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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DE CASILDA
COMBINACION DE ALCOHOL 70° Y RADIACION UV COMO MEDIDA
DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICOBACTERIAS AMBIENTALES
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER EN
BIOSEGURIDAD
Medica Veterinaria
Valeria Graciela Buey
2013
COMBINACION DE ALCOHOL 70° Y RADIACION UV COMO MEDIDA
DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICOBACTERIAS AMBIENTALES
TESISTA: Medico Veterinaria Valeria Graciela Buey
DIRECTOR: Magister en Ciencias Delia Susana Oriani
Prefacio
Esta tesis es presentada como parte de los requisitos
para optar por el grado Académico de Magister en
Bioseguridad, de la Universidad Nacional de Rosario y no
ha sido presentada previamente para la obtención de otro
título en esta Universidad u otras. La misma contiene los
resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en
el Laboratorio de Microbiología, dependiente de la Facultad
de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La
Pampa, bajo la dirección de Delia Susana Oriani, Profesor
Titular de Bacteriología y Micología de la UNLPam.
Diciembre 2013
Facultad de Ciencias Veterinarias
de Casilda UNR.
Valeria Graciela Buey
Agradecimientos
A mi directora por su apoyo incondicional en el transcurso de
todo el proceso de investigación.
A las autoridades de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
UNLPam por brindarme el apoyo económico para realizar esta
maestría
A mis compañeras de la Cátedra de Microbiología.
Y principalmente a mi familia.
Dedico esta tesis a mi marido y a mis hijos,
Que me apoyaron mes a mes para poder
culminar esta maestría.
Índice
Resumen 1
Introducción 2
Características del género 6
Generalidades de Bioseguridad 8
Generalidades de desinfección y esterilización 14
Problema Científico 21
Hipótesis 22
Objetivos 22
Materiales y Métodos 23
Resultados 25
Discusión 28
Conclusión 32
Bibliografía 33
1
Resumen
El personal que trabaja en los laboratorios de microbiología está expuesto en
general a una serie de riesgos biológicos a partir de las muestras que se
procesan. Además del riesgo compartido con los laboratorios de microbiología
clínica convencional, los laboratoristas de micobacterias lo están aún más
debido a los complejos pasos que presenta dicho diagnóstico,
fundamentalmente en la descontaminación de la muestra. Este proceso
involucra el uso de líquidos, micropipetas, tips , lavados y centrifugaciones
que favorecen la generación de aerosoles y salpicaduras, pudiendo traer
aparejado la transferencia accidental de bacilos desde los cultivos positivos
tanto a las soluciones como a las y superficies de trabajo o del material. Estos
errores, que en general pasan inadvertidos, generan consecuencias
indeseables ya sea por la contaminación cruzada y la interferencia en el
diagnóstico, como por el riesgo potencial de infecciones en el personal del
laboratorio. El objetivo del presente trabajo fue valorar el poder desinfectante
de la combinación de alcohol 70°-UV en la superficie de la campana de
contención posteriormente a la contaminación de la misma con una
suspensión de una cepa propia de Mycobacterium porcinum aislada de agua
de red. El proceso de secado de las microgotas inoculadas de la suspensión 1
Mac Farland de M.porcinum sobre la superficie de la campana, redujo en un
50% el número de microorganismos evidenciando la viabilidad de los
microorganismos en los extendidos secados por calor.
La combinación de alcohol 70º y la exposición a UV simultánea durante en 30
minutos redujo entre uno y dos logaritmos el inoculo seco; a los 60 min de
exposición no se logró recuperar M. porcinum considerando que el número de
bacterias viables se redujo a una unidad contaminada por cada 10 unidades
idénticas procesadas.
2
INTRODUCCION
Al abordar el tema de la bioseguridad en microbiología ambiental debemos
tener presente que el medio ambiente alberga tanto microorganismos
altamente patógenos como son entre otros las esporas del Bacillus antrhacis,
como así también bacterias saprofíticas que interactúan con los vegetales
facilitando el desarrollo de la agricultura tales como las distintas especies del
genero Rhizobium. Los microorganismos en el ambiente pueden ser
transitorios y encontrarse ocasionalmente (alóctonos) o bien formar parte de la
flora residente (autóctona). La concentración de microorganismos patógenos
viables en el medio ambiente es inferior si la comparamos a la que se presenta
en especímenes provenientes de individuos enfermos o portadores debido la
mayor competencia que le proporcionan los microorganismos autóctonos.
Cuando nos referimos a la bioseguridad en el laboratorio de microbiología y
específicamente en el área micobacterias debemos considerar que el género
Mycobacterium comprende más de 130 especies, 49 de ellas son consideradas
ambientales. Actualmente se han propuestos tres epítetos para clasificar a las
micobacterias (Kazda, et. al., 2009):
Micobacterias Patogenas Obligadas (OPM): son altamente virulentas, su
supervivencia en el ambiente es muy limitada (Complejo tuberculosis: M.
tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M canetti, M. capreae, M. microti y M.
pinnipedii y complejo Lepra: M. leprae y M. lepraemurium).
Micobacterias Potencialmente patógenas (PPM): se aíslan tanto de ambientes
terrestres como acuáticos pudiendo, bajo ciertas circunstancias causar
enfermedades en individuos que padecen enfermedades crónicas o trastornos
en el sistema inmune, ejemplo de estos son: el complejo Mycobacterium
avium (MAC) y complejo MAIS (M. avium-intracellulare-scrofulaceum).
Micobacterias Saprofitas Ambientales (ESM): comprende especies saprofitas
que no son patógenas o lo son esporádicamente. Estas especies son
importantes en el desarrollo de la agricultura, ya sea, interviniendo en la
degradación de hidrocarburos, tal es el caso de M. flavum y M. vaccae en la
fijación libre de nitrógeno y en la solubilización del fosfato de calcio.
3
Las especies del segundo y tercer grupo se las denomina comúnmente como
micobacterias no tuberculosas (MNT), micobacterias atípicas, mycobacteria
other than tuberculosis (MOTT) , o simplemente micobacterias ambientales
(MA) cabe destacar que no presentan huésped animal primario, se encuentran
en el polvo, suelo y agua ; se trasmiten por inhalación, ingestión e inoculación.
No existe evidencia de transmisión directa entre individuos, las afecciones que
producen se conocen como micobacteriosis, (Hernandez Borje y García
Hidalgo, 2008).
Algunas especies de micobacterias ambientales son consideradas como
patógenos emergentes causando infecciones oportunistas tanto en animales
como en el hombre. La lentitud en reproducirse, debido a la hidrofobicidad,
parece ser una desventaja de las MA, sin embargo le garantiza resistencia a la
cloración, a los biosidas y a los antibióticos. La hidrofobicidad también le
facilita la adquisición de nutrientes, la formación de biofilm y la consecuente
propagación por aerosoles. Otra característica importante que favorece la
sobrevida y perdurabilidad de las MA en el medio ambiente es la marcada
tolerancia al stress así como la capacidad para invadir a protozoos de vida
libre, estableciendo asociaciones tanto de parasitismo como de simbiosis. Los
mecanismos moleculares de patogénesis intracelular en animales y en
protozoos son similares ( Primm et. al., 2004).
Los individuos inmunocompetentes pueden ser susceptibles a micobacteriosis
cutáneas que suelen aparecer después del contacto de heridas traumáticas o
quirúrgicas, con agua u otros productos contaminados, formando pápulas,
pústulas, ulceras o lesiones de paniculitis como manifestaciones más comunes.
La vía de entrada puede ser única o múltiple como sucede en el caso de la
mesoterapia, la depilación, la acupuntura, manicura , pedicura, tatuajes y
liposucción entre otros. Han sido reportado casos de infección de este tipo por
M. chelonae y M. abcessus (DaMataJardın, 2010). Respecto a los tatuajes, las
lesiones presentadas incluyen dermatitis de contacto, fotodermatosis,
reacciones liquenoides y granulomas. El origen aparente es la contaminación
de la tinta (Ara et. al., 2001). En pediatría, la manifestación más común es las
linfadenitis cervical crónica ocacionada por Mycobacterium avium complex
4
seguida de M.scrofulaceum y M. kansasii . La enfermedad micobacteriana
diseminada, se presenta especialmente en pacientes inmunodeprimidos,
(Baquero y Artigao, 2005). En Argentina, Oldrino y colaboradores (2010) han
reportado un caso de micobacteriosis pulmonar causada por Mycobacterium
simiae en un paciente pediátrico infectado por el virus de inmunodeficiencia
humana. En la provincia de Córdoba, el 32% de los casos reportados entre
1991 y 2000 de micobacteriosis pulmonar corresponden a micobacterias
ambientales de especies como M. fortuitum, M.kansasii, M. chelonae y en
mayor proporción M. avium-intracelulare (Barnes, et. al., 2004).
5
CARACTERISTICA DEL GÉNERO
El género Mycobacterium se caracteriza por ser bacilos aerobios estrictos,
mesófilos, inmóviles, pleomórficos, acapsulados y no esporulados. La
membrana celular le otorga a la célula protección osmótica y transporte de
iones y moléculas, en tanto que la pared le brinda soporte mecánico y
protección ya que presenta en su composición un elevado contenido lipídico
(60 % del peso seco de la misma). Los principales compuestos de la pared son
peptidoglicanos, arabinogalactanos, acidos micólicos y glicopeptidolípidos. En
la membrana encontramos moléculas de liposacaridos, lipoarabinomananos
(LAM), lipomananos (LM) y fosfatidil inositol monosidos. Algunos de ellos
implicados en la vida endocelular tales como los glicopeptidolipidos, LAM y LM,
acidos micólicos, 2,3-Di-O-aciltrehalosa (DAT), glicanos, cera C, sulfolípidos,
proteínas del choque térmico y enzimas como la catalasa y micobactina. La
pared le confiere escasa permeabilidad celular, dificultad para la tinción de
Gram, así como un tiempo de generación prolongado (3 a 18 h) (Alcaide
Fernández de Vega et. al, 2005). En el medio ambiente la hidrofobicidad le
premite sobrevivir en ecosistemas oligotrofos ya que atraen nutrientes y
pequeños compuestos orgánicos, condición que les otorga ser los pioneros en
la formación del biofilm. Además la tendencia a desarrollarse en la interfase
aire- agua favorece la formación de aerosoles y estos son uno de los
mecanismos más efectivos para acceder al pulmón (Primm et. al., 2004).
Las necesidades nutritivas de las micobacterias ambientales son sencillas
siendo necesaria una fuente de carbono como el glicerol o el piruvato,
nitrógeno, sales minerales y lípidos aportados por huevos preferentemente de
gallinas alimentadas a grano (Löwenstein Jensen y Stonebrink).
Los factores de virulencia de las MNT incluyen componentes de la envoltura
celular, enzimas y otras moléculas que actúan como moduladores de la
respuesta inmune. Los factores de virulencia son determinantes para la
colonización, supervivencia y proliferación micobacteriana en diversos tejidos
del huésped y la resistencia en el medio ambiente.
En la envoltura celular micobacteriana se encuentran aquellos compuestos que
le otorgan una importante barrera de permeabilidad para moléculas polares y le
6
confiere además resistencia a la acción de ácidos y álcalis e hipoclorito (Elhers
y Daffe ,1998). Entre ellos se encuentran los:
Glicopeptidolípidos (GPL). Constituyentes predominantes de la envoltura de
numerosas MNT (Schorey y Sweet, 2008). Su presencia, se asocia a al
deslizamiento “sliding” que presentan algunas cepas. Esta característica se
encuentra relacionada a la capacidad de producir biofilm que actúa como
protector de una gran variedad de condiciones de stress ambiental (rayos
ultravioleta, cambios de pH, shock osmótico y desecación) (Loera Muro et. al.,
2012).
Los ácidos micólicos le confieren al microorganismo resistencia al daño
químico, a la deshidratación, a diversos antibióticos y sustratos hidrofílicos
(Gao, et. al 2003).
7
GENERALIDADES DE BIOSEGURIDAD
La bioseguridad en microbiología, es el conjunto de medidas mínimas que
deben ser adoptadas, con el fin de reducir o minimizar los riesgos para el
personal, la comunidad y el medio ambiente, que pueden ser producidos por
los agentes infecciosos.
El término “contención” se refiere a los métodos seguros para manejar
materiales infecciosos en el ambiente del laboratorio. La contención primaria
es la protección contra la exposición de agentes infecciosos del personal así
como del ambiente inmediato del laboratorio; mientras que la contención
secundaria se refiere, a la protección del medio ambiente externo al laboratorio.
Para que ambas contenciones sean efectivas debe existir una combinación
entre el diseño de la instalación y las prácticas operativas, siendo el requisito
más importante el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas
microbiológicas ( National Institutes of Health, 2007).
Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales
potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales y también
estar capacitadas y ser expertas en las prácticas y técnicas requeridas para
manipular dichos materiales en forma segura. Los laboratorios deben disponer
de protocolos de trabajo para las técnicas que se realizan en dicha instalación,
así como un manual de bioseguridad, propio, que contenga información sobre
las normas de bioseguridad y de prevención sanitaria del personal, manejo de
residuos, equipos de seguridad, planes de contingencia y procedimientos de
emergencia y transporte de sustancias peligrosas (Jonathan et. al.,1999). En
1983, fue publicada la primera edición del manual de bioseguridad en los
laboratorios, proporcionando así la orientación práctica sobre las técnicas de
bioseguridad en todos sus niveles. Las técnicas microbiológicas apropiadas y el
uso correcto del equipo de bioseguridad fueron promovidas por personal bien
adiestrado, siendo los pilares fundamentales de la bioseguridad en el
laboratorio. Sin embargo, los importantes avances tecnológicos, la aparición de
nuevas enfermedades y las graves amenazas que suponen el uso indebido así
como la liberación de agentes microbiológicos y toxinas han hecho necesario
revisar los procedimientos conocidos (OMS, 2005).
8
Fernández y Castillo en el año 2000, enumeraron algunas de las causas más
frecuentes de infecciones en el personal de laboratorio entre las que se
encuentran:
Auto inoculación accidental con agujas, pipetas, bisturíes u otros
elementos punzantes.
Exposición de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos
biológicos contaminados, especialmente cuando la permeabilidad de las
mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas, herpes,
conjuntivitis o quemaduras.
Inhalación de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos,
al expulsar la última gota de una pipeta o bien durante la centrifugación
ya sea al emplear tubos abiertos o con mayor volumen del aconsejado,
así como en la utilización de centrífugas de ángulo fijo o cuando son
frenadas abruptamente.
Salpicaduras en los ojos o aspiración bucal.
Los Aerosoles fueron clasificados por la agencia de protección ambiental
(E.P.A) en el año 1983. Las partículas de rango de 1 µ a 10 µ caen con una
velocidad constante y calculable en aire quieto (Ley de Stokes). Sin embargo,
su mantenimiento en el aire puede deberse a corrientes del mismo.
Las partículas mayores de 10 µ, caen rápidamente aunque pueden mantenerse
en el aire cerca de donde se generan. Según el tamaño de partícula se
distinguen los núcleos de Well (1-10 micras de diámetro) y las gotitas de
Pflugge (alrededor de 100 micras). La medida de la mayoría de las bacterias
fluctúa entre 0,2 µ y 0,7 µ, aunque normalmente están agrupadas en colonias o
alojadas en partículas de mayor tamaño (Arden Pope, III et. al., 2009).
Para poder conocer los peligros relativos que entrañan los microorganismos
infecciosos se los ha clasificado en 4 grupos sobre la base del riesgo individual
y el riesgo para la comunidad. De esta manera el Grupo de riesgo 1 (riesgo
individual y poblacional escaso o nulo) abarca microorganismos que tienen
pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los
animales. El grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional
bajo) contiene agentes patógenos que pueden provocar enfermedades
9
humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un
riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio
ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave,
pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces siendo limitado.el
riesgo de propagación que presentan. El grupo de riesgo 3 (riesgo individual
elevado, riesgo poblacional bajo) incluye agentes patógenos que provocan
enfermedades humanas o animales graves, que raramente se propagan de
un individuo a otro y existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Por
ultimo el grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) en el cual
los agentes patógenos provocan enfermedades graves en el humano y/o los
animales, se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o
indirectamente. En general no existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces. Cada región o país deberá elaborar su propia clasificación de
microorganismos teniendo en cuenta factores como la patogenicidad del
microorganismo; el modo de transmisión y la gama de huéspedes; la
disponibilidad local de medidas preventivas y tratamientos eficaces (OMS
2005).
Por otro lado, los laboratorios también se clasifican en distintos niveles de
bioseguridad basándose en una combinación de las características de diseño,
construcción, medidas de contención, equipamientos, prácticas y
procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos
de los distintos grupos de riesgo. El nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio
básico en el cual los requisitos son mínimos en lo referido a contención
primaria y secundaria, haciéndose hincapié en las prácticas y los
procedimientos de laboratorio que constituyen la base de las técnicas
microbiológicas apropiadas, las cuales se encuentran enumeradas en el
Código de Practicas del Manual de Bioseguridad de la OMS. En el BSL 1 se
realizan tareas de enseñanza e investigación. En el nivel de bioseguridad 2
(BSL 2) además de lo requerido en el BSL1 se le agregan mayores
requerimientos como dispositivos de pipeteo, según el trabajo a realizar, una
campana vidriada con mechero de Bunsen o una cabina de bioseguridad con
incinerador de ansa, autoclaves para esterilizar material contaminado. Todos
10
los aparatos deben ser validados por métodos apropiados antes de ser
utilizados. El personal debe estar capacitado para realizar las técnicas y/o
procedimientos, debe contar con un manejo de desechos adecuado. En este
nivel de laboratorio pueden realizarse tareas de diagnóstico e investigación.
Respecto al nivel de bioseguridad 3 (BSL 3) es un laboratorio de contención
que se encuentra concebido e instalado para trabajar con microorganismos del
grupo de riesgo 3, así como con grandes volúmenes o concentraciones de
microorganismos del grupo de riesgo 2, por entrañar un mayor riesgo de
difusión de aerosoles. A los requerimientos mencionados para el BSL 2 se le
agregan otras modificaciones, principalmente en las instalaciones (transito
restringido, doble puerta, pisos, paredes y techos impermeables, filtrado del
aire que se libera al medio ambiente antes de salir, ventilación direccionada
entre otras). Los requerimientos de equipamiento son mayores. Se trabaja
siempre en cabinas de bioseguridad I y II, el agua debe ser tratada antes de
acceder al sistema público de cloacas. En este nivel de laboratorio se realizan
diagnósticos especiales e investigación. En el laboratorio de bioseguridad 4, a
los requisitos de contención expuestos en el nivel de bioseguridad 3 se le
agregan otros requisitos haciendo hincapié no solo en lo edilicio sino en la
contención primaria. Se trabaja con unidades de patógenos peligrosos (Nivel 4
de microorganismos) siendo necesario el uso de una contención primaria muy
eficiente (uso de trajes especiales, cabinas de bioseguridad III y IV) así como
un mayor control en la contención secundaria (tratamiento de efluentes,
ventilación, decontaminación de todo los materiales, la energía eléctrica debe
ser redundante, entradas herméticas) (OMS 2005). En todos los niveles el
personal debe ser entrenado y concientizado de las prácticas a realizar y de los
riesgos a los que está expuesto.
La asignación de un microorganismo a un nivel de bioseguridad para el trabajo
de laboratorio, dependerá de la valoración del riesgo que presente. El nivel de
bioseguridad, para un trabajo concreto dependerá del juicio profesional
elaborado mediante la evaluación del riesgo, considerando por un lado, el
microorganismo utilizado, las instalaciones disponibles, el equipamiento y las
prácticas y/o procedimientos apropiados (World Health Organization 2012 ).
11
Se han establecido diversos criterios para la clasificación de los laboratorios de
micobacterias, de forma que las necesidades de equipamiento y la capacidad
de los mismos pudiesen estar de acuerdo con las posibilidades diagnósticas
que éstos pudiesen ofrecer. Es recomendado el nivel de BSL 2 para el
laboratorio de micobacterias ambientales con los elementos de contención ya
descriptos anteriormente (Alcaide Fernández de Vega et. al., 2005).
La mayoría de los accidentes en el laboratorio de micobacterias puede
reducirse mediante la práctica de procedimientos microbiológicos adecuados,
el uso de dispositivos de contención y protección y un diseño de las
instalaciones apropiado (López-Cerero, et. al., 2006).
El cultivo de todas las micobacterias requiere de procedimientos especiales
que consisten en la descontaminación de la muestra, la neutralización y la
concentración de estos microorganismos, ya sea por centrifugación (método de
Petroff para M. tuberculosis y M. bovis) o por filtración (Método de Kamala
1994, Iivanainien 1999 para micobacterias ambientales). Esta compleja
técnica del cultivo favorece sutiles errores de manipulación que suelen pasar
inadvertidos, los puntos críticos consisten en la formación de aerosoles ya sea
en la centrifugación, filtración así como en la manipulación de líquidos
contaminando superficies que alberguen bacilos por períodos prolongados ,
pudiendo generar además transferencia de bacilos de una muestra a otra (De
Ramos et. al, 1999); (Burman y Reves ,2000).
La probabilidad de estos accidentes es mayor cuando existe sobrecarga de
trabajo o bien cuando se procesan escasas muestras por falta de habilidades
de los operarios (Boer et. al., 2002).
Se atribuye un riesgo mayor de falsos cultivos positivos al uso de medios
líquidos. La manipulación de líquidos favorece la formación de aerosoles, lo
que acrecienta el riesgo de contaminación cruzada. Además, las pipetas y en
particular, las micropipetas empleadas para dispensarlos, pueden
contaminarse y transferir bacilos (Gascoyne-Binzi, et al., 2001).
Todos las especies de micobacterias, tuberculosas y no tuberculosas, están
clasificadas en segundo lugar en la escala de resistencia a los desinfectantes
luego de las esporas bacterianas (Primm, 2004).
12
Estudios realizados muestran que para la desinfección de superficies como
mesadas o campanas de contención, el hipoclorito de sodio al 1% y el alcohol
al 70° con un tiempo de exposición de 25 minutos son suficientes para
inactivarlas ( Oriani y Sagardoy 2006).
Otros estudios muestran la resistencia de distintas micobacterias no
tuberculosas al hipoclorito de sodio en distintas condiciones de pH y
temperatura. También fue evaluada la resistencia a la UV aplicándola en
distintas intensidades, hallando que dentro de las especies utilizadas M.
fortuitum fue la más resistente (Lee et. al., 2010).
13
GENERALIDADES DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACION.
Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de desinfección
o de esterilización, que le provoca una pérdida de viabilidad, se observa una
disminución progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes en
función del tiempo de exposición al agente esterilizante o desinfectante.
La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo que
se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a
cero.
Una forma útil de caracterizar la inactivación de los microorganismos por
agentes físicos o químicos es mediante la ley de Chick- Watson. Esta ley
puede tomarse como referencia para conocer el comportamiento de un
determinado proceso de desinfección.
Conociendo el número de microorganismos y la cantidad de ellos en un
determinado tiempo (N/N0), se puede determinar el valor de k es decir, la
velocidad de reacción con el desinfectante ya sea físico o químico.
Básicamente se parte de la siguiente ecuación:
N= N0 . e –Kt
N= número de sobrevivientes
N0= número inicial de microorganismos
K es la tasa de muerte (min -1)
t es el tiempo de exposición al agente.
El coeficiente K (pendiente de la recta) es función de las condiciones de
esterilización (temperatura, tenor de humedad, concentración del agente) y de
la resistencia del microorganismo al proceso de esterilización.
Cuando se trata de esterilización por calor se determina el tiempo en el cual
una fracción defina del microorganismo muere independientemente del inóculo
inicial. Denominado tiempo de reducción decimal (D) esto es el tiempo
14
requerido para reducir la población microbiana un 90 % o un orden de
magnitud. N=N0. 10 –1
Menores valores de D significan una mayor tasa de muerte o una muerte más
rápida.
Graficando el logaritmo del número de microorganismos sobrevivientes en
función del tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se
obtiene una recta. La pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es
Log N0. Por lo explicado anteriormente, la pendiente de la recta está
determinada por las condiciones de esterilización y de la resistencia del
microorganismo.
Cuando el Log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de
probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto cuando el valor de la probabilidad
sea -1 significa que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o
correctamente expresado: una unidad contaminada por cada 10 unidades
idénticas procesadas.
Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades
contaminadas es menor o igual a 10 -6, esto es una unidad contaminada cada
millón de unidades idénticas procesadas. (Medigan, 2010)
Grafico 1. Representacion de tiempo de reducción decimal (D).
15
Uno de los métodos físicos de esterilización es el calor: todos los
microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del mismo. El
calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las
membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. El
calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Se utiliza
el autoclave con y sin presión. El calor seco produce desecación de la célula,
efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y
fusión de membranas. A su vez el calor seco puede utilizarse directa o
indirectamente. La primera puede realizarse por incineración o por llama
directa y la segunda con aire caliente utilizando hornos. La esterilización por
llama directa se utiliza principalmente para eliminar microorganismos del ansa,
teniendo en cuenta las distintas zonas de temperatura que presenta esta fuente
de calor para evitar la formación de aerosoles. Cabe recordar que un mechero
Bunsen alcanza un halo de esterilidad del aire de 30 cm. (Medigan, 2010).
Otro método físico empleado en la desinfección del aire, agua, alimentos y
gabinetes de seguridad biológica es la radiación ultravioleta (UV), considerada
una alternativa a la desinfección química para la reducción de formas
vegetativas de bacterias, virus y hongos. Posee propiedades germicidas en un
rango de longitudes de onda de entre 100 y 280 nm. El mecanismo de
inactivación de la UV se debe a la transformación fotoquímica de las pirimidinas
en el ADN bacteriano o viral formando dímeros impidiendo de esta manera la
multiplicación. Las tasas de inactivación microbiana varían dependiendo de la
especie de microbios, la población microbiana y la longitud de onda de la luz
UV. Estas radiaciones pueden ser de cuatro tipos UV entre 100 y 200 nm, UVC
entre 200 y 280 nm, UVB entre 280 y 315 nm, y UVA entre 315 y 400 nm
dependiendo de su longitud de onda. La aplicación práctica de la desinfección
UV se basa en la capacidad germicida de UVC y UVB. La radiación UV 254 nm
destruye en primer término a las formas vegetativas bacterianas, luego a los
virus y por último a las formas esporuladas (Wright y Cairns, 1998). La UV no
penetra superficies sólidas, opacas, adsorbente de luz y su utilidad se limita a
la desinfección de superficies (Medigan, 2010).
16
Esquema 1. Espectro de radiaciones. www.alimentosargentinos.gob.ar
La radiación emitida se mide en Watts (W) y la intensidad de la radiación en
W/m².
Para una desinfección eficaz es importante conocer la dosis de radiación
necesaria para reducir la carga del microorganismo, la misma es el producto
entre la intensidad de la radiación (I), expresada como energía por unidad de
área y el tiempo de residencia o contacto con la luz UV (t) en segundos.
La dosis (D) se mide en J/m² (1 Joule = 1 Watt):
D (J/m²) = I (W/m²) x t (s)
También suele expresarse en mJ/cm2 = μW s/cm2
La resistencia de los organismos a la luz ultravioleta es variada. El ambiente en
el que se encuentran también influye en la dosis necesaria para su destrucción.
La relación entre la dosis y la destrucción de un microorganismo por
tratamiento con luz UV puede verse de la siguiente forma N = N0 e-KD
Donde:
N0 = número inicial de microorganismos
17
N = Numero de microorganismos después del tratamiento
Para M. tuberculosis la dosificación necesaria para inactivar 1 Log es de 6
mWs/cm2 y para reducir 2 log es necesario aplicar 10 mWs/cm2. Mientras que
para M. smegmatis es de 200J/m2 (Dominguez;
www.alimentosargentinos.gob.ar). Y para reducir la misma cantidad de M.
intracellulare yM. fortuitum son necesarias 25 y 103 mJ/cm2 respectivamente
(Bohrerova y Linden, 2006) .
Otra alternativa dentro de los agentes germicidas la constituyen los químicos.
La resistencia de los microorganismos a estos, no es uniforme debido a
diferencias en la estructura, tamaño y características de los microorganismos,
jerarquizando la resistencia a los distintos agentes químicos (Leon et. al.,
2004).
Las variables que influyen en la efectividad de los procesos de desinfección
son: el tiempo de contacto con el desinfectante, la carga bacteriana y la
cantidad de materia orgánica presente (Vives et. al., 2004).
La velocidad de muerte mediante agentes químicos o físicos sigue una recta
de orden logarítmico, donde el número de microorganismos muertos en cada
período de tiempo es un porcentaje constante del número de microorganismos
vivos al comienzo de dicho período ( Vives et. al., 2004) .
Al aplicar la ley de Chick - Watson en el empleo de germicidas químicos es
necesarios agregar la concentración del desinfectante: N/No= e-KTC
El tiempo necesario para destruir los microorganismos presentes en un área a
desinfectar es directamente proporcional al logaritmo de la concentración
inicial. Por lo tanto, se requiere mayor tiempo para destruir concentraciones
altas de microorganismos (Vignoli , 2008).
El mecanismo bactericida de los alcoholes consiste en solubilizar las
membranas lipídicas celulares y desnaturalizando sus proteínas. La máxima
eficacia se alcanza al diluirlos en agua hasta alcanzar una concentración final
de 70° en el caso del alcohol etílico ya que en concentraciones mayores la
deshidratación inicial de las proteínas celulares las hace resistentes a la
18
desnaturalización (Adams , 2001).
La temperatura influye en la desinfección química aumentando la velocidad de
muerte por cada grado de incremento de la misma.
La actividad de un agente antimicrobiano se ve influenciado por los cambios de
pH. El pH influye sobre los desinfectantes químicos determinando el grado de
disociación de sus moléculas activas y este hecho puede estar estrechamente
ligado al poder antimicrobiano. (Vignoli , 2008).
La presencia de materia orgánica puede alterar dichas combinaciones
disminuyendo la concentración efectiva con la consecuente pérdida parcial o
total de eficacia (por causas como adsorción superficial del desinfectante por
coloides, formación de compuestos inertes o bien la presencia de una capa
protectora formada por el microorganismo que impida el contacto adecuado)
(Vignoli , 2008).
La mayoría de los desinfectantes de uso corriente actúan eficientemente frente
a formas vegetativas de bacterias. Las bacterias Gram positivas en general
son más sensibles que las Gram negativas a algunos desinfectantes. Las
formas que ofrecen mayor resistencia son las esporas bacterianas y las
bacterias acido alcohol resistentes las cuales se ven afectadas por algunos de
los agentes químicos luego de prolongados períodos de exposición. (Vives et.
al., 2004; Leon, et. al., 2004).
Los mecanismos de acción desinfectante son complejos. Una de las
clasificaciónes de los agentes desinfectantes se basa en el blanco de acción
(Vignoli , 2008).
De acuerdo al lugar de la célula sobre el cual actúan tenemos
a) Pared y membrana celular: provocan una desorganización de la pared y/o
membrana celular interfiriendo con sus funciones, pudiendo ocasionar la
pérdida de diferentes metabolitos.
Ej: Aldehídos, tensioactivos aniónicos, agentes quelantes, fenoles y derivados.
b) Material nuclear: provocan reacciones de alquilación de las bases puricas
19
(guanina y adeninas) reemplazando un atomo de hidrógeno con un grupo
alquilo,causando el daño o muerte del microorganismo Ej.: Agentes alquilantes,
colorantes, acridinas, óxido de etileno.
c) Grupos enzimáticos o proteínas: provocan desnaturalización y precipitación
de las proteínas por oxidación o alquilación de grupos sulfhídrilos, carbonilos,
etc. Ej: Agentes oxidantes, halógenos, agentes alquilantes y alcoholes
(Arévalo, et. al., 1996).
Niveles de eliminación de microorganismos
Los agentes químicos pueden ser clasificados desde diferentes puntos de
vista. El C.D.C. (Center of Disease Control) en 1985 definió los niveles de
Eliminación de microorganismos como: esterilización , desinfección de alto
nivel; desinfección de nivel intermedio; desinfección de bajo nivel. La
desinfección de alto nivel destruirá todos los microorganismos, con la
excepción de un alto número de esporas bacterianas. La desinfección de nivel
intermedio inactiva Mycobacterium tuberculosis, formas vegetativas, muchos
virus, muchos hongos, pero no necesariamente esporas bacterianas. Una
desinfección de bajo nivel puede eliminar muchas bacterias, algunos virus y
algunos hongos, pero no puede eliminar microorganismos resistentes tales
como M. tuberculosis y esporas bacterianas.
La Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) editó en 2009 las normas
para la determinación de la actividad bactericida de desinfectantes y
antisépticos que se utilicen en forma líquida y que sean miscibles en agua.
En todos los casos se debe tener en cuenta: la elección de la cepa bacteriana,
el tiempo de contacto, el umbral de actividad mínima buscada y las
condiciones físico-químicas en que se realiza el ensayo.
20
PROBLEMA CIENTIFICO
Es reconocido que todo el personal que trabaja en un laboratorio de
microbiología está expuesto a una serie de riesgos biológicos a partir de las
muestras que se procesen y de los cultivos que se manipulen. Específicamente
en el laboratorio de investigación de micobacterias ambientales reconocemos
dos situaciones donde debemos valorar el proceso de inactivación total de las
micobacterias que, debido a que su viabilidad, resultaría un riesgo potencial de
infección por la formación de aerosoles. Dichas situaciones son : 1) en los
procesos de manipulación de las cepas aisladas para tipificación bioquímica y
2) en el procesamiento de las muestras ambientales con menor carga de
microorganismos que el proceso antes mencionado.
El mayor riesgo de contaminar las superficies de trabajo se produce cada vez
que se destapan los tubos tapa a rosca conteniendo micobacterias, cuando se
suspenden cepas, así como en la incineración del ansa cargada de
microorganismos en el mechero de Bunsen debido a la generación de
aerosoles de partícula mínima. Por su pequeño tamaño pueden permanecer
largo tiempo en la campana hasta que son sedimentados y de no ser
inactivados física o químicamente, ante débiles corrientes de aire generadas
por la manipulación dentro de la campana pueden re suspenderse
nuevamente.
Los bacilos pueden permanecer viables en equipos o soluciones de trabajo
contaminadas durante períodos prolongados lo cual induce a obtener
resultados falsos positivos. (Ramos, et. al., 1999); (Kantor, et. al., 1999)
La realización de controles rutinarios o periódicos son un excelente indicador
para evaluar el adecuado funcionamiento de los proceso de inactivación.
El punto crítico de control establecido es la campana de contención después
de manipular cepas de micobacterias ambientales.
En el laboratorio de micobacterias, perteneciente a la Cátedra de
Microbiología de la Universidad Nacional de La Pampa se manipulan
fundamentalmente especies micobacterias no tuberculosas para la
21
investigación. Como resultado de estas prácticas el personal de laboratorio,
está expuesto a los riesgos antes mencionados, siendo entonces, necesaria la
validación de los procesos de inactivación empleados con el propósito de
minimizar el riesgo biológico en este laboratorio.
La cepa elegida para este trabajo fue Mycobacterim porcinum. Es una
micobacteria no cromógena de crecimiento rápido descrita por Tsukamura y
colaboradores en 1983, asociada a infecciones en animales, que no ha sido
referida en muestras clínicas humanas hasta el año 2004 donde fue
identificado como Mycobacterium fortuitum tercera biovariedad D-sorbitol-
negativo. Existen reportes de aislamiento en casos de osteomielitis esternal
posquirúrgica en porcinos (Idigoras et. al., 2007) y hallazgo de necropsia en los
nódulos linfáticos de animales. (Wallace et. al., 2004).
Tiene capacidad para formar en medios como el MB 7H9 (MB) con y sin
glicerol (Oriani et. al., 2013).
HIPOTESIS
La combinación de alcohol 70º y la luz ultravioleta sobre un inoculo
previamente secado por calor de M. porcinum son efectivos para reducir el
número de bacterias viables en un tiempo inferior a 120 minutos.
OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo es valorar una combinación de un método
físico y químico en el proceso de inactivación en micobacterias ambientales.
Objetivo especifico
Evaluar el procedimiento de desinfección con alcohol 70º y UV en la
campana de contención, posteriormente a la manipulación de una cepa de
Mycobacterium porcinum.
22
MATERIALES Y METODOS
El proceso de aislamiento de MA se realiza en una campana de contención
vidriada con puerta tipo guillotina (foto1) que cuenta con mechero de bunsen y
luz ultravioleta.
Se trabajó con una cepa de M. porcinum aislada de agua corriente de la ciudad
de General Pico La Pampa en época estival, tipificada bioquímicamente y
molecularmente.
Se establecieron 5 sitios (foto 2) 1, 2, 3, 4 y 5 con una superficie de 25 cm2
delimitados por una plancha de acero inoxidable, cada uno a 3 cm del
mechero de Bunsen. Se preparó una suspensión de un cultivo joven de M.
porcinum equivalente al tubo 1 de Mac Farland (3 x 108 b/ml). Los sitios se
contaminaron con 100µL (5 x 25 µL) de dicha suspensión. Se esperó el tiempo
necesario hasta el secado de las mismas (aproximadamente 50 min) con el
mechero encendido y la campana cerrada alcanzando una temperatura de 27
+/- 2 ºC. Una vez seco, se hisopó el sitio 1 para establecer el número real de
bacterias al comenzar el experimento. Para el muestreo de todas las áreas, se
utilizaron hisopos estériles embebidos en solución de NaCl 0,85% estéril. Una
vez muestreada la superficie el hisopo se resuspendió en 3 mL de solución de
NaCl 0,85%. A la cual se le determino el número de M. porcinum viables,
siguiendo el método de las diluciones en base 10 sembrando 100 µL, por
duplicado, en placas con agar Müller Hinton (MH). Además se inocularon 100
µL de la suspensión en tubos pico de flauta con medio Lówenstein Jensen (LJ)
para observar posibles alteraciones en el fenotipo de la colonia. Las placas y
tubos se incubaron a 32ºC hasta la visualización de colonias (foto 3).
Posteriormente se aplicó en toda la campana de contención con mechero
apagado, el tratamiento de desinfección propuesto, que consistió en la
pulverización de alcohol 70º (diluido al momento del experimento) y a la
exposición de UV (260 nm) durante 1 hora (el tubo de luz UV se encuentra
ubicado a 72 cm del área a muestrear, los rayos inciden en forma perpendicular
a la muestra). La campana se mantuvo cerrada y la habitación iluminada con
luz natural y artificial.
23
Cada 30 minutos se realizaron los muestreos correspondientes a los sitios
preestablecidos (2, 3, 4 y 5) correspondiéndoles 30, 60, 90 y 120 minutos de
tratamiento respectivamente. Se determinó el tiempo de reducción decimal
para el pre tratamiento de secado y el método de desinfección con alcohol 70 º
y UV en 30 minutos.
Foto1. Campana vidriada con puerta guillotina.
Foto 2. Distribución de los sitios de muestreo 1 (N0 real), 2, 3, 4, 5 (sitios
muestreados del tratamiento químico- físico).
24
RESULTADOS
En la siguiente tabla se muestra el número de bacterias en el inoculo inicial
(N0), el número de bacterias/mL (N0r) resultante de la acción desecación y el
número final de micobacterias/mL Nf obtenido posteriormente a acción del
alcohol 70° y UV expresada en logaritmo de reducción después de 30, 60, 90 y
120 min. de exposición. Los ensayos fueron realizados por duplicado
Tabla 1: recuento de viables de M. pocinum en agar MH
Ex N0 B/mL
N0r B/mL Nf30 B/mL
Nf60 B/mL Nf90 B/mL Nf120 B/mL
1 8.6x108 8x105 8x104 neg neg Neg
2 6.92x107 2x104 4x102 neg neg Neg
3 3.5x108 1.38x105 4x103 neg neg Neg
4 5.7x108 2.8x104 4x102 neg neg Neg
N0: bacterias/ml del inoculo inicial; N0r: sobrevivientes al tratamiento físico por calor; Nf30 Nf60 Nf90 Nf120,
poesterior al tratamiento con alcohol 70°-UV
Tabla 2 . Tiempo de reducción decimal de M.porcinum por acción del secado en campana de contención durante 50 min de exposición
Ex N0 Log10 mL-1
N0r Log10 mL- Red.Unid Log10 (D)30 min
1 8,9 5,9 3 16,66
2 7,8 4,3 3,5 14,28
3 8,5 5,1 3,4 14,7
5 8,7 4,4 4,3 11,6
_ X
14,56
25
Tabla 3 . Tiempo de reducción decimal de M.porcinum por acción del alcohol 70º y UV durante 30 min de exposición.
Ex N0 Log10 mL-1
N0r Log10 mL- Red. Unid
Log10
(D) min
1 5,9 4,9 1 30
2 4,3 2,6 1,7 17,64
4 5,1 3,6 1,5 20
5 4,4 2,6 1,8 16,6
_ X
21,6
El inoculo se redujo entre 2 y 4 logaritmos por la acción de la desecación
lograda campana de vidrio, cerrada y con el mechero encendido durante 50
minutos con una temperatura ambiente de 27+/-2ºC.
Con el tratamiento de alcohol 70° y UV (perpendicular y a 72 cm del área
problema) la reducción de microorganismos fue de 1 a 4 logaritmos (gráfico
4). Cabe destacar que a partir de los 60 minutos de tratamiento no se
recuperaron micobacterias viables, pudiendo inferir que puede existir una
unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas.
26
Grafico 1. Reducción decimal observada en las 4 experiencias con M. porcinum
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
E1
E2
E3
E4
T1 T2T0
Tiempo min
Foto 3. Desarrollo de M.porcinum en L.J Foto 4. Desarrollo de M. porcinum en MH
27
DISCUSION
Los resultados obtenidos demuestran que si bien se reduce el número de
viables en el 50% de M. porcinum por el efecto de la desecación ocasionada
en la muestra por la cercanía al mechero de bunsen, es importante destacar
que el otro 50% permanece viable, pudiendo ser responsable tanto de
contaminaciones cruzadas en cultivos negativos como de aumentar el riesgo
de infección en los operarios.
Según lo publicado por algunos autores, entre 0.33% y 16% de los cultivos
positivos a micobacterias son falsos cultivos positivos, debido al error de
transferencia cruzada ya sea por salpicaduras inadvertidas, fundamentalmente
cuando se procesa un número de muestras superior a la media de
procesamiento, o bien cuando las muestras son esporádicas y los operarios no
están lo suficientemente entrenados. Un estudio realizado en Argentina
detecto 27 episodios de contaminación cruzada sobre 12 laboratorios
encuestados en el periodo comprendido entre 1996 y 2003 (Alonso, et. al.,
2007).
La viabilidad de las micobacterias en los extendidos secados y/o fijados por
calor fue comprobada por Allen, BW en 1987 cuando alimento adultos de Blatta
orientalis con extendidos realizados con esputos humanos con tuberculosis que
habían sido fijados por calor. Pudo recuperar micobacterias de las heces de
dichos insectos. Resalta este estudio la importancia de no dejar extendidos sin
colorear al descubierto fundamentalmente en la noche o en los horarios que no
se trabaja en los laboratorios.
Respecto al uso del alcohol 70º como micobactericida existe discrepancia entre
los autores ya que algunos consideran que su uso en equipos de laboratorio
parece ser un factor de riesgo ya que encontraron mayor contaminación
cruzada en aquellos laboratorios que utilizaban dicho desinfectante como
descontaminante (Boer, et al 2002).
Sin embargo Griffiths et al, 1998 demostraron que el alcohol 70 es efectivo para
inactivar a M.tuberculosis y Mycobacterium terrae, aunque M.avium –
intracellulare mostro ser más resistente.
28
Estudios realizados con 9 aislamientos de micobacterias ambientales aisladas
de suelo mostraron que una exposición de 25 min de al alcohol 70° inactivaron
inoculos variables entre 104 b/mL a 109 b/ mL. (Oriani y Sagardoy, 2006).
Nomura et al., (2000) comprobaron la efectividad en la desinfección de M.
chelonae con etanol al 70 º en las máquinas de desinfección de broncoscopios,
mientras que no obtuvieron los mismos resultados usando glutaraldehído al
2%.
Es sabido que existen desinfectantes más potentes y rápidos en su accionar
que el alcohol 70° como el glutaraldehído 0,5% y el hipoclorito de sodio 0.2%
que destruyen Mycobacterium fortuitum en 10 min y 5 min respectivamente
(Leon et. al, 2002) Es importante agregar que el glutaraldehído es un agente
de alto poder desinfectante de amplio espectro de acción, es activo en
presencia de material orgánico y no es corrosivo Su desventaja principal es su
toxicidad para el que lo manipula. El hipoclorito de sodio es un desinfectante de
alto poder que tiene un uso clínico más limitado ya que disminuye su actividad
con pH alcalino y materia orgánica. Otra desventaja es que corroe los metales
por lo que no puede ser usado en equipos. (Meza Vera, 2006) .
Asociado a la creciente preocupación por la exposición humana a M. avium en
los sistemas de distribución de agua potable debido a su alta resistencia a la
mayoría de los desinfectantes químicos en los procesos de tratamiento de
agua, muchos países están estudiando el fenómeno de desinfección con UV
como una nueva alternativa, debido a su notable eficacia contra protozoarios
resistentes al cloro (Shin, et. al., 2008).
Experimentos realizados por Lee, et. al. (2010) respecto a la radiación UV
como desinfectante con cuatro especies de micobacterias ambientales (M.
fortuitum, M.avium, M.intracellulare y M.lentiflavum) determinaron que la
susceptibilidad fue especifica de especie, siendo el más resistente M. fortuitum
. Estos autores también comprobaron que las micobacterias fueron entre 2 y 10
veces más resistentes a los rayos UV que E. coli.
29
Está comprobado además que una exposición de 20 minutos a la luz UV
(85mJ/cm2/s) es suficiente para inactivar una suspensión 1 Mac Farland de
Mycobacterium brumae ( Julian Gomez et. al., 2008)
Shin, et. al. (2008) determinaron que la dosis de UV necesaria para lograr la
inactivación de 1 log de distintas cepas de M, avium y de M. intracellulare
oscilo entre 3,5 y 7 mJ/cm2. Estos investigadores detectaron además que una
cepa de M. avium fue más resistente que la mayoría de los protozoos y
bacterias patógenas. ; (Collins, 1970) (Lee et. al., 2010).
Hijnen y colaboradores, (2006) informaron sobre el incremento de la
resistencia de bacterias ambientales a la radiación UV necesitando mayores
dosis para inactivar el mismo número de bacterias. Esto puede deberse al al
efecto tailing o cola , ( modificaciones a la ley de Chick y Watson) que se
refieren a cierto número de microoganismos dentro de una población que
presentan protección estructural y persistencia fenotípica lo que hace que no se
inactiven luego de la exposición al desinfectante. Se ha demostrado que la
persistencia fenotípica es un factor importante a considerar cuando se evalúan
las curvas de dosis-respuesta de un desinfectante (Pennell et. al., 2007).
Considerando nuestros resultados podemos inferir que no se presentó dicho
efecto debido, posiblemente, a la combinación de los dos métodos.
Mycobacterium terrae fue estudiado por Bohrerova y Linden (2006) quienes
midieron la inactivación con UV y la capacidad de foto-reparación bacteriana
utilizando 4 lámparas de 15 W/cm2 a 45-52 cm. Los resultados indicaron que
M. terrae fue el más resistente de las bacterias estudiadas por otros autores
como Bacillus subtilis y E. coli.
Es reconocido que las cepas de micobacterias ambientales pigmentadas son
más resistentes a los efectos nocivos de la UV debido a la presencia de los
carotenos que evitan la foto oxidación, favoreciendo su permanencia en el
medio ambiente.
La capacidad de reparación en las micobacterias depende fundamentalmente
de la especie en estudio siendo las que presentan más desarrollada esta
capacidad: M. tuberculosis, M.marinum y M. parafortuitum.
30
Podemos inferir, según nuestros resultados, que la metodología empleada en
este proyecto cumplió con lo mencionado por Kovacs et. al., (1999) respecto a
la valoración de los germicidas. Ya que obtuvimos reducciones del orden 6 o
más logaritmos.
31
CONCLUSIONES.
• Existe contaminación cruzada en los laboratorios de micobacterias
debido a la transferencia de bacilos cuando se procesan secuencialmente
muestras positivas y muestras negativas, conduciendo a consecuencias
desfavorables ya sea desde, la proyección de los datos estadísticos, hasta el
incremento del riesgo de los operarios.
• El procedimiento bacteriológico más vulnerable para el aislamiento de
micobacterias de diferente origen (muestras clínicas y/o ambientales) es la
descontaminación de las muestras, específicamente por la generación de
aerosoles y microgotas.
• En los extendidos de micobacterias y/o salpicaduras el efecto del
secado por calor reduce un 50 % en número de viables, siendo este un punto
crítico en la contaminación cruzada de muestras.
• La combinación de la luz UV y la pulverización con alcohol 70º son
suficientes para reducir el número de M. porcinum a una unidad contaminada
por cada 10 unidades idénticas procesadas en un periodo de tiempo entre 30 y
60 minutos.
• El efecto del secado de la muestra ocasiono una disminución de viables
más rápida (D= 14,56) que la combinación del alcohol 70 y la UV (D= 21,6).
32
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Disponible en la OPS/CEPIS
