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COMPORTAMIENTO EN ALMÁCIGO DEL PORTAINJERTO CÍTRICO Poncirus trifoliata var. Flying Dragon INOCULADO CON MICORRIZAS, EN

TUCUMÁN, ARGENTINA. ESTUDIOS PRELIMINARES*.(1)Pérez Visñuk, M. A.; (2)Ortiz, N. del V.; (3)Brandán de Weht, C. I.; (4)García, R.; (5)Weht, R. S.

(1), (2), (3) Facultad de Agronomía y Zootecnia, UNT (4) Citrusvil S. A. (5) LABOCOIN Trabajo financiado con los proyectos CIUNT 403 y 420.

e-mail: nortiz@arnet.com.ar ; celiainesbrandan@yahoo.com.ar

RESUMEN

Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon) es un portainjerto cítrico de alta aceptación en Tucumán. La fertilización biológica con hongos formadores de micorrizas en sustratos de almacigueras en vive-ros cítricos, mejora la nutrición en plantines, el crecimiento y defensa contra patógenos de raíces. Los citrus son dependientes de las micorrizas. Sin antecedentes de inoculación sistemática en portainjer-tos citrus con hongos micorrícicos en Tucumán, el objetivo fue evaluar los efectos de la inoculación con una especie de hongo (Glomus intrardices) en el comportamiento y evolución de plantines de Poncirus trifoliata var. Flying Dragon en un vivero comercial. Se tomaron muestras de plantas de 45 días de edad de portainjerto cítrico Poncirus trifoliata var. Flying Dragon. Los tratamientos fueron: Testigo, sin inocular, y Tratamiento, plantas inoculadas. Las plantas se seleccionaron con un Mues-treo Simple al Azar. Se determinaron: longitud radical y de parte aérea, peso fresco y diámetro del tallo a la altura del cuello. La cantidad de esporas en el sustrato y el porcentaje de colonización fueron bajos. Se detectaron nemátodes vivos y muertos en sustrato y raicillas. La presencia de nemátodes micófagos y fitófagos afectó severamente la colonización y eficiencia de la micorrización.

Palabras claves: viveros-nutrición-micorrización-nemátodes

SUMMARY

Poncirus trifoliata var. Flying Dragon is a citrus rootstock with high acceptance in Tucumán. Bio-logical fertilization using species of mycorrhizal fungi in the soil mixture of seedbeds in the nursery citrus, promotes seedling nutrient acquisition, growth and protection against root pathogens. The citrus in general are dependent on mycorrhizae. There is no previous studies out systematic inoculation in citrus rootstocks with mycorrhizal fungi in Tucumán. The objective was to evaluate the inoculation effects with a fungal species (Glomus intrardices) on the behavior and development of seedlings of Poncirus trifo-liata var. Flying Dragon in a commercial nursery. Samples were taken from 45 days old plants rootstock. The treatments were: “control”, without inoculation, and treatment, “inoculated plants”. Samples were selected from simple random sampling. Was used to determine root length, fresh weight, dry weight and stem diameter at the neck of seedlings. The number of spores in the substrate and the colonization rate was low. Nematodes were found alive and dead on soil and roots. The presence of these, had severely affected the colonization and mycorrhizal efficiency.

Key words: nurseries – nutrition – mycorrhization – nematodes.

INTRODUCCIÓNPoncirus trifoliata, variedad cítrica utilizada como portainjerto, es originario de China. Presenta muy

buenas características productivas debido a su resistencia al frío y a sus propiedades enanizantes, altamen-te deseadas por facilitar las tareas de manejo en la quinta cítrica tucumana y permitir reducir los costos de producción. Es considerada una variedad con buena tolerancia al anegamiento de suelos, a la presencia de Phytophthora parasítica y al ataque de nemátodes en suelo.

El empleo de micorrizas, del griego, mycos = hongos y rhizos = raíces, en la mezcla de suelo utili-zado en las almacigueras de los viveros cítricos, está orientado dentro de los mecanismos de fertilización biológica a favorecer la adquisición de nutrientes por parte de los plantines, a la vez de ejercer un efecto promotor del crecimiento que ayude a superar situaciones de estrés fundamentalmente al momento de

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transplante del plantín durante el pasaje de almácigo a vivero y de vivero al campo. Estos microorganis-mos cumplen con la condición de ser amigables con el ambiente, ya que se trata de organismos que natu-ralmente se encuentran vinculados en la rizósfera de las plantas cultivadas (micorrizas nativas), sólo que en estos casos se incrementa su población, para lograr los fines ya citados con anterioridad.

Los objetivos de este trabajo fueron evaluar los efectos de la aplicación de un inoculante comercial con una especie de hongo (Glomus intraradices) en el comportamiento y evolución de plantines de Pon-cirus trifoliata var. Flying Dragon en un vivero comercial.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo de campo se llevó a cabo en los viveros de una empresa citrícola privada de Tucumán.

Previo a la toma de muestras del ensayo implantado se realizó un estudio de determinación de pre-sencia-ausencia de micorrizas en el sustrato (musgo Sphagnum sp importado) a fin de desestimar posible presencia de micorrizas de otros géneros que incidieran de algún modo en el ensayo a implementarse. El método usado fue el de tratamiento de muestras de Sphagnum con un protocolo de decoloración (Philips and Hayman, 1970), y coloración con el colorante triple de Gueguén (Verna y Herrero, 1952). En la Fig. N° se observan los ensayos realizados y la toma de muestras.

Fig. 1 .Se observan imágenes de la cama con sustrato de Sphagnum sp puro, el estado de los plantines, el ambiente con registro de temperaturas y la toma de muestras en la empresa comercial.

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En el mes de Noviembre de 2010, se tomaron muestras de especimenes cítricos pertenecientes a Pon-cirus trifoliata (var. Flying Dragon), obteniéndose dos tratamientos T(0) testigo sin inocular y T1 varie-dad inoculada con un inoculante comercial en base a Glomus intraradices.

La obtención de las muestras se realizó mediante un Diseño Muestral Simple al azar. Se seleccionaron las unidades testigos T0 (n = 79) e inoculadas T1(n = 86) mediante un esquema aleatorio dentro de cada almaciguera.

Entre los materiales empleados para la recolección se pueden citar: guantes de látex para manos, bolsas plásticas, etiquetas, libreta de campo y lapicera, registros fotográficos “in situ” en laboratorio con técnicas de macro y microfotografía.

Una vez ingresado al vivero, se procedió a visualizar y a diferenciar las almacigueras inoculadas de aquellas que no lo estaban. Se extrajeron las muestras, desestimando las de las borduras, de acuerdo al un diseño de muestreo aleatorizado de 8 muestras de plantines cítricos variedad Flying Dragon por módulo de almaciguera. Se colocaron éstos dentro de bolsas plásticas etiquetadas, juntamente con muestras de sustrato del área de la rizósfera, que luego se conservaron en heladera a 4° C hasta su análisis en labora-torio.

Posterior a la recolección de las muestras verdes en vivero, en laboratorio de Microbiología Agrícola de la Facultad de Agronomía y Zootecnia, se realizaron análisis cuantitativo y medición de los siguientes parámetros: Longitud radical y de parte aérea; Peso fresco de cada muestra y Diámetro del tallo a la altura del cuello de cada plantín. Se emplearon para ello Balanza electrónica, regla milimetrada y calibre Vernier Cualitativamente, la recolección y recuento de esporas se realizaron mediante un protocolo estandariza-do de tamizado húmedo (Gerdeman and Nicolson, 1963). Se observó presencia-ausencia de estructuras fúngicas de Glomus intaradices en raicillas tratadas con un método de decoloración y tinción (Philips and Hayman, 1970) y se las coloreó con colorante triple de Gueguén(Verna y Herrero, 1952). Se realizaron otras observaciones a fin de detectar otros agentes bióticos en raíces o libres en el sustrato.

Los equipos y materiales usados fueron: Balanza electrónica, Vasos de precipitación, Contenedores plásticos, Juego de tamices de mallas calibradas con diferentes tamaños, Lupa binocular / Microscopio computarizado, Solución de Dextrosa al 60%, porta y cubreobjetos, centrífuga, etiquetas, cuaderno de campo.

Para la recolección de esporas se tomaron 50 gr de las muestras de sustrato. Se trabajó con un total de 4 muestras, considerando una perteneciente a Flying Dragon T0 (testigo) y la otra perteneciente a Flying Dragon T1 (inoculada).Una vez pesadas las mismas, se suspendieron en agua durante 5 minutos. Se hizo pasar por un juego de tamices la suspensión generada, descartando el empleo del precipitado ubicado en el fondo del contenedor. Se diluyó la muestra, dejando reposar 5 minutos nuevamente, haciendo pasar la suspensión por el juego de tamiz. Se repitió la operación 2 veces más. Se desecharon las muestras re-tenidas en tamices 1 (mallas de 1 mm) y 2 (60 mallas pulg2); se consideraron las de los tamices número 3 (90 mallas pulg2) para el análisis en muestra fresca; el retenido en el tamiz 4 (230 mallas pulg2) se lo destinó para ser centrifugado durante 5 minutos a 1.500 rpm. El contenido se colocó en agua corriente y se trasvasó a un tubo de centrífuga con 25 ml de agua corriente y 25 ml de dextrosa al 60%. Se extrajo de la interfase de dextrosa del tubo de ensayo, haciéndola pasar nuevamente por tamiz número 4; se lavaron de inmediato con agua corriente para evitar daños por acción de la presión osmótica y con micropipeta se colectaron las esporas y se transfirieron a portaobjetos.

Tanto la muestra fresca como la obtenida del proceso de centrifugación se observaron en lupa bino-cular y microscopio, a los fines de detectar e identificar las micorrizas u otros organismos presentes. Se trataron las esporas colectadas con reactivo de Melzer y otras con PVLG (alcohol polivinílico en lacto-glicerol). Para su identificación se usaron claves taxonómicas (Schenk y Pérez, 1986) y las del INVAM (www.invam.caf.wvu.edu/).

Se trabajó posteriormente con los datos cuantitativos obtenidos en laboratorio, confrontando los datos referidos a variedad Flying Dragon T0 frente a los de Flying Dragon T1, a través del uso del programa estadístico INFOSTAT.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se constató la ausencia de micorrizas de todo tipo en el sustrato en base a musgo Sphagnum sp im-portado.

Del análisis en laboratorio, cuyos resultados se expresan en la Tabla 1, se determinaron ausencia de micorrizas en T0 y presencia en T1, tanto en muestras del sustrato como en las raicillas. En las raicillas se observaron vesículas esféricas con contenido lipídico neto de color rojo, hifas cenocíticas, y arbúsculos.

Tabla N° 1. Presencia-ausencia de micorrizas en Poncirus trifoliata var. Flying dragon. 2010. Tucumán.

TratamientosPresencia de estructuras

fúngicas

Cantidad de esporas/50 g de

sustrato

Colonización en raicillas (%)

Otras observaciones

T0 (-) 0 0Nemátodes en sustrato

y raicillas

T1(+)

(v, a, h, e)298 34

Nemátodes en sustrato y raicillas

Referencias. V: vesículas; a: arbúsculos; h: hifas cenocíticas; e: esporas internas

Se considera que los valores encontrados son escasos en cuanto al número de esporas libres en el sus-trato; esto estaría dentro de lo normal para esta especie que forma las esporas en el interior de las raicillas, pero a su vez los valores del porcentaje de colonización no es el esperable, teniendo en cuenta que no había otros agentes fúngicos que compitan por los sitios de colonización.

En las observaciones microscópicas se detectaron, por una parte, la presencia constante de nemátodes vivos y muertos en muestras del sustrato, en coincidencia con la presencia de esporas perforadas por los estiletes de los nemátodes; y por otra, en el interior de los tejidos de las raicillas (fitófagos). Se considera que las poblaciones de nemátodes afectan a las esporas de los hongos (micófagos) conllevando esto a la disminución de propágulos como elementos de recolonización natural y permanente. Los nemátodes observados en las raicillas de los citrus (fitófagos) inciden, por las heridas que causan, como puntos de ingreso de agentes patógenos bacterianos o fúngicos del ambiente. Se estima que las poblaciones de ne-mátodes provienen de los restos de las camas (de madera) de cultivos anteriores al presente que no fueron desinfectadas oportunamente.

Los resultados del análisis estadístico se observan en la Tabla N° 2

Tabla N° 2. Medidas resumen variedad Flying Dragon Testigo / Tratamiento

TIPO Variable n Media D.E. Mín Máx MedianaTESTIGO PESO FRESCO (GR) 79 5,07 1,22 1,94 8,37 5,06TESTIGO LONG PARTE AEREA(CM) 79 40,28 5,18 31,00 59,00 40,00TESTIGO LONG RAICES (CM) 79 20,77 4,03 13,00 34,00 21,00TESTIGO DIÁMETRO TALLO (MM) 79 3,67 0,39 2,34 4,92 3,66

TRATAMIENTO PESO FRESCO (GR) 86 3,61 1,38 0,85 6,37 3,67TRATAMIENTO LONG PARTE AEREA(CM) 86 34,13 6,98 17,50 46,50 35,75TRATAMIENTO LONG RAICES (CM) 86 18,56 4,04 10,00 28,00 18,00TRATAMIENTO DIÁMETRO TALLO (MM) 86 3,06 0,58 1,58 5,50 3,05

Los mismos muestran que el testigo presenta valores mayores que el tratamiento en todos los pará-metros. De la inferencia estadística realizada para la diferencia de medias de testigo y variedad tratada se observó que para los parámetros peso fresco, longitud parte aérea y longitud de diámetro de tallo resultó significativa con p = 0,0000, mientras que longitud de raíces no tiene diferencia significativa (p = 0,9997)

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CONCLUSIONES

La presencia de nemátodes micófagos produce una disminución en el potencial de reinfección y efi-ciencia del hongo micorrícico, perjudicando su óptima expresión en la simbiosis microorganismo – planta.

Los resultados obtenidos para Flying Dragon, llevan a suponer que la fertilización biológica con mi-corrizas no generó cambios positivos entre los valores de la muestra testigo y la inoculada. Los resultados del testigo ligeramente superiores a los del tratamiento se atribuyen a la interacción de factores externos que pertubaron su expresión.

Se estima que la presencia de nemátodes micófagos influye severamente sobre la expresión de la ac-ción de las micorrizas.

A partir de las conclusiones obtenidas en este trabajo se aconseja realizar severos controles de agentes bióticos contaminantes que afectan fuetemente al hongo micorrícico y a la planta hospedera.

BIBLIOGRAFÍAGerdemann, J. W. & Nicolson, T. H. 1963. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet siev-Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet siev-

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Infostat. Software estadístico. 2008. Facultad de Ciências Agrárias de la Universidad Nacional de Córdoba.

INVAM (www.invam.caf.wvu.edu/)

Phillips JM, Hayman DS. 1970. Improves procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbus-oves procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbus-cular mycorrhizal fungi for rapid assesment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55: 158-161.

Schenck , N. C. and Perez, I. 1986. Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi Ed: The American Phyto-pathological Society. USA: 335 p.

Steel Robert G. D. , Torrie James H.. Bioestadística, Principios y Procedimientos. Segunda Edición. 622 páginas. McGraw-Hill, 1989.

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Verna, L.C.; Herrero, F.J. 1952. Micología. Morfología, biología, Experimentación. Ed. El Ateneo, Bs As: 209-210.

Walpole, Ronald E., Myers, Raymond H. , Myers Sharon L . 1999. Probabilidad y Estadística para Ingenieros. Sexta Edición. Pearson Educación Publicaciones. México, 752 p.