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COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS.

Rev. No.: 0 FECHA: 2011-03-28 CLAVE: CCAYAC-P-062

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Exactitud relativa ó recuperación: Es la aproximación entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el propósito de esta guía, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de microorganismo inoculado o nivel de fortificación. Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentración microbiana. Fortificación de la muestra. Inoculación de una cantidad conocida del o los microorganismos de prueba. Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando. Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperación. Límite de detección: Es el numero más pequeño de microorganismos en una muestra que puede ser detectado bajo las condiciones de análisis. El limite microbiológico de una prueba determina la presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de muestra.

Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito. Método Normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados. Métodos internacionalmente aceptados y validados. Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de microorganismos inoculados a una muestra. Protocolo para la evaluación del desempeño: Documento que describe los pasos a seguir durante la evaluación del desempeño de un método analítico microbiológico, cuyo fundamento se encuentra descrito en el presente documento. Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecución de la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en situaciones normales. Evaluación del desempeño: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un método normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones particulares del laboratorio. Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que un




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método analítico validado internacionalmente cumple con su propósito en las condiciones particulares del laboratorio donde se realiza el análisis. Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la misma matriz, en las mismas condiciones de análisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo. Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medición (personal) y en diferentes tiempos (o a intervalos de tiempos más largos).

4 DOCUMENTOS APLICABLES

4.1 USP 32, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.

4.2 USP 32, <1225> Validation of Compendial Procedures

4.3 USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

4.4 Dulce Toccheto S. Curso-teórico-práctico Validación de Métodos Microbiológicos bajo un

Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/ Bolivia-México. 2007.

4.5 European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological laboratories. 2002.

4.6 G.A. Leotta, I. Chinen. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiología. Vol.37, No. 1 2005.

4.7 Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos

Biólogos de México, A.C. Edición 2002.

4.8 ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

4.9 ISO/TR 13843:2000 - Water Quality — Guidance on Validation of Microbiological methods. First Edition.




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4.10 ISO 17994:2004 Water Quality—Criteria for Establishing Equivalence between Microbiological methods. First Edition.

4.11 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)

4.12 Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)

5 DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD. 5.1 Estrategia para la evaluación del desempeño de los métodos de prueba

microbiológicos.

Para cada método de prueba a evaluar se deberá contar con protocolo para la evaluación del desempeño particular que describa el método a evaluar, la estrategia particular de evaluación, los materiales y reactivos y las especificaciones. Durante la ejecución del protocolo de evaluación se deberán documentar las actividades y los resultados.

Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidad conforme se establece en el sistema de gestión de calidad y conforme a la NMX-EC-17025-IMNC-2006. Antes de cada validación deberá comprobarse que el equipo utilizado, cumple con el calendario de mantenimiento y/o calibración de cada laboratorio.

Con base en el protocolo de evaluación se deberá verificar que se cuenta con todos los materiales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los analistas que participaran en la evaluación del desempeño.

La preparación del inóculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la evaluación del desempeño del método.

5.2 Selección y obtención de la matriz.

Los criterios de selección de la matriz se deberán describir en el protocolo para la evaluación del desempeño de cada método, considerando los siguientes lineamientos:




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• Se deberán elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la metodología a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer su microbiota. Se deberá contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los análisis. Las matrices elegidas y su justificación deben mencionarse en el protocolo de validación.

• Cuando el método analítico a ser verificado se destina al análisis de varios tipos de

alimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categorías que aparece en la ISO 16140, y será aquella donde se esperan las mayores dificultades para la recuperación del microorganismo de prueba con respecto de las matrices más analizadas en el laboratorio.

5.3 Preparación del inóculo

5.3.1 Determinación de la concentración de la cuenta bacteriana en la Fase estacionaria.

Este procedimiento es general y adecuado para la mayoría de los microorganismos de prueba, pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inóculos constantes.

Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, (este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estándar, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilución para conocer la concentración de microorganismos.

Registrar los resultados indicando la concentración de microorganismos en cada dilución. Estos resultados servirán de referencia para la estimación de la dilución adecuada a utilizar durante la fortificación de las muestras en la evaluación del desempeño del método de prueba.

Antes de cada prueba deberá repetirse la preparación del inóculo de forma idéntica que en la determinación de concentración de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inóculo deberá ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.

Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubación, volumen necesario que lleve la concentración microbiana, para fortificar cada una de las alícuotas de acuerdo al protocolo de evaluación de desempeño del método en particular. Durante su manipulación se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fría. Nota 2: Cuando la matriz sea sólida, fortificar las alícuotas. Si es líquida se puede fortificar la matriz completa o las alícuotas.




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5.4 Preparación de muestras

Registrar la muestra con la siguiente información: • Fecha y hora de muestreo, • Tipo de muestra, • Procedencia ó lugar de muestreo, • Cantidad.

Homogeneizar perfectamente y separar la muestra que se utilizará para el análisis. Si es perecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeración. Se recomienda iniciar el análisis inmediatamente.

5.4.1 Fortificación de la muestra.

En condiciones asépticas dividir la muestra cuantitativamente siguiendo el método de prueba. Inocular la muestra con una concentración conocida del microorganismo de prueba.

5.5 MÉTODOS CUALITATIVOS. 5.5.1 Criterios de Aceptación

Parámetro Criterio de aceptación

Límite de detección Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones.

Repetibilidad No más del 20 % de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

Reproducibilidad Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos en no más del 20 % cuando

realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

Incertidumbre Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a

las mediciones. 5.5.2 Límite de detección

Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones.

Microorganismo de Prueba: Utilizar al menos aquellos microorganismos indicados como control positivo en el método de prueba, el tamaño del inóculo deberá ser menor de 5 UFC.




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Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado la ausencia del microorganismo de prueba.

Repeticiones: 30 repeticiones.

Cálculos:

Ejemplo:

Se desea validar el método para aislamiento de un patógeno; para la determinación del límite de detección deberá prepararse un inóculo de menos de 5 UFC del patógeno.

Al realizar la estimación de la curva microbiana se determina que en la dilución 10-7, se obtienen 150 UFC/mL. Antes de la prueba deberá preparar un inóculo fresco, y realizar diluciones decimales hasta 10-9, a partir de esa dilución transferir dos mililitros a cada una de las 30 porciones de muestra. En paralelo verificar el inóculo, transfiriendo 1 mililitro de la suspensión a 6 cajas de Petri.

Para la verificación del inóculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los cálculos para determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es válida si se inoculan menos de 5 UFC.

Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el método de prueba. Registrar los resultados de ausencia y presencia.

Ausencia. 5 Presencia 25

Entonces:

83.33%Lectura10030

25Lectura =⇒×=

Conclusión:

Se cumple con el criterio de aceptación

100 esrepeticion de No.

positivos de No. Lectura ×=




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5.5.3 Repetibilidad

Los resultados de métodos cualitativos se registran comúnmente como positivo ó negativo ó presencia-ausencia por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en la prueba de limite de detección. El criterio de aceptación es igual o menor al 20%.

Ejemplo:

Usando los datos del ejemplo de límite de detección.

Supongamos que:

Ausencia 5 Presencia 25

Entonces:

Lectura =5

30×100⇒ Lectura =16.66%

Conclusión:

Se cumple con el criterio de aceptación 5.5.4 Reproducibilidad

Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20 % cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

Las repeticiones deberán suceder en momentos diferentes. Ejemplo:

Analista Uno Ausencia: 1 Presencia: 9

Lectura =1

10×100⇒ Lectura =10%

Cumple el criterio de

repetibilidad Se cumple el

criterio de reproducibilidad Analista Dos

Ausencia: 2 Presencia: 8

Lectura =2

10×100⇒ Lectura = 20%

Cumple el criterio de

repetibilidad

5.5.5 Incertidumbre del método Microbiológico (Eurachem:2002)

El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos en pruebas microbiológicas por lo que solo se mencionan las siguientes:




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Fuentes de Incertidumbre

Distribución de los microorganismos en la muestra; Efecto de la matriz; Personal operativo; Mediciones (pesada o medición de la muestra); Diluciones y volúmenes; Homogeneización; Calidad de los medios; Tiempo hasta la inoculación; Temperatura de incubación;

5.6 MÉTODOS CUANTITATIVOS.

Parámetro Criterio de aceptación Repetibilidad r < 30 %

Reproducibilidad R < 30 % Recuperación Entre el 90% y el 110% log

Sesgo La diferencia absoluta

de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

Incertidumbre a) Especificar el mensurando. b) Identificar las fuentes de incertidumbre

5.6.1 Selección de Matrices

Muestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un método para recuperar de forma consistente un microorganismo o grupo de microorganismos de interés, es importante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas deberán de ser comprobadas por el método de prueba por duplicado. Estas muestras deberán ser utilizadas para la comparación de muestras. Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que no cuenten con el microorganismo de interés (en algunos casos pueden producirse artificialmente mediante esterilización). Se deberá comprobar usando el método de prueba por duplicado. Los resultados de las matrices deberán registrarse e incluirse en el informe de validación.




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5.6.2 Repetibilidad. La determinación de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.

Analito: Usar una cepa del microorganismo de interés asociado a la prueba. Número de repeticiones: 30 (a excepción NMP 10 repeticiones) Nivel de fortificación: 1 nivel (valor medio)

5.6.2.1 Muestras no contaminadas. Fortificación de la muestra. Inocular una concentración conocida de microorganismos tal que al concluir el análisis se recuperen cuentas de aproximadamente el valor medio del intervalo de lectura. 5.6.2.2 Muestras naturalmente contaminadas. Verificar por duplicado la concentración de los microorganismos.

Ejemplo Cuando el método de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC, se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilución por placa. El inóculo en la muestra debe ser tal que después del método de análisis se recuperen aproximadamente 80 UFC

Límite Inferior log(25) La diferencia entre log(250) y log(25)

Diferencia entre 2

log(25) + 0.5 UFC 25 1.40

Límite Superior log(250) 1 0.5 1.90 79

250 2.40

Límite Inferior log(15) La diferencia entre log(150) y log(15)

Diferencia entre 2

log(15) + 0.5 UFC 15 1.18

Límite Superior log(150) 1 0.5 1.68 47

150 2.18 Si se considera que se realizará una sola dilución entonces la concentración del microorganismo en la dilución 10-1 deberá ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamaño de la muestra es de 25 g entonces se deberían inocular aproximadamente 2000 UFC Nota 3: Todos los inóculos deben ser verificados utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando para el cálculo 6 cajas.




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Desarrollo Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas, proceder como se indica en el método de prueba. Cálculos Calcular el log de las UFC contadas por placa en cada repetición

A B C D E

1 Repetición Placa 1 Placa 2 log(Placa 1) log(Placa 2)

2 Repetición 1 70 UFC 90 UFC 1.85 1.95









Excel texto # "UFC" # "UFC" =LOG(B2) =LOG(C2)

Calcular la desviación estándar relativa (DSR) y elevar al cuadrado

D E F G H I 1 log(Placa 1) log(Placa 2) Desviación Estándar MEDIA DSR DSR2 2 1.85 1.95 0.077 1.900 0.0406 0.001651 3 1.85 1.96 0.076 1.905 0.0400 0.001600 4 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.000000 5 1.88 1.91 0.023 1.897 0.0123 0.000151 6 1.89 1.91 0.015 1.903 0.0081 0.000065 7 1.89 1.94 0.041 1.915 0.0214 0.000458 8 1.75 1.90 0.110 p1.826 0.0600 0.003600 9 1.94 1.90 0.026 1.921 0.0134 0.000180 10 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178 0.000316 Excel =LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:F:2) =PROMEDIO(D2:E2) =(F2/G2) =H2^2

Calcular la media cuadrática de la DSR usando la siguiente fórmula

RSDA =RDS12 +RDS22 +...+RDSn2

n

RSD =s

x




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Para determinar la repetibilidad del método se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribución normal de Z con 95% de confianza.

Repetibilidad (r)= 2.8 X RSD de repetibilidad

I J K DSR2 DSR(a) r

0.001651

0.0299 0.0836

0.001600 0.000000 0.000151 0.000065 0.000458 0.003600 0.000180 0.000316 "=H2^2 "=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10))) "=J2*2.28

5.6.3 Reproducibilidad

La determinación de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes tiempos. Desarrollo. Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procederán como se describió para repetibilidad hasta el cálculo del cuadrado de la DSR Ejemplo:

A B C D E F G H I

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2

Log (Placa 1)

Log (Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2

2

A

Repetición 1 79 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.004 1.900 0.0020 0.000004

3 Repetición 2 60 UFC 67 UFC 1.78 1.83 0.034 1.802 0.0188 0.000354








11 Analista Repetición Placa 1 Placa 2

Log (Placa 1)

Log (Placa 2) D.E. MEDIA DSR DSR2

12

B

Repetición 1 70 UFC 79 UFC 1.85 1.90 0.037 1.871 0.0198 0.000394












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Calcular la media cuadrática utilizando la siguiente fórmula:

RSDAB =RDS12 +RDS22 + ...+RDSn2

n

Para determinar la reproducibilidad del método se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribución normal de Z con 95% de confianza.

Reproducibilidad (R) = 2.8 X RSD

I J K

1 DSR2 DSR(ab) R 2 0.000004

0.0309 0.0865

3 0.000354 4 0.000316 5 0.000246 6 0.001511 7 0.001703 8 0.000038 9 0.000000 10 0.000100 11 DSR2 12 0.000394 13 0.000289 14 0.000038 15 0.000246 16 0.001511 17 0.001703 18 0.000038 19 0.000000 20 0.000100

J K

"=RAIZ((SUMA(I2:I10,I12:I20)/CONTAR(I2:I10,I12:I20))) "=J2*2.28

5.6.4 Recuperación

Es la cantidad de UFC que el método de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado un numero conocido de microorganismos.

Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC, en cada repetición y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el logaritmo del inóculo verificado. Finalmente calcular el % de recuperación

% Recuperación= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100

Logaritmo de las UFC inoculadas

A B C D E F G H I J

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Cuenta log(Cuenta ) Media (log(Cuenta )) Inóculo log (Inóculo) % Recuperación 2

A

Repetición 1 79 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90

1.89 80 UFC 1.90 99%

3 Repetición 2 60 UFC 67 UFC 64 UFC 1.80 4 Repetición 3 77 UFC 86 UFC 82 UFC 1.91 5 Repetición 4 77 UFC 70 UFC 74 UFC 1.87 6 Repetición 5 89 UFC 70 UFC 80 UFC 1.90 7 Repetición 6 69 UFC 89 UFC 79 UFC 1.90 8 Repetición 7 77 UFC 80 UFC 79 UFC 1.89 9 Repetición 8 80 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90 10 Repetición 9 78 UFC 83 UFC 81 UFC 1.91

=PROMEDIO(B2:C2) =LOG(E2) =PROMEDIO(F2:F10) "=LOG(H2) "=G2/I2




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5.6.5 Sesgo

El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido experimentalmente. A partir de los cálculos de recuperación, calcular el valor absoluto de la diferencia de la media de los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inóculo utilizado.

Sesgo=�� − �� Donde Ve= valor esperado Vo= valor obtenido

5.6.6 Incertidumbre.

Especificar el mensurando. Identificar las fuentes de incertidumbre

5.7 Criterios de aceptación para la evaluación de métodos microbiológicos.

Cuantitativos

Parámetro Criterio de aceptación Repetibilidad r < 30 %

Reproducibilidad R < 30 % Recuperación Entre el 90% y el 110% log

Sesgo La diferencia absoluta

de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

Incertidumbre a) Especificar el mensurando. b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos

Parámetro Criterio de aceptación

Límite de detección Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones.

Repetibilidad No más del 20 % de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

Reproducibilidad Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20 %

cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

Incertidumbre Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a

las mediciones.




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5.8 Elaboración del protocolo Elaborar un protocolo de validación que incluya lo siguiente:

Título Protocolo para la evaluación del desempeño del método: el nombre y clave del método que se pretende evaluar.

1.Objetivo Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito a determinar

2. Campo de aplicación

Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validación

3. Método de ensayo Elaborar un diagrama de flujo del método en cuestión

4. Equipo Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificación y/o calibración, si aplica)

5. Materiales Indicar los materiales a utilizar

6. Reactivos y Medios de Cultivo

a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado. b) Indicar los medios de cultivo a utilizar c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inóculos

7. Muestras Indicar las características, forma de almacenamiento y cantidades de muestra estimadas para llevar a cabo la validación. Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas.

8. Desarrollo experimental

Detallar las instrucciones para cada uno de los parámetros de desempeño a ensayar.

9. Resultados Formato para el registro de resultados

10. Análisis estadístico Establecer para cada parámetro de desempeño la herramienta estadística a utilizar para su evaluación.

11. Criterios de aceptación

Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su respectiva referencia bibliográfica.

Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.

5.9 Ejecución del protocolo

Deberán documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todos los registros deberán estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencia de supervisión. Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deberá estar documentado y autorizado.




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5.10 Elaboración del Informe Elaborar un informe de resultados de validación que incluya lo siguiente:

Título Informe de resultados de la evaluación del desempeño del método: el nombre y clave del método que se evalúo.

1.Objetivo Considerar los parámetros de desempeño evaluados y el analito determinado.

2. Campo de aplicación Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la validación

4. Equipo Listado de los equipos utilizados y su estado de calibración/verificación/mantenimiento

5. Materiales Listado de los materiales utilizados. 6. Reactivos y Medios de

cultivo Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.

7. Muestras

Indicar las características, forma de almacenamiento, marca, presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la validación. Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas utilizadas.

8. Método de ensayo Incluir el diagrama de flujo del método.

9. Desarrollo experimental

Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los parámetros de desempeño.

10. Resultados Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas de inicio y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz, unidades y clave de bitácora o registro primario

11. Análisis de resultados Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados y los resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.

12. Conclusión Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método se ajusta al uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)

13. Bibliografía Referencias utilizadas.

14. Anexos

Los que aplique: • Registros primarios, • Bases de datos utilizadas • Certificados de equipos, • Medios de cultivo • Cepas • Formatos de verificación, • Gráficos de control, etc.

Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.




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6.0 NOTIFICACIÓN DE VIGENCIA Se otorga un periodo de transición de 180 días contados a partir de la fecha de publicación para que los laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a éstos criterios. Para los laboratorios que soliciten autorización posterior a la fecha de publicación, deberán cumplir éstos criterios de inicio. Estos criterios se aplicarán en todos los procesos de evaluación que se realicen a los 180 días naturales, a partir de la fecha de publicación del documento en la página web de la COFEPRIS.




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Anexo Informativo 1 Guía Informativa para la fortificación de una matriz

La fortificación de muestras se hace por medio de la adición de diluciones conocidas del microorganismo a prueba, a partir de su Fase Estacionaria (FE), en la matriz en cuestión, como sigue: Estimación de la dilución de trabajo A partir de un cultivo del microorganismo de interés en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento). Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que utilice el laboratorio. Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar cuenta estándar. Realizar las lecturas y cálculos de los números de células en cada una de las diluciones para establecer la dilución que será usada en la fortificación de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y cálculo. Preparación del Inóculo Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados obtenidos en la estimación de la dilución de trabajo, verificar la concentración del inóculo por sextuplicado.




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Anexo Informativo 2 Guía informativa de formatos

Cuadro 1: VALIDACIÓN PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIA Analista: Fecha:

Nombre del microorganismo:

Caldo: Volumen de caldo: Temperatura y tiempo total de incubación:

Intervalos de tiempo de lectura: FE en UFC/mL=

Horas vol. de inóculo en placa

Dilución Cuenta UFC Placa 1

Cuenta UFC Placa 2

Promedio de cuentas

UFC/mL

Cálculos:

Cuadro 2: VALIDACIÓN PARCIAL DE:

CÁLCULO DE INÓCULOS Analista: Fecha:

Nombre del microorganismo:

Parámetro de desempeño:

FE en UFC/mL=

Dilución de FE

Concentración de UFC/mL

Dilución Nivel y concentración a la que se quiere llegar en UFC/g ó mL

Dilución seleccionada

Volumen necesario

Cálculos:




20/23

Cuadro 3: Análisis de la matriz en estudio (prueba de ausencia del analito). Matriz:

Método de prueba: Analito:

Fecha: UFC/mL en FE: _________________

Analista:

Parámetro de desempeño:

Alícuotas de 25 g Resultado del análisis Observaciones

1

2

3

4

5

6

Cuadro 4: Cálculos para la obtención de los datos de la dilución y el volumen seleccionado de la FE para fortificar las alícuotas de la matriz en estudio del LD. Matriz: Analista(s):

Fecha: Método de prueba:

Parámetro de desempeño: Límite de detección

Analito: ________________________________________ No. de UFC/mL en FE: ____________________________

Nivel a confirmar: LD no declarado: _______ UFC/25g LD declarado:_______

Niveles que se prueban:

No. de alícuotas: _____________

Cantidad de muestra por alícuota: _________

Nivel: ________ Dilución seleccionada de la FE: Concentración en UFC/mL que corresponde a la dilución seleccionada: Cálculos: RESULTADOS: Dilución de FE:___________ Volumen de FE:___________




21/23

Cuadro 5: Resultados del parámetro de Límite de Detección Matriz:

Método de prueba: Analito:

Fecha: UFC/mL en FE: ________

No. de replicas del nivel declarado: 30

Analista:

Nivel de

fortificación (N1)

Concentración

esperada en

UFC/25g

Resultado

(registrar (+) o (-) )

No. total de positivos x 100 /

No. total de alícuotas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15…….30 R= resultado, en esta tabla se registran 3 porque se hace la determinación por nivel para 3 medios de cultivo en el caso de Salmonella. N1= nivel declarado en el método de prueba.




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Anexo Informativo 3 Guía informativa para la construcción de hojas de cálculo

Porcentaje de recuperación Analista

Repetición

Placa 1

Placa 2 Cuenta

=CONCATENAR("log(",E1,")")

=CONCATENAR("Media (",F1,")") Inóculo

=CONCATENAR("log (",H1,")")

% Recuperación

=PROMEDIO(C2:D2) =LOG(E2)

=PROMEDIO(F2:F10)

=LOG(H2) =G2/$I$2

=PROMEDIO(C3:D3) =LOG(E3) =PROMEDIO(C4:D4) =LOG(E4) =PROMEDIO(C5:D5) =LOG(E5) =PROMEDIO(C6:D6) =LOG(E6) =PROMEDIO(C7:D7) =LOG(E7) =PROMEDIO(C8:D8) =LOG(E8) =PROMEDIO(C9:D9) =LOG(E9) =PROMEDIO(C10:D10) =LOG(E10)

Sesgo Analista

Repetición

Placa 1

Placa 2 Cuenta

=CONCATENATE("log(",E1,")")

=CONCATENATE("Media (",F1,")") Inóculo

=CONCATENATE("log (",H1,")") SESGO

=AVERAGE(C2:D2) =LOG(E2)

=AVERAGE(F2:F10)

=LOG(H2) =ABS(G2-

I2)

=AVERAGE(C3:D3) =LOG(E3) =AVERAGE(C4:D4) =LOG(E4) =AVERAGE(C5:D5) =LOG(E5) =AVERAGE(C6:D6) =LOG(E6) =AVERAGE(C7:D7) =LOG(E7) =AVERAGE(C8:D8) =LOG(E8) =AVERAGE(C9:D9) =LOG(E9) =AVERAGE(C10:D10) =LOG(E10)

Reproducibilidad

Analista

Repetición

Placa 1

Placa 2

=CONCATENAR("log(",C1,")")

=CONCATENAR("log(",D1,")")

Desviación Estandar MEDIA DSR

DSR2 DSR(ab) R

=LOG(C2) =LOG(D2) =DESVEST(E2:F2)

=PROMEDIO(E2:F2)

=G2/H2

=I2^2

=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CONTAR(J2:J10)))

=K2*2.8


=PROMEDIO(E3:F3)

=G3/H3

=I3^2


=PROMEDIO(E4:F4)

=G4/H4

=I4^2


=PROMEDIO(E5:F5)

=G5/H5

=I5^2


=PROMEDIO(E6:F6)

=G6/H6

=I6^2


=PROMEDIO(E7:F7)

=G7/H7

=I7^2


=PROMEDIO(E8:F8)

=G8/H8

=I8^2


=PROMEDIO(E9:F9)

=G9/H9

=I9^2


=PROMEDIO(E10:F10)

=G10/H10

=I10^2

Analista

Repetición

Placa 1

Placa 2


=CONCATENAR("log(",D11,")")

Desviación Estandar MEDIA DSR

DSR2


=PROMEDIO(E12:F12)

=G12/H12

=I12^2


=PROMEDIO(E13:F13)

=G13/H13

=I13^2


=PROMEDIO(E14:F14)

=G14/H14

=I14^2


=PROMEDIO(E15:F15)

=G15/H15

=I15^2


=PROMEDIO(E16:F16)

=G16/H16

=I16^2


=PROMEDIO(E17:F17)

=G17/H17

=I17^2


=PROMEDIO(E18:F18)

=G18/H18

=I18^2


=PROMEDIO(E19:F19)

=G19/H19

=I19^2


=PROMEDIO(E20:F20)

=G20/H20

=I20^2




23/23

Repetibilidad Repetición

Placa 1

Placa 2

=CONCATENAR("log(",B1,")")


Desviación Estandar MEDIA DSR DSR2 DSR(a) r

=LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:E2)

=PROMEDIO(D2:E2) =F2/G2

=H2^2

=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10)))

=J2*2.8



=H3^2



=H4^2



=H5^2



=H6^2



=H7^2



=H8^2



=H9^2


=PROMEDIO(D10:E10)

=F10/G10

=H10^2

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