¿Cómo se calcula m con datos

microscópicos?

Gustavo Viniegra González

Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F.

MEXICO (vini@xanum.uam.mx)

CICLO DE VIDA DE UN MOHO

Beauveria bassiana sobre cutícula

de grillo.

Los mohos crecen bien sobre las superficies sólidas.

Es su habitat natural.

Divanery Rodríguez

(2004)

Cultivo en caja Petri

El micelio se separa por filtración del agar licuado por calor.

El peso seco se estima como: rA = mg X/cm2

Macro cinética de A. niger Larralde-Corona et al., (1997)

X = peso seco en caja petri (mg/cm2)

Al principio crece muy rápido con la velocidad, rX.

Finalmente llega a un nivel máximo Xm

Los valores de, r y Xm, dependen del valor de So 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

4

8

12

16

20 120 gL-1

70 gL-1

300 gL-1

40 gL-1

10 gL-1

Bio

mas

s dr

y w

eigh

t, X

(mg/

cm2)

Time (h)

Modelo macroscópico

• La tasa específica de crecimiento se

define como

r = (1/X)dX/dt

• Se supone, que, r, debe reducirse cuando

X, llega al valor, Xm.

Modelo de von Bertanlanffy

r = m{1 – (X/Xm)n}

X << Xm r m; X Xm, r 0

Consecuencias del modelo

• Si n = 1; r vs. X, es

una recta.

• Si n > 1; r vs. X, es

convexa.

• Si n < 1; r vs. X, es

cóncava.

El caso simple, n = 1,

es la ecuación

logística.

Velocidad específ., r, vs. densidad, X

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0 5 10 15 20

X (mg/cm2)

r (1

/h)

n = 1 n = 1/2 n=2

Teoría vs. Experimento

• Datos de la tesis de M. Raimbault (1980).

• Crecimiento de A. niger sobre harina de mandioca.

• No se ajusta con el modelo anterior. El valor de, r, varía con el avance del proceso.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

x = X/Xm

r/r

ma

x

¿Por qué un modelo microscópico?

• Un modelo predictivo (a diferencia de ser

descriptivo), … debe contener un

parámetro microscópico que represente …

a un parámetro biológico, y … al

modificarse … afecte al crecimiento global

y al desarrollo*

• (Se recomienda leer la cita adjunta)

*http://140.136.180.180/Repository/SCO_009/Cyberfungi/Kinetics/Kinetics_o

f_mycelial_growth.pdf

¿Datos microscópicos?

Se pueden medir:

• a) Velocidad máxima de extensión apical,

Umax.

Variación temporal del diámetro de las

colonias

• b) Longitud, L, y diámetro, d, de las hifas y

segmentos.

Medidos con un analizador de imágenes.

Umax = dR/dt

Las hifas se extienden y

ramifican Las más rápidas van afuera

Edelstein, J. Theoret. Biol. 98: 679, 1982

Morfometría

Las longitudes y diámetros de las hifas se

miden por el análisis de imágenes

obtenidas por video y digitalizadas en una

computadora.

Estas mediciones pueden registrarse y

analizarse en forma estadística a diversos

períodos de tiempo.

Germinación de B. bassiana

• Se puede medir la

longitud de las hifas,

L, a diversos tiempos.

• Se usa un analizador

de imágenes.

• A una longitud, Lc, se

ramifican (no

mostrada aquí).

Divanery Rodríguez (2006)

Crecimiento de las hifas de A. niger

Las hifas, al principio, crecen rápidamente

L Loekt.

Cuando la velocidad disminuye, se ramifican (flechas) L = Lc.

Los valores de, Lc, primero aumentan con So y luego disminuyen.

Datos de Larralde et al., (1997) Glucosa: (g/L) 10; 40; 70; 120; 300-

6 8 10 12 14 16 18 20

0

100

200

300

400

500

Hy

ph

al

Le

ng

th,

L (

mm

)

Time (h)

Lc

Estructura de las hifas

Distal Subapical Apical

Dirección del crecimiento Septo

Spitzenkörper

U = velocidad de extensión apical (cm/s)

N = velocidad de formación de nueva pared (cm2/s)

N

Esquema de Patricia Larralde (1997)

Modelo de Bartnicki-García

Predice la forma de las

hifas en función de

dos variables, N, y U

N = formación de nueva

pared por las

vesículas (cm2/s).

U = velocidad de

extensión apical

(cm/s).

Modelo vs. Experimento

• Superposición de la

curva teórica con la

imagen.

• El foco de la curva

está en el

Spitzencörper.

Según: Bartnicki-García et al. Protoplasma

153: 46, (1989)

Modelo conceptual

Las vesículas son acarreadas por kinesina a través de

filamentos de tubulina. En el SPK se descargan y distribuyen

para construir nueva pared. La kinesina se recicla hacia el

retículo endoplásmico, para su recarga

Cuando se acumulan demasiadas vesículas,

en el SPK (L = Lc) la hifa se ramifica.

Dinámica de microtúbulos de

Neurospora crassa

Uchida et al. Fungal Genet. Biol. 45: 683 (2008)

IMÁGENES DE A. niger

Modelo Geométrico

NS = número de segmentos

NP = número de puntas

NS = 2Np - 1

Ejemplo: 11 = 2(6) - 1

Biomasa:

X = NSVr

X = NS[rpd2Lc/4]

X = [2Np - 1][rpd2Lc/4]

Si se conoce, Np, se calcula X

P3

P6

S0

P2

P4 P5

S1

S2 S6

S5

S4 S3 S1

0 S9

S8 S7

P1

Las puntas (Np) crecen exponencialmente con tc,

• Np(0) = 1

• Np(tc) = 21

• Np(2tc) = 22

• Np(ntc) = 2n

¿Cómo ligamos Np con dL/dt?

• Se necesita calcular el tiempo, tc,

necesario para un ramificación.

• Necesitamos una función L = L(t) que

provenga de los experimentos

microscópicos.

• De esa forma se podrá ligar el tiempo, tc,

con las medidas microscópicas del

micelio.

Modelo de saturación

La velocidad, dL/dt = U, depende de la tasa

de suministro y distribución de vesículas,

N. Entre más biomasa, más vesículas,

hasta que se satura el SPK

LK

LU

dt

dL

L max

Si L << KL dL/dt UmaxL/KL; Si L >> KL dL/dt Umax

Esta ecuación ajusta los datos de P. Larralde et al. (1997)

Cálculo del tiempo de ramificación

La ecuación cinética se puede integrar

Cuando, t = 0, L = d, porque las hifas se ramifican lateralmente.

Cuando, t = tc, L = Lc, la hifa se ramifica.

max

ln

U

dLd

LK

tc

cL

c

Liga: micro macro

• El numero de ramificaciones promedio esta dado por, n = t/tc

• NP(t) = 2(t/tc)

• Pero como, tc, se puede estimar de la morfometría microscópica.

• Se puede calcular la velocidad macroscópica, m, en función de variables microscópicas.

max

ln

U

dLd

LK

tc

cL

c

dLd

LK

U

cc

L

ln

2ln2 maxm

Modelos microscópicos

Trinci (1971)

µ = Umax/LC

Larralde-Corona et al., (1997)

¿Cuál seguirá mejor los datos?

dLd

LK

U

cc

L

ln

2ln2 maxm

Comparación de modelos

Glucose mobs m1 m1/mobs m2 m2/mobs mcalc mcalc/mob

s (g L-1

) (h-1

) (h-1

) (h-1

) (h-1

)

10 0.3 0.55 1.8 0.44 1.5 0.31 1

40 0.18 0.36 1.9 0.32 1.8 0.16 0.8

70 0.2 0.46 2.3 0.35 1.8 0.2 1

120 0.19 0.45 2.4 0.46 2.4 0.2 1.1

300 0.09 0.21 2.4 0.23 2.6 0.08 0.9

Mean

ratio

2.2 ±

0.3

2.0 ±

0.5

0.97 ±

0.09

% of

error

12% 25% 9%

m1=ln2Umax/2Lav ; m2=ln2Umax/Lmax ; mcalc=Umax{Lavln(Lav/d)}-1

Modelo vs. Experimento

µcalc (microscópica) KL = LC Lav

µc Umaxln2/[Lavln(Lav/d0)] µobs = (1/X)dX/dt (macro) Umax = velocidad de extensión. Lav = longitud media d = diámetro medio Concuerda el modelo con el

experimento. 0.0 0.1 0.2 0.3

0.0

0.1

0.2

0.3

R2=0.98

5

2

3

4

1

mcalc

mobs

Aplicaciones prácticas

Se pueden medir en colonias de cajas Petri:

a) La velocidad de crecimiento, m (análisis de imágenes microscópicas).

b) La producción de la enzima, E (halos

alrededor de la colonia)

c) Se puede automatizar el método.

¿Criterios de selección de mutantes?

FENOTIPOS DE MUTANTES DE A. niger PRODUCTORAS DE PECTINASAS (Petri)

Velocidades de crecimiento

Halos de pectinasa

Loera y Viniegra-González (1998)

Interpretación de los diagramas

No hay correlación directa entre, m, y la producción enzimática, E.

Correlación inversa Si producen mucha enzima crecen más lentamente. ¿Por qué?

¿Competencia entre excreción de proteínas y formación de pared?

A. niger sobre salvado de trigo

Conclusiones

• Se puede estimar la velocidad macroscópica,

m, calculada con la ecuación logística, de los

datos microscópicos, Umax, Lav y d.

• El análisis de imágenes de cultivos en cajas

de Petri, permite la evaluación de cepas

microbianas productoras de enzimas.

Problema 1

Según Trinci (1991) m = Umax/(Lhgu)

Lhgu = (NSLav/Np) = (Longitud Total)/(Np)

Lav → longitud media de los segmentos.

Ns y Np → número de segmentos o puntas.

Demuestre que m = ½(Umax/Lav) si 2NP >> 1

Problema 2

• Un micelio se bifurca, con segmentos de

longitud promedio igual a 500 micrones.

En matraces se observa que el tiempo de

duplicación es de 6 h.

• Use el modelo de Trinci para estimar en

cuánto tiempo se llenará una caja Petri de

9 cm de diámetro, si se siembra la colonia

por picadura central.

Problema 3

• Un hongo crece según el modelo de

Larralde (1997).

• En cajas Petri se mide que Umax = 6x10-2

cm/h; Lav = 0.05 cm y d0 = 3x10-4 cm.

• Calcule en cuánto tiempo se habrá

decuplicado la biomasa inicial.

Problema 4

• Una superficie plana de 1,000 m2 se siembra

homogéneamente, con 107 esporas.

• En cajas Petri se mide Umax = 0.47 mm/h

• Suponga que el micelio se vegetativo se

extiende en forma sincrónica.

• Calcule en cuanto tiempo, la superficie, se

cubre de colonias circulares y equidistantes,

las cuales se tocan unas con otras.