 65%B en 9.05 min, mantenido durante 0.41

min, re-acondicionamiento al 35%B.

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

Alliance 2695 HPLC XSelect CSH C18 XP

4.6 x 75 mm, 2.5 µm

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

ACQUITY UPLC H-Class XSelect CSH C18 XP

4.6 x 75 mm, 2.5 µm

Tolm

etin

Nap

roxe

n

Feno

prof

en

Indo

met

haci

n

Dic

lofe

nac

15% disminución anchura pico

30% aumento altura pico


Resolución, Throughput y Sensibilidad: Comparación entre Columnas 2.5 µm XP y 1.7 µm UPLC

Columna 1.7 µm ACQUITY UPLC ofrece

2X mayor velocidad y 20% mayor sensibilidad

comparado con columnas 2.5 µm XP mientras se

mantiene la selectividad

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

XSelect CSH C18 XP 2.1 x 75 mm, 2.5 µm

Caudal: 0.54 mL/min


fórmico Mezcla NSAID (50-100 ug/mL)

Detección UV a 270 nm

Gradient e(2.5µm): 35%B al 65%B en 4.85 min, mantenido durante 0.66


Gradiente (1.7µm): 35%B al 65%B en 2.20 min, mantenido durante 0.3


Las 2 columnas se usaron en un sistema ACQUITY UPLC H-Class

ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

Caudal: 0.8 mL/min

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

Tolm

etin

Nap

roxe

n

Feno

prof

en

Indo

met

haci

n Dic

lofe

nac


Impacto del Tamaño de Partícula en el Rendimiento de la Columna

Columna 1.7 µm ACQUITY UPLC ofrece

15% aumento en Resolución Rs y

Capacidad de picos Pc 20% mayor sensibilidad comparado con columna

2.5 µm XP

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

XSelect CSH C18 XP 2.1 x 75 mm, 2.5 µm

Caudal = 0.54 mL/min

Presión = 5,300 PSI Peak Capacity = 34

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 75 mm, 1.7 µm

Caudal = 0.54 mL/min

Presión = 9,200 PSI Peak Capacity = 40

Tolm

etin

Nap

roxe

n

Feno

prof

en

Indo

met

haci

n

Dic

lofe

nac Rs = 5.5

Rs = 6.3

15% aumento en Rs y Pc

20% mayor sensibilidad

40% menor presión


fórmico Mezcla NSAID (50-100 ug/mL)

Detección UV a 270 nm

Gradient e(2.5µm): 35%B al 65%B en 4.85 min, mantenido durante 0.66


Gradiente (1.7µm): 35%B al 65%B en 2.20 min, mantenido durante 0.3


Las 2 columnas se usaron en un sistema ACQUITY UPLC H-Class


Agenda


HILIC


— HSS PFP








Allowable Adjustments in Chromatography <621>

Variable Allowable Changes

Before Stimuli Article PF 35(6) After Stimuli Article PF 35(6) Particle Size -50% Any allowed as long as column length to

particle size (l/dp) is maintained (±25%) Column Length ±70% Flow Rate ±50% Adjust for length, particle size and column ID Column ID Any allowed Any allowed

Injection Volume Any reduction Any allowed Column Temperature ±10% ±10%

Mobile Phase pH ±0.2 unit ±0.2 unit

When Stimuli Article PF 35(6) [Nov-Dec 2009] Officially Becomes Part of Chromatography <621>, Analysts Will Have More

Flexibility to Utilize Modern Chromatographic Techniques Such as UPLC Technology


Agenda


HILIC


— HSS PFP








Herramientas disponibles on line: Waters


Herramientas disponibles: Waters Vial Selector


Herramientas disponibles: Waters Columns Selectivity Chart


Herramientas disponibles: Waters Columns Selectivity Chart


Waters THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE.TM

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