COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD DE REMOCIÓN DE …útiles en la remoción y transformación de contaminantes orgánicos. MATERIAL Y MÉTODOS Obtención de las plántulas de Cyperus elegans

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Núm.20, pp.31-45, ISSN 1405-2768; México, 2005

COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD DE REMOCIÓN DE FENANTRENO Y LAACTIVIDAD ENZIMÁTICA RADICAL SUPERFICIAL DE CULTIVOS RADICALES

(in toto e in vitro) DE Cyperus elegans

L. Angélica Guerrero ZúñigaInstituto Mexicano del Petróleo, Eje Central Lázaro Cárdenas 152, CP 07730,

México, DF

Angélica Ma. Rodríguez Dorantes*Lab. Fisiología Vegetal, Departamento de Botánica, Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas, IPN, Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. CP11340, México,DF,e-mail: [email protected]

y

Ma. Aurora Gasca Rodríguez y Rogelio A. Benítez IbarraCentral de Instrumentación de Espectroscopía, Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas, IPN, Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n. CP11340, México,DF

*Becario de la Comisión de Operaciones y Fomento de Actividades Académicas(COFAA-IPN)

RESUMEN

Los sistemas radicales de las plantas pue-den facilitar la biodegradación de los hidro-carburos aromáticos policíclicos (HAP’S).Éstos pueden ser bioconcentrados en las raí-ces ya que tienden a ser lipofílicos ehidrofóbicos, y con ello éste puede ser elprimer paso en un proceso de remoción conel empleo de plantas. Estos contaminantesuna vez inmovilizados en las raíces puedensufrir cambios estructurales a compuestosmenos complejos o hasta derivados más sim-ples, como un mecanismo importante parasu detoxificación. El presente estudio consi-deró la evaluación de la actividad enzimáticade fenoloxidasas de una especie de pantanoCyperus elegans de los sistemas radicalesde plantas in toto y de cultivo de raíces (invitro) expuestos a fenantreno, un hidrocar-

buro aromático policíclico consideradocomo uno de los HAP’s más tóxicos en elambiente, con la finalidad de analizarfisiológicamente estos sistemas radicalescomo posibles herramientas útiles en la re-moción y transformación de contaminantesorgánicos. No obstante que la remoción defenantreno por el sistema radical de C.elegans fue de 32%, se presentó un incre-mento en la actividad de enzimas radicalesinducido por la presencia de éste; las quepudieran estar relacionadas con la separa-ción de un compuesto que pudiera ser pro-ducto de la transformación del fenantreno,lo que sugiere que estos sistemas radicalesconstituyan una fuente de fenoloxidasasque participen directamente en la transfor-mación de compuestos orgánicos, en parti-cular con aromáticos policíclicos.

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Diciembre 2005Núm. 20:31-45

Palabras clave: cyperáceas, fenol oxida-sas, fi tor r emediación .

ABSTRACT

The radical systems may concentratepolycyclic aromatic hydrocarbons, becausethese compounds are highly lipophilic andhydrophobic, and with it, it can take placethe first step involved in a removal processassisted by plants. These contaminantsonce immobilized on roots can change theirstructures to simple compounds as animportant mechanism for their detoxifica-tion. This study evaluated the fenoloxidasesactivity of the radical system of a swampspecies Cyperus elegans, from in toto andin vitro root cultures exposed tophenanthrene, a polycyclic aromatichydrocarbon highly toxic for environment,for the physiological analysis of theseradical systems as a useful tools for theremoval and transformation of organiccontaminants. Although the remotion ofphenanthrene by the radical systems of C.elegans was 32%, an increase of the activityof the radical enzymes was induced by thepresence of this contaminant and itsuggests that these radical systems wouldbe possible sources of phenoloxidases andmight participate directly on the transforma-tion of organic compounds, particularly withpolycyclic aromatics.

Key words: cyperaceae, phenoloxidases,phytoremediation.

INTRODUCCIÓN

El sistema radical puede bioconcentrarhidrocarburos aromáticos policíclicos, yaque estos compuestos son altamentelipofílicos e hidrofóbicos y con ellos sepuede efectuar el primer paso que implica

un proceso de remoción asistido conplantas, lo que ayuda a su biodegradacióncon la participación de enzimas intra yextracelulares radicales.

Se han caracterizado en el suelo algunasenzimas de origen vegetal a través de ensayosinmunológicos que han identificado lapresencia de lacasas, deshalogenasas,nitrorreductasas, nitrasas y peroxidasas(Schnoor et al., 1995).

Algunas de estas proteínas catalizan laoxidación de muchos compuestosaromáticos, como son mono y polifenoles,así como también aminofenoles queproducen compuestos poliméricos comoresultado de esta reacción; esto constituyeun mecanismo de eliminación de éstos delsuelo a través de su inmovilización y cambioen su nivel de toxicidad.

Poco se conoce sobre la actividad biológicapotencial de la mayoría de los metabolitoscon respecto al total de la biota vegetal; lamayor parte de la información relacionadacon la interacción metabólica planta-xenobiótico se ha obtenido a partir de lainvestigación del metabolismo de losherbicidas contra malezas y con especiesde cultivo (Bell, 1992) y los cultivos decélulas vegetales se han sugerido comosistemas in vitro para investigar los efectostóxicos de los contaminantes y/o sutransformación (Macková et al., 2001;Chroma et al., 2002; Santos de Araujo et al.,2002; Flocco & Giulietti, 2003).

Se menciona que el empleo de estos siste-mas posee ventajas que incluyen un míni-mo mantenimiento, estandarización y manejoen condiciones estériles, así como que po-seen la habilidad para manipular el estadofisiológico de las células, tejidos u órganos.

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Guerrero et al.: Comparación de la capacidad de remoción de fenantreno y la actividad enzimática

Estos sistemas también permiten el análi-sis r ápido del metabol ismo de losxenobióticos en plantas, ya que éstos notienen la interferencia de microorganismos,la sorción rápida de los compuestos bajoestudio y la alta tasa de formación demetabolitos (Harmes, 1992).

Dentro del manejo de sistemas vegetales queparticipan en la transformación de contami-nantes, se tiene la determinación de la activi-dad de peroxidasas radicales de Eichhorniacrassipes y Lycopersicon esculentum L y suparticipación en la polimerización de com-puestos fenólicos disueltos en cuerpos deagua contaminados, lo que minimiza su ab-sorción al precipitarlos en la superficie radi-cal (Adler et al., 1994) y la caracterización delacasas en Populus deltoides, cuyas raícespueden absorber atrazina (un pesticida) ytransformarla a compuestos menos tóxicos,que incluyen metabolitos de cadena corta(Schnoor et al., 1995).

Este estudio consideró la evaluación de laactividad enzimática de fenoloxidasas en unaespecie de pantano Cyperus elegans de lossistemas radicales de plantas in toto yde cultivo de raíces (in vitro) expuestos afenantreno, un hidrocarburo aromáticopolicíclico considerado como uno de losHAP’s más tóxicos del ambiente, con la fina-lidad de analizar fisiológicamente estos sis-temas radicales como posibles herramientasútiles en la remoción y transformación decontaminantes orgánicos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de las plántulas de Cyperus elegans

Las semillas empleadas provienen de unacolecta de material vegetal de Cyperuselegans en el pantano Santa Alejandrina,

el cual está cercano a la refinería deMinatitlán en el estado de Veracruz, Ver.,zona contaminada con hidrocarburosderivados del petróleo con un total de estoshidrocarburos del petróleo de 81 640 mg kg-1

de suelo seco (IMP & UAM, 1997).

La germinación se realizó en germinadorescon arena y agua destilada estéril a 36°C, enoscuridad. Posteriormente las plántulas setrasplantaron y mantuvieron para sucrecimiento en cultivos hidropónicos encontenedores de vidrio ámbar de 500 ml, con400ml de solución mineral: 0.20M NH

4H

2PO

4,

0.50M NH4NO

3, 1.15M Ca(NO

3)

2, 0.26M

CaCl2, 0.20M MgCl

2·6H

2O, 0.20M

Mg(NO3)

2·6H

2O, 0.40M MgSO

4·7H

2O,

0.20M KH2PO

4, 1.20M KNO

3, 0.50M K

2SO

4,

0.040M FeCl3·6H

2O, 1.2 x 10-2M H

3BO

3, 1.2 x

10-4M CuCl2·H

2O, 2.3 x 10-3M ZnCl

2, 4.4 x

10-4M MnCl2·4H

2O, 6 x 10-6M Na

2MoO

4·H

2O,

EDTA and FeSO4·7H

2O: pH 6 y se man-

tuvieron bajo condiciones controladas eninvernadero a 37/17°C y 56% de humedadrelativa en promedio con fotoperiodo 12:12por 60 días, para establecer posteriormentelos cultivos in vitro de las raíces de Cyperuselegans y las plantas completas, para suexposición con fenantreno.

Cultivo de raíces de Cyperus elegans

Se obtuvieron las raíces de las plantas de 60días de crecimiento cultivadas en soluciónnutritiva, todas las actividades siguientes sedesarrollaron bajo condiciones de esterilidad;éstas se cortaron, pesaron y depositaronen hipoclorito de sodio al 10% por 15minutos para su desinfestación, se enjua-garon con agua destilada estéril y seseccionaron cuidadosamente de ellascinco ápices radicales de 10 mm de longitudque se transfirieron a matraces Erlenmeyerde 125 ml con 25 ml de medio White (1934).

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Co.) a las mismas concentraciones que enlos experimentos in vitro: 40, 60 y 90 ppm, apartir de la solución patrón de fenantreno(100 mg/10 ml etanol al 95%), exponiéndolosdurante 10 días. Los cultivos hidropónicoscon el contaminante se mantuvieron bajocondiciones de invernadero a 37/17°C y56% de humedad relativa en promedio, conun sistema de burbujeo continuo mediantevarillas de vidrio sumergidas en cadaunidad hidropónica, conectadas a unabomba de aireación para proveer de aire a lasolución, prevenir la deposición defenantreno insoluble en el fondo y favorecerla intercepción de éste por los sistemasradicales y garantizar la distribución delcompuesto en el sistema.

Después de transcurrido el periodo deexposición a fenantreno, se obtuvo el pesode la biomasa total epigea (material foliar) ehipogea (material radical) para cadaexperimento, se evaluó la remoción defenantreno y se separó el sistema radicalpara los análisis enzimáticos.

Cuantificación del fenatreno removido porlos cultivos radicales de Cyperus elegans

Después de la exposición de los sistemasradicales de Cyperus elegans in toto e invitro a las diferentes concentraciones defenantreno, se decantó el medio de cultivoo la solución nutritiva para determinar lacantidad total de fenantreno (soluble y enpartículas). Para lo cual las raíces sesacudieron cuidadosamente dentro de lasolución para liberar cualquier partícula(s)de fenantreno depositadas y no adsorbidasen las raíces.

Se realizó la cuantificación del fenantrenoresidual en el medio, mediante una extracciónlíquido-líquido con 10 ml de benceno

Los cul tivos se mantuvieron bajocondiciones de oscuridad a 30ºC conagitación continua durante ocho días, parasu exposición a fenantreno.

Exposición de cultivos radicales in vitro deCyperus elegans a diferentes concentracionesde fenantreno

Los cultivos de los sistemas radicalesobtenidos, se expusieron a 40, 60 y 90 ppmde fenantreno (grado HPLC, SIGMAChemical Co.), a partir de una soluciónconcentrada (100 mg/10 ml etanol al 95%) ycon un cultivo sin fenantreno como testigo,todo esto bajo condiciones de esterilidad.La selección de la concentración defenantreno empleada en estos experimentostanto en condiciones in vitro como in totoproviene de ensayos previos realizados conésta y otras especies que toleran unintervalo de concentraciones probadas,además de otros reportes donde laconcentración de este contaminante fue de50, 100 y 200 mg/L (Flocco et al.; 2002 y2004) y de 7 a 500 ppm en suelo (Gao & Zhu,2004). La exposición se realizó por 10 díascon agitación continua para permitir laaireación de los cultivos y la dispersión delas partículas de fenantreno, no solubles enel sistema y al término se cuantificó lacantidad de biomasa radical total obtenida,la evaluación de la remoción del fenantrenoy la actividad enzimática superficial radicalde las fenoloxidasas.

Exposición de los cultivos in toto de Cyperuselegans a fenantreno

Se transfir ieron plantas completas acontenedores de vidrio ámbar de 1 L decapacidad que contenían 900 ml de lasolución mineral, a los que se les adicionófenantreno (grado HPLC, SIGMA Chemical

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(SIGMA Chemical Co.) empleando unembudo de separación, agitando y dejandoreposar por 10 minutos para separar yrecuperar la fase orgánica, este proceso deextracción se realizó dos veces con unarecuperación eficiente del fenantrenoremanente presente en el medio. Tambiénse realizó la extracción de fenantreno deextractos radicales, los cuales se obtuvierontomando una fracción de la biomasa radicaltotal y moliendo ésta en mortero con 5 ml debenceno, para después colocar la suspensiónen un embudo de separación, dejando reposarpor 10 minutos y separando la fase orgánicaque contenía el fenantreno.

Cabe mencionar que en los experimentosin toto, solamente se consideró lacuantificación de la biomasa radical debidoal contacto directo con el contaminante,además de que el fenantreno, por su tamañomolecular y sus características lipofílicas,no se transloca al resto de la planta.

Se guardó la fase orgánica para cuantificar elfenantreno por espectroscopía UV ypreviamente al análisis por cromatografía dealta presión de líquidos (HPLC), todas lasmuestras de los extractos en benceno de todoslos experimentos, se concentraron enrotavapor (40ºC/ 82 rpm) y se resuspendieronen 2 ml de metanol concentrado grado HPLC.

Para el análisis de HPLC se usó unacolumna HICHRON C-18 Hypersil, de 25cm x 4.6 mm, utilizando como fase móvil ungradiente de metanol-agua (50: 50), conun corrimiento de 70 minutos (velocidad deflujo: 1 ml/min), con un detector de UV paradeterminar la cantidad de fenantrenoresidual así como también la presencia deposibles productos de transformación

Determinación de la actividad enzimáticade fenoloxidasas radicales

Para realizar la determinación de la actividadde lacasas y peroxidasas en la superficieradical de estas plantas, se seccionaroncinco extremos apicales de un centímetrode longitud, de raíces frescas para cadaensayo llevando a cabo la medición de lasiguiente manera:

Determinación de la actividad enzimáticade lacasas

Se implementó el método de Guerrero(2000), donde las puntas de raíces secolocaron directamente en las celdas delespectrofotómetro y se adicionaron 2 mlde catecol 20 mM disuelto en regulador defosfato de sodio 20 mM, pH 6.8; la reacciónse efectuó a temperatura ambiente y se leyóla absorbancia a 450 nm, a los 10 minutos.Se transformaron las lecturas de As 450 nmy se utilizó el coeficiente de extinción molardel catecol (e

450 = 2.211 x 103 M-1 cm-1) para

determinar la actividad enzimática específicade las lacasas superficiales de la raíz, conrelación a la cantidad de catecol oxidado.

Para ajustar el espectrofotómetro se utilizócomo testigo una celda con 2 ml de catecol20 mM en regulador de fosfato de potasio 20mM, pH 6.8.

Determinación de la actividad enzimáticade peroxidasas

La determinación de la actividad de estasenzimas empleó 2 ml de regulador de fosfatode potasio 0.1 M, pH 6.0, 32 µl de guaiacol0.2 M y 26 µl de peróxido de hidrógeno 0.03M, la reacción se realizó a temperaturaambiente y se leyó la absorbancia a 436 nma los 5 minutos. Se transformaron las lecturas

de este compuesto a 254 nm.

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de As 436 nm, utilizando el coeficiente deextinción molar del guaiacol (e

436 = 6.4 x 103

M-1 cm-1) para determinar la actividadenzimática específica de las peroxidasas dela superficie radical, con relación a la cantidadde guaiacol oxidado.

Para ajustar el espectrofotómetro se utilizó comotestigo una celda con 2 ml de regulador defosfato de potasio 0.1 M, 32 µl de guaiacol 0.2M y 26 µl de peróxido de hidrógeno 0.03 M.Para la expresión de la actividad enzimáticaespecífica de ambas fenoloxidasas por árearadical (cm2) y por gramo de peso frescoradical se aplicó el método de Hendry(Guerrero, 2000) que se basa en la mediciónde la actividad enzimática con base en loscambios de absorbancia en el tiempo.

Análisis microscópico de las raícesexpuestas a fenantreno

Este análisis se realizó con el objeto deregistrar algún cambio evidente en lasuperficie de las raíces, después dehaberse expuesto a fenantreno.

Los fragmentos de raíz empleados seenjuagaron previamente con agua destiladay se montaron en gelatina glicerada coloridapara su observación en el microscopioestereoscópico Stemí SVII, Zeiss.

Análisis estadístico de los resultados

A los resultados de cuantificación debiomasa radical, porcentaje de fenantrenoremovido y actividad enzimática, se lesaplicó un análisis de varianza bifactorial(ANOVA) y una prueba de Tukey (p<0.05),empleando el paquete estadístico deDiseños Experimentales FAUNL, véase 1.4(Olivares, 1989). Todos los experimentos serealizaron por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis de la remoción de fenantreno porlos cultivos radicales in vitro e in toto deCyperus elegans

En cuanto al crecimiento radical de Cyperuselegans, la cantidad de biomasa hipogeaobtenida en el tiempo de exposición afenantreno, fue ligeramente mayor en loscultivos expuestos a fenantreno conrespecto al testigo en ambas condicionesde cultivo. Sin embargo, esto no representaun efecto notorio sobre la masa radical, yaque las diferencias estadísticas tanto en loscultivos in vitro como in toto no reflejaronuna diferencia significativa entre lostratamientos con fenantreno y el testigo;no obstante que sí se presenta unadiferencia significativa entre las doscondiciones experimentales (p < 0.05).Cabe mencionar que la respuesta obtenidaen los cultivos radicales in toto, fue mayordadas las características de la plantacompleta; en el otro caso (cultivo in vitro)prácticamente el alargamiento delas raíces obtenido no reflejó un crecimientosustancial en esta especie bajo talescondiciones (fig. 1).

Remoción de fenantreno por el sistemaradical in vitro e in toto de Cyperus elegans

El porcentaje de fenantreno removido poresta especie fue bajo en este tiempo deexposición (10 días) ya que solamente seobtuvo un 6 y 8% de remoción en losexperimentos con 60 ppm y de 32 a 27% enlos experimentos de 90 ppm en los cultivosin vitro e in toto respectivamente; mientrasque en ambas condiciones de cultivo en elexperimento con 40 ppm no hubo remoción,quedando el contaminante en el medio decultivo (casi el total de las 40 ppm) (fig. 2),

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0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Testigo 40 ppm 60 ppm 90 ppm

Experim ento s

g p

eso

fres

co r

adic

al

in vi troin toto

Fig. 1. Biomasa radical de Cyperus elegans, in toto e in vitro expuestas a fenantreno,sin diferencias significativas entre los experimentos; pero sí entre

las dos condiciones de cultivo.

a

bb

a

0

5

10

15

20

25

30

35

40

40 ppm 60 ppm 90 ppm

Experimentos

% d

e re

moc

ión

de fe

nant

reno

in vitro

in toto

Fig. 2. Porcentaje de fenantreno removido por el sistema radical de Cyperuselegans, las diferentes letras señalan las diferencias significativasencontradas entre los experimentos con fenantreno para las dos

condiciones: in vitro e in toto (p< 0.05).

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Fig. 3. Raíces de Cyperus elegans, cultivo in toto, testigo sin fenantreno,técnica de campo oscuro (66 x).

Fig 4 . Raíces de Cyperus elegans cultivo in toto, expuestas a 60 ppm de fenantreno,donde se observa la masa del contaminante adherido a la

superficie radical, técnica de campo oscuro (66 x).

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primera fase del gradiente metanol-agua yque no se presentó en las muestras testigo(fig. 5). Se sugiere que su estructura poseediferente polaridad a la del fenantreno, quese podría tratar de un compuesto nuevo(fig. 6).

Evaluación de la actividad enzimática defenoloxidasas radicales superficiales de losexperimentos de los cultivos radicales invitro e in toto de Cyperus elegans

Es difícil separar las respuestas primariasrelacionadas con la inhibición delcrecimiento radical de respuestas secun-darias que se obtienen como consecuenciadel daño de los sistemas radicales. Cambiosen la actividad enzimática y las pozasmetabólicas en respuesta al estrés, sonparticularmente útiles para proporcionar unadetección temprana de las alteracionesprimarias en plantas.

Los parámetros fisiológicos y diagnósticosque se evalúan, proporcionan investigaciónsobre la respuesta de xenobióticos enplantas, y permiten revelar mecanismos queconfieran tolerancia; los cambios fisio-lógicos específicos están relacionados conel modo de acción de un compuesto, lo quepermite cuantificar el efecto de éste, noobstante que también las respuestasmetabólicas a un estrés fisiológico generalpueden ser útiles como indicadores del efectode xenobióticos (Sprecher & Stewart, 1995).Una de estas respuestas es la activación oincremento en la síntesis de enzimas oxidativas(peroxidasas, superóxido dismutasas, catalasa,glutatión reductasa, polifenol oxidasas) lascuales con frecuencia se presentan enrespuesta a varias condiciones de estrés enplantas (Cakmak & Marschner, 1992).

esto pudo deberse a problemas en laextracción del contaminante, ya que seobservó una turbidez en el medio, lo queinterfirió directamente en la cuantificacióndel mismo. Es importante mencionar que noobstante que la magnitud del porcentaje deremoción (menos del 50%) así como lacantidad de biomasa radical fueron bajas,la cantidad de fenantreno removido estuvoasociado con el desarrollo radical a mayorconcentración de fenantreno, siendosignificativa la diferencia entre losexperimentos de 60 y 90 ppm (p< 0.05) paralas dos condiciones: in vitro e in toto,presentándose una interacción hidrofóbicaentre el contaminante y el sistema radical(figs. 3 y 4), donde las propiedadeslipofílicas de los componentes de las paredesy membranas celulares de las raíces, eltamaño del compuesto y sus característicashidrofóbicas, permitieron que el fenantrenose concentrara en la superficie radical.Este evento confirma los patronescaracterísticos que presentan loshidrocarburos policíclicos aromáticos de sercompuestos lipofílicos, hidrofóbicos y conuna alta tendencia a concentrarse sobre lasraíces (Schwab et al., 1998).

Caracterización cromatográfica por HPLCdel fenantreno extraído de los cultivosradicales de Cyperus elegans

Los análisis por cromatografía de líquidosde alta presión (HPLC) del medio de cultivoy del extracto radical mostraron la detecciónde los picos característicos de fenantreno,entre ellos el más prominente a los 35minutos de retención, y en particular en elextracto radical de 90 ppm, un pico a los 25minutos 40 segundos, no comparable a lospicos característicos del fenantreno, ya queestos compuestos se separaron durante la

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Fig. 6. Cromatograma del extracto radical del experimento con 90 ppm defenantreno, cultivo in toto de Cyperus elegans y patrones de fenantreno,

fenantrol y fenatroquinona.

Fenantroquinona

Fenantrol

Fenantreno

Pico del extracto radical 90 ppm (25’ 40’’)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

UA

Minutos 25 50 0

Fig. 5. Cromatograma del extracto radical del experimento testigo,cultivo in toto de Cyperus elegans.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

UA

Minutos 25 50 0

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Las peroxidasas son enzimas que juegan unpapel importante en la fisiología de lasplantas participando en la regulación delcrecimiento celular y la expansión ydesarrollo vegetal; son fácilmente mediblesy dan una evidencia temprana de larespuesta de plantas ante estrés biótico yabiótico (Gaspar et al., 1985; de Souza etal., 2002).

En este trabajo se evaluó la actividad dedos fenoloxidasas: lacasas y peroxidasas,cuya actividad fue diferente no solamentedependiendo de la enzima, sino también delsistema radical empleado.

En los experimentos in vitro, la actividad delas peroxidasas superficiales radicales

resultó mucho menor y fue casi impercep-tible comparada con la de lacasas; lo quepudo estar relacionado con las caracte-r ísticas constitutivas de las enzimaspresentes en estas raíces además de que lascondiciones y desarrollo de estos sistemasradicales es diferente; ambas enzimasdisminuyeron en su actividad ante lapresencia del contaminante (fig. 7), cabemencionar que se presentó diferenciasignificativa entre las dos enzimas deacuerdo con la actividad medida (p< 0.05).

En los sistemas radicales in toto, la actividadde peroxidasas fue mayor que la de lacasas,además de que en este caso se evidencióde manera notoria que la presencia delcontaminante incrementó la actividad de las

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0.001

0.002

0.003

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Experimentos

nM/m

in/c

m2 /g

pes

o fr

esco

rad

ical

peroxidasaslacasas

Fig. 7. Actividad de peroxidasas y lacasas radicales de Cyperus elegans in vitro,sin diferencias significativas entre los diferentes tratamientos por enzima (p< 0.05).

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reportados por Santos de Araujo et al. (2002)realizados con raíces transformadas dezanahoria, expuestas a pirogalol, 2-aminofenol, p-cresol, catecol, 2-4diclorofenol y guaiacol, la actividad deperoxidasas de los extractos radicales seincrementó después de la adición de estoscompuestos aromáticos. En nuestro caso,la naturaleza de los sistemas empleadosdemostró que en los cultivos in vitro deesta especie, el estado de las raíces fueimportante para la respuesta obtenida. Cabemencionar que estos experimentos nofueron con raíces transformadas, sólo fueroncultivos obtenidos de raíces de la plantamadre que se dejaron en un medio mineralcon hormonas vegetales y prácticamentefueron considerados como sistemasinmovilizadores del contaminante, sin laparticipación de toda la planta.

La respuesta de los sistemas radicales intoto de C. elegans, mostró que la plantacompleta dio una respuesta integral ante lapresencia del contaminante, que resultó másrepresentativa y con una variabilidad relati-vamente menor a la medida en las raíces invitro; cabe mencionar que ésta puede rela-cionarse con la respuesta individual y au-tónoma de cada raíz dadas las condicionesde cultivo donde se mantuvo su prolifera-ción. Obteniéndose también una diferenciasignificativa para la actividad de peroxidasasentre las condiciones in vitro e in toto.

Este estudio consideró la evaluación de laactividad de dos tipos de fenoloxidasas yla naturaleza de la respuesta dependió de lasusceptibilidad y situación constitutiva delas enzimas radicales superficiales:peroxidasas y lacasas.

Se hace mención a que la aplicación deplantas completas ricas en peroxidasas

peroxidasas en por lo menos dos veces másque la actividad de los sistemas radicalessin fenantreno; lo que resultó inversó parael caso de lacasas (fig. 8). No se obtuvo unadiferencia siginificativa en la actividadenzimática de peroxidasas en losexperimentos expuestos a fenantreno,mientras que sí se presentó en el caso delacasas, además de que la comparación entrelos sistemas enzimáticos para las raíces delas plantas completas, sí mostró unadiferencia estadística significativa (p< 0.05).

Se menciona que las enzimas de plantas dela familia del Citocromo P450, son capacesde oxidar compuestos aromáticos mono ypolicíclicos, y estas enzimas podrían cons-tituir la vía principal de detoxificación deestos compuestos (Korte et al., 2000), noobstante esto, se ha sugerido la participa-ción de peroxidasas en la detoxificación dealgunos compuestos aromáticos (Pletsch, etal., 1999; Santos de Araujo et al., 2002;Kucerová et al., 1998), además de que estasenzimas se emplean frecuentemente comobiomarcadores no específicos de contami-nación ambiental (Lyte & Lyte, 2001) res-pondiendo a la acción de estrés abiótico dadopor la presencia de químicos orgánicos queson altamente tóxicos para la planta.

El caso particular de Flocco et al. (2002) queevaluaron la actividad de peroxidasas de losextractos radicales de plantas de alfalfaexpuestas a fenantreno en cultivoshidropónicos donde la concentraciónempleada de este contaminante (50 mg/L)afectó el estado fisiológico de las plantasevidenciado a través del decremento en elíndice de crecimiento, el contenido declorofila y una reducción significativa en laactividad de estas enzimas, asociados a unefecto tóxico del contaminante para estaespecie; mientras que en los resultados

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a

bb b

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Experimentos

nM/m

in/c

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pes

o fr

esco

rad

ical

peroxidasaslacasas

Fig. 8. Actividad de peroxidasas y lacasas radicales de Cyperus elegans, in toto,las diferentes letras señalan las diferencias significativas encontradas únicamente

entre los experimentos con fenantreno y el testigo para lacasas (p< 0.05).

En cuanto a la actividad enzimática radicalsuperficial, la actividad de lacasas fue mayoren los cultivos in vitro, mientras que la acti-vidad de peroxidasas lo fue en los cultivosin toto; la naturaleza de estos sistemas radi-cales evidenció la susceptibilidad de los pri-meros de manera significativa.

La separación por el análisis de HPLC de uncompuesto particular en los extractosradicales de los cultivos in toto para laconcentración más alta de fenantreno,mostró la probabilidad de que existiera unatransformación del fenantreno, quizá por laoxidación de alguno de sus anillos. Para ello,falta constatar si las enzimas inducidas(peroxidasas) en los experimentos de loscultivos radicales in toto con el fenantreno,participarían en ello.

para el tratamiento de suelos y aguacontaminados es recomendable como loreportan Adler et al. (1994), por lo que,como lo sugieren Santos de Araujo et al.(2002), la investigación debe orientarsesobre otras enzimas catabólicas comolacasas, tirosinasas y otras fenoloxidasasútiles en la transformación de xenobióticos.

CONCLUSIONES

Cyperus elegans resultó ser una especie cuyacapacidad de remoción de fenantreno por susraíces no fue tan significativa, ya queconstituyó un 32 y 27% en los sistemasradicales in vitro e in toto respectivamente;así mismo, el efecto que causó la exposición afenantreno, no fue perjudicial para el desarrolloradical para ambas condiciones de cultivo.

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Finalmente, este ensayo mostró que la relaciónentre la dinámica de remoción, el metabolismodel fenantreno y la actividad in situ deperoxidasas y lacasas por los sistemasradicales de Cyperus elegans de la plantacompleta y los cultivos de raíces, constituyenuna investigación que marca el punto departida en el conocimiento de sistemasradicales de especies que crecen en zonascontaminadas que pudieran ser consideradascomo columnas inmovilizadoras decompuestos, como superficies con enzimasasociadas a ellas que transformen y confinenxenobióticos en la superficie radical y con elloconstituir herramientas biotecnológicas parala remoción de contaminantes.

AGRADECIMIENTOS

El segundo autor agradece a la Direcciónde Posgrado e Investigación del IPN, elapoyo financiero otorgado al ProyectoCGPI: 20041251, para la realización de estetrabajo.

LITERATURA CITADA

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COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD DE REMOCIÓN DE …útiles en la remoción y transformación de contaminantes orgánicos. MATERIAL Y MÉTODOS Obtención de las plántulas de Cyperus elegans