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Consejo Superior de
Investigaciones Científicas
Departamento de Nutrición Vegetal
Estación Experimental de Aula Dei
Zaragoza
Tesis Doctoral
Metabolismo de Ascorbato y Tioles en Leguminosas
Memoria presentada por D. Jorge Loscos Aranda
Licenciado en Bioquímica, para optar al grado de Doctor en Bioquímica
Zaragoza, Diciembre de 2007
D. Manuel Becana Ausejo, Profesor de Investigación del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas, y D. Manuel Ángel Matamoros Galindo, Científico Titular
del Consejo Superior de Investigaciones Científicas,
CERTIFICAN:
Que la Tesis Doctoral titulada “Metabolismo de Ascorbato y Tioles en Leguminosas”
ha sido realizada por el Licenciado D. Jorge Loscos Aranda en el Departamento de
Nutrición Vegetal de la Estación Experimental de Aula Dei del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas bajo nuestra dirección y reúne, a nuestro juicio, las
condiciones requeridas para optar al Grado de Doctor en Bioquímica.
Zaragoza, Diciembre de 2007
Dr. Manuel Becana Ausejo Dr. Manuel Ángel Matamoros Galindo
A Mª Carmen,
a mis padres y a mi hermana
AGRADECIMIENTOS
Una de las mayores ventajas de la profesión de científico es que te permite observar, interaccionar, dialogar, compartir, comprender, aprender cosas y hasta conocer a muchas y muy variadas personas a lo largo de tu vida. En alguna ocasión puedes hacer muy buenos amigos o, incluso, llegar a amar a alguien. Por tanto, son muchos los que han intervenido directa o indirectamente, voluntaria o involuntariamente, a la realización de esta Tesis. Muchas gracias a todos ellos, especialmente a las siguientes personas. En primer lugar quiero agradecer al Dr. Manuel Becana el estímulo y la ilusión transmitidos durante la realización de esta Tesis, así como todo el conocimiento que haya podido “absorber” de él. También quiero agradecer al Dr. Manuel Matamoros (“Manu”) el esfuerzo dedicado a la realización de gran parte de los experimentos que se presentan aquí y, especialmente, las críticas constructivas y su implicación en la corrección de esta Tesis. Asimismo agradezco también la financiación recibida por parte de los proyectos en los que figura el Dr. Manuel Becana como investigador principal: AGL2002-02876 y AGL2005-01404 del Ministerio de Educación y Ciencia – Fondos Europeos de Desarrollo Regional, y E33 (Grupo de Investigación Consolidado) del Gobierno de Aragón – Fondo Social Europeo. También el proyecto PIP137/2005 del Gobierno de Aragón, cuyo investigador responsable es el Dr. Manuel Matamoros. Por último, quiero agradecer al Gobierno de Aragón la concesión de una ayuda predoctoral de investigación (B041/2004). Al Dr. Joaquín Abián quiero agradecerle el haberme dado la oportunidad de visitar su laboratorio en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona, y a Montse, Ignasi, Marina y Miguel su hospitalidad y ayuda. A mis compañeros de laboratorio, porque sin su ayuda y colaboración no hubiera sido posible la obtención de los resultados que aparecen en esta Tesis y en los artículos: a María C quiero agradecerle sus enseñanzas (y su infinita paciencia) al comienzo de mi estancia en la EEAD. Tampoco me olvido de las clases de Carmen, sobre todo con la HPLC, ni de su asistencia técnica con algunas figuras y diapositivas gracias a su “tetracromismo”. A Javier le agradezco sobre todo que haya compartido conmigo experiencias vitales, lecciones de historia y revelaciones apocalípticas. Gracias también a Loreto, que ha sido la persona con la que más horas de laboratorio y de despacho he compartido; y a Pilar, especialmente porque cuando veo un bombero ya no puedo evitar sonreír. Por último a Joaquín, al que quiero pedir perdón públicamente por utilizarle de conejillo de indias y obligarle a beber cervezas belgas de alta graduación (aunque realmente no le vi muy enfadado...).
Al resto de compañeros de la EEAD, tanto los que están actualmente (Marian, Vanesa, Beatriz, Sara S, Sara L, Víctor, Ruth, Aurora, Rubén, Irene, Ade, Ana Flor, Ana A, María M, Merche, Natalia, Pedro, Afif, Laura, Manuel, David, Leticia, Conchi,...) como los que se fueron (Sergio, Olfa, María B, Raquel, Iñaqui, Lorena, Sofía, Meriam, Jorge AF, Juan, Laura O, Lourdes,... y, por supuesto, Conchita). Pero principalmente quiero agradecerle TODO a Victoria, por ser así y estar siempre ahí, y a Miguel y Mariví, por sus consejos y apoyo tanto dentro como, sobre todo, fuera del trabajo. También me gustaría dar las gracias a Benjamín, Nacho y Pablo, mis amigos de la infancia, adolescencia y juventud. Espero que sigamos batiendo récords imposibles y contando batallitas “limberas”. Para el final dejo a mis padres, José Luis y Ascensión, a mi hermana Silvia, a mis abuelas y al resto de mi familia. Aunque aparezcan los últimos, NADA hubiera sido posible sin ellos. Gracias por vuestro cariño, ánimo y comprensión. Muchas gracias también por lo mismo a José Luis II, Fina, Susana, Jorgete y Elka. Y especialmente, muchas gracias a Mª Carmen, por servirme de ejemplo con lo que hace y con lo que dice, por sufrirme y ayudarme en todo, y por estar siempre a mi lado. Gracias por haberme cambiado la vida.
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ABREVIATURAS AO Ascorbato oxidasa ASC Ascorbato reducido Ax Absorbancia a una longitud de onda de X nm BSA Albúmina sérica bovina DAPI 4’,6-diamidino-2-fenilindol DFO Desferrioxamina B DHA Deshidroascorbato DIC Contraste de interferencia diferencial DMSO Dimetilsulfóxido DR Deshidroascorbato reductasa DTE Ditioeritritol DTNB Ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) DTPA Ácido dietilentriaminopentaacético DTT Ditiotreitol εx Coeficiente de extinción a una longitud de onda de X nm EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EPPS Ácido N-(2-hidroxietil)piperacina-N’-3-propanosulfónico FISH Hibridación in situ con fluorescencia GalLDH L-Galactono-1,4-lactona deshidrogenasa γEC γ-Glutamilcisteína γECS γ-Glutamilcisteína sintetasa HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetanosulfónico (h)GSH (Homo)glutatión reducido (h)GSHS (Homo)glutatión sintetasa (h)GSSG (Homo)glutatión oxidado (h)PC (Homo)fitoquelatina HPLC Cromatografía líquida de alta resolución IPTG Isopropiltio-β-galactósido JA Ácido jasmónico Lb Leghemoglobina MBB Monobromobimano MDA Malondialdehído MDHA Monodeshidroascorbato MOPS Ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico OASTL O-Acetilserina(tiol)liasa PCS Fitoquelatina sintasa Pi Fosfato inorgánico PVDF Polivinildifluoruro PVP Polivinilpirrolidona PVPP Polivinilpolipirrolidona qRT-PCR RT-PCR cuantitativa en tiempo real RNS Especie reactiva de nitrógeno ROS Especie reactiva de oxígeno SAT Serina acetiltransferasa TBA Ácido 2-tiobarbitúrico TFA Ácido trifluoroacético Tris Tris(hidroximetil)aminometano
Índice
Índice
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ÍNDICE 1.Introducción ..................................................................................................... 1
1.1. Fijación biológica de N2 ....................................................................................3 1.1.1. Simbiosis rizobio-leguminosa ...................................................................4 1.1.2. Formación, tipos y estructura de nódulos de leguminosas ........................5
1.2. Especies reactivas de oxígeno y estrés oxidativo en plantas.............................9 1.2.1. Definición y tipos de especies reactivas de oxígeno .................................9 1.2.2. Producción de especies reactivas de oxígeno en plantas......................... 11 1.2.3. Daño oxidativo a biomoléculas ............................................................... 15 1.2.4..Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno: señalización molecular ....... 17
1.3. Sistemas antioxidantes en plantas ................................................................... 18 1.3.1. Antioxidantes enzimáticos....................................................................... 18 1.3.2. Antioxidantes no enzimáticos.................................................................. 21
1.4. Ascorbato (vitamina C) en plantas .................................................................. 23 1.4.1. Funciones................................................................................................. 23 1.4.2. Biosíntesis y degradación ........................................................................ 23 1.4.3. Regulación del metabolismo ................................................................... 26
1.5. Tioles en plantas .............................................................................................. 28 1.5.1. Funciones................................................................................................. 28 1.5.2. Biosíntesis de cisteína y glutatión ........................................................... 28 1.5.3. Regulación del metabolismo ................................................................... 30 1.5.4. Biosíntesis y función de las fitoquelatinas .............................................. 31
1.5.4.1. Mecanismo enzimático de las fitoquelatina sintasas ...................... 32 1.5.4.2. Regulación de la síntesis................................................................. 33
1.6. Senescencia natural e inducida por estrés en nódulos..................................... 34
2. Objetivos ..........................................................................................................37
3. Materiales y Métodos......................................................................................41 3.1. Reactivos químicos y bioquímicos.................................................................. 43 3.2. Material biológico y condiciones de cultivo ................................................... 43
3.2.1. Plantas...................................................................................................... 43 3.2.2. Bacterias .................................................................................................. 47
3.3. Tratamientos de las plantas ............................................................................. 48 3.4. Aislamiento y purificación de mitocondrias de nódulos ................................. 49 3.5. Marcadores de senescencia y daño oxidativo en nódulos ............................... 51
3.5.1. Marcadores de senescencia...................................................................... 51 3.5.2. Daño oxidativo a lípidos.......................................................................... 52 3.5.3. Daño oxidativo a proteínas ...................................................................... 53
3.6. Análisis de la expresión génica en nódulos..................................................... 54 3.6.1. Extracción de RNA.................................................................................. 54
Introducción
- vi -
3.6.2. Cuantificación de mRNAs mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real ....................................................... 55
3.7. Hibridación in situ de mRNA y microscopía confocal ................................... 58 3.8. Expresión de proteínas de plantas en Escherichia coli ................................... 59 3.9. Purificación de proteínas recombinantes ........................................................ 60 3.10. Análisis western .............................................................................................. 62 3.11. Actividades enzimáticas.................................................................................. 66
3.11.1. Enzimas del metabolismo del ascorbato................................................. 68 3.11.2. Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión.................................................... 69 3.11.3. Enzimas de la síntesis de cisteína y (homo)glutatión............................. 70 3.11.4. Actividad fitoquelatina sintasa ............................................................... 73
3.12. Determinación de metabolitos......................................................................... 74 3.12.1. Contenido de ascorbato y estado redox .................................................. 75 3.12.2. Contenido de tioles y estado redox del (homo)glutatión........................ 76 3.12.3. Contenido de fitoquelatinas .................................................................... 77
3.13. Análisis estadístico .......................................................................................... 77 4. Resultados ....................................................................................................... 79
4.1. Metabolismo del ascorbato en nódulos ........................................................... 81 4.1.1. Biosíntesis................................................................................................ 81 4.1.2. Estrés oxidativo y senescencia natural .................................................... 88 4.1.3. Metabolismo del ascorbato en condiciones de estrés.............................. 90 4.1.4. Metabolismo del ascorbato durante la senescencia natural..................... 95
4.2. Regulación del ciclo ascorbato-glutatión en nódulos...................................... 96 4.2.1. Regulación en condiciones de estrés ....................................................... 96 4.2.2. Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión durante la senescencia natural.... 99
4.3. Metabolismo de tioles en nódulos................................................................... 99 4.3.1. Regulación de las tiol-sintetasas en condiciones de estrés...................... 99 4.3.2. Análisis western de la γ-glutamilcisteína sintetasa ............................... 102 4.3.3. Regulación de las tiol-sintetasas durante la senescencia natural........... 103
4.4. Biosíntesis de fitoquelatinas en plantas......................................................... 104 4.4.1. Actividad PCS1 recombinante .............................................................. 104 4.4.2. Actividad fitoquelatina sintasa en plantas ............................................. 119 4.4.3. Análisis western de fitoquelatina sintasas de plantas............................ 119 4.4.4. Fitoquelatinas en plantas ....................................................................... 121
5. Discusión ........................................................................................................127
5.1. Metabolismo del ascorbato en nódulos ......................................................... 129 5.2. Metabolismo de los tioles en nódulos ........................................................... 139 5.3. Mecanismo enzimático de fitoquelatina sintasas recombinantes de plantas....................................................................................................... 143 5.4. Fitoquelatinas en plantas ............................................................................... 147
6. Conclusiones ..................................................................................................155 7. Bibliografía ....................................................................................................159
Introducción
Introducción
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1. INTRODUCCIÓN
1.1. Fijación biológica de nitrógeno
El nitrógeno (N) es un elemento que se encuentra ampliamente distribuido en la
naturaleza, siendo el compuesto gaseoso mayoritario en la atmósfera (cerca del 78%
del total) y el cuarto elemento más abundante en las plantas (sólo por detrás de C, H y
O), donde forma parte de numerosas biomoléculas. El N se encuentra en la atmósfera
en forma de dinitrógeno (N2), una molécula gaseosa y relativamente inerte debido a la
estabilidad del triple enlace entre los dos átomos de N.
Las plantas toman el N del suelo en forma de nitrato (NO3-) o amonio (NH4
+), o
bien, en el caso de las leguminosas, por reducción del N2 atmosférico mediante el
establecimiento de asociaciones simbióticas (Aparicio-Tejo y cols, 2000; de Felipe,
2006). Este último proceso es lo que se denomina fijación biológica de N2 (FBN). No
obstante, el N es, después del agua, el principal nutriente limitante para el desarrollo
de las plantas. De hecho, entre 1950 y 1990 se incrementó diez veces el uso de
fertilizantes nitrogenados en España. El uso de estos fertilizantes conlleva problemas
de contaminación tanto del agua, debido a la presencia de NO3-, como de la atmósfera,
causada por la emisión de gases nitrogenados que potencian el llamado “efecto
invernadero”, la destrucción de la capa de ozono (O3) y la formación de lluvia ácida.
Además, se ha demostrado que la contaminación causada por la utilización de
fertilizantes químicos provoca distintos trastornos en la salud humana. Por ejemplo, la
ingestión de NO3- en el agua de bebida o en alimentos conduce a la aparición de
metahemoglobinemia. Así, el NO3- se transforma en el organismo en nitrito (NO2
-), el
cual oxida el Fe2+ de la hemoglobina a Fe3+ e impide que fije el oxígeno molecular
(O2) para transportarlo a los tejidos, originando la “enfermedad azul de los lactantes”.
Otros productos secundarios generados a partir de los fertilizantes nitrogenados son las
nitrosaminas, con demostrado carácter cancerígeno. Todo esto hace de la FBN una
alternativa más respetuosa con el medio ambiente que la fertilización química.
Introducción
- 4 -
Los dos tipos de cultivos más importantes en el mundo son los cereales y las
leguminosas (Aparicio-Tejo y cols, 2000). Todas las culturas han practicado la
rotación de cultivos cereal-leguminosa, ya que las leguminosas son de enorme interés
como enriquecedoras de N en los suelos. Cuando se compara el crecimiento de plantas
noduladas y fertilizadas se concluye que, si existe una simbiosis bien adaptada, la FBN
resulta igual de eficaz que la fertilización química para el crecimiento de la planta.
Para que una leguminosa fije eficientemente N2 debe estar bien nodulada, tener tasas
fotosintéticas y respiratorias elevadas, encontrarse en condiciones ambientales
adecuadas y poseer un sistema de transporte eficaz de los productos de fijación para su
distribución desde el nódulo a otros órganos de la planta. Aunque las plantas
fertilizadas pueden tener más C disponible para su crecimiento, una gran proporción
de este C se utiliza en el mantenimiento de estructuras inertes, por lo que disminuye su
potencial de crecimiento y reduce la superioridad relativa de las plantas dependientes
de fertilizantes con respecto a las fijadoras de N2.
1.1.1. Simbiosis rizobio-leguminosa
La FBN es llevada a cabo por el complejo enzimático nitrogenasa, que se encuentra
exclusivamente en procariotas. Este complejo es muy sensible al O2, por lo que la FBN
tiene que realizarse en un ambiente muy reductor (Dixon y Kahn, 2004; Seefeldt y
cols, 2004). El número y el rango de organismos que fijan N2 (organismos diazotrofos)
es muy amplio, pudiéndose clasificar en dos grandes grupos: diazotrofos en vida libre
y en simbiosis. La simbiosis fijadora de N2 más conocida e importante desde un punto
de vista agronómico y económico es la que se establece entre las raíces de las
leguminosas y las bacterias de los géneros Rhizobium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Sinorhizobium (Ensifer) y Azorhizobium, colectivamente
denominadas rizobios (Velázquez y cols, 2006). La interacción entre estas bacterias
gram negativas y las raíces de la leguminosa huésped da lugar a la formación de un
nuevo órgano en la planta, el nódulo, en donde se lleva a cabo la FBN.
Introducción
- 5 -
1.1.2. Formación, tipos y estructura de nódulos de leguminosas
El establecimiento de una simbiosis rizobio-leguminosa funcional es un proceso
complejo que requiere el intercambio de señales moleculares entre la planta y los
rizobios (Figura 1.1 A). El reconocimiento entre los dos organismos comienza con la
liberación de exudados por las raíces de la planta, como flavonoides, ácidos orgánicos
y aminoácidos (Morón y cols, 2006). En concentraciones nanomolares, los flavonoides
secretados a la rizosfera provocan quimiotaxis en los rizobios hacia la superficie de los
pelos radicales, mientras que en concentraciones micromolares activan los genes nod
en las bacterias, responsables de la nodulación. La inducción de estos genes provoca la
secreción de los factores Nod, constituidos por lipoquitín-oligosacáridos (Morón y
cols, 2006). Los rizobios producen factores Nod con una estructura básica similar,
compuesta por un esqueleto de 3-5 residuos de N-acetil-D-glucosamina unidos
mediante enlaces β (esqueleto de quitina), al que se une un ácido graso en el residuo de
azúcar del extremo no reductor. Las diferencias ente las distintas clases de factores
Nod se deben a modificaciones específicas de los residuos del azúcar y del ácido
graso.
Los factores Nod liberados por los rizobios se unen a receptores kinasas
específicos de la planta, que contienen motivos LysM de unión a oligosacáridos, tales
como los receptores NFR1 y NFR5 de Lotus japonicus (Lotus) o los LYK3 y LYK4 de
Medicago truncatula (Ramos y Bisseling, 2004). Estas plantas son leguminosas
modelo que producen nódulos determinados e indeterminados, respectivamente (ver
más adelante esta clasificación de nódulos). A continuación, otras proteínas (SYMRK
de Lotus, DMI2 de M. truncatula) transmiten la señal de percepción del factor Nod a
un canal de Ca2+, provocando oscilaciones en la concentración de Ca2+ intracelular.
Éstas son percibidas por una proteína kinasa dependiente de Ca2+ y calmodulina
(Tirichine y cols, 2006), lo que inicia la cascada de fosforilación de factores de
transcripción e inducción de genes implicados en la formación del nódulo.
En las primeras etapas del reconocimiento planta-bacteria, los pelos radicales se
curvan y atrapan los rizobios que, tras degradar parcialmente la pared celular mediante
la secreción de celulasas, penetran en los pelos radicales por invaginaciones de la
membrana plasmática (Figura 1.1 A). Se forma así una estructura tubular (cordón de
Introducción
- 6 -
infección) que progresa hacia la base del pelo radical. Finalmente, las bacterias
invasoras son liberadas en las células del córtex mediante endosimbiosis, quedando
rodeadas de una membrana peribacteroidal derivada de la planta y formando los
simbiosomas. Los simbiosomas ocupan el citoplasma de la célula infectada y en su
interior las bacterias se diferencian en bacteroides maduros capaces de reducir el N2
atmosférico a NH4+. Cuando se ha formado un número suficiente de nódulos, la planta
inhibe la formación de los siguientes (retroalimentación reguladora). Las respuestas
autorreguladoras son sistémicas y requieren la presencia de la parte aérea. Asimismo,
la formación de los nódulos se inhibe cuando las plantas tienen acceso a suficiente N
asimilable en la rizosfera (Krusell y cols, 2002; Gleason y cols, 2006).
Las leguminosas pueden formar dos tipos de nódulos, determinados e
indeterminados, que se diferencian estructural y metabólicamente (Hirsch, 1992; Hadri
y cols, 1998; Aparicio-Tejo y cols, 2000). En las especies de nódulos indeterminados,
como alfalfa (Medicago sativa) y guisante (Pisum sativum), el cordón de infección
alcanza las células cercanas al cilindro vascular y los meristemos son persistentes; en
las de nódulos determinados, como judía (Phaseolus vulgaris) y soja (Glycine max),
sólo algunas células son infectadas por los cordones de infección y los meristemos
cesan su actividad poco después de la formación de los nódulos. En los nódulos
indeterminados hay un solo bacteroide por simbiosoma, que puede ser hasta 30 veces
más grande que una bacteria de vida libre, mientras que en los nódulos determinados
el número de bacteroides por simbiosoma varía, debido fundamentalmente a la fusión
de simbiosomas (Vasse y cols, 1990; Cermola y cols, 2000). Tanto las células como
los bacteroides se dividen activamente hasta conformar el nódulo funcional. En la
Tabla 1.1 se recogen las principales características de los nódulos determinados e
indeterminados y en la Figura 1.1 B se representa un esquema de los dos tipos de
nódulos mostrando sus diferentes zonas.
Introducción
- 7 -
Figura 1.1. A, Esquema de la formación del nódulo. Basado en Hirsch (1992) y Ramos y Bisseling (2004). B, Esquema de un nódulo indeterminado (izquierda) y determinado (derecha), mostrando sus diferentes zonas. Modificado de Hadri y cols (1998).
Nódulo indeterminado
CórtexEndodermis
ParénquimaHaces
vasculares
Meristemo apical
Zona de infección
Interzona
Zona de fijación
Zona de senescencia
Zonade
infección
Nódulo determinado
A
B
Exudadosraíz
Rizobios
FactoresNod
Deformaciónpelo radical
Primordionodular Formación
cordón de infección
Simbiosomas
Nódulo indeterminado
CórtexEndodermis
ParénquimaHaces
vasculares
Meristemo apical
Zona de infección
Interzona
Zona de fijación
Zona de senescencia
Zonade
infección
Nódulo determinado
A
B
Exudadosraíz
Rizobios
FactoresNod
Deformaciónpelo radical
Primordionodular Formación
cordón de infección
Simbiosomas
Introducción
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Indeterminados Determinados
Planta huésped Alfalfa, guisante, M. truncatula
Judía, soja, Lotus
Origen geográfico Templado Tropical y subtropical Forma del nódulo Cilíndrica Esférica Divisiones celulares iniciales
Córtex interno Córtex externo
Crecimiento nodular División celular. Presencia de meristemo persistente
Expansión celular
Flavonoides inductores de genes nod
Isoflavonas Flavonas, flavononas
Producto de asimilación exportado
Amidas Ureidos
a Tabla adaptada de Aparicio-Tejo y cols (2000) y Hirsch (1992)
Los bacteroides expresan el complejo enzimático nitrogenasa y determinados
citocromos que no están presentes en las bacterias de vida libre. La nitrogenasa es la
responsable de la fijación de N2, catalizando la siguiente reacción:
N2 + 16 ATP + 10 H+ + 8 e- → 2 NH4+ + H2 + 16 ADP + 16 Pi
Puesto que esta reacción necesita grandes cantidades de ATP, la fijación de N2 es un
proceso muy costoso energéticamente (≈ 960 kJ mol-1 de N2 fijado). El complejo
nitrogenasa puede usar otros sustratos en lugar del N2, como cianuro, azida, NO o
acetileno. Este último gas se utiliza para determinar la actividad nitrogenasa (Witty y
cols, 1983; Witty y Minchin, 1998). Los bacteroides producen el ATP necesario para
la fijación del N2 mediante fosforilación oxidativa y, por tanto, requieren grandes
cantidades de O2. Sin embargo, concentraciones mínimas de O2 son capaces de
inactivar la nitrogenasa en pocos minutos. Por lo tanto, los nódulos deben mantener
concentraciones muy bajas de O2 libre en las células infectadas y, a su vez, garantizar
el suministro de O2 a los bacteroides. Para conseguirlo, los nódulos emplean tres
mecanismos (Aparicio-Tejo y cols, 2000): una alta actividad metabólica, que consume
grandes cantidades de O2; una barrera variable a la difusión de O2, que controla la
Tabla 1.1. Características principales de nódulos indeterminados y determinados a.
Introducción
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cantidad que llega de este gas a la zona infectada; y un sistema de transporte de O2
eficiente mediante la proteína leghemoglobina (Lb). Midiendo la concentración de O2
en varias zonas del nódulo con un microelectrodo selectivo se pudo comprobar que
existe una barrera a la difusión de O2 en el parénquima nodular (Witty y cols, 1986;
Denison y cols, 1992). Variando la concentración de O2 externa, dichos autores
mostraron que los nódulos pueden adaptarse rápidamente a estos cambios ajustando el
flujo de O2 que llega a la zona infectada. Por otra parte, las células infectadas del
nódulo contienen grandes cantidades de Lb, una proteína de función similar a la
mioglobina de los músculos, que facilita la transferencia de O2 desde el citosol a la
membrana de los simbiosomas. La Lb tiene una gran afinidad por el O2 (Km = 48-60
nM), al cual se une reversiblemente. Prácticamente todo el O2 que llega a los
bacteroides es transportado por la Lb.
1.2. Especies reactivas de oxígeno y estrés oxidativo en plantas
1.2.1. Definición y tipos de especies reactivas de oxígeno
En su configuración basal (estado triplete, 3O2), la molécula de O2 es relativamente
poco reactiva debido a que presenta dos electrones en orbitales separados con “spines”
paralelos (Figura 1.2). Por ello, su poder de oxidación está restringido a aquellas
moléculas que presentan electrones con “spines” antiparalelos a estos electrones (Apel
y Hirt, 2004; Scandalios, 2005). La reducción completa del O2 a H2O llevada a cabo en
la respiración celular requiere la transferencia de cuatro electrones. Sin embargo, se
pueden producir reducciones incompletas del O2, originándose las especies reactivas
de oxígeno (ROS; “Reactive Oxygen Species”). Las más importantes son los radicales
hidroxilo (·OH) y superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el oxígeno
singlete (1O2). Las ROS pueden resultar dañinas (1.2.3) o bien desempeñar funciones
fundamentales en las plantas si su producción es estrictamente controlada (1.2.4). Las
características y las principales fuentes de ROS se indican en la Tabla 1.2. Así pues, el
O2 es esencial para la vida aeróbica pero, en sus formas parcialmente reducidas, puede
resultar potencialmente tóxico.
Introducción
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ROS Características y fuentes de ROS
Oxígeno singlete (1O2)
Fotoinhibición, radiación UV y transferencia de energía en el fotosistema II (cloroplastos). Vida media: 1 μs. Distancia recorridab: 30 nm. Reacciona con ácidos grasos poliinsaturados, DNA (principalmente con guaninas) y proteínas (especialmente con residuos de Trp, His, Tyr, Met y Cys).
Superóxido (O2-)
Reacciones de fotooxidación (p.ej. las catalizadas por flavoproteínas), reacción de Mehler (ver 1.2.2) en el cloroplasto, respiración mitocondrial, fotorrespiración y actividad metabólica en glioxisomas, fijación de N2, reacción de O3 y ·OH en el apoplasto, defensa frente a patógenos y oxidación de xenobióticos. Vida media: 1 μs. Distancia recorridab: 30 nm. Reacciona con centros Fe-S de proteínas.
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Dismutación del O2-, fotorrespiración, β-oxidación de
ácidos grasos, descomposición del O2- en medio ácido y
defensa frente a patógenos. Vida media: 1 ms. Distancia recorridab: 1 μm. Reacciona con residuos de Cys de proteínas.
Radical hidroxilo (·OH)
Descomposición del O3 en el apoplasto, defensa frente a patógenos, reacciones Fenton y Haber-Weiss (ver 1.2.2). Vida media: 1 ns. Distancia recorridab: 1 nm. Reacciona instantáneamente con lípidos, proteínas, carbohidratos y DNA.
Radical perhidroxilo (·O2H-)
Forma protonada del O2-. Reacción del O3 y ·OH en el
apoplasto.
Ozono (O3) Radiación UV o descargas eléctricas en la estratosfera, producto de reacciones de combustión de hidrocarburos fósiles, radiación UV en la troposfera.
a Tabla adaptada de Scandalios (2005) y Møller y cols (2007). b Distancia recorrida por la ROS durante su vida media asumiendo un coeficiente de
difusión de 109 m2 s-1
Tabla 1.2. Características y fuentes principales de ROS a.
Introducción
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1.2.2. Producción de especies reactivas de oxígeno en plantas
En las plantas, la mayor cantidad de ROS se produce en los cloroplastos, mitocondrias
y peroxisomas. No obstante, también se pueden formar ROS en otros compartimentos
celulares o extracelulares, como el apoplasto.
Cloroplastos
La fotorreducción del O2 durante la fotosíntesis por la cadena de transporte de
electrones en el fotosistema I fue descubierta por Mehler en 1951 (Mehler, 1951) y
conlleva la producción de O2-:
2 O2 + 2 e- → 2 O2-
El O2- puede dismutar espontáneamente a O2 y H2O2, pero lo más habitual, a pH
fisiológico, es que esta reacción sea catalizada por la superóxido dismutasa (ver 1.3.1):
2 O2- + 2 H+ → H2O2 +O2
Por otra parte, en el fotosistema II el O2 es excitado a 1O2 mediante la transferencia de
energía de resonancia desde el estado excitado triplete del P680 (Asada, 2006).
Oxígeno triplete3O2
Oxígeno singlete1O2
Superóxido
O2-
Ion peróxido
O22-
σ* 2p
π* 2p
π 2p
σ 2p
σ* 2s
σ 2s
σ* 1s
σ 1s
Orb
ital m
olec
ular
Oxígeno triplete3O2
Oxígeno singlete1O2
Superóxido
O2-
Ion peróxido
O22-
σ* 2p
π* 2p
π 2p
σ 2p
σ* 2s
σ 2s
σ* 1s
σ 1s
Orb
ital m
olec
ular
Figura 1.2. Configuración electrónica de algunas ROS. Figura adaptada de Halliwell (2006).
Introducción
- 12 -
Hay otros dos procesos adicionales en los que se pueden producir ROS en los
cloroplastos: uno es la clororrespiración, que se va a describir a continuación, y otro es
la fotorrespiración. Este último proceso se describirá en el apartado de peroxisomas, ya
que constituye un ciclo en el que también intervienen estos orgánulos.
La clororrespiración es el proceso mediante el cual el O2 es reducido mediante
una cadena respiratoria alternativa, formada por una NAD(P)H deshidrogenasa y una
oxidasa alternativa cloroplástica que compiten por los equivalentes de reducción con la
cadena fotosintética de transporte electrónico (Nixon, 2000). Aun así, se estima que la
clororrespiración supone menos del 1% del total de producción de ROS en la
fotosíntesis.
Mitocondrias
Las ROS se generan inevitablemente durante la fosforilación oxidativa en las
mitocondrias. En este proceso, el O2 puede reaccionar con intermediarios de la cadena
de transporte electrónico, como flavinas y ubiquinona, para generar O2-. Los
principales sitios de producción de ROS son el complejo I (NADH deshidrogenasa) y
el complejo III (complejo del citocromo bc1 o citocromo reductasa).
Además de los complejos I-IV, la cadena de transporte electrónico de las
mitocondrias de plantas contienen cinco enzimas que no están presentes en las
mitocondrias de mamíferos: una oxidasa alternativa y cuatro NAD(P)H
deshidrogenasas (Møller, 2001). Estas últimas son flavoproteínas que se encuentran en
los dos lados de la membrana interna y, por tanto, constituyen sitios potenciales de
generación de ROS. La presencia de estas NAD(P)H deshidrogenasas en la superficie
externa de la membrana interna mitocondrial hace posible la oxidación de NAD(P)H
citosólico. Sin embargo, en este caso no se produce un bombeo de protones a través de
estas proteínas, por lo que disminuye la capacidad mitocondrial de síntesis de ATP al
competir con el complejo I por el NADH de la matriz mitocondrial. En cuanto a la
oxidasa alternativa, ésta constituye un mecanismo para disminuir la producción de
ROS, ya que previene la sobrerreducción de los componentes de la cadena de
transporte electrónico mitocondrial (por ejemplo la ubiquinona) actuando como una
proteína aceptora alternativa de electrones. Se ha observado que células que
Introducción
- 13 -
sobreexpresan la oxidasa alternativa producen la mitad de ROS que las células control,
mientras que las células con baja expresión de esta proteína producen cinco veces más
ROS que los controles (Maxwell y cols, 1999).
Peroxisomas
Los peroxisomas son el principal sitio de producción de H2O2 en la célula (del Río y
cols, 2006). Los principales procesos metabólicos en los que se produce H2O2 son la β-
oxidación de ácidos grasos en los glioxisomas, la oxidación del ácido úrico a alantoína
catalizada por la urato oxidasa, la dismutación de O2- por las superóxido dismutasas
(ver 1.3.1) peroxisomales y la fotorrespiración. La fotorrespiración se origina en el
cloroplasto cuando la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) utiliza
preferentemente O2 en lugar de CO2 en condiciones favorecidas por altas temperaturas
o bajas concentraciones intracelulares de CO2. Esta reacción de oxigenación conlleva
la liberación de glicolato, que es transportado de los cloroplastos a los peroxisomas,
donde es oxidado por la glicolato oxidasa.
Además, en peroxisomas de hojas de guisante se han identificado dos posibles
sitios de producción de O2- (del Río y cols, 2002). Uno es la matriz, debido a la enzima
xantina oxidasa, que cataliza la oxidación de xantina e hipoxantina a ácido úrico; el
otro sitio es la membrana del peroxisoma, mediante una cadena de transporte
electrónico compuesta por tres proteínas de membrana.
Apoplasto
En el apoplasto también se generan ROS, sobre todo durante la respuesta defensiva de
la planta frente a patógenos. Existen al menos cuatro fuentes de ROS en el apoplasto:
NADPH oxidasas, oxalato oxidasas tipo germina, amino-oxidasas y peroxidasas
extracelulares.
Las NADPH oxidasas de la membrana plasmática catalizan la reacción:
NADPH + 2 O2 → NADP+ + 2 O2- + H+
Estas oxidasas son activadas por Ca2+ y son las principales responsables del pulso
oxidativo [“oxidative burst”; (Lamb y Dixon, 1997)], que consiste en una producción
rápida y abundante de O2- dañino para el microorganismo (Sagi y Fluhr, 2001, 2006).
Introducción
- 14 -
Durante las interacciones planta-patógeno, el ácido oxálico es secretado por
algunos hongos, probablemente para secuestrar iones Ca2+ y acidificar el medio,
facilitando así la acción de enzimas hidrolíticas secretadas por el hongo. Las oxalato
oxidasas tipo germina catalizan la conversión de oxalato a CO2 y H2O2, produciendo
una doble acción defensiva: eliminar el oxalato y generar H2O2 perjudicial para los
microorganismos (Lane y cols, 1993; Woo y cols, 2000).
Las amino-oxidasas son cuproproteínas, muy comunes en leguminosas, que
catalizan la oxidación de mono-, di- o poliaminas a los correspondientes aldehídos,
con la consiguiente liberación de NH3 y H2O2 (Grant y Loake, 2000). Este H2O2 puede
ser utilizado directamente en procesos tales como el endurecimiento de la pared celular
y el entrecruzamiento de macromoléculas extracelulares como las extensinas.
Las peroxidasas unidas a la pared celular son capaces de producir grandes
cantidades de H2O2 en una reacción muy dependiente del pH, mostrando un máximo
de actividad a pH neutro-básico en función del tipo de peroxidasa (Lamb y Dixon,
1997). Estudios in vitro han demostrado que estas enzimas utilizan compuestos de Fe2+
y diversos reductores como sustratos de la reacción; entre éstos, los más eficientes son
la Cys y el glutatión (GSH), mientras que el NAD(P)H y el ascorbato (ASC)
mantienen la producción de H2O2 a una velocidad más lenta. También pueden producir
radical ·OH no sólo con funciones defensivas, sino también durante la reorganización
de las paredes celulares que tiene lugar durante el desarrollo de la planta (Chen y
Schopfer, 1999; Frahry y Schopfer, 2001).
Producción de especies reactivas de oxígeno en nódulos
Los nódulos de las leguminosas producen gran cantidad de ROS principalmente
debido a su elevada actividad respiratoria, su alto contenido en proteínas oxidables
(como la nitrogenasa y la Lb) y al ambiente altamente reductor en el que tiene lugar la
fijación de N2 (Becana y cols, 2000). La principal fuente de ROS en los nódulos es,
probablemente, la autooxidación de la Lb, que origina radical O2-. Además, puesto que
los nódulos son extremadamente ricos en Fe (como constituyente de la nitrogenasa,
ferritina y Lb), hay un riesgo potencial de generación de ·OH mediante la reacción
Fenton, en la que el H2O2 es reducido a O2- por Fe2+. El O2
- puede actuar a su vez
Introducción
- 15 -
como reductor del Fe3+, permitiendo que la reacción continúe. La suma de las dos
reacciones se conoce como reacción Haber-Weiss (Halliwell y Gutteridge, 2007):
H2O2 + Fe2+ → ·OH + Fe3+ + OH-
O2- + Fe3+ → O2 + Fe2+
H2O2 + O2- → ·OH + O2 + OH-
1.2.3. Daño oxidativo a biomoléculas
Además de producirse como consecuencia del metabolismo celular, las ROS pueden
generarse también en condiciones de estrés abiótico y biótico. Si se producen de forma
incontrolada, las ROS pueden modificar y dañar oxidativamente biomoléculas
esenciales para la célula, como carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, y
generar una situación de estrés oxidativo (Møller y cols, 2007).
Modificaciones en carbohidratos
La ruptura oxidativa de azúcares por ·OH libera a menudo ácido fórmico como
subproducto, con potenciales efectos tóxicos (Isbell y cols, 1973). Asimismo, en
estudios in vitro se ha demostrado, en condiciones fisiológicas, que los polisacáridos
de las paredes celulares de las plantas son susceptibles a la escisión mediada por ·OH
(Fry, 1998). Las peroxidasas unidas a la pared celular generan ·OH cerca del sitio de
escisión, actuando este último como un factor debilitante de las paredes in vivo
(Schopfer y cols, 2002). Estas modificaciones oxidativas en carbohidratos, lejos de ser
perjudiciales, son necesarias para el crecimiento de las células vegetales.
Modificaciones en lípidos
Los ácidos grasos insaturados linoleico y linolénico son los predominantes en los
galactolípidos de las membranas de los tilacoides y en los fosfolípidos del resto de
membranas de la planta, respectivamente. Estos ácidos grasos son particularmente
sensibles al ataque por 1O2 y ·OH (Mueller, 2004; Halliwell y Gutteridge, 2007),
dando lugar tras su oxidación a hidroperóxidos de lípidos y aldehídos complejos como
el 4-hidroxi-2-nonenal y el malondialdehído (MDA). La peroxidación de ácidos grasos
insaturados disminuye la fluidez de la membrana, interfiere con la interacción de
receptores celulares y provoca la pérdida de electrolitos (Halliwell, 2006).
Introducción
- 16 -
Modificaciones en proteínas
Los aminoácidos que contienen azufre (Cys y Met) son particularmente susceptibles a
la oxidación por ROS, especialmente 1O2 y ·OH. El grupo tiol de la Cys puede
oxidarse de manera reversible formándose un puente disulfuro (cistina). Esta
oxidación puede ser producida por diferentes ROS y es un mecanismo de regulación
redox muy importante. La forma reducida puede ser regenerada, principalmente, por
las tiorredoxinas y glutarredoxinas (Buchanan y Balmer, 2005) (ver 1.3.1). Además, la
Cys también puede formar puentes disulfuros mixtos con el GSH, lo que puede servir
para proteger a la Cys de una futura oxidación (S-glutationilación; ver 1.2.4) (Dixon y
cols, 2005). La oxidación de la Met a Met-sulfóxido es otra modificación reversible de
aminoácidos mediada por ROS (Gustavsson y cols, 2002). Además de las reacciones
en las que intervienen los aminoácidos con azufre, la carbonilación es la modificación
oxidativa de proteínas más común, sin que se haya demostrado hasta el momento que
este proceso sea reversible (Shacter, 2000). Los grupos carbonilo se producen por la
oxidación de las cadenas laterales de los aminoácidos, principalmente Arg, His, Lys,
Pro, Thr y Trp. En general, los datos disponibles indican que las proteínas oxidadas
son degradadas de forma relativamente rápida, ya que un cambio en sus
conformaciones expone residuos hidrofóbicos que son reconocidos por proteasas.
Recientemente se ha determinado que la autofagia es la causa más probable de
eliminación de proteínas oxidadas en condiciones de estrés oxidativo intenso (Xiong y
cols, 2007).
Modificaciones en DNA
El DNA puede ser modificado por las ROS de múltiples maneras, aunque la principal
es la oxidación directa de guanina a 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina llevada a cabo por 1O2 y ·OH (Wiseman y Halliwell, 1996). Las ROS también pueden modificar el DNA
indirectamente. Por ejemplo, el MDA generado durante la peroxidación de lípidos
puede conjugarse con una guanina, creando un anillo extra en su estructura (Jeong y
cols, 2005). Además de las mutaciones, las lesiones oxidativas en el DNA pueden
producir cambios en el patrón de metilación de las citosinas, lo cual es importante en
la regulación de la expresión génica (Halliwell, 2006).
Introducción
- 17 -
1.2.4. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno: señalización molecular
A pesar de que los efectos dañinos producidos por las ROS han sido ampliamente
descritos en la bibliografía, en los últimos años se ha puesto de manifiesto que
concentraciones estrictamente controladas de ROS (mediante la acción de las defensas
antioxidantes) son necesarias para el correcto funcionamiento celular, interviniendo en
la regulación redox y en procesos de señalización molecular (Apel y Hirt, 2004;
Mittler y cols, 2004; Foyer y Noctor, 2005a, 2005b; Mittler, 2006). Así, las ROS
pueden provocar cambios en el estado redox celular que modifican la actividad de
factores de transcripción involucrados en la respuesta defensiva de la planta (Mou y
cols, 2003), o también pueden actuar directamente como segundos mensajeros,
participando en rutas de señalización intracelular. Por ejemplo, el H2O2 interviene en
la defensa frente a patógenos, la adaptación al estrés, el mecanismo de cierre
estomático y en la regulación de la expansión celular y desarrollo de la planta. Una de
las principales formas en que la acción conjunta de ROS y antioxidantes regula la
actividad de proteínas o factores de transcripción es mediante la formación o ruptura
de puentes disulfuro entre residuos de Cys.
Al igual que con las ROS, en los últimos años está ganando importancia, por su
significativa participación, el papel de las especies reactivas de nitrógeno (RNS) en
cascadas de señalización molecular (Neill y cols, 2003; Wendehenne y cols, 2004;
Grün y cols, 2006). Las RNS incluyen moléculas como el óxido nítrico (NO),
peroxinitrito (ONOO-) y S-nitrosoglutatión (GSNO). El NO es fundamental en
procesos como la regulación del crecimiento, señalización hormonal, homeostasis del
Fe y defensa de la planta frente a patógenos. El ONOO- se origina por reacción entre el
NO y el O2-, o entre el NO2
- y el H2O2. Este potente oxidante es capaz de oxidar
grupos tioles y catalizar la reacción de adición de un grupo NO2 a las Tyr de las
proteínas (nitración), alterando su conformación, estructura y actividad. Además de la
nitración, las RNS son capaces de inducir otras modificaciones postraduccionales,
como la S-nitrosilación y la S-glutationilación. La S-nitrosilación es una modificación
reversible que produce cambios en la función o actividad de las proteínas mediante la
formación de un enlace S-NO por reacción del NO con un residuo de Cys. La reacción
entre NO y GSH produce GSNO, el cual está implicado en la S-glutationilación (unión
Introducción
- 18 -
de una molécula de GSH al grupo tiol de un residuo de Cys) de proteínas y, además,
puede transferir NO a grupos tioles de proteínas mediante la transnitrosilación
(Martínez-Ruiz y Lamas, 2007). En un reciente estudio de proteómica (Lindermayr y
cols, 2005) se han identificado 63 posibles proteínas susceptibles de S-nitrosilación por
GSNO en Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), entre las que se encuentran proteínas
relacionadas con la respuesta al estrés, metabolismo, señalización y regulación, lo que
da una idea de la importancia de este mecanismo de regulación postraduccional.
También se ha implicado a las RNS, junto con las ROS y el GSH, en la formación del
nódulo (Hérouart y cols, 2002; Frendo y cols, 2005; Pauly y cols, 2006) y en la
regulación de la síntesis de tioles (Innocenti y cols, 2007). Actualmente se emplea el
término estrés nitrosativo para designar el desequilibrio entre producción y
eliminación de RNS, de forma análoga a las ROS y el estrés oxidativo. Por ejemplo, se
ha comprobado que en hojas de olivo sometidas a estrés salino se produce un aumento
en la producción de RNS (Valderrama y cols, 2007).
1.3. Sistemas antioxidantes en plantas
Las plantas contienen una gran variedad y cantidad de antioxidantes que disminuyen el
riesgo de estrés oxidativo y mantienen el estado redox celular en niveles estables.
1.3.1. Antioxidantes enzimáticos
Las principales enzimas antioxidantes de las que disponen las plantas para controlar la
concentración de ROS son las superóxido dismutasas, ascorbato peroxidasas (APXs) y
el resto de enzimas del ciclo ASC-GSH, catalasas, glutatión peroxidasas y
peroxirredoxinas (Figura 1.3) (Mittler y cols, 2004).
Introducción
- 19 -
Las superóxido dismutasas constituyen una familia de metaloproteínas que
catalizan la dismutación del O2- a O2. En plantas, existen tres tipos de superóxido
dismutasas que difieren en el metal que utilizan como cofactor (CuZn, Mn o Fe), así
como en su localización subcelular (Rubio y cols, 2007). Mediante la eliminación del
O2-, las superóxido dismutasas disminuyen el riesgo de formación del radical ·OH por
la reacción Haber-Weiss (1.2.2). Por otra parte, el H2O2 generado como producto de la
reacción es eliminado por la catalasa o por la APX en el ciclo ASC-GSH.
La catalasa (Figura 1.3) es una hemoproteína tetramérica que cataliza la
descomposición de H2O2 a H2O y O2. En plantas, esta enzima está localizada
exclusivamente en peroxisomas o glioxisomas, donde elimina el H2O2 que producen
enzimas como la urato oxidasa o la glicolato oxidasa, o que se genera durante el
metabolismo de lípidos en los glioxisomas. Su afinidad por el H2O2 es
sorprendentemente baja, lo que sugiere que está implicada en la eliminación del
exceso de esta ROS durante situaciones de estrés oxidativo (Scandalios, 1997; Mittler,
2002). De hecho, plantas transgénicas de tabaco (Nicotiana tabacum) con una
expresión disminuida de catalasa experimentan un incremento en el nivel de ROS en
respuesta a estreses abióticos o bióticos (Scandalios, 1997; Willekens y cols, 1997), lo
ASCASC
DHADHANADP+
H2O2
APX
HH22OO MDHAMDHA
GSH
GSSGNAD+
NADH
NADPHCAT
O2-
Ciclo ASC-GSH
MR
O2
O2DR GR
SOD
ASCASC
DHADHANADP+
H2O2
APX
HH22OO MDHAMDHA
GSH
GSSGNAD+
NADH
NADPHCAT
O2-
Ciclo ASC-GSH
MR
O2
O2DR GR
SOD
Figura 1.3. Principales enzimas antioxidantes de plantas. SOD, superóxido dismutasa; CAT, catalasa; APX, ascorbato peroxidasa; MR, monodeshidroascorbato reductasa; DR, deshidroascorbato reductasa; GR, glutatión reductasa. MDHA, monodeshidroascorbato; DHA, deshidroascorbato; GSSG, glutatión oxidado. En verde está sombreado el ciclo ASC-GSH.
Introducción
- 20 -
que demuestra que esta enzima es indispensable para la tolerancia al estrés oxidativo.
En el citosol y en los cloroplastos la eliminación del H2O2 la lleva a cabo la APX, que
presenta una afinidad por el H2O2 mucho mayor que la catalasa.
El ciclo ASC-GSH (Figura 1.3) desempeña un papel fundamental en la
regulación del nivel de H2O2 celular, pues está presente en los cloroplastos, citosol,
mitocondrias y peroxisomas (Hernández y cols, 2001). También hay evidencias de la
presencia en el apoplasto de al menos alguna isoforma de las enzimas del ciclo
(Vanacker y cols, 1998). En la primera reacción, la APX oxida el ASC para reducir el
H2O2 a H2O, generando el radical monodeshidroascorbato (MDHA). Éste dismuta
espontáneamente produciendo deshidroascorbato (DHA), el cual es reducido de nuevo
a ASC por acción de la deshidroascorbato reductasa (DR), utilizando GSH como
agente reductor. El glutatión oxidado (GSSG) formado se puede reducir de nuevo
mediante la actividad glutatión reductasa (GR), que utiliza NADPH como poder
reductor. El MDHA también puede reciclarse a ASC mediante la acción de la
monodeshidroascorbato reductasa (MR), utilizando NADH como agente reductor.
Las glutatión peroxidasas catalizan la conversión de los peróxidos orgánicos y
de los peróxidos de lípidos a los correspondientes alcoholes utilizando GSH como
poder reductor. A diferencia de las glutatión peroxidasas de animales, las de plantas
superiores contienen una Cys en el centro activo de la enzima en lugar de una
selenocisteína (Rouhier y Jacquot, 2002). Las glutatión peroxidasas se encuentran en
el citosol y los plastidios, aunque también se ha sugerido su localización en
mitocondrias, retículo endoplasmático, núcleo y apoplasto (Rodríguez-Milla y cols,
2003; Navrot y cols, 2006). Recientemente (Navrot y cols, 2006) se ha descrito que
algunas glutatión peroxidasas reaccionan preferentemente con tiorredoxinas, en lugar
de GSH o glutarredoxinas, por lo que se ha propuesto incluir a las glutatión
peroxidasas como una quinta subclase dentro de la amplia familia de las
peroxirredoxinas. En general, la expresión de las glutatión peroxidasas de plantas
aumenta con el estrés.
Las peroxirredoxinas, también llamadas tiorredoxinas peroxidasas, son
peroxidasas no hémicas de pequeño tamaño (≈15-30 kD) capaces de eliminar el H2O2
y los hidroperóxidos orgánicos (Rouhier y Jacquot, 2002). Para compensar la carencia
Introducción
- 21 -
de grupo hemo, estas proteínas requieren un dador de electrones, frecuentemente
tiorredoxinas o glutarredoxinas reducidas y, en cloroplastos, también el NADPH
mediante la acción de la NADPH tiorredoxina reductasa (Pérez-Ruiz y cols, 2006).
Todas las isoformas de peroxirredoxinas contienen al menos una Cys catalítica
conservada (Rouhier y Jacquot, 2002; Dietz, 2003).
Las tiorredoxinas son pequeñas proteínas (≈10-15 kD), presentes en todos los
organismos de vida libre estudiados, que intervienen en reacciones de intercambio tiol-
disulfuro para la regulación de proteínas específicas (Figura 1.4). Su centro activo
[W-C-G(P)-P-C] se encuentra muy conservado. Las glutarredoxinas, pequeñas
proteínas redox de la superfamilia de las tiorredoxinas que usan GSH como dador de
electrones, pueden desempeñar un papel importante en la señalización redox mediante
la regulación de la S-glutationilación de proteínas (Michelet y cols, 2006).
1.3.2. Antioxidantes no enzimáticos
Los antioxidantes no enzimáticos incluyen una gran variedad y cantidad de
metabolitos de baja masa molecular que se encuentran presentes en todos los
compartimentos celulares. Los antioxidantes no enzimáticos pueden ser de naturaleza
liposoluble o hidrosoluble. Los más importantes son los carotenos, α-tocoferol,
flavonoides, poliaminas, ASC y GSH.
Figura 1.4. Mecanismo enzimático de tiorredoxinas (TRX) y glutarredoxinas (GRX). Ambas pueden reducir las Cys de enzimas (Enz) y otras proteínas para regular su actividad mediante el intercambio tiol-disulfuro. Las TRXs utilizan el poder reductor de la ferredoxina (Fd) o el NADPH mediante la ferredoxina tiorredoxina reductasa (FTR) o la NADPH tiorredoxina reductasa (NTR), respectivamente. Las GRXs, en cambio, reducen las proteínas oxidando el GSH a GSSG, el cual es reducido de nuevo mediante la enzima GR utilizando NADPH.
TRXred
TRXox
Enzred
Enzox
FTRred/NTRred
FTRox/NTRox
GRXred
GRXox
Enzred
Enzox
GSH
GSSG
NADPH
NADP+GR
Fdred/NADPH
Fdox/NADP+
TRXred
TRXox
Enzred
Enzox
FTRred/NTRred
FTRox/NTRox
GRXred
GRXox
Enzred
Enzox
GSH
GSSG
NADPH
NADP+GR
Fdred/NADPH
Fdox/NADP+
Introducción
- 22 -
La principal función de los antioxidantes liposolubles es la protección frente a
la peroxidación lipídica de las membranas celulares (Halliwell y Gutteridge, 2007). El
β-caroteno es un pigmento fotosintético capaz de destruir el 1O2 formado en el
fotosistema I durante la fotosíntesis. La zeaxantina, otro carotenoide, interviene en el
ciclo de la xantofila, el cual permite disipar el exceso de energía de excitación en
condiciones de alta intensidad lumínica. El α-tocoferol (vitamina E) destruye e
inactiva el 1O2, detiene el proceso de peroxidación lipídica de las membranas y repara
los radicales libres de aminoácidos hidrofóbicos (Dalton, 1995). Recientemente, se ha
sugerido que el α-tocoferol podría desempeñar una función como señalizador
molecular, modulando los niveles de ácido jasmónico (JA) en la hoja (Munné-Bosch y
cols, 2007). Los flavonoides y otros compuestos fenólicos también son capaces de
inhibir la peroxidación lipídica eliminando los radicales peroxilo formados en las
membranas. Además de ser potentes antioxidantes, los flavonoides y polifenoles
también actúan como moléculas señal implicadas en la formación del nódulo (ver
1.1.2).
Otros antioxidantes muy importantes son las poliaminas, cationes polivalentes
con dos o más grupos amino. Las cargas positivas posibilitan su interacción con el
DNA o RNA, protegiéndolos frente a las ROS y regulando la transcripción, y también
con los fosfolípidos ácidos de las membranas lipídicas, a las que proporcionan rigidez
(Wallace y cols, 2003).
Los antioxidantes no enzimáticos hidrosolubles más importantes en la célula
son el ASC y el GSH. El estudio de las funciones, biosíntesis y regulación del
metabolismo de estos dos compuestos en las leguminosas constituye el objetivo
principal de esta Tesis y, por este motivo, van a ser comentados con más detalle en los
apartados 1.4 y 1.5, respectivamente.
Introducción
- 23 -
1.4. Ascorbato (vitamina C) en plantas
1.4.1. Funciones
El ASC (vitamina C) es un potente antioxidante que puede ser sintetizado por la
mayoría de los eucariotas, con muy pocas excepciones, entre las que nos incluimos los
humanos. En las plantas, el ASC es el antioxidante soluble más abundante e interviene,
además, en procesos tan importantes como la señalización redox, la elongación y
división celular, la síntesis de hormonas y la respuesta a estreses abióticos y bióticos
(Hancock y Viola, 2005). Por ejemplo, el ASC es cofactor de las dioxigenasas, que
catalizan reacciones de hidroxilación de Pro en las glicoproteínas de la pared celular
(Sommer-Knudsen y cols, 1998). Las dioxigenasas están implicadas también en la
biosíntesis de hormonas como etileno, giberelinas y ácido abscísico (De Tullio y
Arrigoni, 2004). El ASC es responsable de la regeneración del α-tocoferol (Packer y
cols, 1979) y de los flavonoides oxidados (Pérez y cols, 2002) y también es, asimismo,
cofactor de la violaxantina des-epoxidasa, que interviene en la síntesis de la zeaxantina
(Rockholm y Yamamoto, 1996). También se ha observado, utilizando mutantes de
Arabidopsis con una deficiencia moderada (vtc1) o severa (vtc2) en el contenido de
ASC, que éste puede modular la morfología, la estructura celular y el desarrollo de la
planta (Olmos y cols, 2006), así como la señalización mediada por hormonas y la
respuesta defensiva (Pastori y cols, 2003; Pavet y cols, 2005).
1.4.2. Biosíntesis y degradación
A pesar de la importancia del ASC, su principal ruta biosintética en las plantas fue
establecida hace tan sólo una década (Wheeler y cols, 1998) y requiere la participación
de unas diez enzimas (Figura 1.5, parte central, recuadro negro). La última reacción
consiste en la oxidación de L-galactono-1,4-lactona (L-GalL) a ASC y está catalizada
por la L-galactono-1,4-lactona deshidrogenasa (GalLDH). Esta enzima se localiza en la
membrana interna mitocondrial y utiliza citocromo c como aceptor de electrones
(Siendones y cols, 1999; Bartoli y cols, 2000). Recientemente, se ha completado la
caracterización de todas las enzimas que componen la ruta principal de biosíntesis de
ASC en plantas (Dowdle y cols, 2007; Laing y cols, 2007; Linster y cols, 2007).
Introducción
- 24 -
Figura 1.5. Rutas biosintéticas de ASC en animales (en rojo; enzimas 1-8) y en plantas (en verde y amarillo). La ruta principal de biosíntesis en plantas se recuadra en negro. Nombres de las enzimas según Dowdle y cols (2007): 1, fosfoglucosa mutasa; 2, UDP-D-glucosa pirofosforilasa; 3, UDP-D-glucosa deshidrogenasa; 4, UDP-D-glucuronato pirofosforilasa; 5, D-glucuronato-1-kinasa; 6, D-glucuronato reductasa; 7, aldonolactonasa; 8, L-gulono-1,4-lactona oxidasa/deshidrogenasa; 9, fosfoglucosa isomerasa; 10, fosfomanosa isomerasa; 11, fosfomanosa mutasa; 12, GDP-D-manosa pirofosforilasa (GMP; vtc1); 13, GDP-D-manosa-3’’,5’’-epimerasa (GME); 14, GDP-L-galactosa fosforilasa (vtc2 y vtc5); 15, L-galactosa-1-fosfato fosfatasa (GalPP; vtc4); 16, L-galactosa deshidrogenasa (GalDH); 17, L-galactono-1,4-lactona deshidrogenasa (GalLDH); 18, metil-D-galacturonato esterasa; 19, D-galacturonato reductasa; 20, aldonolactonasa; 21, fosfodiesterasa; 22, azúcar fosfatasa; 23, L-gulosa deshidrogenasa; 24, mio-inositol oxigenasa. Esquema modificado de Valpuesta y Botella (2004).
Introducción
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Se han descrito posibles rutas, alternativas o simultáneas a la anterior, para la
biosíntesis de ASC en plantas (Valpuesta y Botella, 2004; Hancock y Viola, 2005). En
la parte derecha de la Figura 1.5 (sombreado amarillo, enzimas 18-20) se representa la
ruta en la que interviene el D-galacturonato proveniente de la degradación de
polímeros presentes en las paredes celulares (Agius y cols, 2003). Por otro lado, la
enzima GDP-D-manosa-3’’,5’’-epimerasa (GME) puede representar un punto de
conexión entre las rutas de plantas y animales (Figura 1.5, sombreado verde, enzimas
13 y 21-23), al dar lugar a una ramificación de la ruta principal de plantas que lleva a
la producción de L-gulono-1,4-lactona (L-GulL), el análogo en animales de la L-GalL
(Wolucka y Van Montagu, 2003). La expresión de una L-gulono-1,4-lactona oxidasa
de rata en plantas transgénicas de Arabidopsis deficientes en GME restableció el
contenido de ASC, lo que sugiere que la L-GulL podría estar siendo utilizada in vivo
para la síntesis de ASC en plantas (Radzio y cols, 2003). Además, en Arabidopsis se
ha encontrado un gen que codifica una mio-inositol oxigenasa (Lorence y cols, 2004),
una enzima que cataliza la conversión de mio-inositol en D-glucuronato (Figura 1.5,
enzima 24), otro intermediario de la ruta animal. Recientemente, la sobreexpresión en
plantas transgénicas de Arabidopsis de una fosfatasa ácida que hidroliza fitato (mio-
inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisfosfato) produciendo mio-inositol y Pi, aumentó dos veces
el contenido total de ASC foliar (Zhang y cols, 2008).
La oxidación del ASC en las plantas puede ocurrir por reacción directa con
ROS o por reacciones catalizadas por enzimas como APX, ascorbato oxidasa (AO) o
dioxigenasas (Noctor y Foyer, 1998). Estas reacciones implican la transferencia
secuencial de electrones desde el ASC, produciéndose el radical MDHA (forma
parcialmente oxidada) y DHA (forma totalmente oxidada). Este último puede sufrir
una hidrólisis irreversible para producir 2,3-diceto-L-gulonato, con la consiguiente
pérdida de actividad biológica, o bien ser catabolizado formando hasta unos 50
subproductos distintos de degradación (Hancock y Viola, 2005). Así, en las plantas el
DHA puede ser procesado enzimáticamente mediante dos rutas distintas, dependiendo
de si se produce la ruptura de su esqueleto carbonado entre las posiciones 2 y 3 (para
dar oxalato y treonato, el cual es oxidado después a tartrato) o entre los átomos 4 y 5
(para dar tartrato y un fragmento de dos átomos de C que es reciclado durante el
Introducción
- 26 -
metabolismo de carbohidratos). La prevalencia de una u otra ruta depende de la
especie, pero se desconoce qué otros factores pueden determinarla (DeBolt y cols,
2006; DeBolt y cols, 2007).
Se sabe muy poco acerca del metabolismo de ASC en nódulos de leguminosas.
En el único artículo previo a la realización de esta Tesis que trata sobre el tema
(Groten y cols, 2005), los autores concluyen que los nódulos de guisante deben
importar el ASC de las hojas o raíces, ya que su capacidad para sintetizarlo es muy
limitada (en el caso de nódulos jóvenes) o nula (en nódulos maduros).
1.4.3. Regulación del metabolismo
Una de las consecuencias de la complejidad de la ruta biosintética del ASC es la
dificultad para establecer los elementos implicados en la regulación de su
metabolismo. Son muchos los factores, tanto externos (intensidad de la luz,
temperatura, disponibilidad de N, patógenos) como internos (germinación, desarrollo
de los frutos, hormonas), que controlan el contenido de ASC en los distintos tejidos de
las plantas. Además de las tasas de biosíntesis y degradación in vivo, en los últimos
años se ha puesto de manifiesto la importancia de los procesos de transporte (entre
órganos “fuentes” y “sumideros”) en la distribución del ASC en las plantas (Hancock
y Viola, 2005). Aquí se van a describir únicamente los mecanismos de regulación del
metabolismo del ASC que cuentan con mayor evidencia experimental, con especial
atención a la regulación de tres enzimas de la ruta principal: GME (Figura 1.5, enzima
13), L-galactosa deshidrogenasa (GalDH; Figura 1.5, enzima 16) y GalLDH (Figura
1.5, enzima 17).
La actividad de la GME purificada de Arabidopsis parece estar modulada por
varios metabolitos, como GDP, GDP-D-glucosa, ASC y L-GalL, que la inhiben
completamente a concentraciones fisiológicas (Wolucka y Van Montagu, 2003). Sin
embargo, la inhibición por NAD(P)+ y la estimulación de la actividad por NAD(P)H
sugieren un mecanismo de regulación redox más general. Por otra parte, se ha
observado una correlación positiva entre la actividad GME y la concentración de ASC
en cepas mutantes de la microalga Prototheca moriformis (Running y cols, 2003) y en
células en suspensión de Arabidopsis (Wolucka y cols, 2001).
Introducción
- 27 -
La enzima GalDH purificada de guisante es inhibida por su producto, L-GalL
(Gatzek y cols, 2002), aunque se ha cuestionado el significado fisiológico de esta
observación debido al rápido metabolismo de este compuesto. La GalDH purificada de
espinaca (Spinacia oleracea) es inhibida reversiblemente por ASC (Mieda y cols,
2004), mientras que la inhibición de la enzima de kiwi (Actinidia deliciosa) es
irreversible (Laing y cols, 2004). Por otra parte, todavía no existen datos concluyentes
que indiquen una correlación entre la actividad GalDH y la acumulación de ASC en
plantas. En plantas transgénicas de tabaco con expresión disminuida de GalDH se
encontró que esta actividad puede llegar a ser limitante en la síntesis de ASC en
condiciones que requieran un mayor flujo biosintético de este metabolito, como, por
ejemplo, durante la exposición a intensidades de luz elevadas (Gatzek y cols, 2002).
En varios casos se ha encontrado una correlación entre la expresión del
transcrito de GalLDH y el estado de desarrollo de la planta (Bartoli y cols, 2000;
Tabata y cols, 2002; Pateraki y cols, 2004), o entre la expresión de GalLDH y el
contenido de ASC total en plantas transgénicas (Tokunaga y cols, 2005) o líneas
celulares BY-2 (Tabata y cols, 2001) de tabaco. Asimismo, se ha detectado un
incremento en la expresión del gen tras la exposición de la planta a factores externos
como las heridas (Ôba y cols, 1995) o altas intensidades luminosas (Tamaoki y cols,
2003). Pese a que todos estos datos sugieren que la GalLDH ejerce un fuerte control
sobre la biosíntesis del ASC, no explican la síntesis rápida y aparentemente no
controlada de ASC in vivo cuando se suministra a la planta L-galactosa o L-GalL
(Davey y cols, 1999). No obstante, la estrecha asociación de esta proteína con el
complejo I de la cadena de transporte de electrones en la membrana interna
mitocondrial, junto con el requerimiento de la forma oxidada de citocromo c para su
actividad, pueden representar posibles mecanismos adicionales de regulación de la
síntesis de ASC por la actividad respiratoria in vivo (Bartoli y cols, 2000; Millar y
cols, 2003).
Introducción
- 28 -
1.5. Tioles en plantas
1.5.1. Funciones
El GSH (γGlu-Cys-Gly) es el segundo antioxidante soluble más abundante en las
células vegetales, alcanzando concentraciones de 1-3,5 mM en los cloroplastos y de
0,5-1,5 mM en los nódulos. El GSH elimina directamente el radical O2- y participa en
el control de la concentración de H2O2 mediante el ciclo ASC-GSH (Matamoros y
cols, 1999b; Meyer y Hell, 2005). Además de su papel como antioxidante (Noctor y
Foyer, 1998), el GSH también actúa como tampón redox, regula el ciclo celular,
constituye la principal forma de transporte y almacenamiento de azufre en la planta
(Foyer y cols, 2002) e interviene en la desintoxicación de xenobióticos y metales
pesados (ver 1.5.4). También se ha relacionado al GSH y su metabolismo con la
expresión de genes de defensa asociada al estado redox celular y a la concentración
citosólica de Ca2+ (Mou y cols, 2003; Ball y cols, 2004; Gómez y cols, 2004a).
Algunas plantas contienen tripéptidos análogos al GSH, en los que la Gly del extremo
C-terminal es sustituida por otros aminoácidos. El homoglutatión (hGSH; γGlu-Cys-
βAla) está presente exclusivamente en las leguminosas, donde puede reemplazar total
o parcialmente al GSH.
1.5.2. Biosíntesis de cisteína y glutatión La síntesis de Cys (Figura 1.6, sombreado naranja) es llevada a cabo por las enzimas
serina acetiltransferasa (SAT) y O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL). Mientras que la
asimilación de sulfato (SO42-) tiene lugar en los plastidios, la biosíntesis de Cys ocurre
en los plastidios, mitocondrias y citosol, donde se encuentran isoformas específicas de
SAT y OASTL (Droux, 2004; Wirtz y cols, 2004). La enzima SAT consiste en dos
subunidades de homotrímeros que sintetizan eficientemente O-acetilserina a partir de
Ser y acetil-CoA sólo cuando se asocian a dos homodímeros de OASTL,
constituyendo el complejo Cys sintasa (Wirtz y Hell, 2007). De hecho, se ha
comprobado que la SAT purificada de espinacas es catalíticamente activa, pero
requiere un exceso de 400 veces de OASTL para la síntesis efectiva de Cys (Ruffet y
Introducción
- 29 -
cols, 1994). La O-acetilserina producida, junto con el sulfuro (S2-) proveniente de la
asimilación reductora de SO42-, son los sustratos de la OASTL para la síntesis de Cys.
La biosíntesis de GSH (Figura 1.6, sombreado verde) tiene lugar en dos
reacciones secuenciales dependientes de ATP catalizadas por la γ-glutamilcisteína
sintetasa (γECS) y la glutatión sintetasa (GSHS), respectivamente. En las leguminosas,
Figura 1.6. Metabolismo de tioles (recuadrados en amarillo) en plantas: síntesis de Cys a partir de Ser (sombreado naranja); síntesis de GSH y hGSH (sombreado en verde) mediante el intermediario γ-glutamilcisteína (γEC); y síntesis de fitoquelatinas (PCs) y homofitoquelatinas (hPCs) (sombreado azul). Nombre de las enzimas (recuadradas en rojo): SAT, serina acetiltransferasa; OASTL, O-acetilserina(tiol)liasa; γECS, γ-glutamilcisteína sintetasa; GSHS, glutatión sintetasa; hGSHS, homoglutatión sintetasa; y PCS, fitoquelatina sintasa. Acetil-CoA, acetil-coenzima A; O-AcSer, O-acetilserina. El S2- para la síntesis de Cys proviene de la asimilación de SO4
2- en los plastidios.
O-AcSer
γGlu-Cys (γEC)
ATP
ADP + Pi
ATP ATP
ADP + Pi ADP + Pi
Gly βAla
γECS
Cys
Glu
PCs
S2-
hPCs
Ser
Acetil-CoA
SO42-
hGSHSGSHS
OASTL
SAT
PCSPCS
γGlu-Cys-Gly (GSH) γGlu-Cys-βAla (hGSH)
O-AcSer
γGlu-Cys (γEC)
ATP
ADP + Pi
ATP ATP
ADP + Pi ADP + Pi
Gly βAla
γECS
Cys
Glu
PCs
S2-
hPCs
Ser
Acetil-CoA
SO42-
hGSHSGSHS
OASTL
SAT
PCSPCS
γGlu-Cys-Gly (GSH) γGlu-Cys-βAla (hGSH)
Introducción
- 30 -
el hGSH es sintetizado por la homoglutatión sintetasa (hGSHS), que utiliza βAla como
sustrato en lugar de Gly, siendo la reacción análoga a la de la GSHS (Frendo y cols,
1999; Frendo y cols, 2001; Iturbe-Ormaetxe y cols, 2002). La γECS se considera una
enzima clave (ver 1.5.3) en la regulación del metabolismo de tioles (Noctor y Foyer,
1998; Xiang y Oliver, 1998).
1.5.3. Regulación del metabolismo
Diversos análisis cinéticos han revelado que los dímeros OASTL son poco activos
catalíticamente en el complejo Cys sintasa de plantas, mientras que la SAT necesita de
un gran exceso de OASTL para funcionar (Wirtz y cols, 2004). Por lo tanto, se ha
propuesto que la O-acetilserina es liberada del complejo Cys sintasa para servir como
sustrato a dímeros de OASTL que se encuentran libres (Droux, 2004; Saito, 2004). La
actividad SAT es inhibida mediante un mecanismo de retroalimentación (“feed-back”)
por Cys, aunque este hecho depende de la especie estudiada y de la localización
subcelular de isoformas específicas (Droux, 2004; Wirtz y cols, 2004; Kawashima y
cols, 2005). También se ha observado un incremento en la expresión de diferentes
isoformas de la SAT por el Cd2+ (Howarth y cols, 2003). In vitro, el S2- estabiliza el
complejo Cys sintasa, mientras que la O-acetilserina lo desestabiliza, regulando de esta
forma la síntesis in vivo de Cys en situaciones de escasa asimilación de SO42-, en las
que la O-acetilserina se acumula. Por lo tanto, la unión de la SAT a la OASTL para
formar el complejo Cys sintasa es el factor más importante que regula la síntesis de
Cys en las plantas (Wirtz y Hell, 2007).
Se ha observado que la expresión y actividad enzimática de la γECS están
reguladas por múltiples factores, que varían desde la activación transcripcional
(Schäfer y cols, 1998; Xiang y Oliver, 1998) o postranscripcional (May y cols, 1998)
del gen hasta la modificación postraduccional del estado redox de la proteína (Jez y
cols, 2004; Hicks y cols, 2007). También se ha sugerido la posibilidad de que existan
proteínas que se unan a la región 5’-UTR (“Untranslated Region”) del transcrito de
γECS y que puedan ejercer un control traduccional de la enzima (Xiang y Bertrand,
2000; Wachter y cols, 2005). Todos estos datos indican que la γECS está sujeta a
Introducción
- 31 -
múltiples niveles de regulación. Además, la expresión de γECS y GSHS, pero no de
hGSHS, aumenta en raíces de M. truncatula tras el tratamiento de plantas con
compuestos que producen NO in vivo (Innocenti y cols, 2007).
Recientemente, se ha demostrado en Brassica juncea y Arabidopsis que la
γECS es exclusivamente plastidial, mientras que la GSHS está localizada en el citosol
y los plastidios (Wachter y cols, 2005). Teniendo en cuenta estos datos, se ha sugerido
que la γ-glutamilcisteína (γEC) sintetizada en los plastidios es el precursor para la
síntesis de (h)GSH, que tiene lugar mayoritariamente en el citosol. Esto requeriría un
sistema de transporte de γEC, todavía no identificado, en la membrana del plastidio.
No obstante, en nódulos de Vigna unguiculata se ha detectado actividad γECS en el
citosol (Moran y cols, 2000), además de actividad GSHS en mitocondrias, lo que
sugiere que la compartimentalización exclusivamente plastidial de la γECS y
mayoritariamente citosólica de la GSHS podría no ser una característica general en
plantas.
1.5.4. Biosíntesis y función de las fitoquelatinas
El GSH también está implicado en la desintoxicación de metales pesados, al tratarse
del precursor de las fitoquelatinas (PCs) (Figura 1.6, sombreado azul). Estos
polipéptidos de estructura general (γGlu-Cys)n-Gly (n=2-11) se encuentran
principalmente en plantas, pero también en levaduras (Schizosaccharomyces pombe) y
nemátodos (Caenorhabditis elegans), donde parecen desempeñar un papel similar. En
las leguminosas, el hGSH es el precursor de las homofitoquelatinas (hPCs), con
estructura general (γGlu-Cys)n-βAla (n=2-11) y función análoga a las PCs (Klapheck y
cols, 1995; Oven y cols, 2002).
Las PCs pueden detectarse en los tejidos y cultivos celulares de plantas
expuestos a concentraciones fisiológicas de metales esenciales como Cu y Zn, lo que
sugiere un papel de las PCs en la homeostasis de estos metales (Rauser, 1995; Zenk,
1996; Cobbett, 2000). Además, experimentos in vitro han mostrado que los complejos
PC-Cu y PC-Zn pueden reactivar las formas apo de las enzimas diamino-oxidasa
(dependiente de Cu) y anhidrasa carbónica (dependiente de Zn), respectivamente
Introducción
- 32 -
(Thumann y cols, 1991). Estos experimentos demostrarían que los complejos
anteriores son capaces de donar iones metálicos a enzimas que requieren metales para
su funcionamiento, aunque en el caso del Cu y Zn estos complejos no fueron
significativamente más efectivos que los correspondientes sulfatos metálicos. Además,
se han atribuido funciones a las PCs en el metabolismo del Fe o del S (Zenk, 1996;
Sannitá di Toppi y Gabbrielli, 1999). Otras funciones recientemente asignadas a las
PCs y a la enzima que las sintetiza (1.5.4.1) son la eliminación de ROS (Tsuji y cols,
2002) y la desintoxicación de compuestos xenobióticos (Beck y cols, 2003; Blum y
cols, 2007).
1.5.4.1. Mecanismo enzimático de las fitoquelatina sintasas
Las PCs son sintetizadas por la enzima fitoquelatina sintasa (PCS) (Figura 1.6,
sombreado azul), aunque en Saccharomyces cerevisiae parte de las PCs pueden ser
sintetizadas por una carboxipeptidasa vacuolar (Wünschmann y cols, 2007). La PCS es
una dipeptidil transferasa cuya reacción tiene lugar en dos etapas (Rea y cols, 2004).
Primero, una molécula de GSH cede una unidad γEC al sitio activo de la enzima,
formándose un intermediario (γEC)-enzima; segundo, se transfiere la γEC unida a la
enzima a una molécula aceptora, ya sea otra molécula de GSH (para formar PC2) o una
molécula de PCn (para producir PCn+1). Según las hipótesis iniciales sobre el
mecanismo enzimático, la reacción requería la unión directa del metal a la PCS. Sin
embargo, se ha demostrado recientemente que el metal pesado forma primero un
complejo con el GSH [un tiolato metal·(GS2)] que actúa como molécula aceptora. De
hecho, la presencia de una molécula con un tiol conjugado (por ejemplo, un S-alquil-
GSH) es suficiente para que se sinteticen PCs sin necesidad de metal (Vatamaniuk y
cols, 2000). Por tanto, la actividad PCS depende de las concentraciones del complejo
metal·(GS2) y del GSH libre, que actúan como cosustratos de alta y baja afinidad,
respectivamente, de la enzima.
La cristalización de la PCS de la cianobacteria Nostoc (Vivares y cols, 2005),
junto a estudios con proteínas mutadas de plantas (Ruotolo y cols, 2004; Vatamaniuk y
cols, 2004; Romanyuk y cols, 2006), han permitido demostrar que las PCS de
eucariotas contienen un dominio N-terminal o catalítico, en el que reside el sitio activo
Introducción
- 33 -
de la enzima, y un dominio C-terminal, donde se produce una segunda acilación de la
enzima dependiente del metal pesado y que sirve, presumiblemente, como sensor de
los metales y potenciador de la actividad PCS.
Los datos disponibles sobre las PCS de leguminosas previos a la realización de
esta Tesis (Oven y cols, 2002) sugieren que las hPCs son sintetizadas por proteínas
con actividad PCS que utilizan como sustratos GSH y, con menor afinidad, hGSH. Sin
embargo, todavía no se ha identificado una auténtica homofitoquelatina sintasa (hPCS)
que utilice exclusivamente hGSH como sustrato. En trabajos recientes, nuestro grupo
ha demostrado la existencia de al menos tres genes PCS en Lotus (Ramos y cols,
2007). Las correspondientes proteínas podrían tener distintas especificidades por
metales y se expresan diferencialmente según el tiempo de exposición a metales
pesados y el tejido de la planta.
1.5.4.2. Regulación de la síntesis
La regulación de la síntesis de (h)PCs puede efectuarse a nivel de la expresión de las
enzimas γECS y GSHS, encargadas de la síntesis de GSH, o bien a nivel de la propia
PCS.
Estudios con plantas transgénicas de B. juncea con niveles elevados de
expresión de las enzimas de la ruta biosintética de GSH mostraron que la síntesis de
PCs y la tolerancia a Cd2+ fueron también incrementadas (Zhu y cols, 1999a; Zhu y
cols, 1999b). Por otra parte, también se ha demostrado que plantas silvestres de B.
juncea responden a la exposición al Cd2+ con aumentos en la expresión del transcrito
de γECS (Schäfer y cols, 1998). Además, en plantas de Arabidopsis expuestas a Cd2+ o
Cu2+ se encontró un incremento en la transcripción de los genes γECS, GSHS y GR
(Xiang y Oliver, 1998). El JA produjo un efecto parecido en ausencia de metal pesado
(Xiang y Oliver, 1998), pero no existen pruebas concluyentes de que la respuesta al
estrés causado por metales pesados sea mediada por esta hormona.
Numerosos estudios indican que la PCS se expresa constitutivamente y que es
activada postraduccionalmente por los metales (Cobbett y Goldsbrough, 2002). Estas
observaciones sugieren que la expresión de la PCS, a nivel de mRNA y proteína, no
desempeñaría un papel importante en la regulación de la biosíntesis de PCs. Así, los
Introducción
- 34 -
niveles de mRNA del gen PCS1 de Arabidopsis no se vieron afectados por la
exposición de las plantas a Cd2+ u otros metales (Ha y cols, 1999; Vatamaniuk y cols,
2000). Sin embargo, la expresión del gen PCS1 de trigo (Triticum aestivum) aumentó
tras la exposición a Cd2+ (Clemens y cols, 1999), y lo mismo sucedió durante las
primeras etapas del desarrollo en plantas de Arabidopsis expuestas a Cd2+ (Lee y
Korban, 2002). Por lo tanto, al menos en algunas especies o en determinados estados
del desarrollo, la actividad PCS podría estar regulada a nivel transcripcional y
postraduccional.
1.6. Senescencia natural e inducida por estrés en nódulos
Una característica de la senescencia natural (envejecimiento) o inducida por estrés de
los nódulos es la pérdida o disminución de la capacidad fijadora de N2. Durante la
senescencia nodular tiene lugar una serie de cambios perfectamente organizados, tanto
morfológicos como metabólicos, que se comentarán a continuación.
El cambio visible más evidente en los nódulos durante la senescencia es el paso
del color rojo al verde, lo que indica una alteración del contenido y estado funcional de
la Lb (Swaraj y Bishnoi, 1996). A nivel celular también se producen cambios
estructurales, como la opacidad del citoplasma y la aparición de numerosas vesículas.
Presumiblemente, estas vesículas son consecuencia del daño oxidativo a la membrana
de los simbiosomas, lo que sucede en las primeras etapas de la senescencia (Pladys y
cols, 1991; Puppo y cols, 1991), aunque en lupino (Lupinus albus) este proceso ocurre
en estadios mucho más avanzados (Hernández-Jiménez y cols, 2002). También se ha
observado un incremento en el número de peroxisomas y la acumulación de ferritina
en los plastidios (Lucas y cols, 1998). En nódulos indeterminados, como ya se ha
comentado anteriormente, existe un gradiente de edad en los tejidos del nódulo
(Figura 1.1 B), pero incluso en los de tipo determinado la senescencia ocurre
heterogéneamente. Durante las etapas finales de la senescencia suceden grandes
movilizaciones de proteínas y metabolitos. Además, se produce una activación de
enzimas hidrolíticas, como Asp-proteasas y, especialmente, Cys-proteasas (Palma y
cols, 2002; Alesandrini y cols, 2003; Groten y cols, 2006).
Introducción
- 35 -
La pérdida de la capacidad para fijar N2 sucede en paralelo al descenso en el
contenido de Lb durante la senescencia natural de los nódulos de soja, judía y Vigna
radiata (Dalton y cols, 1986; Lahiri y cols, 1993). Lo mismo ocurre con el contenido
de ASC y GSH (Groten y cols, 2005). Estas moléculas son importantes en el proceso
de senescencia nodular, ya que se ha observado que el aporte de ASC exógeno
estimula la nodulación y aumenta la fijación de N2 (Swaraj y Garg, 1970; Bashor y
Dalton, 1999). Asimismo, tanto el ASC como el GSH son necesarios para el correcto
funcionamiento del ciclo celular (Vernoux y cols, 2000; Potters y cols, 2004). Las
hormonas vegetales, principalmente ácido abscísico y etileno, también desempeñan
papeles importantes en la senescencia nodular (Puppo y cols, 2005).
Una característica común a casi todos los tipos de senescencia nodular inducida
es la caída de la respiración bacteroidal, que se ha observado en diversos estreses
como oscuridad (Gogorcena y cols, 1997; Matamoros y cols, 1999a; Hernández-
Jiménez y cols, 2002), desfoliación (Vance y cols, 1979), tratamiento con NO3-
(Escuredo y cols, 1996; Matamoros y cols, 1999a) y sequía (Gogorcena y cols, 1995;
González y cols, 1998). Este descenso de la respiración nodular es consecuencia,
fundamentalmente, del aumento de la resistencia a la difusión del O2 (ver 1.1.2), lo que
es particularmente evidente en los casos de estrés hídrico, salinidad o inundación de
los suelos.
La senescencia natural e inducida por estrés puede conllevar la aparición de una
situación de estrés oxidativo que es posible estimar mediante la cuantificación de
grupos carbonilos en las proteínas oxidadas, de MDA proveniente de la peroxidación
de lípidos, o de 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina en el DNA dañado.
Objetivos
Objetivos
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2. OBJETIVOS
1. Determinar si los nódulos de leguminosas son capaces de sintetizar ascorbato de
novo o, por el contrario, si éste proviene exclusivamente de otros órganos de la
planta.
2. Estudiar el metabolismo del ascorbato en nódulos sometidos a estrés y durante la
senescencia natural, analizando la expresión de los genes implicados en su
biosíntesis, las correspondientes actividades enzimáticas y el contenido y estado
redox del ascorbato.
3. Analizar la regulación del metabolismo de los tioles en nódulos sometidos a estrés y
durante la senescencia natural mediante el estudio de la expresión de los genes
implicados en su biosíntesis, las correspondientes actividades enzimáticas y el
contenido y estado redox del (homo)glutatión. En particular, determinar el
mecanismo de regulación de la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa en las
condiciones anteriores.
4. Caracterizar, a nivel bioquímico y molecular, las fitoquelatina sintasas
recombinantes de Lotus japonicus y Arabidopsis thaliana, especialmente en lo
referente a la especificidad de sustratos y la activación por metales pesados y
micronutrientes esenciales. Asimismo, analizar la expresión y actividad de las
fitoquelatina sintasas de plantas.
5. Estudiar la síntesis de (homo)fitoquelatinas en plantas sometidas a tratamientos que
activan la fitoquelatina sintasa in vitro para establecer la posible contribución de las
(homo)fitoquelatinas a la homeostasis de metales con relevancia fisiológica.
Materiales y métodos
Materiales y Métodos
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Reactivos químicos y bioquímicos
Los reactivos utilizados para las soluciones nutritivas fueron de grado analítico de
Panreac (Barcelona). Las soluciones se prepararon con agua desionizada por ósmosis
reversa, mientras que para los análisis experimentales se utilizó agua Milli-Q
(Millipore, Billerica, EEUU). Los reactivos químicos usados para los tratamientos de
las plantas, incluidas las sales metálicas, fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, EEUU),
excepto el NaCl (Panreac). Los disolventes orgánicos utilizados en la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) fueron de Panreac. El monobromobimano (MBB)
fue suministrado por Calbiochem/EMD Chemicals (San Diego, EEUU) y el ácido
5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) por Sigma-Aldrich. El resto de reactivos
utilizados en los experimentos de esta Tesis provinieron de Sigma-Aldrich, a no ser
que se especifique lo contrario, y fueron de la máxima calidad disponible. La
procedencia de los reactivos que no se nombran en este apartado, en especial los
utilizados en los experimentos de biología molecular, se indicará en el texto junto a
dichos reactivos.
3.2. Material biológico y condiciones de cultivo
3.2.1. Plantas
Las semillas de judía (Phaseolus vulgaris L. cv. Contender) y de guisante (Pisum
sativum L. cv. Lincoln) se obtuvieron comercialmente (Ramiro Arnedo, Calahorra),
mientras que las semillas de Lotus (Lotus japonicus cv. Gifu B-129) y de Arabidopsis
(Arabidopsis thaliana ecotipo Col-0) fueron cedidas por la Dra. J. Webb (Institute for
Grassland and Environmental Research, Reino Unido) y la Dra. C. Gotor (Instituto de
Materiales y Métodos
- 44 -
Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, CSIC, Sevilla), respectivamente. Las semillas de
alfalfa (Medicago sativa L. cv. Aragón) fueron proporcionadas por el Dr. J.J. Irigoyen
(Universidad de Navarra, Pamplona). Los rizobios usados para la inoculación de las
plantas se indican en la Tabla 3.1.
Las semillas de judía se esterilizaron con etanol 70% (v/v) durante 3 min, se
lavaron con abundante agua destilada y se plantaron en macetas (de 2,5 L de
capacidad) que contenían una mezcla de perlita y vermiculita (1:1) como sustrato
inerte (Projar, Valencia). Las plantas crecieron en una cámara de ambiente controlado
(ASL, Madrid) con una temperatura de 24/20ºC día/noche, 70-80% de humedad
relativa y 16 h de fotoperiodo (Gogorcena y cols, 1997). La luz (300-350 μmol m-2 s-1)
fue suministrada por una combinación de lámparas fluorescentes (Silvania WHO
“coolwhite”, 215 w) e incandescentes (Mazda 60 w). Las plantas de judía se
mantuvieron en estas condiciones hasta los 29-30 d de edad, salvo en los experimentos
de senescencia natural (ver 3.3). La composición de la solución nutritiva usada para
regar las plantas (tres veces por semana) se detalla en la Tabla 3.2. Para los
experimentos de determinación de la actividad PCS y de (h)PCs en radículas de judía
de 10 d de edad (ver 3.3), las plántulas se regaron con la solución anterior
suplementada con NH4NO3 5 mM.
Las semillas de guisante se esterilizaron de forma similar a las de judía. En este
caso, antes de plantarlas en las macetas las semillas se mantuvieron a temperatura
ambiente en una placa petri con papel humedecido en el fondo hasta su germinación
(3-4 d). Las plantas de guisante crecieron en las mismas condiciones ambientales que
las de judía y fueron regadas con la misma solución nutritiva hasta los 32-35 d de
edad. Las radículas de guisante empleadas para la determinación de la actividad PCS y
de (h)PCs (ver 3.3) fueron mantenidas en las mismas condiciones que las de judía.
La esterilización de las semillas de alfalfa se realizó de forma similar a la
descrita para judía y guisante, y se mantuvieron durante 5-6 d a temperatura ambiente
en una placa petri con papel humedecido hasta su germinación. Las plantas de alfalfa
crecieron en las mismas condiciones descritas para judía hasta los 56-60 d de edad.
Las semillas de Lotus se escarificaron con papel de lija, se esterilizaron con
etanol 70% (v/v) durante 3 min, se lavaron con abundante agua destilada y se dejaron
Materiales y Métodos
- 45 -
en agua a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se transfirieron a placas petri
con papel absorbente, se humedecieron con agua destilada y se mantuvieron 2-3 d a
temperatura ambiente hasta que germinaron. Posteriormente, se plantaron en macetas
(de 1 L de volumen) con vermiculita y crecieron en las mismas condiciones que las
descritas para las plantas de judía, excepto que la temperatura se fijó en 22/18ºC
día/noche y la intensidad luminosa fue de 250 μmol m-2 s-1 (Handberg y Stougaard,
1992). Las plantas se mantuvieron hasta los 45-49 d de edad, regándolas una vez por
semana con solución B&D (Broughton y Dilworth, 1971) suplementada con NH4NO3
0,25 mM, a no ser que se especifique lo contrario. La concentración de macro- y
micronutrientes de la solución B&D se detalla en la Tabla 3.3.
Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron con una mezcla 1:1 de H2O2 30%
(p/v) y etanol absoluto durante 1 min y se lavaron con abundante agua estéril, con un
último lavado de 3-4 h de duración para favorecer la hidratación de las semillas. Una
vez hidratadas, las semillas se transfirieron a placas petri con un medio estéril
compuesto por “Phytagar” 1,5% (p/v) de Becton-Dickinson (Franklin Lakes, EEUU) y
“Half-strength Murashige and Skoog” (pH 5,6), en el cual la concentración de ZnSO4
se redujo a 0,1 µM (Tabla 3.4). Las semillas se mantuvieron en estas condiciones
durante 3-4 d en oscuridad a 4ºC y, posteriormente, las plántulas crecieron en las
mismas condiciones de luz, temperatura y humedad que las de Lotus hasta los 15 d de
edad. Las vitaminas se obtuvieron de Duchefa Biochemie (Haarlen, Holanda).
En todos los casos, el material vegetal se cosechó en N2 líquido con guantes y
pinzas y se almacenó inmediatamente a -80ºC hasta su utilización.
Leguminosa a Rizobio
Judía Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 3622 Guisante Rhizobium leguminosarum bv. leguminosarum NLV8Lotus Mesorhizobium loti NZP 2235 Alfalfa Sinorhizobium meliloti 102F78 a Las plántulas se inocularon ≈ 6-8 d después de su esterilización.
Tabla 3.1. Rizobios empleados en la inoculación de las plantas.
Materiales y Métodos
- 46 -
Macronutriente Concentración (mg L-1)
MgSO4·7H2O 800 KH2PO4 540 K2HPO4 90 CaSO4·2H2O 500 Sequestrene 138Fe (6% Fe) 25 NH4NO3 40
Micronutriente Concentración (µg L-1)
MnSO4·H2O 253,5 CuSO4·5H2O 37,5 ZnSO4·7H2O 43,5 H3BO3 465 NaCl 885 Na2MoO4·2H2O 18,2 CoCl2·6H2O 7,6
a El pH de la solución se ajustó a 6,5 con KOH 2 M
Macronutriente Concentración (mg L-1)
CaCl2·2H2O 147 KH2PO4 68 MgSO4·7H2O 62 K2SO4 44 Sequestrene 138Fe (6% Fe) 25 NH4NO3 20
Micronutriente Concentración (µg L-1)
MnSO4·H2O 169 CuSO4·5H2O 50 ZnSO4·7H2O 144 H3BO3 124 Na2MoO4·2H2O 24 CoCl2·6H2O 24
a El pH de la solución se ajustó a 6,5 – 6,7 con KOH 2 M
Tabla 3.2. Composición de la solución nutritiva empleada para el cultivo de judía, guisante y alfalfa a.
Tabla 3.3. Composición de la solución nutritiva empleada para el cultivo de Lotus a.
Materiales y Métodos
- 47 -
Macronutriente Concentración (mg L-1)
CaCl2 332 KNO3 1900 MgSO4 180,5 NH4NO3 1650 KH2PO4 170
Micronutriente Concentración (µg L-1)
Gly 200 Mio-inositol 10000 CoCl2·6H2O 25 CuSO4·5H2O 25 FeNaEDTA 36,7 H3BO3 6200 KI 830 MnSO4·H2O 16900 Na2MoO4·2H2O 250 ZnSO4·7H2O 8600
Vitaminas Concentración (µg L-1)
Ácido nicotínico 50 Piridoxina-HCl 50 Tiamina-HCl 10
3.2.2. Bacterias
Los rizobios utilizados para inocular las plantas crecieron en el medio de cultivo
líquido que se detalla en la Tabla 3.5 en un agitador refrigerado MaxQ 4000
(Barnstead, Dubuque, EEUU) a 28ºC y 160 rpm. La inoculación de las plantas tuvo
lugar cuando los rizobios alcanzaron el final de la etapa logarítmica de crecimiento (≈
2-3 d con A600 = 1,0-1,2). Los rizobios crecieron en un frasco erlenmeyer con 125 mL
de medio líquido, empleándose el volumen de un frasco por cada tres macetas con 6-7
plantas de judía, guisante o alfalfa, o con 9-10 plantas de Lotus.
Tabla 3.4. Composición del medio empleado para el crecimiento de Arabidopsis.
Materiales y Métodos
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Las células de Escherichia coli crecieron, a no ser que se especifique lo
contrario, a 37ºC y 250 rpm en un incubador orbital (New Brunswick Scientific,
Edison, EEUU). La composición del medio de cultivo Luria-Bertani (LB) en el que
crecieron las bacterias se detalla en la Tabla 3.6. La triptona se obtuvo de
Cultimed/Panreac (Barcelona) y el extracto de levadura de Becton-Dickinson.
Nutriente Concentración (g L-1)
Manitol 10,0 KH2PO4 0,4 K2HPO4 0,1 MgSO4·2H2O 0,2 NaCl 0,1 Extracto de levadura 0,4
a El pH del medio se ajustó a 6,5 con azul de bromotimol 5% (p/v) en KOH 2 M
Nutriente Concentración (g L-1)
Triptona 10 NaCl 10 Extracto de levadura 5
3.3. Tratamientos de las plantas
Para el estudio de la regulación del metabolismo de ASC y tioles en nódulos de judía
se aplicaron los siguientes tratamientos: NaCl 150 mM durante 7 d, CdCl2 100 µM
durante 4 d o H2O2 10 mM durante 4 d, todos ellos disueltos en solución nutritiva. El
tratamiento con JA 100 µM durante 4 d (o el tiempo que se indique en la sección de
Tabla 3.5. Composición del medio líquido empleado para el crecimiento de rizobios a.
Tabla 3.6. Composición del medio líquido Luria-Bertani (LB) empleado para el crecimiento de E. coli.
Materiales y Métodos
- 49 -
“Resultados”) se aplicó a partir de una dilución en solución nutritiva de un stock 100
mM de la hormona preparado en dimetilsulfóxido (DMSO). También se trató un grupo
de plantas con DMSO diluido 1:1000 como control específico del tratamiento con JA.
Asimismo, una maceta de cada serie se mantuvo en condiciones normales de
crecimiento y se utilizó como control. Las plantas de judía se trataron a los 22-23 d de
edad en el caso del tratamiento con NaCl, y a los 25-26 d para los demás tratamientos,
de tal forma que la edad de las plantas al cosecharlas fue de 29-30 d. En los estudios
de senescencia natural en nódulos de judía, las plantas se mantuvieron en condiciones
normales de crecimiento hasta los 50-53 d de edad.
Para los experimentos de cuantificación de (h)PCs, las plantas de Lotus y
Arabidopsis crecieron durante 45 o 15 d, respectivamente, tras los que se trataron con
CdCl2 100 µM, CuCl2·2H2O 100 µM, ZnSO4·7H2O 100 µM, NiSO4·6H2O 100 µM o
FeCl3·6H2O 500 µM durante 4 d. Las plantas de Lotus se regaron con solución
nutritiva suplementada con NH4NO3 5 mM.
En la determinación de actividad PCS de plantas, se utilizaron radículas de
judía y de guisante crecidas en condiciones “no nodulantes” (con un suplemento de
NH4NO3 5 mM) durante una semana, tras la que se trataron con CdCl2 50 µM durante
3 d. También se determinó el contenido de (h)PCs en las mismas plantas.
3.4. Aislamiento y purificación de mitocondrias de nódulos
Todos los pasos se realizaron a 0-4ºC para evitar la degradación de proteínas,
siguiendo protocolos publicados (Iturbe-Ormaetxe y cols, 2001) con pequeñas
modificaciones. Aproximadamente 10 g de nódulos de judía se lavaron con agua
destilada fría y se homogeneizaron en un mortero con 30 mL de un medio de
extracción compuesto por MOPS 30 mM (pH 7,2), manitol 0,35 M, EDTA 2 mM,
KH2PO4 10 mM, PVPP 2% (p/v) y BSA 0,4% (p/v). El extracto se filtró a través de
cuatro capas de gasa humedecida en el medio de extracción, se centrifugó dos veces a
4000g durante 5 min a 4ºC para eliminar los restos de tejido nodular, y posteriormente
a 12000g durante 15 min a 4ºC. El precipitado se resuspendió suavemente (con la
Materiales y Métodos
- 50 -
ayuda de un pincel) en 25 mL de medio de lavado con BSA, compuesto por MOPS 20
mM, manitol 0,3 M, EDTA 1 mM y BSA 0,2% (p/v). A continuación, se volvió a
centrifugar a 12000g durante 15 min a 4ºC y el precipitado se resuspendió nuevamente
en 1,8 mL de medio de lavado con BSA. Todo el volumen se cargó en un gradiente de
Percoll (Amersham Biosciences/General Electric, Piscataway, EEUU), que consistió
en cuatro capas de Percoll al 50, 35, 15 y 10% (v/v). La composición y la preparación
de las capas se muestran en la Tabla 3.7.
Reactivo Concentración (g L-1)
Sacarosa 284,1 MOPS 7,7
SCTB (Solución Concentrada del Tampón Base) BSA 6,7
Reactivo Volumen (mL)
SCTB 40,0 SCTB diluida a
Agua 93,3
Reactivo Volumen (mL)
Percoll 52,0 Percoll 70 % a
SCTB 22,3
Percoll 70 %(mL)
SCTB diluida (mL)
Propilenglicol(µL)
10 % 6,0 35,7 310 15 % 7,7 28,0 266 35 % 30,0 30,0 −
Capas de Percoll a
50 % 21,42 8,6 −
a Volúmenes calculados para la realización de cuatro gradientes.
Después de centrifugar los extractos en una ultracentrífuga Beckman-Coulter
L8-70M (Fullerton, EEUU; rotor 70 Ti, aceleración: 4, deceleración: 4) a 13000g
durante 35 min a 4ºC, las mitocondrias, que bandearon entre las capas de Percoll del
35 y del 15%, se extrajeron (4-5 mL) con una jeringa de plástico y se lavaron con 30
mL de medio de lavado sin BSA, teniendo la precaución de añadirlo por las paredes
del tubo sin que cayera directamente sobre las mitocondrias. Tras centrifugar a 17000g
Tabla 3.7. Composición de las capas de Percoll utilizadas para la purificación de mitocondrias de nódulos de judía.
Materiales y Métodos
- 51 -
durante 10 min a 4ºC, se volvieron a lavar con 30 mL de medio de lavado sin BSA y
se centrifugaron como antes. El precipitado final de mitocondrias se resuspendió en
500 µL de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y Triton X-100 0,15% (v/v). Para la
determinación de la actividad GalLDH, la suspensión de mitocondrias se mantuvo en
hielo durante 2 h para asegurar su completa ruptura, mientras que para los análisis
western se lisaron 4 × 30 s en un sonicador XL2020 (Misonix, Farmingdale, EEUU).
Posteriormente, los lisados se centrifugaron en ambos casos a 15000g durante 15 min a
4ºC y se recogió el sobrenadante.
3.5. Marcadores de senescencia y daño oxidativo en nódulos
3.5.1. Marcadores de senescencia
El contenido de Lb se determinó espectrofotométricamente por el método del piridín-
hemocromo (Appleby y Bergersen, 1980). Las medidas de absorbancia se realizaron
con un espectrofotómetro Lambda 25 (Perkin-Elmer, Waltham, EEUU). Los nódulos
de judía (50 mg) se homogeneizaron con 1 mL de tampón fosfato potásico (KPi) 50
mM (pH 7,0) y se centrifugaron a 15000g durante 15 min a 4ºC. Una alícuota del
sobrenadante se guardó a -20ºC para la determinación de la proteína soluble total. A
400 µL del extracto se le añadieron 1,2 mL de piridina 33% (v/v en NaOH 0,2 M) y se
completó con agua hasta un volumen total de 2,4 mL. La forma oxidada (A539) del
complejo piridín-hemocromo se obtuvo añadiendo unos cristales de ferricianuro
potásico a la mitad del volumen anterior, y la forma reducida (A556) añadiendo unos
cristales de ditionito sódico a la otra mitad. Para la determinación de Lb, se calculó la
diferencia de absorbancia entre ambas formas del complejo y se utilizó un coeficiente
de extinción ε556-539 = 23,4 mM-1 cm-1.
La proteína soluble total se cuantificó mediante el ensayo de Bradford (Bio-
Rad, Hercules, EEUU) a partir de las alícuotas de los mismos extractos de nódulos
usados para la determinación de Lb, utilizando BSA como estándar.
Materiales y Métodos
- 52 -
3.5.2. Daño oxidativo a lípidos
El daño oxidativo a lípidos se estimó como contenido de MDA, producto mayoritario
de la peroxidación de lípidos. El MDA se hizo reaccionar con el ácido 2-tiobarbitúrico
(TBA) a alta temperatura y en medio ácido, produciéndose un aducto [(TBA)2-MDA)]
de color rojo. Este cromógeno puede extraerse fácilmente en disolventes orgánicos
(como butanol) y cuantificarse por A532 o fluorescencia a 553 nm. En nuestro caso se
utilizó HPLC para separar y cuantificar específicamente el contenido de (TBA)2-MDA
(Iturbe-Ormaetxe y cols, 1998).
Para ello, se homogeneizaron 50 mg de nódulos de judía con 250 µL de ácido
metafosfórico 5% (p/v), a los que se añadieron 5 µL de butil-hidroxitolueno (BHT) 2%
(p/v en etanol) como antioxidante. Los extractos se centrifugaron a 15000g durante 15
min a 4ºC y se recogió el sobrenadante. Para el ensayo se mezclaron 100 µL de este
sobrenadante, 10 µL de BHT 2% (p/v en etanol), 50 µL de TBA 1% (p/v en NaOH 50
mM) y 50 µL de HCl 25% (v/v). Como controles, se realizaron un blanco general, que
contenía 100 µL de medio de extracción en lugar del extracto, y un blanco para cada
muestra con 50 µL NaOH 50 mM en lugar de TBA.
Las muestras se incubaron en un baño a 95ºC durante 30 min y posteriormente
la reacción se detuvo introduciendo las muestras en hielo. El cromógeno formado se
extrajo dos veces con 100 µL de butanol y, tras agitación vigorosa, se llevó a cabo la
separación de las fases por centrifugación a 200g durante 1 min. La fase butanólica
(superior) se desecó en un liofilizador Savant Speedvac SC110 (GMI, Ramsey,
EEUU) y se almacenó a -80ºC.
El complejo (TBA)2-MDA se separó mediante HPLC con una columna analítica
Ultrasphere C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm; Beckman-Coulter) y se detectó por fotodiodos
(PDA996; Waters, Milford, EEUU) a una A532. La fase móvil consistió en KPi 5 mM
(pH 7,0), acetonitrilo 15% (v/v) y tetrahidrofurano 0,6% (v/v), con un flujo isocrático
de 1 mL min-1. Todos los disolventes empleados en esta Tesis para los análisis
mediante HPLC fueron previamente desgasificados y filtrados a vacío.
Las muestras almacenadas a -80ºC se resuspendieron en 60 µL de fase móvil
inmediatamente antes de ser inyectadas tras centrifugar a 15000g durante 30 s con
filtros Ultrafree-MC de 0,45 µm (Amicon/Millipore, Billerica, EEUU). Se inyectaron
Materiales y Métodos
- 53 -
50 µL de muestra y el complejo (TBA)2-MDA se cuantificó utilizando una recta de
calibrado con 1,1,3,3-tetraetoxipropano (forma acetilada estable del MDA) como
estándar, en el rango de 0-1 nmol.
3.5.3. Daño oxidativo a proteínas
El daño oxidativo a proteínas se estimó mediante la detección de los grupos carbonilo
que se forman en las cadenas laterales de las proteínas tras estar expuestas,
principalmente, a ROS. Los grupos carbonilo se derivatizaron con el compuesto 2,4-
dinitrofenilhidracina (DNPH) para formar las correspondientes 2,4-
dinitrofenilhidrazonas (DNP-hidrazonas). Las muestras derivatizadas se separaron
mediante electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 12,5%, de acuerdo
con las instrucciones del OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit (Chemicon,
Temecula, EEUU). Posteriormente, las proteínas se transfirieron a una membrana de
polivinildifluoruro (PVDF) BioTrace-PVDF (Pall Corporation, Ann Arbor, EEUU) y
ésta se incubó con un anticuerpo primario (dilución 1:150) que reconoce
específicamente las DNP-hidrazonas. A continuación, la membrana se incubó con un
anticuerpo secundario (dilución 1:3000) conjugado a una peroxidasa de rábano
(Sigma-Aldrich). Las proteínas inmunorreactivas se detectaron por
quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, EEUU) utilizando películas fotográficas
sensibles a la luz azul (ver 3.10 para la descripción detallada de la electroforesis de
proteínas y el análisis western).
La intensidad de la señal se cuantificó por densitometría empleando el software
ImageJ v.1.38 (disponible gratuitamente en http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html),
relativizando la intensidad de la señal de cada muestra frente a la obtenida en la
muestra control. Además, para cada muestra, se incluyó en la electroforesis un blanco
que se derivatizó con una solución control en lugar de la solución de DNPH, según las
instrucciones del fabricante, y también un blanco general derivatizado con medio de
extracción en lugar de muestra.
Materiales y Métodos
- 54 -
3.6. Análisis de la expresión génica en nódulos
3.6.1. Extracción de RNA
Todo el material fungible empleado para analizar la expresión génica se esterilizó
previamente en un autoclave. La extracción de RNA total se realizó utilizando el
RNAqueous Isolation Kit (Ambion, Austin, EEUU), siguiendo las instrucciones del
fabricante. El RNA aislado se precipitó con LiCl durante toda la noche a -20ºC para
purificarlo y el precipitado se lavó con etanol 70% (v/v) a -20ºC. El RNA se trató con
DNasaI (Roche, Penzberg, Alemania) a 37ºC durante 30-40 min. Después, la DNasaI
se inactivó añadiendo 2 µL de inhibidor de DNasaI (Ambion) e incubando durante 2
min a temperatura ambiente. Con el fin de descartar la posible contaminación con
DNA genómico de las muestras de RNA, se utilizaron los cebadores diseñados a partir
del gen ubiquitina (ver Tablas 3.10 y 3.11) y se preparó la mezcla de reacción descrita
en la Tabla 3.9, sustituyendo el cDNA por 1 µL del correspondiente RNA.
Reactivo Volumen (µL)
MMLV-RT Buffer 5X 10 dNTPs 25 mM 2 Inhibidor de RNasa 40 U µL-1 0,5 H2O estéril 14,5 Mezcla RNA – oligo(dT)17 10 µM 22 MMLV-RT 200 U µL-1 1
Reactivo Volumen (µL)
iQ SYBR-Green Supermix 12,5 cDNA 1 Cebadores 1,5 µM (mezcla “forward” + “reverse”) 5 H2O estéril 6,5
Tabla 3.9. Mezcla de reacción para el análisis mediante qRT-PCR.
Tabla 3.8. Mezcla de reacción para la síntesis de cDNA.
Materiales y Métodos
- 55 -
3.6.2. Cuantificación de mRNAs mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Para la síntesis de cDNA, se mezclaron 20 µL de RNA con 2 µL de oligo-(dT)17 10
µM (Invitrogen, Carlsbad, EEUU) durante 10 min a 65ºC. A continuación, la mezcla
se enfrió inmediatamente a 0ºC para evitar la formación de estructuras secundarias en
el RNA. La mezcla de reacción para la síntesis de cDNA se detalla en la Tabla 3.8. La
reacción tuvo lugar a 42ºC durante ≈ 1 h. Los cDNAs sintetizados fueron almacenados
a -20 ºC. La transcriptasa inversa (MMLV-RT; “Moloney Murine Leukemia Virus-
Reverse Transcriptase”) se obtuvo de Promega (Madison, EEUU) y la mezcla de los
desoxirribonucleótidos (dNTPs) de Invitrogen.
La cuantificación de los cDNAs se realizó mediante RT-PCR cuantitativa en
tiempo real (qRT-PCR) usando los cebadores de ubiquitina (ver Tablas 3.10 y 3.11).
Las cantidades de cDNA se igualaron ajustando al mayor número de Ct (“threshold
cycle” o ciclo umbral) obtenido, siempre que éste fuera ≤ 20 ciclos. La mezcla de
reacción para la qRT-PCR se detalla en la Tabla 3.9. El análisis qRT-PCR se llevó a
cabo en un equipo iCycler iQ utilizando el reactivo iQ SYBR-Green Supermix (Bio-
Rad) y los cebadores específicos recogidos en las Tablas 3.10 y 3.11. El programa de
qRT-PCR consistió en un primer paso de desnaturalización del cDNA y activación de
la Taq polimerasa a 95ºC durante 5 min, seguido de 40 ciclos a 95ºC durante 15 s y a
60ºC durante 1 min. Para determinar la especificidad de la qRT-PCR, los productos
amplificados se sometieron a una curva de desnaturalización (“melting curve”). Los
niveles de mRNA de cada gen en los diferentes tratamientos se normalizaron frente al
gen ubiquitina (y también β-actina en el caso de Lotus) y se expresaron de forma
relativa a los niveles de mRNA de los nódulos control, a los que se les dio
arbitrariamente el valor de 1, usando el método de 2-ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001).
En el caso de los nódulos de judía tratados con JA, los controles fueron los nódulos
tratados con DMSO.
En los experimentos realizados para el aislamiento y caracterización de los
genes LjGalLDH, PvGalLDH y LjPCS1, se utilizaron los cebadores descritos en la
Tabla 3.12.
Materiales y Métodos
- 56 -
Número de acceso Gen Secuencia de los cebadores
(dirección 5’ → 3’) a, b
U77940 Ubiquitina GCTTCGTGGTGGAATGCAGAT TCGCACCTTGGCAGACTACAA
TC466 GDP-manosa pirofosforilasa (GMP)
AGCTGCACAATAATGCGAGGA TCCACTCGAGACCATTGACCA
TC410 GME CTTTGGAATTGAGTGCCGCA TCTTCCGGCAAAATGCAGC
CV538392 L-Galactosa-1-fosfato fosfatasa (GalPP)
CTGGAATCCGTGGAAAAGGTG TGTTCCAATCTCTGTGGCGAG
TC2872 GalDH CGATTGATGTGGTGCTTTCGT GGAGAAGCATTGATGATGGCA
sin depositar c GalLDH GCAAAGCCAAGCATGAAAGAC ATTGGGCAGCGATGGACAT
AF128454 γECS AGCTGTGTCCCACCGAGTG AAGAGTGAGCGGAGGAGGGT
AF258320 hGSHS AGTTCCAGGTGTGGGTTTGG GGCCCGGGTAATAAGCAAAG
CB539361 DR plastidial (DR1) CAATGTCTTCCGTTCCCCCT AGCTTTAACGGCGATTTCGA
TC2364 DR citosólica (DR2) GCAACAAACCCGAATGGTTT ACGGGCACCTTTCCTTCAG
Pv_ERRI_26 AO CAGGAGTTTGGGCCTTCCAT TTCCCATGTGCAAATGTGGT
a La secuencia superior corresponde al cebador sentido (“forward”) y la inferior al antisentido (“reverse”).
b Las secuencias de los cebadores se diseñaron usando el programa Primer Express v.2.0 (Applied Biosystems, Foster City, EEUU).
c Los cebadores se diseñaron a partir de una secuencia parcial de cDNA de nódulos de judía usando cebadores (Tabla 3.12) obtenidos a partir de la secuencia del gen GalLDH de Lotus.
Tabla 3.10. Cebadores usados para la cuantificación de los transcritos por qRT-PCR en judía.
Materiales y Métodos
- 57 -
Número de acceso Gen Secuencia de los cebadores
(dirección 5’ → 3’) a, b
DQ249171 Ubiquitina TTCACCTTGTGCTCCGTCTTC AACAACAGCACACACAGACAA
AP006104 β-actina GCATTGTTGGTCGTCCTCGT TGTGCCTCATCCCCAACATA
TC14556 GMP CCGTCTGTTTTGGACCGAATT TCCAGGCAGAACCATTGCA
TC8218 GME GAAGGCTCCTGCTGCTTTTTG GGCTCACGGAAGTCGGATTTA
TC10248 GalDH TCAAGCTGCTGCAACCCATT TGCCAACAAGCACCGATGT
DQ455608 GalLDH GAGATGCTGAGAGCGCTGG GTGATGGTGGACACGGAGG
a La secuencia superior corresponde al cebador sentido (“forward”) y la inferior al antisentido (“reverse”).
b Las secuencias de los cebadores se diseñaron usando el programa Primer Express v.2.0 (Applied Biosystems, Foster City, EEUU).
Gen Secuencia de los cebadores (dirección 5’ → 3’) a
LjGalLDH GTCCACCATCACAACACCTG ACTGTCAGGCTGGTGGAAAT
PvGalLDH TCAGAAACATGCTTCCCTGCT CATCCACAGGAAACCGCTTT
LjPCS1 AACATATGGCGATGGCGGGGTTG TACTCGAGCTAAGACAAAGGTACACC
a La secuencia superior corresponde al cebador sentido (“forward”) y la inferior al antisentido (“reverse”).
Tabla 3.12. Cebadores usados para el aislamiento y clonaje de genes.
Tabla 3.11. Cebadores usados para la cuantificación de los transcritos por qRT-PCR en Lotus.
Materiales y Métodos
- 58 -
3.7. Hibridación in situ de mRNA y microscopía confocal
Para la hibridación in situ del mRNA con una sonda fluorescente (FISH) y
visualización mediante microscopía confocal, los nódulos se fijaron con formaldehído
4% (v/v) en medio PBS [tampón fosfato sódico (NaPi) 20 mM (pH 7,4), NaCl 150
mM] durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, se lavaron con PBS y se cortaron
directamente en secciones de 30 μm con un vibrotomo Intracel Series 1000 Sectioning
System (Herts, Reino Unido). Las secciones de los nódulos se colocaron en
portaobjetos recubiertos con 3-aminopropiltrietoxisilano (Sigma-Aldrich) y se
prepararon para la hibridación siguiendo protocolos publicados (Massonneau y cols,
2005) con pequeñas modificaciones. Las secciones se deshidrataron en una serie de
metanol 30, 50, 70 y 100% (v/v) en agua, se rehidrataron en una serie de metanol 70,
50, y 30% (v/v) en agua y, finalmente, se lavaron con PBS (5 min para cada etapa). A
continuación, se trataron con celulasa Onozuka R-10 2% (p/v; SERVA
Electrophoresis, Heidelberg, Alemania) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, se
lavaron con PBS y, posteriormente, con agua. Finalmente, las secciones se
deshidrataron en una serie de metanol 30, 50, 70 y 100% (v/v) en agua, y se
almacenaron secas a -20ºC hasta su hibridación con las sondas.
La secuencia de GalLDH de Lotus se amplificó por PCR convencional
utilizando cebadores específicos (ver Tabla 3.12) que fueron diseñados a partir de una
secuencia genómica de LjGalLDH suministrada por el laboratorio del Dr. S. Tabata
(Kazusa DNA Research Institute, Chiba, Japón), en el marco del proyecto de
secuenciación del genoma de Lotus. Para la hibridación in situ, se sintetizaron sondas
sentido (control negativo) y antisentido etiquetadas con digoxigenina mediante
transcripción in vitro, usando digoxigenina-UTP de acuerdo con las especificaciones
del DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Roche). Se preparó una dilución 1:25 de cada
sonda en solución de hibridación [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), formamida 50% (v/v),
dextran-sulfato 10% (v/v), EDTA 1 mM, NaCl 300 mM, tRNA de levadura 200 μg
mL-1] y se añadieron 10 μL de la sonda diluida sobre cada sección. La hibridación se
dejó proceder durante toda la noche a 50ºC en una cámara humidificadora.
Posteriormente, las secciones se lavaron cuatro veces (2 min cada vez, temperatura
Materiales y Métodos
- 59 -
ambiente) con medio SSC 4X [“Saline-Sodium Citrate buffer”: citrato sódico 60 mM
(pH 7,0), NaCl 0,6 M], cuatro veces (2 min cada vez, temperatura ambiente) con SSC
2X y dos veces con SSC 0,1X (15 min cada vez, 50ºC). Después de un lavado en PBS,
las secciones se incubaron con BSA 5% (p/v) durante 10 min y, posteriormente, con
un anticuerpo anti-digoxigenina de ratón (Sigma-Aldrich), diluido 1:5000 en PBS
conteniendo BSA 3%, durante 90 min a temperatura ambiente. A continuación, tras
lavar con PBS, las secciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y en
oscuridad con un anticuerpo fluorescente anti-ALEXA Fluor 488 (Molecular
Probes/Invitrogen, Carlsbad, EEUU) diluido 1:25 en PBS. Este anticuerpo reconoce el
anticuerpo anti-digoxigenina de ratón y emite una señal fluorescente verde.
Posteriormente, las secciones se lavaron con PBS, se incubaron 10 min con 4’,6-
diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la visualización del núcleo celular (fluorescencia
azul), se montaron en Mowiol (Calbiochem/EMD Chemicals) y se observaron al
microscopio. Las imágenes confocales de las secciones de los nódulos se obtuvieron
con un microscopio Leica TCS-SP (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con objetivos
acromáticos planos, y fueron tomadas como una “serie z” de secciones ópticas. Las
imágenes en color de fluorescencia DAPI se adquirieron con una longitud de onda de
excitación de 351 nm (línea de láser de Ar) y de emisión de 440 ± 30 nm. La señal de
fluorescencia verde se detectó con una longitud de onda de excitación de 488 nm
(línea de láser de He-Ne-Kr) y de emisión de 520 ± 20 nm. También se tomaron
imágenes de las secciones usando el contraste de interferencia diferencial (DIC) para
delimitar su estructura. El procesado de datos y solapamiento de imágenes se
realizaron con el programa LCS v.2.61 Build 1537 (Leica).
3.8. Expresión de proteínas de plantas en Escherichia coli
El RNA total de raíces de Lotus se aisló y el correspondiente cDNA se sintetizó de
acuerdo con el protocolo detallado en 3.6. La secuencia completa del gen PCS1 de
Lotus (LjPCS1) se aisló por PCR empleando la enzima High-fidelity Platinum Taq
DNA polymerase (Invitrogen) y cebadores específicos (ver Tabla 3.12). La secuencia
Materiales y Métodos
- 60 -
de estos cebadores se diseñó utilizando una secuencia genómica suministrada por el
Dr. S. Tabata. Además, estos cebadores incluyeron en sus extremos 5’ los sitios de
corte que reconocen las enzimas de restricción NdeI (“forward”) y XhoI (“reverse”). El
programa de PCR consistió en una etapa inicial de desnaturalización de 5 min a 94ºC,
seguida por 40 ciclos de 30 s a 94ºC, 40 s a 61ºC y 2 min a 68ºC, con una etapa final
de elongación de 10 min a 68ºC. El producto resultante, de 1,5 kb, se clonó en el
plásmido pCRII-TOPO (Invitrogen) y, seguidamente, en el vector de expresión pET-
28a(+) (Novagen/EMD Chemicals, San Diego, EEUU), usando las enzimas de
restricción NdeI y XhoI. El plásmido pET-28a(+) presenta una región que codifica una
cola de polihistidinas [poli(His)6] situada antes de la secuencia de LjPCS1, necesaria
para la posterior purificación de la proteína recombinante (3.9). La construcción con la
secuencia de la PCS1 de Arabidopsis (AtPCS1) en el plásmido pET-28a(+) fue cedida
por el Dr. M. Oven (Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Halle, Alemania). Las
secuencias de LjPCS2 y LjPCS3 se aislaron de forma similar (Ramos y cols, 2007).
Los cultivos de E. coli BL21(DE3) transformadas con el plásmido de expresión
pET28a(+) conteniendo las secuencias AtPCS1 o LjPCS1 se incubaron durante 16 h a
37ºC y 250 rpm en 3 mL de medio LB. Posteriormente, se añadieron 1,5 mL de cultivo
a 500 mL de medio LB, el cual se incubó de nuevo en las mismas condiciones
anteriores hasta que alcanzó una A600 = 1,0 (2-3 h). Las proteínas recombinantes se
expresaron incubando el cultivo durante 16 h a 18ºC con isopropiltio-β-galactósido
(IPTG) 0,1 mM.
3.9. Purificación de proteínas recombinantes
Las bacterias que expresaban AtPCS1 o LjPCS1 (500 mL de cultivo) se centrifugaron
a 4000g durante 20 min a 4ºC y el sedimento de las células se lavó a continuación dos
veces con 20 mL de medio PBS. Finalmente, las bacterias se resuspendieron en 20 mL
de PBS y se hicieron alícuotas de 2 mL en tubos eppendorf. Tras centrifugar a 10000g
durante 10 min a 4ºC, las bacterias sedimentadas se conservaron a -80ºC. Sólo se
utilizaron bacterias que fueron almacenadas como máximo durante tres semanas.
Materiales y Métodos
- 61 -
Las bacterias se resuspendieron en 1 mL de medio A [Tris-HCl 20 mM (pH
8,0), NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM, glicerol 10% (v/v), imidazol 50 mM, β-
mercaptoetanol 10 mM] y se sonicaron (6 × 30 s, con 30 s de descanso tras cada
pulso). Después de centrifugar a 15000g durante 15 min a 4ºC, el extracto soluble de
las bacterias se cargó en una columna de afinidad de Ni2+ (HisTrap Chelating;
Amersham Biosciences), equilibrada previamente con 5 volúmenes del medio A. La
columna se lavó con otros 5 volúmenes del mismo medio y la proteína recombinante
se eluyó con medio A conteniendo imidazol 250 mM. Los primeros 0,5 mL del eluido
se desecharon por presentar proteínas contaminantes, mientras que los siguientes 1,5
mL se recogieron y se cargaron en una columna HiTrap Desalting (Amersham
Biosciences) previamente equilibrada con 5 volúmenes del medio A conteniendo β-
mercaptoetanol 1 mM y sin imidazol. Este mismo medio fue utilizado para la elución
de la proteína, desechándose los primeros 1,5 mL de eluido y recogiéndose los
siguientes 2 mL, que contenían la proteína purificada con poli(His)6. La proteína se
dializó y concentró por centrifugación a 10000g a 4ºC en dispositivos Vivaspin 2
(Sartorius/Vivascience, Goettingen, Alemania), durante ≈ 1-2 h, hasta alcanzar un
volumen de 500 µL. Para eliminar la poli(His)6 de la proteína purificada se utilizó
trombina conjugada a biotina (Novagen/EMD Chemicals), puesto que el plásmido de
expresión codifica una secuencia de corte reconocida por la trombina justo después de
la secuencia que codifica la poli(His)6. Así, se añadió de nuevo CaCl2 hasta una
concentración final de 2,5 mM en la preparación de la proteína y ésta se incubó con 2
U de trombina durante 16 h a 20ºC. Una vez finalizada la incubación, la trombina fue
eliminada por afinidad utilizando una resina con estreptavidina. A continuación, se
añadió β-mercaptoetanol a la preparación (concentración final 2 mM) y ésta se cargó
de nuevo en otra columna de afinidad de Ni2+. En este caso, las proteínas purificadas
sin poli(His)6 se eluyeron (los primeros 1,5 mL) con medio B [Tris-HCl 20 mM (pH
8,0), NaCl 500 mM, glicerol 10% (v/v), β-mercaptoetanol 10 mM, imidazol 20 mM].
La proteína se cargó a continuación en una columna HiTrap Desalting y se eluyó, de
forma similar a la descrita anteriormente, con medio B que contenía β-mercaptoetanol
1 mM y carecía de imidazol. Después de eliminar los primeros 1,5 mL, los 2 mL
siguientes de proteína purificada sin poli(His)6 se concentraron en dispositivos
Materiales y Métodos
- 62 -
Vivaspin hasta un volumen de 500 µL. El proceso de purificación de las proteínas
recombinantes LjPCS1 y AtPCS1 se esquematiza en la Figura 3.1.
Los diferentes pasos de purificación de las proteínas recombinantes fueron
verificados mediante la tinción de geles desnaturalizantes de poliacrilamida y análisis
western (ver 3.10), utilizando en este último caso anticuerpos monoclonales
específicos para poli(His)6. Las proteínas separadas por electroforesis se visualizaron
tiñiendo los geles con Coomassie Brilliant Blue R-250 0,05% (p/v; Sigma-Aldrich),
etanol 40% y ácido acético 10% durante ≈ 1 h, y se destiñieron con etanol 40% y ácido
acético 10% durante 1-2 h hasta alcanzar la intensidad de las bandas deseada.
3.10. Análisis western
Las proteínas sometidas a análisis western se separaron por electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida de 0,75 mm de espesor con el sistema de
electroforesis vertical Miniprotean III (Bio-Rad). Se usaron distintos porcentajes de
poliacrilamida en el gel separador, dependiendo de la masa molecular de la proteína
analizada (ver Tabla 3.14). La composición de los medios y la proporción de reactivos
usada para la preparación de los geles se indica en la Tabla 3.13. En todos los casos, la
concentración de poliacrilamida del gel concentrador fue del 4,6%.
El medio de extracción para muestras vegetales que se utilizó para los análisis
western consistió en KPi 50 mM (pH 7,4), EDTA 0,1 mM y Triton X-100 0,1% (v/v).
La cantidad de cada proteína cargada en el gel se especifica en la sección de
“Resultados”. Los análisis western realizados con muestras vegetales a las que se
añadieron inhibidores de proteasas (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail,
Roche) se indicarán en la sección correspondiente.
Materiales y Métodos
- 63 -
Figura 3.1. Esquema de la purificación de LjPCS1 y AtPCS1 recombinantes expresadas en E. coli. Ver el texto para consultar la composición de los medios A y B.
Eppendorf conteniendo el sedimento seco de bacterias
Sonicar 6 × 30 s
Centrifugar 15000g15 min 4ºC
Eluir con medio A con imidazol 250 mM
Resuspender en 1 mLde medio A
Descartar los primeros 0,5 mL
Recoger los siguientes 1,5 mL
Eluir con medio A con β-mercaptoetanol 1 mMy sin imidazol
Descartar los primeros 1,5 mL
Recoger los siguientes 2 mL
Concentrar hasta 500 µL
Proteína purificada con poli(His)
Añadir Ca2+
hasta 2,5 mMIncubar con 2 U de trombina conjugada con biotina durante 16 h a 20ºC
Eliminar la trombina con resina de estreptavidina
Añadir β-mercaptoetanolhasta 2 mM
Eluir con medio B
Recoger los primeros 1,5 mL
Eluir con medio B con β-mercaptoetanol 1 mMy sin imidazol
Descartar los primeros 1,5 mL
Recoger los siguientes 2 mL
Concentrar hasta 500 µL
Proteína purificada sin poli(His)
Se quedan retenidas las
colas de poli(His)6
“HisTrapChelating”
“HiTrapDesalting”
Eppendorf conteniendo el sedimento seco de bacterias
Sonicar 6 × 30 s
Centrifugar 15000g15 min 4ºC
Eluir con medio A con imidazol 250 mM
Resuspender en 1 mLde medio A
Descartar los primeros 0,5 mL
Recoger los siguientes 1,5 mL
Eluir con medio A con β-mercaptoetanol 1 mMy sin imidazol
Descartar los primeros 1,5 mL
Recoger los siguientes 2 mL
Concentrar hasta 500 µL
Proteína purificada con poli(His)
Añadir Ca2+
hasta 2,5 mMIncubar con 2 U de trombina conjugada con biotina durante 16 h a 20ºC
Eliminar la trombina con resina de estreptavidina
Añadir β-mercaptoetanolhasta 2 mM
Eluir con medio B
Recoger los primeros 1,5 mL
Eluir con medio B con β-mercaptoetanol 1 mMy sin imidazol
Descartar los primeros 1,5 mL
Recoger los siguientes 2 mL
Concentrar hasta 500 µL
Proteína purificada sin poli(His)
Se quedan retenidas las
colas de poli(His)6
“HisTrapChelating”
“HiTrapDesalting”
Materiales y Métodos
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Gel concentrador a Gel separador a Reactivo 4,6% 10% 15%
H2O 3,0 mL 3,75 mL 2,62 mLTris-HCl 1,5 M (pH 8,8), SDS 0,4% (p/v) − 3,0 mL 3,0 mLTris-HCl 0,5 M (pH 6,8), SDS 0,4% (p/v) 1,425 mL − − Acrilamida/Bis-acrilamida (40% T, 3% C) b 0,575 mL 2,25 mL 3,38 mL
Persulfato de amonio 10% (p/v) 30 µL 60 µL 60 µLN,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina 6 µL 12 µL 12 µL
a Volúmenes calculados para la preparación de dos geles. Los volúmenes de mezcla añadidos por cada gel fueron de 3,45 mL para el gel separador y de 1,0 mL de gel concentrador.
b T: concentración total de monómero. T = [(g acrilamida + g bis-acrilamida) ÷ Volumen total] × 100
C: proporción de bis-acrilamida. C = [g bis-acrilamida ÷ (g acrilamida + g bis-acrilamida)] × 100
Proteína Poliacrilamida Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º
γECS 10% PvECS 1:1000
Anti-conejo / Peroxidasa 1:20000
DR 15% AtDR 1:2500
Anti-cobaya / Peroxidasa 1:5000
Anti-poli(His)6 1:3000
Anti-ratón / Fosfatasa alcalina 1:20000
PCS 10%
LjPCS1 1:1000
Anti-conejo / Peroxidasa 1:20000
Las muestras se mezclaron con tampón concentrado [Tris-HCl 62,5 mM (pH
6,8), glicerol 10% (v/v), SDS 2,3% (p/v), azul de bromofenol 0,1% (p/v) y β-
mercaptoetanol 5% (v/v; añadido justo antes de preparar las muestras)] en una
proporción 4:1 (muestra:tampón) y se hirvieron durante 10 min, tras los cuales se
introdujeron inmediatamente en hielo para evitar la renaturalización de las proteínas.
La composición del tampón de electroforesis fue Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), Gly 192
Tabla 3.13. Composición de los geles empleados en SDS-PAGE.
Tabla 3.14. Porcentaje de acrilamida en los geles y diluciones de los anticuerpos primarios y secundarios empleados para los análisis western.
Materiales y Métodos
- 65 -
mM y SDS 1% (p/v). Se emplearon marcadores de masa molecular preteñidos
Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range (Bio-Rad) para controlar el progreso
de la electroforesis y la subsiguiente electrotransferencia.
Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Pall Corporation) en
frío durante 75 min a 100 V en un tampón Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), Gly 192 mM y
metanol 20% (v/v). La membrana se tiñó con Ponceau S (Sigma-Aldrich) para
comprobar la correcta transferencia de las proteínas y, a continuación, se bloqueó
durante la noche en leche desnatada 5 % (p/v) en medio TBS [Tris-HCl 20 mM (pH
7,5), NaCl 500 mM]. Tras el bloqueo de la membrana, ésta se aclaró durante 5 min con
medio TTBS [medio TBS con Tween 0,05% (v/v; Sigma-Aldrich)]. Las diluciones de
los anticuerpos primarios (Tabla 3.14) se realizaron en este tampón y las membranas
se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador orbital Polymax 2040
(Heidolph, Schwabach, Alemania). Posteriormente, se realizó una serie de tres lavados
de 10 min con TTBS. Las diluciones de los anticuerpos secundarios (Tabla 3.14) se
prepararon en TTBS con leche desnatada 5% para disminuir la señal inespecífica de
fondo. La membrana se incubó con los correspondientes anticuerpos secundarios
durante 1 h a temperatura ambiente con agitación, y después la membrana se lavó tres
veces durante 1 h en total.
El anticuerpo primario de la γECS se generó frente a la γECS de judía
recombinante expresada en el plásmido pMAL-c2 (New England Biolabs, Ipswich,
EEUU). El plásmido pMAL-c2 da lugar a una proteína de fusión entre la proteína de
unión a maltosa y la proteína expresada, lo que ayuda a aumentar su solubilidad. Por
otra parte, el anticuerpo primario de la PCS se produjo frente a la PCS1 de Lotus
expresada en el plásmido pET28a(+). En todos los casos, las proteínas se purificaron
mediante cromatografía de afinidad por metal inmovilizado utilizando columnas de
Ni2+, se liofilizaron y se enviaron a un servicio especializado (Biogenes, Berlín,
Alemania) para producir un anticuerpo policlonal monoespecífico. Se requirieron 6-7
mg de proteína para inmunizar dos conejos y preparar una columna de afinidad para
purificar las IgGs específicas a partir de los antisueros. El anticuerpo primario
monoclonal “anti-polyhistidine clone His-1” es un anticuerpo monoclonal
monoespecífico de Sigma-Aldrich que reconoce la poli(His)6. El anticuerpo que
Materiales y Métodos
- 66 -
reconoce la DR se produjo en cobaya frente a una DR citosólica recombinante de
Arabidopsis y fue cedido amablemente por el Dr. K. Tanaka (Universidad de Tottori,
Japón).
Para la detección de las bandas se utilizaron dos métodos, dependiendo de la
molécula conjugada al anticuerpo secundario. En el caso del anticuerpo secundario
conjugado con fosfatasa alcalina [anti-mouse IgG (whole molecule) alkaline
phosphatase conjugate; Sigma-Aldrich] se utilizó el método de detección BCIP/NBT
Blue Liquid Substrate for Membranes (Sigma-Aldrich). El revelado se realizó
incubando la membrana en este reactivo durante 5 min a temperatura ambiente y
oscuridad, hasta obtener la intensidad de señal deseada. La reacción se detuvo
sumergiendo la membrana en agua. En el caso del anticuerpo secundario conjugado
con la peroxidasa de rábano [anti-rabbit IgG (whole molecule) peroxidase conjugate;
Sigma-Aldrich], la detección de las bandas se realizó incubando con el reactivo
Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) durante 5 min a
temperatura ambiente, según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la
membrana se expuso en un cuarto oscuro a una película de fotografía (CL-XPosure
Blue X-ray Film; Pierce). El revelado de las películas se realizó en un baño de
revelador T-Max Professional (Kodak, Rochester, EEUU) durante 4-5 min, seguido de
un baño de paro (agua destilada) y otro baño de fijador Polymax (Kodak) durante 2-3
min. Todas las películas se digitalizaron usando un escáner EPSON Perfection 4870
(Seiko-EPSON, Nagano, Japón) y, en su caso, el análisis de las intensidades de las
bandas mediante densitometrías se realizó con el software ImageJ, como se ha descrito
anteriormente (ver 3.5.3).
3.11. Actividades enzimáticas
La composición de los medios de extracción utilizados para la determinación de las
actividades enzimáticas se encuentra detallada en la Tabla 3.15. Todos los extractos se
centrifugaron a 15000g durante 15 min a 4ºC y se utilizó el sobrenadante para la
medida de actividad (a no ser que se especifique lo contrario). Los reactivos utilizados,
Materiales y Métodos
- 67 -
sus concentraciones y el protocolo para determinar la actividad se especifican a
continuación para cada caso concreto. Todas las actividades enzimáticas se
determinaron a 25ºC (a no ser que se especifique lo contrario) en la región de
linealidad. En todos los casos se incluyó un control negativo ensayando la
correspondiente actividad en un extracto hervido durante 15 min e introducido
inmediatamente en hielo.
Enzima Medio de extracción Extracto a
GalLDH Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) Triton X-100 0,15% (v/v)
50 mg + 250 μL
AO NaPi 10 mM (pH 6,5) 50 mg + 500 μL
APX total KPi 50 mM (pH 7,0) PVP-10 0,5% (p/v) ASC 5 mM b
50 mg + 500 μL
GR, MR y DR KPi 50 mM (pH 7,8) PVP-10 1% (p/v) EDTA 0,2 mM β-mercaptoetanol 100 mM b
100 mg + 1 mL
SAT y OASTL KPi 50 mM (pH 7,8) EDTA 1 mM Piridoxal fosfato 20 µM b DTE 1 mM b
50 mg + 100 μL
γECS y (h)GSHS Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) EDTA 0,2 mM MgCl2 10 mM Glicerol 10% (v/v)
50 mg + 500 μL
PCS recombinante Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) NaCl 50 mM β-mercaptoetanol 10 mM b
ver 3.8 y 3.9
PCS de plantas Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) NaCl 50 mM Glicerol 10% (v/v) β-mercaptoetanol 10 mM b
500 mg + 1,25 mL
a Proporción entre el peso fresco de material vegetal (hojas, raíces o nódulos) y el volumen de medio de extracción.
b Reactivos preparados inmediatamente antes de la extracción.
Tabla 3.15. Medios de extracción para la determinación de actividades enzimáticas.
Materiales y Métodos
- 68 -
3.11.1. Enzimas del metabolismo del ascorbato
L-Galactono-1,4-lactona deshidrogenasa (GalLDH)
La actividad GalLDH se determinó siguiendo el descenso de A550 debido a la
reducción del citocromo c (Bartoli y cols, 2000). El medio de ensayo contenía 500 µL
de Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), 15 µL de Triton X-100 10% (v/v), 191 µL de H2O, 100
µL de extracto y 9 µL de KCN 1 mM. Tras incubar durante 5 min a temperatura
ambiente, se añadieron 85 µL de L-GalL 50 mM y 100 µL de citocromo c 0,6 mM para
iniciar la reacción. Ésta se midió durante 5 min y se utilizó un ε550 = 21 mM-1 cm-1 para
el citocromo c. Los valores obtenidos se corrigieron con un blanco general, en el que
se añadió medio de extracción en lugar de extracto, y con un blanco para cada muestra
que no contenía L-GalL, ajustándose el volumen añadido de Tris-HCl 100 mM (pH
8,0) hasta un volumen final de 1 mL.
En el caso de la actividad GalLDH de mitocondrias purificadas de nódulos,
éstas se resuspendieron en 500 µL de medio de extracción para GalLDH (ver 3.4). La
suspensión de mitocondrias se dejó en hielo durante 2 h para asegurar su completa
ruptura, el lisado se centrifugó a 15000g durante 15 min a 4ºC y 100 µL del
sobrenadante se utilizaron para el ensayo como se ha descrito anteriormente.
Ascorbato oxidasa (AO)
La actividad AO se determinó siguiendo el descenso de A265 debido a la oxidación del
ASC (Pignocchi y cols, 2003). El medio de ensayo contenía 750 µL de NaPi 10 mM
(pH 5,6), 100 µL de EDTA 5 mM, 50 µL de extracto y 100 µL de ASC 1 mM. La
reacción se midió durante 3 min y se empleó un ε265 = 14,1 mM-1 cm-1 para el ASC.
Los valores obtenidos se corrigieron con un blanco general, en el que se añadió medio
de extracción en lugar de extracto y, además, un blanco para cada muestra que carecía
de ASC, ajustándose el volumen añadido de NaPi 10 mM (pH 6,5) hasta un volumen
final de 1 mL.
Puesto que la AO es una enzima apoplástica que se encuentra unida a la pared
celular mediante fuerzas iónicas, el precipitado resultante después de realizar el
extracto se resuspendió en un volumen de [NaPi 10 mM (pH 6,5), NaCl 1 M] igual que
el volumen de medio de extracción utilizado para extraer la AO (ver Tabla 3.15). La
Materiales y Métodos
- 69 -
suspensión se mantuvo en hielo durante 10 min (agitando con “vórtex” cada 2 min) y
se volvió a centrifugar como antes. El sobrenadante resultante se utilizó para el ensayo
de la actividad AO.
3.11.2. Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión Ascorbato peroxidasa (APX)
La actividad APX total se determinó siguiendo el descenso de A290 debido a la
oxidación del ASC (Asada, 1984). El medio de ensayo contenía 890 µL de KPi 50 mM
(pH 7,0), 25 µL de ASC 20 mM, 25 µL de extracto y 60 µL de H2O2 8,3 mM. La
reacción se midió durante 2 min, tomando los tiempos entre 30 y 150 s, ya que se
observó una fase de latencia de la enzima en los instantes iniciales de la reacción. Se
utilizó un ε290 = 2,8 mM-1 cm-1 para el ASC. Los valores obtenidos se corrigieron con
un blanco general, en el que se añadió medio de extracción en lugar de extracto, y
también con un blanco para cada muestra que carecía de H2O2, ajustándose el volumen
añadido de KPi 50 mM (pH 7,0) hasta un volumen final de 1 mL. La actividad APX
citosólica (APXc) se determinó de la misma forma que la actividad APX total
omitiendo el ASC en el medio de extracción (ver Tabla 3.15).
Glutatión reductasa (GR)
La actividad GR se determinó siguiendo el descenso de A340 debido a la oxidación del
NADPH (Dalton y cols, 1986). El medio de ensayo consistió en 600 µL de Tricina 50
mM (pH 7,8), 100 µL de NADPH 1,25 mM, 100 µL de EDTA 5 mM, 100 µL de
extracto y 100 µL de GSSG 2,5 mM. La concentración de NADPH empleada en el
ensayo se verificó mediante su A340. La reacción se midió durante 3 min y se utilizó un
ε340 = 6,22 mM-1 cm-1 para el NADPH. Los valores obtenidos se corrigieron con un
blanco general, en el que se añadió medio de extracción en lugar de extracto y,
además, con un blanco para cada muestra que no contenía GSSG, ajustándose el
volumen añadido de Tricina 50 mM (pH 7,8) hasta un volumen final de 1 mL.
Materiales y Métodos
- 70 -
Monodeshidroascorbato reductasa (MR)
La actividad MR se determinó siguiendo el descenso de A340 debido a la oxidación del
NADH (Dalton y cols, 1993b). El medio de ensayo consistía en 645 µL de Tris-HCl
50 mM (pH 7,8), 150 µL de NADH 0,667 mM, 125 µL de ASC 5 mM, 30 µL de
extracto y 50 μL de AO 0,01 U μL-1 (Sigma-Aldrich) como enzima generadora del
radical MDHA. La concentración de NADH empleada en el ensayo se verificó
mediante su A340. La reacción se midió durante 90 s y se utilizó un ε340 = 6,22 mM-1
cm-1 para el NADH. Los valores obtenidos se corrigieron con un blanco general, en el
que se añadió medio de extracción en lugar de extracto y, también, con un blanco para
cada muestra que no contenía AO, ajustándose el volumen añadido de Tris-HCl 50
mM (pH 7,8) hasta un volumen final de 1 mL.
Deshidroascorbato reductasa (DR)
La actividad DR se determinó siguiendo el incremento de A265 debido a la producción
de ASC (Nakano y Asada, 1981). El medio de ensayo consistió en 650 µL de KPi 100
mM (pH 7,0), 100 µL de EDTA 1 mM, 100 µL de DHA 2 mM, 50 µL de extracto y
100 µL de GSH 25 mM. La reacción se midió durante 3 min y se empleó un ε265 =
14,1 mM-1 cm-1 para el ASC. Los valores obtenidos se corrigieron con un blanco
general, en el que se añadió medio de extracción en lugar de extracto y, además, con
un blanco para cada muestra que carecía de GSH, ajustándose el volumen añadido de
KPi 100 mM (pH 7,0) hasta un volumen final de 1 mL. El incremento de absorbancia
medido se corrigió multiplicando por un factor de 0,98, ya que el GSSG producido
durante la reacción absorbe ligeramente a 265 nm (≤ 2% del total).
3.11.3. Enzimas de la síntesis de cisteína y (homo)glutatión Serina-acetil transferasa (SAT) y O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL)
Estas dos actividades enzimáticas se determinaron cuantificando la Cys producida,
bien directa (OASTL) o indirectamente (SAT), mediante HPLC con derivatización
poscolumna con DTNB. La actividad OASTL se determinó en un medio de ensayo
que contenía 60 µL de KPi 60 mM (pH 7,5), 20 µL de O-acetilserina 95 mM, 20 µL de
piridoxal fosfato 28 µM, 20 µL de DTE 9,5 mM, 50 µL de extracto y 20 µL de Na2S
Materiales y Métodos
- 71 -
65 mM. La reacción se incubó durante 30 min a 25ºC y se detuvo añadiendo 15 µL de
ácido trifluoroacético (TFA) 2% (v/v) por cada 80 µL de mezcla. Se centrifugó a
15000g durante 10 min a 4ºC y el sobrenadante se filtró. El volumen de inyección para
el análisis por HPLC fue de 50 µL.
El ensayo de actividad SAT consistió en la determinación indirecta de la O-
acetilserina producida mediante su conversión en Cys, tras la reacción de la O-
acetilserina con Na2S catalizada por la OASTL (Figura 3.2). Los reactivos empleados
en la determinación de la actividad SAT fueron 50 µL de KPi 60 mM (pH 7,5), 10 µL
de Ser 60 mM, 10 µL de DTE 15 mM, 10 µL de Na2S 30 mM, 10 µL de piridoxal
fosfato 45 µM, 50 µL de extracto y 10 µL de acetil-CoA 30 mM. La reacción se
incubó durante 30 min a 25ºC y se detuvo añadiendo 15 µL de TFA 2% por cada 80
µL de mezcla de reacción. Se centrifugó a 15000g durante 10 min a 4ºC, el
sobrenadante se filtró y se inyectaron 50 µL para el análisis mediante HPLC.
La Cys producida en ambos casos se separó en dos columnas C18 (4,6 × 250
mm; 5 µm; Mallinckrodt-Baker, Philipsburg, EEUU) conectadas en serie, con un flujo
isocrático de 0,8 mL min-1 de TFA 0,1%. La Cys eluida de la columna se derivatizó
con DTNB 75 µM disuelto en KPi 80 mM (pH 7,8) en un capilar metálico sumergido
en un baño a 50ºC (flujo total: 1,6 mL min-1; tiempo de residencia: 1,56 min). La Cys
derivatizada se detectó por A412 (detector PDA996; Waters) y se identificó por
coelución con Cys estándar (Sigma-Aldrich). Su concentración se determinó utilizando
una recta de calibrado de Cys en el rango de 0-60 nmol. La Cys usada para la recta de
calibrado se cuantificó previamente con DTNB 75 µM en KPi 80 mM (pH 7,8),
utilizando un ε412 = 13,6 mM-1 cm-1 para el DTNB.
Figura 3.2. Síntesis de Cys a partir de Ser catalizada por la acción secuencial de las enzimas SAT y OASTL. O-AcSer, O-acetilserina.
O-AcSerSer
Acetil-CoA
SATCys
OASTL
Na2S
O-AcSerSer
Acetil-CoA
SATCys
OASTL
Na2S
Materiales y Métodos
- 72 -
γ-Glutamilcisteína sintetasa (γECS), glutatión sintetasa (GSHS) y homoglutatión sintetasa (hGSHS)
Las medidas de actividad γECS, GSHS y hGSHS se realizaron siguiendo protocolos
publicados con pequeñas modificaciones (Matamoros y cols, 1999b). Los ensayos se
basan en la separación cromatográfica y detección por fluorescencia de los aductos que
se forman entre el MBB y los correspondientes tioles.
Una vez extraídas las enzimas (ver Tabla 3.15), el sobrenadante se dializó y
concentró por centrifugación con dispositivos Vivaspin hasta un volumen de 250 µL.
El medio de ensayo utilizado para determinar la actividad γECS contenía 60 µL de
tampón [HEPES 500 mM (pH 8,0), MgCl2 250 mM], 15 µL de ATP 100 mM, 15 µL
de fosfoenolpiruvato 100 mM, 15 µL de piruvato kinasa 0,1 U µL-1, 15 µL de DTE 8
mM y 15 µL de Glu 800 mM. Después de incubar durante 5 min a 30ºC, se añadieron
100 µL del extracto dializado y 15 µL de Cys 40 mM. La reacción se dejó proceder
durante 2 h a 30ºC y se detuvo transfiriendo una alícuota a la solución de
derivatización, como se describirá más adelante.
La actividad GSHS se ensayó en un medio que contenía 40 µL de tampón [Tris-
HCl 500 mM (pH 8,5), KCl 250 mM, MgCl2 100 mM], 10 µL de ATP 100 mM, 10 µL
de fosfoenolpiruvato 100 mM, 10 µL de piruvato kinasa 0,1 U µL-1, 10 µL de DTE
100 mM, 10 µL de γEC 10 mM y 10 µL de Gly 100 mM. Después de preincubar la
mezcla durante 5 min a 30ºC, la reacción se inició añadiendo 100 µL de extracto
dializado, se incubó 1 h a 30ºC y se detuvo transfiriendo una alícuota a la solución de
derivatización. La actividad hGSHS se ensayó de la misma forma que la actividad
GSHS, sustituyendo como sustrato la Gly por 10 µL de βAla 100 mM.
La derivatización del γEC, GSH o hGSH sintetizado se realizó con 20 µL de la
correspondiente mezcla de reacción enzimática, a los que se añadieron 30 µL de MBB
7 mM (disuelto en acetonitrilo) y 75 µL de una mezcla de ácido N-[2-hidroxi-
etil]piperacina-N’-3-propanosulfónico (EPPS) 200 mM (pH 8,0) y ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA) 5 mM. La reacción de derivatización tuvo lugar
en oscuridad durante 15 min a 25ºC y se detuvo añadiendo 24 µL de ácido acético
glacial 40%. Las muestras derivatizadas se centrifugaron a 15000g durante 5 min a
4ºC y el sobrenadante se filtró mediante centrifugación empleando los filtros descritos
Materiales y Métodos
- 73 -
con anterioridad. El volumen de inyección para el análisis de las actividades γECS y
hGSHS por HPLC fue de 10 µL.
Los derivados del MBB se separaron en una columna C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm;
(Mallinckrodt-Baker) y se eluyeron con una fase móvil compuesta por metanol 15% y
ácido acético 0,25% (pH a 3,5) con un flujo isocrático de 1 mL min-1. La señal se
midió con un detector de fluorescencia Waters 474 a una longitud de onda de
excitación a 380 nm y de emisión a 480 nm. Se usaron rectas de calibrado en el rango
de 0-0,02 nmol de γEC (para la actividad γECS) y de 0-0,2 nmol de (h)GSH [para la
actividad (h)GSHS] para la cuantificación de los productos formados. Todos los tioles
utilizados para realizar las rectas de calibrado se cuantificaron con DTNB, como se ha
descrito previamente para el caso de la Cys en las actividades SAT y OASTL.
3.11.4. Actividad fitoquelatina sintasa
Actividad PCS recombinante
Las actividades LjPCS1 y AtPCS1 recombinantes se ensayaron según protocolos
optimizados durante la realización de esta Tesis. El ensayo enzimático se basó en la
cuantificación de las (h)PCs sintetizadas mediante HPLC con derivatización
poscolumna con DTNB (ver 3.11.3, actividades SAT y OASTL). La mezcla de
reacción estuvo constituida por Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), β-mercaptoetanol 1 mM,
50 o 500 µM del ion metálico correspondiente, cantidades variables de GSH y/o hGSH
(0-5 mM) y 50 µL de proteína purificada, en un volumen total de 100 µL. La reacción
se detuvo con 15 µL de TFA 5% tras incubar 30 min a 35ºC. El extracto se centrifugó
a 15000g durante 5 min a 4ºC y el sobrenadante se filtró. El volumen de inyección
empleado para el análisis por HPLC fue de 50 µL.
Las (h)PCs producidas se separaron siguiendo protocolos publicados (Grill y
cols, 1987) con algunas modificaciones. Para la separación se emplearon dos columnas
C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm; Mallinckrodt-Baker) conectadas en serie, con un gradiente
lineal (Tabla 3.16) y un flujo de 0,8 mL min-1. Las (h)PCs eluidas de la columna se
derivatizaron con DTNB 75 µM disuelto en KPi 80 mM (pH 7,8) en un capilar
metálico sumergido en un baño a 50ºC, de forma similar a lo descrito para las enzimas
SAT y OASTL (3.11.3). Los tioles derivatizados se detectaron por A412 y se
Materiales y Métodos
- 74 -
identificaron mediante la coelución con estándares de PCs proporcionados por el Dr.
M. Zenk (Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Halle, Alemania), o de hPCs
sintetizados químicamente (Biosyntan, Berlín, Alemania). Se realizó una recta de
calibrado con (h)GSH (0-200 nmol) cuantificado previamente con DTNB (ver 3.11.3,
actividades SAT y OASTL).
La actividad PCS recombinante también fue ensayada (ver 4.4.1) tras dializar la
proteína con Chelex-100 (Bio-Rad) o tras su incubación con mesilato de
desferrioxamina B (DFO; Sigma-Aldrich).
Actividad PCS de plantas
La actividad PCS de extractos vegetales se determinó de la misma manera que la
actividad PCS recombinante con algunas modificaciones. El extracto (ver Tabla 3.15)
se concentró en dispositivos Vivaspin hasta un volumen de 250 µL. En este caso, la
concentración final de CdCl2 en la mezcla de reacción fue de 100 µM y la reacción
tuvo lugar durante 60 min a 35ºC, procediendo a continuación de igual manera a la
descrita para la PCS recombinante. El volumen de inyección para el análisis mediante
HPLC fue de 150 µL.
Tiempo (min) % Fase móvil A a % Fase móvil B b
0 100 0 3 50 50
30 0 100 35 0 100 38 100 0 50 100 0
a TFA 0,1%. b TFA 0,1%, acetonitrilo 20%.
3.12. Determinación de metabolitos
La composición de los medios de extracción utilizados para la determinación de los
metabolitos se indica en la Tabla 3.17.
Tabla 3.16. Condiciones cromatográficas para la separación de (h)PCs.
Materiales y Métodos
- 75 -
Metabolito Medio de extracción Extracto a
ASC total ASC/DHA
HClO4 1 M 200 mg + 500 μL b
Cys, γEC y (h)GSH total
Ácido metanosulfónico 0,2 M DTPA 0,5 mM
50 mg + 500 μL
(h)GSH/(h)GSSG Ácido sulfosalicílico 5% (p/v) 50 mg + 500 μL (h)PCs TFA 0,1% (v/v)
DTPA 0,5 mM 100 mg + 200 μL
a Proporción entre el peso fresco de material vegetal (hojas, raíces o nódulos) y el volumen de medio de extracción.
b Excepto en extractos de hojas, en los que la proporción fue 100 mg + 500 μL.
3.12.1. Contenido de ascorbato y estado redox
El contenido de ASC total (ASC + DHA) se determinó siguiendo el descenso de A265
producido al añadir la enzima AO a la mezcla de reacción (Bartoli y cols, 2000). La
absorbancia se midió hasta el momento de su estabilización (≈ 15 min).
Tras realizar el extracto de nódulos en medio ácido, se neutralizaron 400 µL
con 200 µL de K2CO3 1 M. La mezcla se agitó vigorosamente y se eliminó el
precipitado formado por centrifugación a 15000g durante 5 min a 4ºC. Se utilizaron
250 µL del sobrenadante para la determinación del contenido de ASC total, incubando
el sobrenadante con 13 µL de DTE 8 mM durante 15 min a temperatura ambiente y en
oscuridad. Otros 250 µL del mismo sobrenadante se utilizaron para la determinación
de ASC, de manera similar a la descrita anteriormente pero omitiendo la incubación
con DTE. Los volúmenes de K2CO3 necesarios para neutralizar el extracto en medio
ácido (HClO4) fueron diferentes dependiendo del tejido estudiado, siendo necesaria su
determinación de forma experimental. Así, por ejemplo, para hojas de judía la
proporción fue de 400 µL extracto + 225 µL K2CO3, mientras que para las raíces fue
de 400 µL extracto + 250 µL K2CO3.
Tabla 3.17. Medios de extracción utilizados para la determinación de metabolitos.
Materiales y Métodos
- 76 -
La mezcla de reacción contenía 895 µL de HEPES 100 mM (pH 5,6), 100 µL
de extracto y 5 μL de AO 0,01 U μL-1. Se utilizó un ε265 = 14,1 mM-1 cm-1 para el ASC.
Los valores obtenidos se corrigieron con un blanco general, en el que se añadió medio
de extracción en lugar de extracto, y con un blanco para cada muestra que no contenía
AO, ajustándose el volumen añadido de HEPES 100 mM (pH 5,6) hasta un volumen
final de 1 mL. El estado redox del ASC se definió como el porcentaje de ASC respecto
al contenido de ASC total (ASC + DHA).
3.12.2. Contenido de tioles y estado redox del (homo)glutatión
El contenido de tioles se determinó mediante derivatización con MBB y separación de
los productos fluorescentes por HPLC, empleando las mismas condiciones
cromatográficas que se describen en 3.11.3 [actividades γECS y (h)GSHS]. El extracto
(50 µL) se mezcló con 100 µL de medio de derivatización [EPPS 200 mM (pH 8,0),
DTPA 5 mM], 23 µL de DTE 8 mM y 2 µL de NaOH 5 M. Tras incubar durante 1 h a
25ºC, se añadieron 50 µL de MBB 7 mM y la mezcla se mantuvo durante 15 min a
25ºC en oscuridad. La reacción de derivatización se detuvo con 44 µL de ácido acético
glacial 40%. Las muestras se almacenaron a -80ºC hasta su procesado y, previamente a
su análisis, se centrifugaron durante 5 min a 15000g a 4ºC, se filtraron por
centrifugación y se inyectaron 10 µL para la cuantificación mediante HPLC.
El estado redox del (h)GSH se determinó espectrofotométricamente siguiendo
la formación de (h)GSH a 412 nm durante 3 min, utilizando la enzima GR y la
derivatización con DTNB (Griffith, 1980). Para ello, el contenido de (h)GSH total
[(h)GSH + (h)GSSG] se determinó utilizando un medio de reacción que contenía 25
µL del extracto, 20 µL de GR 10 U mL-1, 100 µL de DTNB 6 mM, NADPH 0,21 mM
y tampón [KPi 150 mM (pH 7,4), EDTA 6,3 mM] en un volumen final de 1 mL. El
NADPH se cuantificó utilizando un ε340 = 6,22 mM-1 cm-1. El contenido de (h)GSSG
se determinó de la misma manera que el total, pero en este caso los grupos tioles libres
se bloquearon con 2-vinilpiridina (Sigma-Aldrich). Así, 90 µL del extracto se
incubaron con 6 µL de 2-vinilpiridina y 10 µL de trietanolamina 50% (v/v) durante 25
min a 25ºC (tras agitar con “vórtex” durante 30 s). Una vez finalizada la
derivatización, se añadieron a la mezcla de reacción 29 µL de extracto derivatizado
Materiales y Métodos
- 77 -
corrigiendo, por tanto, el volumen añadido del tampón. También se hicieron dos
blancos, uno con 25 µL de medio de extracción en lugar de extracto, y otro con 29 µL
de una mezcla de derivatización con medio de extracción en lugar de extracto para
corregir, respectivamente, los valores de (h)GSH total y de (h)GSSG. El contenido de
estos tioles se determinó tras realizar dos rectas de calibrado independientes, una con
(h)GSH (0-4 nmol) y otra con (h)GSSG (0-1 nmol). El estado redox del (h)GSH se
definió como el porcentaje de (h)GSH respecto al contenido de (h)GSH total [(h)GSH
+ (h)GSSG].
3.12.3. Contenido de fitoquelatinas
El contenido de (h)PCs en nódulos, hojas y raíces, a diferencia del resto de tioles, se
determinó mediante HPLC con derivatización poscolumna con DTNB y detección de
los derivados nitrofenilados, utilizando las mismas condiciones que se describen en
3.11.4. El extracto (ver Tabla 3.17) se filtró por centrifugación y se inyectaron 100 µL
para el análisis mediante HPLC.
3.13. Análisis estadístico
En todos los casos se realizaron, al menos, tres réplicas de dos series distintas de
plantas o de cultivos independientes de bacterias. Se utilizó el programa de estadística
SPSS v.14.0 (Chicago, EEUU) para calcular las medias y los errores estándar de las
medias (ES), así como para realizar el análisis de la varianza de un factor y el test de la
mínima diferencia significativa (LSD; “Least Significant Difference”) para P < 0,05.
Resultados
Resultados
- 81 -
4. RESULTADOS
4.1. Metabolismo del ascorbato en nódulos
4.1.1. Biosíntesis
El primero de los objetivos de esta Tesis fue estudiar si el ASC presente en el nódulo
es consecuencia de su síntesis de novo o es importado de otros órganos de la planta,
como las raíces o las hojas. Para ello se utilizaron leguminosas con nódulos de tipo
determinado (Lotus y judía) e indeterminado (alfalfa y guisante).
En primer lugar, se midieron la actividad GalLDH y el contenido de ASC total
(ASC + DHA) en hojas, raíces y nódulos de las cuatro leguminosas (Figura 4.1).
Asimismo, se ensayó la actividad APXc, que constituye ≈ 0,9% de la proteína soluble
total del nódulo (Dalton y cols, 1987). Los resultados demostraron la presencia de
actividad GalLDH en los nódulos de las cuatro especies estudiadas. Además, en todos
los casos la actividad total detectada en los nódulos fue superior a la de las hojas y
raíces de la misma planta (Figura 4.1). Por el contrario, el contenido de ASC total en
los nódulos y raíces resultó ser muy inferior al de las hojas. La actividad APXc de los
nódulos fue 2-5 veces mayor que la de hojas y 10-30 veces superior que la de raíces
(Figura 4.1).
La máxima actividad GalLDH se obtuvo utilizando hojas y raíces frescas, si
bien la actividad en los nódulos se mantuvo tras congelar las muestras a -80ºC. En
cambio, la actividad GalLDH en hojas de guisante y judía y en raíces de Lotus y
alfalfa, cosechadas en N2 líquido y almacenadas a -80ºC durante menos de tres
semanas, disminuyó ≈ 90% respecto a la obtenida cuando se utilizó tejido fresco.
Puesto que la GalLDH es una enzima mitocondrial (Siendones y cols, 1999;
Bartoli y cols, 2000), se ensayó la actividad GalLDH en extractos de mitocondrias
purificadas de nódulos de judía. La actividad obtenida fue de 18,4 ± 3,1 nmoles ASC
min-1 mg-1 (media ± ES de cuatro purificaciones de mitocondrias independientes) y no
Resultados
- 82 -
pudo detectarse cuando se omitió el detergente en el medio de extracción, ni cuando se
sustituyó la L-GalL por D-GalL o por L-GulL, lo que demuestra que la enzima
ensayada en mitocondrias purificadas de judía es una genuina GalLDH y que está
asociada a las membranas mitocondriales.
Figura 4.1. Distribución de la actividad GalLDH, contenido de ASC total y actividad APXc en leguminosas de nódulos indeterminados (alfalfa y guisante) y determinados (judía y Lotus). H, hojas; R, raíces; N, nódulos. Los valores son medias ± ES de 3-8 muestras de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. Las unidades de actividad enzimática y de contenido de ASC total se expresan por gramo de peso fresco.
0,00,51,01,52,02,53,0
0
30
60
90
120
0
5
10
15
20
Alfalfa Guisante Judía Lotus
Act
ivid
ad G
alLD
H(n
mol
min
-1 g
-1)
ASC
tota
l(μ
mol
g-1
)A
ctiv
idad
APX
c(μ
mol
min
-1 g
-1)
H R N H R N H R NH R N
0,00,51,01,52,02,53,0
0
30
60
90
120
0
5
10
15
20
Alfalfa Guisante Judía Lotus
Act
ivid
ad G
alLD
H(n
mol
min
-1 g
-1)
ASC
tota
l(μ
mol
g-1
)A
ctiv
idad
APX
c(μ
mol
min
-1 g
-1)
H R NH R N H R NH R N H R NH R NH R NH R N
Resultados
- 83 -
El siguiente paso fue aislar y caracterizar el gen (o genes) que codifica(n) la
GalLDH de Lotus en colaboración con el grupo del Dr. S. Tabata. Se buscó en una
genoteca TAC (“Transformation Competent Artificial Chromosome”) de Lotus una
secuencia homóloga a una secuencia TC (“Tentative Consensus”) de la GalLDH de M.
truncatula (TC89371) y a una EST (“Expressed Sequence Tag”) de soja (san59d11).
Como resultado, se encontró un clon genómico que codificaba una posible GalLDH de
Lotus (LjT22C22) (Matamoros y cols, 2006). Este gen se encuentra a 44,2 cM en el
cromosoma 5. Asimismo, se sintetizó el cDNA total de raíces de Lotus y se utilizaron
cebadores específicos (ver Tabla 3.12) para aislar por PCR la secuencia del cDNA y
establecer el marco de lectura abierto (ORF; “Open Reading Frame”) del gen
LjGalLDH. Por comparación con la secuencia genómica se determinó la composición
exón-intrón de dicho gen. También se comparó su estructura con la del gen GalLDH
de Arabidopsis y con otras dos posibles secuencias genómicas de arroz (Oryza sativa)
(Figura 4.2). Este análisis mostró que el tamaño de los exones 2 y 5 es idéntico en los
cuatro genes analizados y que los tamaños de los exones 1, 3, 4 y 6 son muy similares.
No obstante, LjGalLDH muestra dos diferencias significativas con respecto a los otros
genes. Primero, contiene un intrón adicional de 87 pb (intrón 6) en la región 3’-UTR y,
segundo, los intrones 2 y 3 son mucho más largos.
Figura 4.2. Comparación de los genes GalLDH de Lotus (LjGalLDH), Arabidopsis (AtGalLDH, locus At3g47930) y arroz (OsGalLDH1, locus Os11g04740; y OsGalLDH2, locus Os12g04520). Las longitudes de los exones (ORFs, en negro; UTRs, en gris) e intrones (en blanco) se indican en pb y se han dibujado a escala, excepto los intrones 2 y 3 de LjGalLDH.
675 141 159186 421251
133 282 92 339 248
19456AtGalLDH
606 141 168183 403251
998 113 164 757 261
35435OsGalLDH1
606 141 168183 403251
1012 113 165 778 230OsGalLDH2
LjGalLDH596 1924 873108326 640
7141 159186 421672 346251
675 141 159186 421251
133 282 92 339 248
19456AtGalLDH
675 141 159186 421251
133 282 92 339 248
19456 675 141 159186 421251
133 282 92 339 248
19456AtGalLDH
606 141 168183 403251
998 113 164 757 261
35435OsGalLDH1
606 141 168183 403251
998 113 164 757 261
35435 606 141 168183 403251
998 113 164 757 261
35435OsGalLDH1
606 141 168183 403251
1012 113 165 778 230OsGalLDH2
606 141 168183 403251
1012 113 165 778 230
606 141 168183 403251
1012 113 165 778 230OsGalLDH2
LjGalLDH596 1924 873108326 640
7141 159186 421672 346251LjGalLDH
596 1924 873108326 640
7141 159186 421672 346251
596 1924 873108326 640
7141 159186 421672 346251
Resultados
- 84 -
A continuación, se cuantificaron los mRNAs de los genes que codifican algunas
de las enzimas que intervienen en la ruta principal de síntesis de ASC (GMP, GME,
GalDH y GalLDH) en hojas, raíces y nódulos de Lotus. Se utilizó la secuencia del
exón 1 del gen LjGalLDH y secuencias TC de los otros genes para diseñar cebadores
específicos para el análisis qRT-PCR (ver Tabla 3.11). Los resultados demostraron
que los cuatro genes analizados son expresados en hojas, raíces y nódulos (Figura
4.3), siendo sus niveles de mRNA variables dependiendo del gen y del órgano de la
planta.
Asimismo, se localizó el mRNA de GalLDH en nódulos de alfalfa (Figura 4.4)
y Lotus (Figura 4.5) mediante hibridación in situ con fluorescencia y microscopía
confocal. También se determinó la correspondiente actividad GalLDH y el contenido
de ASC total en las distintas zonas de nódulos diseccionados de alfalfa y judía (Figura
4.6).
Figura 4.3. Expresión de cuatro genes implicados en la ruta Smirnoff-Wheeler de biosíntesis de ASC en Lotus. Los niveles de mRNAs de GMP, GME, GalDH y GalLDH se cuantificaron en hojas, raíces y nódulos mediante qRT-PCR. Los valores de hojas (H) y nódulos (N) fueron expresados de forma relativa a las raíces de las mismas plantas, a las que se les dio un valor arbitrario de 1. Los valores representados son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series de plantas crecidas independientemente.
0
1
2
3
4
5GMP GME GalDH GalLDH
Niv
el d
e m
RN
A(re
lativ
o a
raíc
es)
H N H N H N H N0
1
2
3
4
5GMP GME GalDH GalLDH
Niv
el d
e m
RN
A(re
lativ
o a
raíc
es)
H NH N H NH N H NH N H NH N
Resultados
- 85 -
Figura 4.4. Localización del mRNA de GalLDH en nódulos de alfalfa. A, Imagen DIC de una sección longitudinal de un nódulo. B, Tinción DAPI de los núcleos (azul) en la misma sección que A. Puede observarse la gran densidad de núcleos en la zona meristemática (zona I, flecha azul) y de invasión (zona II, flecha amarilla). C, La misma sección que A incubada con una sonda antisentido para GalLDH (fluorescencia verde). Puede observarse que la zona infectada (zona III, flecha roja) tiene una señal mucho más intensa que las zonas I (flecha azul) y II (flecha amarilla). D, Combinación de imágenes de las señales FISH y DAPI. E, Aumento de la zona infectada del nódulo, mostrando un solapamiento de imágenes FISH y DAPI. El transcrito de GalLDH (señal verde) se observa fundamentalmente en el citoplasma de las células infectadas. F, Solapamiento de señales FISH y DAPI en una sección longitudinal del nódulo hibridado con una sonda sentido (control). Puede observarse la casi total ausencia de fluorescencia verde y la tinción intensa de los núcleos en el meristemo (zona I, flecha azul). Barras = 300 μm en A-D y F; 75 μm en E.
BA
C D
E F
BA
C D
E F
Resultados
- 86 -
Figura 4.5. Localización del mRNA de GalLDH en nódulos de Lotus. A, Imagen DIC mostrando los tejidos periféricos y la zona infectada de un nódulo. Puede observarse la forma poligonal de las células infectadas. B, Los núcleos de las células infectadas (flechas rojas) son más grandes que los de las células corticales (flecha amarilla) y se localizan hacia el centro de las células. C, Señal FISH en la misma sección que A con una sonda antisentido para GalLDH. La señal de fluorescencia verde se localiza mayoritariamente en las células infectadas. Nótese también la señal verde brillante de autofluorescencia de las paredes celulares en las capas de células periféricas adyacentes a las células infectadas (flechas blancas). La autofluorescencia puede ser distinguida fácilmente de la señal de fluorescencia FISH (flechas rojas) en el citosol de las células infectadas. D, Combinación de señales FISH y DAPI. E, Señal FISH de la zona central infectada de los nódulos (flechas rojas). F, Combinación de señales FISH y DAPI. Puede observarse la señal de los núcleos en las células corticales (flecha amarilla), que muestra una señal de fluorescencia baja comparada con la de las células infectadas (flechas rojas). G, Vista general con menor aumento de un nódulo después de la tinción DAPI. H, Señal FISH de una sección del nódulo incubada con una sonda sentido (control) para GalLDH. Obsérvese la casi total ausencia de fluorescencia verde. Barras = 75 μm en A-D; 300 μm en E-H.
A B
C D
E F
G H
A B
C D
E F
G H
Resultados
- 87 -
La expresión diferencial de GalLDH a lo largo de las distintas zonas del nódulo
indeterminado de alfalfa fue evidente en las imágenes tomadas, donde puede
observarse la fluorescencia verde (correspondiente al mRNA) y azul (correspondiente
a la tinción DAPI) (Figura 4.4 C y D). La zona central infectada (zona III) mostró una
señal verde muy intensa, reflejando una expresión elevada de GalLDH en esa zona,
mientras que en el ápice del nódulo (zonas I+II) se observó una señal más débil
(Figura 4.4 C). Las células infectadas, de forma poligonal con el núcleo situado en
posición central, exhibieron una señal fluorescente intensa en el citoplasma (Figura
4.4 E). En los nódulos determinados de Lotus, la señal fluorescente, al igual que en los
nódulos de alfalfa, fue más intensa en la zona infectada (zona central) que en los
tejidos periféricos (Figura 4.5 C y E). Los controles, en los que las secciones
nodulares se hibridaron con una sonda sentido y los núcleos se tiñeron con DAPI, no
mostraron señal fluorescente verde (Figuras 4.4 F y 4.5 H). Para la descripción
Figura 4.6. Distribución de la actividad GalLDH y del contenido de ASC total en los diferentes tejidos de nódulos de alfalfa y judía. Ambos parámetros fueron medidos en las zonas I+II (meristemo + invasión), III (infectada) y IV (senescente) de los nódulos de alfalfa, y en los tejidos periféricos (P) y zona infectada (I) de los nódulos de judía (ver Figura 1.1 B). Se hizo un extracto de nódulos enteros (N) como control de la recuperación de la actividad GalLDH y del contenido de ASC total. Los valores son medias ± ES de 3-5 muestras de nódulos de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. La actividad GalLDH y el contenido de ASC total están expresados por gramo de peso fresco.
0
0,2
0,4
0,6
0
30
60
90
120
Act
ivid
ad G
alLD
H(n
mol
min
-1g-
1 )A
SC to
tal
(μm
olg-
1 )
I+II III IV N P I N
Alfalfa Judía
0
0,2
0,4
0,6
0
30
60
90
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Act
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H(n
mol
min
-1g-
1 )A
SC to
tal
(μm
olg-
1 )
I+II III IV N P I N
Alfalfa Judía
Resultados
- 88 -
histológica de los nódulos se siguió la terminología de Vasse y cols (1990) y Hirsch
(1992) (ver Figura 1.1 B).
Los estudios de disección de nódulos de alfalfa y judía mostraron una
correlación significativa (r2 = 0,91; n = 5) entre la actividad GalLDH y el contenido de
ASC total en las distintas zonas de los dos tipos de nódulos (Figura 4.6). Los valores
más altos de actividad y contenido de ASC total se encontraron en la zona infectada
(zona III de alfalfa y zona central de judía) de los nódulos. El ápice (zona I+II) de los
nódulos de alfalfa y los tejidos periféricos de los nódulos de judía mostraron niveles
moderados o altos de actividad y de ASC total (65-90%) respecto a la zona infectada,
mientras que la zona senescente (zona IV) de los nódulos de alfalfa mostró valores
mucho más bajos (30-55%) que los de la zona infectada.
4.1.2. Estrés oxidativo y senescencia natural
Para determinar si el metabolismo y el contenido de ASC y de tioles se encuentran
regulados en condiciones de estrés o durante la senescencia natural de los nódulos, se
escogieron plantas de judía debido a la gran cantidad de nódulos que producen y a la
relativa facilidad para aislar mitocondrias (ver 3.4). Estas plantas fueron expuestas a
estrés abiótico (NaCl o CdCl2), a estrés oxidativo (H2O2) o a una hormona relacionada
con la señalización del estrés (JA). Para el estudio de la senescencia natural de los
nódulos, se mantuvieron las plantas de judía en condiciones normales de crecimiento
hasta los 50-53 d. En primer lugar, se estimó el efecto que tuvieron los tratamientos y
la edad sobre la actividad nodular, así como el estrés oxidativo causado en lípidos y
proteínas.
Los contenidos de Lb y de proteína soluble total se determinaron
espectrofotométricamente como marcadores de la actividad nodular. Los nódulos
tratados con NaCl o CdCl2 mostraron un descenso del 35-40% en el contenido de Lb,
mientras que los nódulos tratados con H2O2 o JA presentaron valores similares a los
nódulos control (Figura 4.7). La proteína soluble total sólo disminuyó
significativamente en el tratamiento con NaCl (Figura 4.7).
Resultados
- 89 -
Los nódulos senescentes se clasificaron en dos poblaciones, denominadas S1 y
S2, de acuerdo al contenido de Lb y de proteína soluble total (Figura 4.7) y a
características visuales (Figura 4.8). Los nódulos S1 eran rosados y tenían una
estructura interna claramente organizada en la que se distinguían la zona infectada y
los tejidos periféricos; por el contrario, los nódulos S2 mostraron un color marrón-
verdoso y su interior presentó una clara desorganización estructural y características
propias de los nódulos senescentes (Figura 4.8). El tamaño de los dos tipos de nódulos
fue similar, mientras que su proporción en la planta resultó ser muy variable. El
contenido de Lb disminuyó significativamente en las dos poblaciones de nódulos
senescentes. Los nódulos S1 contuvieron ≈ 50% de Lb y ≈ 70% de proteína soluble
respecto a los nódulos jóvenes, mientras que los nódulos S2 presentaron tan sólo un
5% de Lb y un 25% de proteína soluble total (Figura 4.7).
Figura 4.7. Marcadores de senescencia (contenido de Lb y de proteína soluble total) y de estrés oxidativo [contenido de (TBA)2-MDA para la peroxidación de lípidos y de grupos carbonilo para la oxidación de proteínas] en nódulos de judía. Los valores son medias ± ES de 5-6 muestras de nódulos de al menos dos series de plantas distintas. El contenido de Lb, proteína soluble y (TBA)2-MDA está expresado por gramo de peso fresco y la oxidación proteica se expresa como porcentaje respecto a los nódulos control, a los que se les dio el valor arbitrario de 100%. En este caso, se consideraron diferencias significativas porcentajes de oxidación proteica mayores que 150% o menores que 50%. Para el análisis estadístico del contenido de Lb, proteína soluble total y (TBA)2-MDA se realizó un test LSD (P < 0,05), señalando las diferencias significativas con un asterisco.
0
3
6
9
12
0
120
240
360
480
Lb(m
g g-
1 )
Prot
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sol
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(mg
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lativ
o al
con
trol)
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
0,0
0,6
1,2
1,8
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*
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**
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
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**
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
* *
*
*
**
*
Resultados
- 90 -
El daño oxidativo en los nódulos de judía se estimó determinando la
acumulación de peróxidos de lípidos y de proteínas oxidadas (ver 3.5). El contenido de
MDA se incrementó significativamente en respuesta a los tratamientos con CdCl2,
H2O2 o JA, pero permaneció inalterado en el tratamiento con NaCl (Figura 4.7). El
porcentaje de proteínas oxidadas relativo a los controles fue significativamente mayor
en los nódulos de las plantas tratadas con H2O2, se mantuvo en niveles constantes con
CdCl2 o JA y, disminuyó tras el tratamiento con NaCl (Figura 4.7).
Los niveles de MDA y proteínas oxidadas aumentaron en los nódulos
senescentes, excepto los de peróxidos de lípidos en los nódulos S2, que no resultaron
afectados (Figura 4.7). La oxidación de proteínas fue 2-3,5 veces mayor en los
nódulos S1 y S2 que en los nódulos control.
4.1.3. Metabolismo del ascorbato en condiciones de estrés
En primer lugar, se analizó la expresión de cinco genes (GMP, GME, GalPP, GalDH y
GalLDH) implicados en la ruta principal de biosíntesis de ASC en las plantas. Se
Figura 4.8. Fotografía de los nódulos de una planta de judía de 53 d de edad. Pueden diferenciarse visualmente dos poblaciones (S1 y S2) de nódulos (ver texto). También se muestra una fotografía de una sección transversal de cada tipo de nódulo.
Nódulos S1Nódulos S2
Nódulos S1Nódulos S2
Resultados
- 91 -
emplearon cebadores específicos para los genes de judía (Tabla 3.10) y, al igual que
en Lotus, se pudo detectar la expresión de todos ellos en nódulos de judía (Figura
4.9). En general, la expresión de estos genes disminuyó más del 50% en los nódulos de
las plantas tratadas con CdCl2 100 μM con relación a los controles (excepto GalPP).
Por el contrario, la abundancia relativa de los transcritos de los cinco genes no varió
significativamente en los nódulos tratados con NaCl, H2O2 o JA, salvo en el caso de
GalLDH, cuyo nivel de mRNA disminuyó con H2O2 y aumentó con JA (Figura 4.9).
En cuanto a la actividad GalLDH, tan sólo se pudo observar un descenso del
37% en nódulos tratados con NaCl respecto a los nódulos control. No se observaron
diferencias significativas en la actividad para el resto de tratamientos (Figura 4.10).
Con el objetivo de establecer la posible contribución al contenido de ASC de rutas
alternativas independientes de GalLDH, se ensayaron las actividades enzimáticas D-
galacturonato reductasa (Agius y cols, 2003) y L-gulono-1,4-lactona oxidasa/
deshidrogenasa (Ôba y cols, 1994; Ching y cols, 2003) en extractos de nódulos. Sin
embargo, ninguna de estas dos actividades fue detectada bajo nuestras condiciones
experimentales. El contenido de ASC total (ASC + DHA) aumentó de forma
significativa únicamente en los nódulos sometidos al tratamiento con H2O2 (Figura
4.10), permaneciendo en niveles similares a los controles para el resto de estreses.
El estado redox del ASC, definido como el porcentaje de ASC respecto del
ASC total (3.12.1), sólo disminuyó significativamente en nódulos tratados con JA
(Figura 4.10). Por otra parte, es interesante señalar que dicho porcentaje fue mucho
mayor en nódulos de judía control de tres semanas de edad (85,4%) que los valores
publicados previamente en nódulos de guisante (≈ 30%) (Groten y cols, 2005), pero
similar a los datos publicados recientemente en nódulos de alfalfa (Naya y cols, 2007).
Curiosamente, se pudo observar que los nódulos que no fueron sumergidos
inmediatamente en N2 líquido después de cosecharlos sufrieron un rápido descenso en
el estado redox del ASC. Así, se observó que en nódulos control recién cosechados y
que se mantuvieron 10 min en hielo, el estado redox del ASC descendió del 85,4% al
45,7%. El efecto fue incluso mayor en hojas de las mismas plantas, ya que, después de
5 min en hielo, casi todo el ASC se encontró en la forma oxidada.
Resultados
- 92 -
Figura 4.9. Análisis de la expresión de cinco genes de la ruta Smirnoff-Wheeler de biosíntesis de ASC (GMP, GME, GalPP, GalDH y GalLDH) en nódulos de judía sometidos a estreses y durante el envejecimiento mediante qRT-PCR. Los niveles de mRNA están relativizados frente al nivel de expresión obtenido en los nódulos control (nódulos tratados con DMSO diluido para el caso del JA), a los que se les dio el valor arbitrario de 1. Los valores son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. Los asteriscos representan aumentos o descensos de más de dos veces en los niveles de mRNA en los tratamientos respecto a los controles.
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
0.0
0.6
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1.8
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H2O2NaCl Cd JA S1 S2
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*
*
*
*
*
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* *
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* *
*
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0,0
Resultados
- 93 -
Como continuación del estudio sobre el metabolismo del ASC en nódulos, se
analizó la expresión génica y la actividad de la enzima AO (que interviene entre otros
procesos en la oxidación del ASC) en las plantas sometidas a los tratamientos
anteriores (Figura 4.11). En primer lugar, se observó que la actividad AO se encuentra
en la fracción insoluble (≈ 90% de la actividad AO total). Esto es algo lógico teniendo
en cuenta que la AO es una enzima que se encuentra exclusivamente en el apoplasto,
unida iónicamente a la pared celular. Así, cuando se aumentó la fuerza iónica del
medio de extracción utilizando NaPi 100 mM en vez de 10 mM (ver 3.11.1 y Tabla
3.15), el porcentaje de AO soluble aumentó del 10% al 20% de la actividad AO total.
Figura 4.10. Actividad GalLDH, contenido de ASC total y porcentaje de ASC en nódulos de judía sometidos a estreses y durante la senescencia natural. Los valores son medias ± ES de 8-9 muestras de al menos cuatro series de plantas crecidas independientemente. Los asteriscos representan diferencias significativas con el test LSD (P < 0,05) respecto a los nódulos control. La actividad GalLDH y el contenido de ASC total están expresados por gramo de peso fresco.
0
150
300
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0
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H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
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mol
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ASC
tota
l (
)(n
mol
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SC (
)%
ASC
( )
Resultados
- 94 -
El estrés inducido por NaCl o CdCl2 provocó un moderado descenso de la
actividad AO (Figura 4.11). Por otra parte, el tratamiento con H2O2 no causó ninguna
alteración significativa de la actividad. Sin embargo, el cambio más drástico se
observó en los nódulos tratados con JA 100 μM durante 96 h, en los que la actividad
AO aumentó casi cuatro veces (Figura 4.11). Debido a este fuerte incremento, se
procedió a realizar un estudio más detallado de la expresión y actividad AO en función
del tiempo de exposición a JA (Figura 4.12). La actividad AO aumentó
significativamente a partir de las 24 h de tratamiento y continuó creciendo
gradualmente hasta las 96 h. El incremento de la actividad estuvo precedido por un
aumento (≈ 20 veces) tras 6 h de tratamiento en la expresión del gen que codifica una
AO hipotética de judía, cuya secuencia parcial fue suministrada amablemente por el
Dr. F. Sánchez (Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, México), en
el marco del proyecto de secuenciación del genoma de judía. Aunque los niveles de
Figura 4.11. Actividad AO en nódulos de judía sometidos a estreses y durante el envejecimiento. Los valores son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series independientes de plantas. La actividad enzimática está expresada por mg de proteína.
Act
ivid
ad A
O(μ
mol
min
-1m
g-1 )
C NaCl Cd0
3
6
9
12
H2O2 JA S1 S2
* *
*
*Act
ivid
ad A
O(μ
mol
min
-1m
g-1 )
C NaCl Cd0
3
6
9
12
H2O2 JA S1 S2
* *
*
*Figura 4.12. Nivel de expresión relativa de AO y actividad AO en nódulos tratados con JA 100 μM durante 0, 6, 24, 48 o 96 h. Los valores son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. En el caso de la expresión de AO, los controles fueron nódulos tratados con DMSO diluido durante el mismo tiempo que el tratamiento con JA.
0
6
12
18
24
0
2
4
6
8
JA48 h
JA6 h
JA24 h
JA96 h
CN
ivel
de
mR
NA
de
AO
(rel
ativ
o a
DM
SO)
Act
ivid
ad A
O(μ
mol
min
-1m
g-1 )
* *
*
*
* *
*
0
6
12
18
24
0
2
4
6
8
JA48 h
JA6 h
JA24 h
JA96 h
CN
ivel
de
mR
NA
de
AO
(rel
ativ
o a
DM
SO)
Act
ivid
ad A
O(μ
mol
min
-1m
g-1 )
* *
*
*
* *
*
Resultados
- 95 -
transcrito descendieron tras 24 h de tratamiento con JA, la expresión del gen AO
resultó ser siempre mayor que la observada en los nódulos control (tratados con
DMSO diluido 1:1000 durante el mismo tiempo que con JA). Las secuencias de los
cebadores empleados para la cuantificación del mRNA mediante qRT-PCR en nódulos
de judía se indican en la Tabla 3.10. No se observó ningún cambio en la actividad AO
tras la incubación de los extractos de nódulos con diferentes concentraciones de JA
(25-200 μM), lo que descarta cualquier posible inhibición directa de la enzima por el
JA.
4.1.4. Metabolismo del ascorbato durante la senescencia natural
Los niveles de mRNA de los genes implicados en la biosíntesis de ASC (Figura 4.9)
disminuyeron en los nódulos S2 respecto a los nódulos control (jóvenes) y a los
nódulos S1. Por el contrario, en los nódulos S1 la expresión de GalLDH disminuyó >
50%, mientras que los niveles de mRNA de los restantes genes analizados se
mantuvieron constantes o, incluso en el caso de GalDH, aumentaron más de dos veces
respecto a los nódulos control (Figura 4.9).
Por otra parte, los nódulos S1 contenían un 88% menos de actividad GalLDH y
un 60% menos de ASC total que los controles, mientras que en los nódulos S2 tanto la
actividad GalLDH como el contenido de ASC total disminuyeron un 97-99% (Figura
4.10). A pesar de la baja abundancia relativa respecto a los controles, los nódulos S1
contenían un 88,6% del ASC total en su forma reducida (Figura 4.10), mientras que
en los nódulos S2 este porcentaje fue sólo del 23,1%. Curiosamente, la actividad AO
disminuyó casi un 50% en los nódulos S1, pero no en los nódulos S2 (Figura 4.11).
Como un experimento adicional en el estudio de la regulación del metabolismo
del ASC durante el envejecimiento, se ensayó la actividad GalLDH en mitocondrias
purificadas de nódulos de judía de tres edades distintas: nódulos jóvenes (22-23 d),
maduros (32-33 d) y senescentes (43-46 d; equivalentes a la mezcla de nódulos S1 +
S2). Como puede apreciarse en la Tabla 4.1, la actividad GalLDH disminuyó un 13%
en mitocondrias de nódulos maduros y un 42% en el caso de las mitocondrias de
nódulos senescentes respecto a los valores obtenidos en las mitocondrias de nódulos
jóvenes.
Resultados
- 96 -
Tabla 4.1. Efecto del envejecimiento sobre la actividad GalLDH en mitocondrias purificadas de nódulos de judía.
Edad del nódulo (días) GalLDH (nmol min-1 mg-1) a
22-23 18,4 ± 3,1 32-33 16,0 ± 1,7 43-46 10,7 ± 2,6
a Las actividades son medias ± ES de 4-5 preparaciones independientes de mitocondrias y están expresadas por mg de proteína.
4.2. Regulación del ciclo ascorbato-glutatión en nódulos
4.2.1. Regulación en condiciones de estrés
Los tratamientos de estrés abiótico (NaCl o CdCl2) tuvieron poco efecto en las
actividades de las cuatro enzimas (APX, MR, GR y DR) implicadas en la eliminación
del H2O2 a través del ciclo ASC-GSH en los nódulos (Figura 4.13). Lo mismo puede
decirse, en general, de los tratamientos con H2O2 o JA, con excepción del efecto
inhibitorio del JA sobre la DR. En este caso, cuando las plantas fueron tratadas con JA
100 μM durante 96 h, no se detectó actividad DR dependiente de GSH (Figura 4.13).
El mismo ensayo enzimático en hojas y en raíces de plantas de judía tratadas con JA
reveló, sin embargo, que la actividad DR no sufrió cambios significativos en
comparación con las plantas control específicas para este tratamiento (Tabla 4.2). Este
descubrimiento nos llevó a realizar nuevos experimentos para determinar el efecto
temporal del JA sobre la expresión y la actividad DR en los nódulos de judía.
Estos experimentos mostraron que la inhibición de la DR por JA en los nódulos
es dependiente del tiempo de exposición (Figura 4.14). Así, después de 6 h, la
actividad DR disminuyó ≈ 50% y no se observaron descensos adicionales tras 24 o 48
h. Sin embargo, después de 96 h de exposición al JA, la actividad DR fue
completamente inhibida (Figura 4.14). Los niveles de mRNAs que codifican la DR
plastidial (DR1) y citosólica (DR2) en nódulos de judía fueron significativamente
mayores en los nódulos tratados que en los control, excepto para el transcrito de DR1
Resultados
- 97 -
en los tratamientos de 6 h y 48 h y para el de DR2 a las 48 h de tratamiento (Figura
4.14). Por otra parte, la expresión de DR2 fue siempre significativamente mayor
respecto a DR1 en los nódulos control y tratados con JA (≈ 4-6 veces, con un máximo
de ≈ 14 veces a las 6 h de tratamiento).
Órgano Tratamiento a Actividad DR (μmol min-1 g-1) b
DMSO 2,19 ± 0,09 Hojas JA 2,05 ± 0,04
DMSO 0,88 ± 0,06 Raíces JA 0,95 ± 0,14
DMSO 0,81 ± 0,06 Nódulos JA n.d. c
a Los controles del tratamiento de JA 100 μM 96 h fueron plantas tratadas durante 96 h con DMSO diluido 1:1000 en solución nutritiva.
b Los valores son medias ± ES de al menos 3 muestras de al menos dos series independientes de plantas.
c n.d., actividad no detectable.
Tabla 4.2. Actividad DR en plantas de judía tratadas con JA.
Figura 4.13. Actividades de las enzimas del ciclo ASC-GSH en nódulos de judía sometidos a diversos tratamientos y durante la senescencia natural. Los valores son medias ± ES de 5-6 muestras de al menos tres series de plantas crecidas independientemente. Las actividades están expresadas por gramo de peso fresco.
0
1
2
3
4
5
0,00,20,40,60,81,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
MR
(μm
olm
in-1
g-1 )
APX
(μm
olm
in-1
g-1 )
C NaCl Cd S2H2O2 JA S1
0
4
8
12
16
DR
(μm
olm
in-1
g-1 )
GR
(μm
olm
in-1
g-1 )
C NaCl Cd S2H2O2 JA S1
*
*
*
*
*
*0
1
2
3
4
5
0,00,20,40,60,81,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
MR
(μm
olm
in-1
g-1 )
APX
(μm
olm
in-1
g-1 )
C NaCl Cd S2H2O2 JA S1
0
4
8
12
16
DR
(μm
olm
in-1
g-1 )
GR
(μm
olm
in-1
g-1 )
C NaCl Cd S2H2O2 JA S1
*
*
*
*
*
*
Resultados
- 98 -
El contenido de proteína DR en los nódulos tratados con JA se analizó
utilizando un anticuerpo policlonal frente a la DR citosólica de Arabidopsis (Figura
4.15 A), cedido amablemente por el Dr. K. Tanaka. Este mismo anticuerpo fue
empleado para estudiar el efecto del tratamiento con JA 100 μM durante 96 h sobre la
expresión de la proteína en nódulos, hojas y raíces de judía (Figura 4.15 B). Los
resultados indicaron que la proteína se encontraba presente incluso después de 96 h de
exposición a JA en los nódulos de judía, con niveles similares a los controles (Figura
4.15 A). Además, la expresión de la proteína disminuyó con JA principalmente en las
hojas (Figura 4.15 B), a pesar de que la actividad DR en hojas de plantas de judía
tratadas con JA no experimentó cambios significativos respecto a la de hojas de
plantas control (Tabla 4.2). Por otra parte, tampoco se observó ningún cambio en la
Figura 4.15. Análisis de la expresión de la proteína DR. A, Nódulos de judía tratados con JA 100 μM durante 0, 6, 24, 48 o 96 h. B, Nódulos, hojas y raíces de judía controles y tratadas con JA 100 μM durante 96 h. Se detectó una única banda de ≈ 29 kD en todos los casos. Se cargaron 25 μg de proteína en cada carril, excepto en el caso de las hojas (50 μg). La dilución del anticuerpo fue 1:2500 (ver 3.10 y Tabla 3.14). Las imágenes son representativas de tres réplicas con muestras de series independientes.
JA96 h
JA96 h
C CC JA96 h
Nódulos Hojas Raíces
A
B
JA48 h
JA6 h
JA24 h
JA96 h
C
Nódulos
JA96 h
JA96 h
C CC JA96 h
Nódulos Hojas Raíces
JA96 h
JA96 h
C CC JA96 h
Nódulos Hojas Raíces
A
B
JA48 h
JA6 h
JA24 h
JA96 h
C
Nódulos
JA48 h
JA6 h
JA24 h
JA96 h
C
Nódulos
Figura 4.14. Expresión de DR1 y DR2, y actividad DR (DR1 + DR2), en nódulos de judía tratados con JA 100 μM durante 0, 6, 24, 48 o 96 h. Los valores son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series de plantas independientes. Los controles utilizados para los estudios de expresión génica son nódulos tratados con DMSO diluido durante el mismo tiempo que el tratamiento con JA.
0
4
8
12
16
Niv
eles
de
mR
NA
(rela
tivos
a D
MSO
)A
ctiv
idad
DR
(μm
olm
in-1
g-1 )
C JA6 h
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
JA24 h
JA48 h
JA96 h
DR1 DR2
** *
**
**
*
*
0
4
8
12
16
Niv
eles
de
mR
NA
(rela
tivos
a D
MSO
)A
ctiv
idad
DR
(μm
olm
in-1
g-1 )
C JA6 h
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
JA24 h
JA48 h
JA96 h
DR1 DR2
** *
**
**
*
*
Resultados
- 99 -
actividad DR tras la incubación de los extractos de nódulos con diferentes
concentraciones de JA, al igual que se observó con la actividad AO (ver 4.1.3).
4.2.2. Enzimas del ciclo ascorbato-glutatión durante la senescencia natural
En los nódulos S1, las actividades APX, MR y DR permanecieron inalteradas,
mientras que la actividad GR aumentó un 31% respecto a los nódulos control; por el
contrario, en los nódulos S2 las actividades de las cuatro enzimas del ciclo ASC-GSH
disminuyeron ≈ 30-90% respecto a las actividades de los nódulos jóvenes (Figura
4.13).
4.3. Metabolismo de tioles en nódulos
De forma análoga que para el caso del ASC, el metabolismo de los tioles en nódulos
de judía se estudió mediante el análisis de la expresión de los genes y proteínas de las
tiol-sintetasas, junto con la determinación de sus correspondientes actividades
enzimáticas, contenido de metabolitos y estado redox del (h)GSH.
4.3.1. Regulación de las tiol-sintetasas en condiciones de estrés
Debido a que los nódulos de judía contienen mayoritariamente hGSH en lugar de
GSH, y a que la actividad GSHS es mucho menor que la hGSHS (Matamoros y cols,
1999b), los resultados presentados en esta Tesis se refieren fundamentalmente a la
γECS y la hGSHS de judía. No obstante, también se determinaron la actividad GSHS y
el contenido de GSH total en los nódulos.
A nivel de mRNA, la expresión de los genes que codifican la γECS y la hGSHS
fue inducida ligeramente (≈ 2 veces respecto a los nódulos control) tras el tratamiento
con H2O2 (Figura 4.16). Sin embargo, esta inducción transcripcional no se vio
acompañada de una mayor actividad enzimática ni de un mayor contenido de (h)GSH
total (Figuras 4.16 y 4.17). De hecho, la actividad γECS disminuyó significativamente
(65-75%) en todos los tratamientos, mientras que la actividad hGSHS permaneció
Resultados
- 100 -
constante (Figura 4.16). Como era previsible, no se detectó actividad GSHS en los
nódulos de judía bajo las condiciones experimentales empleadas.
Además, el contenido de (h)GSH total [(h)GSH + (h)GSSG] y su estado redox
(definido en 3.12.2) no cambiaron significativamente en ninguno de los tratamientos
estudiados (Figura 4.17), salvo el hGSH total con JA, que aumentó un 38%. Es
interesante resaltar que, al igual que se ha descrito anteriormente para el estado redox
del ASC, el porcentaje de (h)GSH disminuyó rápida y significativamente cuando los
nódulos se mantuvieron en hielo durante 10 min después de cosecharlos (88,6%), en
comparación con los nódulos que fueron cosechados sumergiéndolos directamente en
N2 líquido (99,0%).
Figura 4.16. Expresión génica y actividad enzimática de las tiol-sintetasas (γECS y hGSHS) en nódulos de judía sometidos a estreses y durante la senescencia natural. Los valores son medias ± ES de 5-6 muestras provenientes de al menos tres series independientes de plantas. La expresión génica está normalizada frente a los nódulos control (nódulos tratados con DMSO en el caso del JA), a los que se les dio un valor arbitrario de 1. Las actividades enzimáticas están expresadas por gramo de peso fresco.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,00,51,01,52,02,53,03,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Act
ivid
ad γE
CS
(nm
ol m
in-1
g-1 )
Niv
el d
e m
RN
A d
e γE
CS
(rel
ativ
o al
con
trol)
Niv
el d
e m
RN
A d
e hG
SHS
(rel
ativ
o al
con
trol)
Act
ivid
ad h
GSH
S(n
mol
min
-1g-
1 )
*
*
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
* * * ** *
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,00,51,01,52,02,53,03,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Act
ivid
ad γE
CS
(nm
ol m
in-1
g-1 )
Niv
el d
e m
RN
A d
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(rel
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trol)
Niv
el d
e m
RN
A d
e hG
SHS
(rel
ativ
o al
con
trol)
Act
ivid
ad h
GSH
S(n
mol
min
-1g-
1 )
*
*
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
* * * ** *
*
Resultados
- 101 -
Figura 4.18. Contenido de Cys y γEC en nódulos de judía sometidos a estreses y durante la senescencia natural. Los valores son medias ± ES de 5-6 réplicas de al menos tres series de plantas crecidas independientemente. El contenido de los tioles está expresado por gramo de peso fresco.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0
10
20
30
40
*
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
Cys
(nm
ol g
-1)
γEC
(nm
ol g
-1)
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
* * * *
*
** *
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0
10
20
30
40
*
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
Cys
(nm
ol g
-1)
γEC
(nm
ol g
-1)
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
* * * *
*
** *
Figura 4.17. Contenido de (h)GSH total [(h)GSH + (h)GSSG] y su estado redox [porcentaje de (h)GSH respecto del total] en nódulos de judía sometidos a estreses y durante la senescencia natural. Los valores son medias ± ES de 5-6 experimentos independientes provenientes de 3-4 series de plantas distintas. Los asteriscos representan diferencias significativas (test LSD, P < 0.05) respecto a los nódulos control. El contenido de (h)GSH está expresado por gramo de peso fresco.
0
125
250
375
500
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
% (h
)GSH
* *
*
*
97,0
97,5
98,0
98,5
99,0
99,5
GSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
hGSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
0
125
250
375
500
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
% (h
)GSH
* *
*
*
97,0
97,5
98,0
98,5
99,0
99,5
GSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
GSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
hGSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
hGSH
tota
l (
)(n
mol
g-1)
Resultados
- 102 -
También se determinó el contenido de Cys y γEC en nódulos (Figura 4.18). El
contenido de Cys disminuyó significativamente en todos los estreses, mientras que el
contenido de γEC disminuyó únicamente en los nódulos sometidos a estrés por NaCl o
CdCl2, manteniéndose tras los tratamientos con H2O2 o JA en valores similares a los
nódulos control.
4.3.2. Análisis western de la γ-glutamilcisteína sintetasa En nuestro laboratorio disponemos de un anticuerpo policlonal producido frente a la
γECS recombinante de judía (ver 3.10) que permitió estudiar la expresión de esta
proteína mediante análisis western en los nódulos de esta especie. Los resultados
indican una menor expresión de la proteína en todos los tratamientos analizados y en la
senescencia natural (Figura 4.19), coincidiendo con los datos de actividad enzimática
(Figura 4.16).
El análisis western se utilizó también para estudiar la localización subcelular de
la γECS, otro aspecto importante en la regulación del metabolismo de tioles. En la
Figura 4.20 A se muestra una banda de γECS del tamaño esperado (≈ 51 kD) en los
extractos de nódulo entero, raíz y hoja de la misma planta. No obstante, en raíces se
detectó una banda adicional de ≈ 30 kD, mientras que en los nódulos y en las hojas el
anticuerpo detectó una única banda (Figura 4.20 A). Además, resultados preliminares
sugieren que la γECS se localiza también en las mitocondrias purificadas de nódulos
de judía (imagen no mostrada), aunque tendrán que confirmarse mediante
inmunolocalización por microscopía electrónica. Actualmente, se está secuenciando el
Figura 4.19. Análisis western de la proteína γECS en nódulos de judía sometidos a diversos tratamientos y durante la senescencia natural. Se cargaron 30 μg de proteína en cada carril y se utilizó una dilución 1:1000 del anticuerpo, observándose una única banda inmunorreactiva de ≈ 51 kD. La imagen mostrada es representativa de tres repeticiones con muestras de plantas crecidas independientemente.
H2O2NaCl Cd JA S1 S2C H2O2NaCl Cd JA S1 S2C
Resultados
- 103 -
extremo N-terminal de la proteína mediante electroforesis 2D y espectrometría de
masas en colaboración con el Dr. J. Abián (Laboratorio de Proteómica, Universidad
Autónoma de Barcelona-CSIC).
El análisis western utilizando anticuerpos producidos frente a la γECS de maíz
(Zea mays) (Gómez y cols, 2004b) y de B. juncea, cedidos por los Drs. C.H. Foyer
(Universidad de Newcastle, Reino Unido) y T. Rausch (Universidad de Heidelberg,
Alemania), respectivamente, confirmaron que nuestro anticuerpo reconoce la misma
banda de ≈ 51 kD en todos los tejidos y en diferentes especies (excepto en maíz, cuya
masa molecular fue menor), mientras que la banda adicional de ≈ 30 kD fue
reconocida únicamente por nuestro anticuerpo (Figura 4.20 B).
4.3.2. Regulación de las tiol-sintetasas durante la senescencia natural
La actividad γECS fue significativamente menor en los nódulos S1 y S2 respecto a los
nódulos jóvenes, mientras que la actividad hGSHS únicamente disminuyó en los
nódulos S2 (Figura 4.16). Además, sólo los nódulos S2 mostraron un claro descenso
en la concentración de (h)GSH total (Figura 4.17). El estado redox del (h)GSH fue
Figura 4.20. Análisis western de la γECS. A, Extractos de nódulos (N), raíces (R) y (H) de judía. Puede observarse una banda de ≈ 51 kD en los tres carriles, además de una banda de ≈ 30 kD en raíces. B, Extractos de raíces de maíz, judía, B. juncea (Bjun) y Lotus. Se comparó el anticuerpo de judía (parte izquierda) con el de B. juncea (parte derecha superior) y el de maíz (parte derecha inferior). En todos los casos se cargaron 30 μg de proteína. Las diluciones de los anticuerpos primarios de la γECS de judía, B. juncea y maíz fueron, respectivamente, 1:1000, 1:5000 y 1:3000.
A
28,9
51,2
36,6
28,9
51,2
36,6
Maíz Judía Bjun Lotus Maíz Judía Bjun Lotus
B
RN
28,9
51,2
36,6
H
A
28,9
51,2
36,6
28,9
51,2
36,6
Maíz Judía Bjun Lotus Maíz Judía Bjun Lotus
B
RN
28,9
51,2
36,6
H
Resultados
- 104 -
también inferior en los nódulos S2 que en los nódulos control. Los nódulos S2
contenían menos Cys y γEC, mientras que los nódulos S1 mostraron un descenso en el
contenido de Cys pero no en el de γEC (Figura 4.18). La expresión de la proteína
γECS fue claramente menor en los dos tipos de nódulos senescentes respecto a los
nódulos jóvenes (Figura 4.19).
4.4. Biosíntesis de fitoquelatinas en plantas
Una de las funciones del (h)GSH en las plantas es la de servir como precursor de las
(h)PCs para la desintoxicación de metales pesados, como ya fue comentado
anteriormente. Por lo tanto, puede considerarse que la síntesis de (h)PCs es otro
aspecto importante del metabolismo del (h)GSH y será descrito a continuación.
4.4.1. Actividad PCS1 recombinante
Al igual que se hizo para el estudio de la estructura y función del gen GalLDH (4.1.1),
se escogió la leguminosa modelo Lotus para llevar a cabo la caracterización molecular
de los genes que codifican las PCS en esta especie. Una búsqueda preliminar de ESTs
que codificaran posibles proteínas PCS en las bases de datos de Lotus no dio ningún
resultado, por lo que se realizó una búsqueda en genotecas TAC en colaboración con
el grupo del Dr. S. Tabata, dentro del programa de secuenciación del genoma de Lotus.
Como resultado se aisló un clon genómico (LjT27M11) que contenía un conjunto
(“cluster”) de tres genes (denominados LjPCS1, LjPCS2 y LjPCS3) localizados a 69,0
cM en el cromosoma 1. Los detalles de la estructura de los genes que componen esta
familia multigénica y de la caracterización bioquímica de las proteínas LjPCS2 y
LjPCS3 han sido recientemente publicados en un trabajo de nuestro grupo (Ramos y
cols, 2007), mientras que aquí sólo se detalla la caracterización de la LjPCS1. También
se llevó a cabo durante esta Tesis la expresión de las proteínas LjPCS2 y LjPCS3 en
bacterias de E. coli, mientras que la expresión de estas mismas proteínas en levaduras
forma parte de la Tesis Doctoral de Loreto Naya (Naya, 2008).
Resultados
- 105 -
En primer lugar, se sintetizó el cDNA a partir del RNA total de raíces de Lotus
y se diseñaron cebadores específicos para obtener mediante PCR la secuencia de
cDNA de LjPCS1 (Tabla 3.12). A continuación, se determinó la organización exón-
intrón por comparación entre la secuencia del cDNA y la genómica. Por otro lado, la
comparación entre el gen LjPCS1 y los dos genes PCS de Arabidopsis reveló algunas
diferencias significativas (Figura 4.21). Mientras que AtPCS1 y AtPCS2 contienen 9
exones, LjPCS1 contiene solamente 8. Los exones 1-6 de todos los genes tienen
tamaños idénticos, excepto el exón 2 de AtPCS2, que es 3 pb más corto. El exón 7 de
LjPCS1 tiene 504 pb, un tamaño mucho mayor que el resto de los exones, mientras
que en AtPCS1 y AtPCS2 aparecen en su lugar dos exones de menor tamaño. El último
exón de los dos genes de Arabidopsis tiene idéntico tamaño, mientras que el de
LjPCS1 es 3 pb más largo.
En la Figura 4.22 se muestra un árbol filogenético que incluye la mayoría de
las secuencias de proteínas PCS disponibles en las bases de datos. El gráfico revela
grupos separados para las PCS de cianobacterias, nemátodos, levaduras, helechos y las
familias de plantas vasculares Poaceae, Alliaceae, Typhaceae, Solanaceae,
Brassicaceae y Leguminosae. También indica que LjPCS1 y la hPCS1 de soja
(GmhPCS1) son, probablemente, homólogos funcionales. Por otro lado, las secuencias
de nucleótidos y aminoácidos mostraron un 65-69% de identidad con AtPCS1 y un 84-
86% con GmhPCS1 (Figura 4.23). El ORF del gen LjPCS1, de 1506 pb, predice una
proteína con una masa molecular de 55,5 kD, 501 aminoácidos y un punto isoeléctrico
de 6,68. El dominio N-terminal de LjPCS1 contiene tres aminoácidos, Cys-56, His-
162 y Asp-180, que son esenciales para la actividad enzimática y que constituyen la
“triada catalítica” (Vatamaniuk y cols, 2004; Vivares y cols, 2005; Romanyuk y cols,
2006) (Figura 4.23). La proteína es muy rica en residuos de Cys (4,2%), su dominio
C-terminal presenta gran variabilidad y tiene un motivo (Cys)2-(X)3-Cys-(X)2-Cys que
aparece en las PCS de la mayoría de plantas superiores (Cobbett y Goldsbrough,
2002).
Resultados
- 106 -
Figura 4.22. Análisis filogenético de las proteínas PCS de cianobacterias, nemátodos, hongos y plantas. Se construyó un árbol filogenético sin raíz usando el método “neighbor-joining” con el programa ClustalW. La longitud de las ramas es proporcional a la distancia genética (barra = 0,1 sustituciones por sitio). Se incluyeron las proteínas de Allium sativum (Asat, AAO13809), AtPCS1 (Atha1, AAD41794), AtPCS2 (Atha2, AAK94671), Athyrium yokoscense (Ayok, BAB64932), Brassica juncea (Bjun, CAC37692), Cynodon dactylon (Cdac, AAO13810), Caenorhabditis elegans (Cele, NP496475), GmhPCS1 (Gmax, AAL78384), LjPCS1 (Ljap1, AY633847), Nicotiana tabacum, (Ntab, AAO74500), Nostoc (NP485018), Oryza sativa (Osat, AAO13349), Prochlorococcus marinus (Pmar, NP894844), Triticum aestivum (Taes, AAD50592), Thlaspi japonicum (Tjap, BAB93119), Typha latifolia (Tlat, AAG22095), Schizosaccharomyces pombe (Spom, CAA92263) y Solanum tuberosum (Stub, CAD68109).
Osat
Asat
Tlat
Ayok
Spom
Nostoc
Pmar Cele
Taes
Cdac
NtabStub
Gmax1Ljap1
Atha2
Atha1BjunTjap
0.1
Osat
Asat
Tlat
Ayok
Spom
Nostoc
Pmar Cele
Taes
Cdac
NtabStub
Gmax1Ljap1
Atha2
Atha1BjunTjap
0.1
Figura 4.21. Comparación de la estructura de los genes LjPCS1 (AY633847), AtPCS1 (AF135155) y AtPCS2 (AY044049). Las longitudes de los exones (ORFs, en negro) e intrones (en blanco) están indicadas en pb y se han dibujado a escala.
LjPCS175 52 228239 164157
494 250 286 629 109
504
85 386
87
AtPCS175 52 228239 164157
431 79 84 99 194
190
102 89
266 84
261
AtPCS272 52 228239 164157
356 66 163 90 98
187
94 126
176 84
209
LjPCS175 52 228239 164157
494 250 286 629 109
504
85 386
8775 52 228239 164157
494 250 286 629 109
504
85 386
87
AtPCS175 52 228239 164157
431 79 84 99 194
190
102 89
266 84
261
75 52 228239 164157
431 79 84 99 194
190
102 89
266 84
261
AtPCS272 52 228239 164157
356 66 163 90 98
187
94 126
176 84
209
72 52 228239 164157
356 66 163 90 98
187
94 126
176 84
209
Resultados
- 107 -
Figura 4.23. Alineamiento de las secuencias de las proteínas LjPCS1, AtPCS1, AtPCS2 y GmhPCS1. El alineamiento se realizó con el programa JalView v2.4 (Clamp y cols, 2004). Los aminoácidos que son idénticos en las cuatro secuencias se representan sobre fondo oscuro. *, residuos que forman parte de la triada catalítica de la enzima. #, residuos de Cys que están presentes en todas las secuencias conocidas de PCS de plantas superiores.
50
*
*
# # #
#
#
#
*
50
*
*
# # #
#
#
#
*
Resultados
- 108 -
La proteína LjPCS1 se expresó en E. coli, se purificó (ver 3.8 y 3.9) y sus
propiedades se compararon con las de la proteína AtPCS1 producida de idéntica
manera. Los distintos pasos del proceso de purificación se analizaron por electroforesis
desnaturalizante (tinción Coomassie) y western con un anticuerpo monoclonal que
reconoce la poli(His)6 (Figura 4.24). Ambos análisis mostraron la eliminación
completa de la poli(His)6 tras el tratamiento con trombina y la casi total ausencia de
contaminantes y de degradación de la proteína. La pureza de la proteína fue > 96%,
según se deduce de la densitometría de imágenes.
Figura 4.24. Purificación de AtPCS1 y LjPCS1 recombinantes mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado. A, Electroforesis SDS-PAGE y tinción Coomassie de distintas fracciones obtenidas durante la purificación de las proteínas (ver 3.9 y Figura 3.1 para la descripción del proceso y la composición de los medios empleados). 1, extracto crudo desalinizado de AtPCS1 recombinante; 2, proteínas eluidas con imidazol 50 mM; 3, AtPCS1 eluida con imidazol 250 mM; 4, preparación de proteína AtPCS1 purificada utilizada para obtener 5, antes de la digestión con trombina; 5, AtPCS1 después de digerir con trombina y eliminar la poli(His)6; 6, extracto crudo dializado de LjPCS1; 7, LjPCS1 eluida con imidazol 250 mM; y 8, LjPCS1 después de digerir con trombina y eliminar la poli(His)6. B, Análisis western de las mismas fracciones que en A utilizando un anticuerpo que reconoce la poli(His)6 y un método de detección basado en fosfatasa alcalina (ver 3.10). Se cargaron 20 μg de proteína por carril en A y 2 μg en B.
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
204.1115.494.9
54.3
37.3
29.1
20.2
Resultados
- 109 -
Figura 4.25. Especificidad de sustrato de AtPCS1 y LjPCS1. Las actividades se determinaron como se describe en 3.11.4, con diferentes concentraciones (0-5 mM) de sustratos (GSH y hGSH). A, Extractos crudos dializados de AtPCS1 (≈ 200 μg de proteína) y LjPCS1 (≈ 120 μg de proteína) con Cd2+ 500 μM. Actividades enzimáticas de extractos de las proteínas purificadas, B con poli(His)6 y C sin poli(His)6. En B y C se ensayaron ≈ 60 μg de cada proteína y la concentración de Cd2+ fue 50 μM. Sólo se representan los tres productos mayoritarios [(h)PC2, (h)PC3 y (h)PC4] con diferentes códigos de colores (parte superior de la gráfica). Los valores son medias ± ES de 6-7 preparaciones independientes de proteínas. Las actividades enzimáticas están expresadas en nmol de (h)PCs producidas (equivalentes de GSH) por min y por mg de proteína.
0
15
30
45
60
75
0
15
30
45
60
75
0
5
10
15
20
25
30
35
Act
ivid
ad P
CS
(nm
olm
in-1
mg-
1 )
AtPCS1Extracto dializado
AtPCS1Purificada con poli(His)6
AtPCS1Purificada sin poli(His)6
LjPCS1Extracto dializado
LjPCS1Purificada con poli(His)6
LjPCS1Purificada sin poli(His)6
Act
ivid
ad P
CS
(nm
olm
in-1
mg-
1 )A
ctiv
idad
PC
S(n
mol
min
-1m
g-1 )
A
B
C
Sustrato (mM)
[GSH][hGSH] 0 2,5 5
5 2,5 00 2,5 55 2,5 0
PC2 PC3 PC4 hPC2 hPC3 hPC4
0
15
30
45
60
75
0
15
30
45
60
75
0
5
10
15
20
25
30
35
Act
ivid
ad P
CS
(nm
olm
in-1
mg-
1 )
AtPCS1Extracto dializado
AtPCS1Purificada con poli(His)6
AtPCS1Purificada sin poli(His)6
LjPCS1Extracto dializado
LjPCS1Purificada con poli(His)6
LjPCS1Purificada sin poli(His)6
Act
ivid
ad P
CS
(nm
olm
in-1
mg-
1 )A
ctiv
idad
PC
S(n
mol
min
-1m
g-1 )
A
B
C
Sustrato (mM)
[GSH][hGSH] 0 2,5 5
5 2,5 00 2,5 55 2,5 0
PC2 PC3 PC4 hPC2 hPC3 hPC4
Resultados
- 110 -
Las proteínas sin purificar provenientes de los extractos de células, junto con las
proteínas AtPCS1 y LjPCS1 purificadas, se ensayaron para determinar las actividades
específicas de las enzimas. Entre las proteínas purificadas, se incluyeron tanto las
proteínas que contenían la cola de poli(His)6 como aquéllas a las que se les eliminó
mediante digestión con trombina. Se realizaron dos tipos de análisis, uno de
especificidad de sustrato y otro de activación por metales fisiológicamente relevantes.
En el primer caso, se mantuvo constante la concentración de metal pesado (Cd2+) en
500 μM (enzimas sin purificar) o 50 μM (enzimas purificadas) y se ensayó la actividad
con cantidades variables de GSH o hGSH, de tal forma que la concentración final de
GSH + hGSH fuera de 5 mM (Figura 4.25 y Tablas 4.3 y 4.4). En el segundo caso, se
mantuvo constante una concentración de GSH de 5 mM y se midió la actividad con
concentraciones 500 μM (enzimas sin purificar) o 50 μM (enzimas purificadas) de los
distintos metales (Figura 4.27 y Tablas 4.5 y 4.6).
Los experimentos iniciales para determinar la especificidad de AtPCS1 y
LjPCS1 por GSH o hGSH se realizaron con preparaciones de proteína sin purificar,
dializadas con columnas HiTrap Desalting (ver 3.9) para eliminar los tioles endógenos
(Figura 4.25 A y Tablas 4.3 y 4.4). En presencia de Cd2+ 500 μM y GSH 5 mM, las
dos proteínas sintetizaron ≈ 60 nmol PCs min-1 mg-1 de proteína. Como era previsible,
AtPCS1 produjo cantidades decrecientes de PC2, PC3 y PC4, y en algunas ocasiones
también PC5 (49% de PC4), PC6 (9% de PC4) y, menos frecuentemente, PCs de cadena
más larga. Por el contrario, LjPCS1 produjo cantidades similares de los tres productos
principales, y sólo ocasionalmente se observó la formación de PC5 (17% de PC4).
Tanto AtPCS1 como LjPCS1 sin purificar produjeron, al menos, el doble de hPCs que
de PCs cuando se usó como sustrato una combinación de GSH 2,5 mM + hGSH 2,5
mM. De nuevo, AtPCS1 sintetizó cantidades decrecientes de hPC2, hPC3 y hPC4 y,
eventualmente, hPC5 (40% de hPC4) y hPC6 (5% de hPC4). No se detectaron
polipéptidos más largos que hPC4 cuando se ensayó la proteína LjPCS1. Es interesante
destacar el hecho de que tanto AtPCS1 como LjPCS1 fueron capaces de sintetizar
hPCs cuando se utilizó hGSH 5 mM como único sustrato. En este caso, AtPCS1
sintetizó curiosamente tres veces más hPCs que LjPCS1. Las cantidades de hPCs
Resultados
- 111 -
totales producidas por AtPCS1 y por LjPCS1 fueron, respectivamente, el 24% y el 9%
de la cantidad total de PCs formadas cuando el sustrato fue GSH 5 mM.
Los resultados obtenidos con las enzimas dializadas sin purificar fueron
confirmados con los correspondientes datos de las enzimas purificadas (Figura 4.25
B-C). Los resultados obtenidos con las enzimas purificadas con poli(His)6 y sin
poli(His)6 fueron muy parecidos, por lo que en el texto sólo se tienen en cuenta los de
estas últimas. No obstante, en la Figura 4.25 y en las Tablas 4.3 y 4.4 aparecen
recogidos todos los datos.
Para optimizar el ensayo con las enzimas purificadas, se redujo la concentración
de Cd2+ a 50 μM. Cuando se utilizó como sustrato GSH 2,5 mM + hGSH 2,5 mM,
AtPCS1 y LjPCS1 produjeron dos veces más hPCs que PCs. Por otra parte, cuando se
empleó hGSH 5 mM como único sustrato, AtPCS1 y LjPCS1 produjeron,
respectivamente, 31 y 15 nmol hPCs min-1 mg-1. Las cantidades de hPCs totales
formadas con hGSH 5 mM respecto a las PCs totales formadas con GSH 5 mM fueron
del 36% para AtPCS1 y del 15% para LjPCS1 (Figura 4.25 C). En la Figura 4.26
puede observarse un cromatograma representativo mostrando la producción de (h)PCs
por AtPCS1 cuando se añadieron como sustratos GSH, hGSH o una mezcla de ambos.
Figura 4.26. Cromatograma de HPLC mostrando la producción de (h)PCs por una preparación de AtPCS1 purificada cuando el medio de reacción contenía Cd2+ 50 μM y GSH 5 mM (rojo), GSH 2,5 mM + hGSH 2,5 mM (azul), o hGSH 5 mM (verde). Nótese la mayor producción de hPCs cuando el sustrato fue GSH 2,5 mM + hGSH 2,5 mM, así como la producción de hPCs por AtPCS1 cuando el único sustrato fue hGSH 5 mM.
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
Uni
dade
s de
abs
orba
ncia
Tiempo (min)
PC2
PC3
PC4
hPC2
hPC4
hPC3
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
Uni
dade
s de
abs
orba
ncia
Tiempo (min)
PC2
PC3
PC4
hPC2
hPC4
hPC3
GSH 5 mM
hGSH 5 mM
GSH 2,5 mM +hGSH 2,5 mM
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
Uni
dade
s de
abs
orba
ncia
Tiempo (min)
PC2
PC3
PC4
hPC2
hPC4
hPC3
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00
Uni
dade
s de
abs
orba
ncia
Tiempo (min)
PC2
PC3
PC4
hPC2
hPC4
hPC3
GSH 5 mM
hGSH 5 mM
GSH 2,5 mM +hGSH 2,5 mM
GSH 5 mM
hGSH 5 mM
GSH 2,5 mM +hGSH 2,5 mM
Resultados
- 112 -
6,7
± 1,
5 3,
8 ±
0,3
3,9
± 0,
8 3,
5 ±
0,6
17,9
± 3
,2
28,8
± 5
,1
3,2
± 0,
6 1,
2 ±
0,4
n.d.
33
,3 ±
6,1
27
,0 ±
4,7
2,
8 ±
0,6
1,2
± 0,
4 n.
d.
31,0
± 5
,7
hGSH
5 m
M
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
18,6
± 1
,7
5,5
± 0,
5 8,
9 ±
1,3
n.d.
33
,0 ±
3,5
33
,0 ±
4,7
6,
4 ±
1,1
1,8
± 0,
2 n.
d.
41,2
± 6
,0
33,8
± 4
,2
6,4
± 1,
0 1,
8 ±
0,2
n.d.
42
,0 ±
5,4
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
6,3
± 2,
2 4,
0 ±
1,2
2,5
± 0,
7 2,
2 ±
0,7
15,0
± 4
,8
21,3
± 3
,3
5,2
± 0,
9 1,
4 ±
0,2
n.d.
27
,9 ±
4,4
19
,0 ±
3,4
5,
4 ±
0,9
1,4
± 0,
2 n.
d.
25,8
± 4
,5
GSH
2,5
mM
hG
SH 2
,5 m
M
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
PC
2 PC
3 PC
4 PC
n>4
Σ(PC
s)
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
31,9
± 2
,4
16,1
± 2
,2
11,7
± 1
,5
7,3
± 0,
8 67
,0 ±
6,9
66
,2 ±
12,
3 18
,4 ±
2,8
6,
8 ±
0,7
0,2
± 0,
0 91
,5 ±
15,
8 64
,4 ±
12,
0 16
,8 ±
2,7
6,
0 ±
0,6
0,2
± 0,
0 87
,4 ±
15,
3
Sust
rato
s
GSH
5 m
M
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
PC
2 PC
3 PC
4 PC
n>4
Σ(PC
s)
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
Tab
la 4
.3. A
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idad
AtP
CS1
con
dife
rent
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once
ntra
cion
es d
e G
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hG
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-5 m
M) c
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rato
s y
Cd2+
500
μM
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ract
odi
aliz
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o 5
0 μM
(enz
ima
purif
icad
a).
AtP
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con
poli(
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AtP
CS1
Pu
rific
ada
sin
poli(
His
) 6
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son
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ias
± ES
de
6-7
prep
arac
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s in
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dos
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to fu
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SH 5
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, ni P
Cs c
uand
o el
sust
rato
fue
hGSH
5 m
M.
Resultados
- 113 -
4,7
± 0,
9 0,
1 ±
0,1
n.d.
n.
d.
4,8
± 1,
0 16
,1 ±
1,3
0,
6 ±
0,1
n.d.
n.
d.
16,8
± 1
,4
14,3
± 1
,3
0,6
± 0,
1 n.
d.
n.d.
14
,9 ±
1,4
hGSH
5 m
M
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2 hP
C3
hPC
4 hP
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4 Σ(
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s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
8,8
± 2,
0 5,
1 ±
1,7
3,0
± 1,
7 n.
d.
16,9
± 5
,4
55,5
± 1
,7
8,0
± 0,
7 1,
1 ±
0,2
n.d.
64
,5 ±
2,6
49
,6 ±
1,8
7,
2 ±
0,7
1,0
± 0,
2 n.
d.
57,8
± 2
,7
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
hPC
2 hP
C3
hPC
4 hP
Cn>
4 Σ(
hPC
s)
3,5
± 0,
1 2,
5 ±
0,5
2,1
± 1,
1 n.
d.
8,1
± 1,
7 24
,3 ±
2,7
5,
2 ±
0,7
0,6
± 0,
1 n.
d.
30,0
± 3
,5
21,9
± 2
,6
5,1
± 0,
6 0,
6 ±
0,1
n.d.
27
,6 ±
3,3
GSH
2,5
mM
hG
SH 2
,5 m
M
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
PC
2 PC
3 PC
4 PC
n>4
Σ(PC
s)
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
20,0
± 4
,3
17,3
± 3
,3
17,0
± 3
,6
2,2
± 0,
4 56
,5 ±
11,
6 69
,9 ±
6,3
19
,9 ±
3,0
4,
7 ±
0,9
0,2
± 0,
0 94
,7 ±
10,
2 73
,5 ±
6,2
19
,1 ±
2,7
4,
6 ±
0,8
n.d.
97
,2 ±
9,7
Sust
rato
s
GSH
5 m
M
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
PC
2 PC
3 PC
4 PC
n>4
Σ(PC
s)
PC2
PC3
PC4
PCn>
4 Σ(
PCs)
Tab
la 4
.4. A
ctiv
idad
LjP
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con
dife
rent
es c
once
ntra
cion
es d
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SH y
hG
SH (
0-5
mM
) co
mo
sust
rato
s y
Cd2+
500
μM
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o 5
0 μM
(enz
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purif
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a).
LjPC
S1
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acto
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LjPC
S1
Puri
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is) 6
LjPC
S1
Puri
ficad
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n po
li(H
is) 6
Los
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med
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± ES
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6-7
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to fu
e G
SH 5
mM
, ni P
Cs c
uand
o el
sust
rato
fue
hGSH
5 m
M.
Resultados
- 114 -
Los experimentos iniciales para estudiar la activación de las enzimas AtPCS1 y
LjPCS1 por metales esenciales para las plantas se realizaron con preparaciones
dializadas de las proteínas sin purificar (Figura 4.27 A y Tablas 4.5 y 4.6). En todos
los experimentos se incluyó Cd2+ como control positivo para verificar la calidad de las
preparaciones enzimáticas y como valor de referencia (100%) de la actividad PCS. La
actividad AtPCS1 no fue detectada cuando se ensayó empleando concentraciones en el
medio de reacción de 500 μM de KCl, MgCl2·6H2O, CaCl2·2H2O, MnSO4·H2O,
Na2MoO4·2H2O o H3BO3. Por el contrario, la actividad fue baja, aunque significativa,
con concentraciones 500 μM de NiSO4·6H2O (1,9%); moderada con CuCl2·2H2O,
CoCl2·6H2O o Fe(NO3)3·9H2O (9-29%); y muy alta con ZnSO4·7H2O (135%).
La identidad de la PC2 sintetizada por la enzima cuando se incluyó Fe3+ en el
medio de reacción fue verificada por espectrometría de masas. También se ensayó la
actividad con otra sal de Fe3+ (FeCl3·6H2O) y con dos sales de Fe2+ (FeSO4·7H2O y
FeCl2·4H2O), encontrándose una activación similar en todos los casos. Para descartar
cualquier contaminación de la sal Fe(NO3)3·9H2O con otros metales o metaloides, se
realizó un análisis semicuantitativo de 68 elementos mediante espectrometría de
emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (“ICP-AEO”) y espectrometría
de masas de plasma acoplado inductivamente (“ICP-MS”). Tan sólo se pudieron
detectar como contaminantes Al y Cr en concentraciones de 20-80 μg g-1, incapaces de
activar las PCS con las concentraciones utilizadas en el experimento (J. Ramos, L.
Naya, M. Becana, datos sin publicar).
En los experimentos con proteínas purificadas, se disminuyó la concentración
de los distintos metales a 50 μM (Figura 4.27 B-C). Como antes, se obtuvieron
resultados similares de activación por metales usando las enzimas purificadas con
poli(His)6 y sin ella, por lo que en el texto sólo se comentarán los que se refieren a la
enzima purificada sin poli(His)6. De nuevo, el Zn2+ fue el mejor activador entre los
metales fisiológicamente importantes, aunque en esta ocasión las actividades obtenidas
con AtPCS1 y LjPCS1 purificadas fueron el 74% y el 45% de las que se obtuvieron
con Cd2+. Las correspondientes actividades con Cu2+ fueron del 44% y del 23%, y con
Fe3+ del 17% y del 2% (Figura 4.27 C y Tablas 4.5 y 4.6).
Resultados
- 115 -
Figura 4.27. Activación de AtPCS1 y LjPCS1 por metales de importancia fisiológica. A, Extractos crudos dializados de AtPCS1 (≈ 200 μg de proteína) y de LjPCS1 (≈ 120 μg de proteína) con 500 μM de cada ion metálico y GSH 5 mM. Actividades enzimáticas de extractos de las proteínas purificadas, B con poli(His)6 y C sin poli(His)6. En B y C se ensayaron ≈ 60 μg de cada proteína con 50 μM de cada metal y GSH 5mM. Los valores son medias ± ES de 6-7 preparaciones independientes de proteínas. Se representa el porcentaje respecto a la actividad obtenida con Cd2+, a la que se dio el valor arbitrario de 100% (ver Tablas 4.5 y 4.6 para consultar los correspondientes valores).
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )A
ctiv
idad
PC
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resp
ecto
a C
d2+ )
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )
0
25
50
75
100
125
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
Cu2+ Zn2+ Fe3+ Co2+ Ni2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Co2+ Ni2+
Cu2+ Zn2+ Fe3+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
Ion metálico (500 μM)
Ion metálico (50 μM)
A
B
C
AtPCS1Extractodializado
AtPCS1Purificada
con poli(His)6
AtPCS1Purificada
sin poli(His)6
LjPCS1Extractodializado
LjPCS1Purificada
con poli(His)6
LjPCS1Purificada
sin poli(His)6
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )A
ctiv
idad
PC
S(%
resp
ecto
a C
d2+ )
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )
0
25
50
75
100
125
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
Cu2+ Zn2+ Fe3+ Co2+ Ni2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Co2+ Ni2+
Cu2+ Zn2+ Fe3+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
Ion metálico (500 μM)
Ion metálico (50 μM)
A
B
C
AtPCS1Extractodializado
AtPCS1Purificada
con poli(His)6
AtPCS1Purificada
sin poli(His)6
LjPCS1Extractodializado
LjPCS1Purificada
con poli(His)6
LjPCS1Purificada
sin poli(His)6
Resultados
- 116 -
AtPCS1
Extracto dializado Purificada con poli(His)6
Purificada sin poli(His)6
Metal Σ(PCs) % respecto
Cd2+ Σ(PCs) % respecto
Cd2+ Σ(PCs) % respecto
Cd2+
Cd2+ 56,2 ± 7,4 100,0 ± 0,0 90,9 ± 3,1 100,0 ± 0,0 87,3 ± 3,1 100,0 ± 0,0 Cu2+ 4,8 ± 0,6 8,5 ± 3,0 38,5 ± 1,3 42,3 ± 4,1 38,8 ± 1,4 44,4 ± 3,4 Zn2+ 76,0 ± 9,9 135,2 ± 5,7 67,6 ± 2,3 74,4 ± 4,2 64,3 ± 2,3 73,6 ± 2,3 Fe3+ 7,4 ± 1,0 13,2 ± 2,7 18,0 ± 0,6 19,8 ± 4,2 14,7 ± 0,5 16,8 ± 2,9 Co2+ 16,5 ± 2,2 29,3 ± 5,2 n.d. n.d. n.d. n.d. Ni2+ 1,1 ± 0,1 1,9 ± 0,4 n.d. n.d. n.d. n.d.
Los valores son medias ± ES de 6-7 preparaciones independientes y la suma de PCs está expresada en nmol de PCs (equivalentes de GSH) min-1 mg-1. n.d., no detectable
LjPCS1
Extracto dializado Purificada con poli(His)6
Purificada sin poli(His)6
Metal Σ(PCs) % respecto
Cd2+ Σ(PCs) % respecto
Cd2+ Σ(PCs) % respecto
Cd2+
Cd2+ 52,0 ± 6,9 100,0 ± 0,0 87,1 ± 12,8 100,0 ± 0,0 89,4 ± 13,6 100,0 ± 0,0Cu2+ 18,7 ± 2,5 35,9 ± 6,9 19,6 ± 2,9 22,5 ± 4,2 20,2 ± 3,1 22,6 ± 3,2Zn2+ 30,2 ± 4,0 58,1 ± 7,6 40,1 ± 5,9 46,1 ± 1,7 40,2 ± 6,1 45,0 ± 1,5Fe3+ 10,2 ± 1,4 19,7 ± 1,7 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,8 1,3 ± 0,2 1,5 ± 0,9Co2+ 7,6 ± 1,0 14,6 ± 1,9 n.d. n.d. n.d. n.d. Ni2+ 0,8 ± 0,1 1,5 ± 0,7 n.d. n.d. n.d. n.d.
Los valores son medias ± ES de 6-7 preparaciones independientes y la suma de PCs está expresada en nmol de PCs (equivalentes de GSH) min-1 mg-1. n.d., no detectable
Tabla 4.5. Actividad AtPCS1 con metales fisiológicamente relevantes. La actividad se determinó con GSH 5 mM y 500 μM (extracto dializado) o 50 μM (enzima purificada) del correspondiente ion metálico.
Tabla 4.6. Actividad LjPCS1 con metales fisiológicamente relevantes. La actividad se determinó con GSH 5 mM y 500 μM (extracto dializado) o 50 μM (enzima purificada) del correspondiente ion metálico.
Resultados
- 117 -
De forma similar a lo observado en los experimentos con las enzimas sin
purificar, también se detectó la activación de las enzimas purificadas con Fe3+, por lo
que se realizaron dos nuevos experimentos para confirmar de forma inequívoca que la
actividad PCS observada con Fe2+ o Fe3+ era debida exclusivamente a este metal. Para
ello, se utilizaron únicamente las proteínas purificadas sin poli(His)6.
En primer lugar, para eliminar la posibilidad de que el Fe estuviera actuando
como activador al desplazar otros metales unidos a la enzima, una alícuota de AtPCS1
se dializó durante toda la noche en el tampón utilizado para ensayar la actividad
enzimática. Otra alícuota de la misma proteína se dializó en el mismo tampón
conteniendo Chelex, una resina quelante de iones metálicos. La actividad de la enzima
se preservó añadiendo DTT 5 mM al tampón. Tras volver a dializar al día siguiente en
tampón para intercambiar el antioxidante DTT por β-mercaptoetanol (ya que el DTT
interfiere con la determinación de la actividad en nuestras condiciones) se ensayó la
actividad enzimática con Fe3+ 50 μM. La actividad resultó ser la misma en las dos
preparaciones de AtPCS1 (datos no mostrados).
En segundo lugar, se añadió EDTA 500 μM a la mezcla de reacción como
quelante de metales de baja especificidad, con lo que se inhibieron completamente las
actividades AtPCS1 y LjPCS1 con Cd2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+ o Fe3+ (Figura 4.28). Por el
contrario, la adición de 500 μM de DFO, un quelante altamente específico del Fe
(Gower y cols, 1989), únicamente inhibió la actividad cuando se añadieron a la mezcla
de reacción Fe2+ o Fe3+, pero no con el resto de metales (Figura 4.28). Estos resultados
proporcionaron una prueba definitiva de la activación por Fe de AtPCS1 y LjPCS1.
Resultados
- 118 -
Figura 4.28. Activación de AtPCS1 y LjPCS1 por Fe. A, Cromatograma HPLC representativo que muestra la activación de la AtPCS1 purificada después de 30 min de incubación con GSH 5 mM y Cd2+ 50 μM (línea roja) o Fe3+ 50 μM (línea verde). La activación con Fe3+ se inhibió casi completamente con la adición de DFO 500 μM (línea azul). B, Actividad de las enzimas AtPCS1 y LjPCS1 purificadas sin poli(His)6 tras la incubación de 60 μg de proteína con GSH 5 mM y 50 μM de los iones indicados sin DFO (blanco) y con DFO 500 μM (negro). La AtPCS1 fue incubada durante 30 min y la LjPCS1 durante 60 min. Todas las reacciones fueron inhibidas completamente con EDTA 500 μM. Los valores son medias ± ES de 3-4 preparaciones independientes y están expresados como porcentaje respecto a la actividad con Cd2+. Los valores del 100% corresponden a las actividades específicas de 91,2 ± 4,6 (AtPCS1) y 68,3 ± 4,1 (LjPCS1) nmoles de PCs (equivalentes de GSH) por min y por mg de proteína.
0
20
40
60
80
100
Cd2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
AtPCS1Purificada sin poli(His)6
LjPCS1Purificada sin poli(His)6
DFO 500 μM
Sin DFO
Cd2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
Ion metálico (50 μM)
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
18 20 22 24 26 28
A41
2
Cd2+ 50 μM
Fe3+ 50 μM
Fe3+ 50 μMDFO 500 μM
Tiempo (min)
A
B
0
20
40
60
80
100
Cd2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
AtPCS1Purificada sin poli(His)6
LjPCS1Purificada sin poli(His)6
DFO 500 μM
Sin DFO
DFO 500 μM
Sin DFO
Cd2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+
Ion metálico (50 μM)
Act
ivid
ad P
CS
(% re
spec
to a
Cd2
+ )
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
18 20 22 24 26 28
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
18 20 22 24 26 28
A41
2
Cd2+ 50 μM
Fe3+ 50 μM
Fe3+ 50 μMDFO 500 μM
Tiempo (min)
A
B
Resultados
- 119 -
4.4.2. Actividad fitoquelatina sintasa en plantas La actividad PCS se ensayó en raíces de Lotus tratadas con Cd2+ (ver 4.4.4) en las
condiciones descritas en 3.11.4. Desafortunadamente, no se pudo detectar actividad
PCS en este tejido. Sin embargo, la actividad PCS se determinó en radículas de judía y
guisante (Tabla 4.7). Como se puede observar, la actividad PCS únicamente se detectó
en las plantas tratadas con Cd2+ pero, sorprendentemente, no en las plantas control,
donde no se produjeron (h)PCs cuando se incubó el extracto con GSH y Cd2+.
Control Cd2+ 50 μM 3d
Judía n.d. 85,2 ± 21,4
Guisante n.d. 58,7 ± 11,7 a El único producto detectado fue PC2. n.d., actividad no detectable.
Los valores de actividad son medias ± ES de 4-5 extractos de al menos dos series de plantas crecidas independientemente y están expresados en pmol de PCs (equivalentes de GSH) min-1 mg-1.
4.4.3. Análisis western de fitoquelatina sintasas de plantas
La proteína LjPCS1 purificada sin poli(His)6 fue enviada a un servicio especializado
para producir un anticuerpo policlonal monoespecífico que fue purificado por
columnas de afinidad (ver 3.10). En primer lugar, se comprobó que el anticuerpo
reconocía una banda del tamaño adecuado utilizando anticuerpos específicos cedidos
amablemente por otros laboratorios (Figura 4.29). A continuación, se analizó la
expresión de la(s) PCS en las mismas radículas de judía empleadas en la
determinación de actividad PCS en plantas (ver 4.4.2 y Figura 4.29).
Tabla 4.7. Actividad PCS en radículas de judía y guisante tratadas con CdCl2 50 μM durante 3 d. El medio de ensayo contenía GSH 5 mM y Cd2+ 100 μM y la reacción tuvo lugar durante 60 min a 35ºC a.
Resultados
- 120 -
El anticuerpo reconoció dos bandas de tamaño inferior al esperado en las
radículas de judía (≈ 36 y ≈ 20 kD frente a ≈ 56 kD de LjPCS1) (Figura 4.29 A). Este
resultado se confirmó empleando otro anticuerpo generado frente a la PCS de B.
juncea (Figura 4.29 B), que fue cedido amablemente por el Dr. T. Rausch. Se observó
el mismo patrón de bandas en los dos casos cuando las muestras de proteínas se
incubaron con inhibidores de proteasas (imagen no mostrada). También puede
apreciarse un aumento en la expresión de la(s) proteína(s) PCS en radículas de judía
expuestas a Cd2+ (Figura 4.29 A). En la actualidad se están realizando electroforesis
2D y secuenciación del extremo N-terminal de la proteína mediante espectrometría de
masas, en colaboración con el Dr. J. Abián, para confirmar que las bandas que
reconoce nuestro anticuerpo se deben a una auténtica PCS.
La expresión de las proteínas LjPCS1, LjPCS2 y LjPCS3 en E. coli se analizó
también utilizando un anticuerpo monoclonal comercial que reconoce la poli(His)6
(Figura 4.30). Los resultados indican que la expresión heteróloga de LjPCS2 y
Figura 4.29. A, Análisis western de las PCS en radículas de judía de 10 d de edad (C) y tratadas con CdCl2 50 μM durante 3 d (Cd2+) utilizando el anticuerpo de Lotus. Se muestran dos réplicas significativas de un total de 3-4 repeticiones de plantas crecidas independientemente. En la imagen puede observarse un aumento en la expresión de la proteína con el Cd2+. Se cargaron 50 μg de proteína en cada carril. B, Idénticos extractos que en A, utilizando un anticuerpo que reconoce la PCS de B. juncea diluido 1:750. Los dos anticuerpos reconocen una banda de ≈ 36 kD, mientras que únicamente el anticuerpo de Lotus (A) reconoce una banda adicional de ≈ 20 kD. La masa molecular teórica de las PCS de plantas superiores se encuentra por encima de 45 kD.
28,9
36,6
28,9
20,0
36,6
C Cd2+ C Cd2+
A
C Cd2+ C Cd2+
B
28,9
36,6
28,9
20,0
36,6
C Cd2+ C Cd2+
A
C Cd2+ C Cd2+
B
Resultados
- 121 -
LjPCS3 en E. coli produce muy poca cantidad de proteína en la fracción soluble en
comparación con LjPCS1, lo que impidió la determinación de la actividad de las
proteínas recombinantes LjPCS2 y LjPCS3 en nuestras condiciones.
4.4.4. Fitoquelatinas en plantas
La síntesis de (h)PCs en plantas se estudió mediante tres experimentos: (1)
determinación del contenido de (h)PCs en plantas de Arabidopsis y Lotus tratadas con
los mismos metales que activaron las enzimas recombinantes in vitro (ver 4.4.1); (2)
cuantificación de (h)PCs en las radículas de judía y guisante en las que se ensayó la
actividad PCS (ver 4.4.2); y (3) análisis de la síntesis de Cys y del contenido de (h)PCs
en plantas de Lotus sometidas a distintos tiempos de exposición a Cd2+.
En el experimento (1), las plantas de Arabidopsis y Lotus se trataron durante 4
d con concentraciones 100 veces superiores de Cu2+ o Zn2+, y hasta 20 veces
superiores de Fe3+ (ver 3.3), a las concentraciones que alcanzan estos metales en las
soluciones nutritivas. También se incluyó el Cd2+ como control positivo para la síntesis
Figura 4.30. Análisis western de las proteínas LjPCS1, LjPCS2 y LjPCS3 expresadas en E. coli. La inducción de la expresión se realizó como se decribe en 3.8. Para cada proteína se cargó un carril correspondiente a la fracción soluble (S) de las bacterias después de sonicarlas y otro carril correspondiente al precipitado resultante de la sonicación después de resuspenderlo en urea 6 M (P). Se utilizó una dilución 1:3000 de un anticuerpo anti-poli(His)6 y la membrana se reveló mediante el método de la fosfatasa alcalina (ver 3.10 y Tabla 3.14). En cada carril se cargaron 2 μg de proteína recombinante.
S P S P S P
29,1
37,3
54,3
20,2
94,9115,4
204,1
LjPCS1 LjPCS2 LjPCS3
S P S P S P
29,1
37,3
54,3
20,2
94,9115,4
204,1
LjPCS1 LjPCS2 LjPCS3
Resultados
- 122 -
de (h)PCs. Las (h)PCs se determinaron en las plantas enteras de Arabidopsis o en
raíces de Lotus. Los tratamientos con los diferentes metales no causaron ningún
síntoma aparente de toxicidad en las plantas de Lotus, mientras que el Cu2+ y Fe3+
tuvieron efectos negativos leves en el crecimiento de Arabidopsis y el tratamiento con
Zn2+ causó una ligera estimulación en su crecimiento. La exposición a Cd2+ indujo la
acumulación de PC3, PC2 y PC4 (en orden decreciente) en las plantas de Arabidopsis, y
de PC3, PC4 y PC2 en las raíces de Lotus (Figura 4.31). No obstante, en Lotus la
cantidad total de hPCs fue muy superior a la de PCs. El orden de las hPCs acumuladas
fue hPC3 >> hPC2 > hPC4. Los tratamientos con Cu2+ o Zn2+ 100 μM también
indujeron la síntesis de PCs en ambas especies, aunque en proporciones (5-13% con
Cu2+ y 0,5-1,5% con Zn2+) muy inferiores respecto al Cd2+ (Figura 4.31).
Curiosamente, en las raíces de Lotus el Zn2+ indujo preferentemente la formación de
hPCs (igual que el Cd2+) pero el Cu2+ produjo un efecto mayor en la síntesis de PCs.
Los tratamientos con Fe3+ (200-500 μM) o Ni2+ (100 μM) prácticamente no causaron
(< 1%) la acumulación de (h)PCs (Figura 4.31).
Como era previsible, en el experimento (2) se comprobó que las (h)PCs se
sintetizaron exclusivamente en las radículas de las plantas tratadas con Cd2+ y no
pudieron ser detectadas en las plantas control (Figura 4.32).
Finalmente, en relación al experimento (3), en primer lugar se optimizó una
técnica cromatográfica de HPLC para el ensayo de las actividades enzimáticas SAT y
OASTL, responsables de la biosíntesis de Cys (ver 3.11.3), uno de los factores
reguladores de la síntesis de (h)GSH y (h)PCs; y por último, se analizó la acumulación
de (h)PCs en plantas de Lotus sometidas a diferentes tiempos de exposición a Cd2+.
Se emplearon raíces, nódulos y mitocondrias purificadas de nódulos de judía
para la optimización de la técnica cromatográfica y, además, se determinó la actividad
OASTL en las mismas raíces de Lotus utilizadas para el estudio de la acumulación de
(h)PCs tras el tratamiento con Cd2+. Los resultados se muestran en la Tabla 4.8 y
Figura 4.33. Como puede observarse, la mayor actividad específica SAT corresponde
a la que se obtiene en las mitocondrias de nódulos, seguida de la de nódulos y raíces de
judía. En cuanto a la actividad OASTL, no se observaron cambios significativos en
raíces de Lotus tras la exposición a Cd2+.
Resultados
- 123 -
Figura 4.32. Contenido de (h)PCs en radículas de guisante y judía tratadas con Cd2+ 50 μM durante 3 d. Los valores son medias ± ES de 3-4 extractos de plantas de series independientes y están expresadas por gramo de peso fresco. La actividad PCS se determinó en las mismas plantas de guisante y judía (ver Tabla 4.7). Se han utilizado los mismos códigos de colores para las (h)PCs producidas que en la Figura 4.25.
0
3
6
9
12
0
3
6
9
12
(h)P
Cs
(nm
olg-1
)
Guisante Judía
Cd2+ (50 μM)
PCs hPCs PCs hPCs0
3
6
9
12
0
3
6
9
12
(h)P
Cs
(nm
olg-1
)
Guisante Judía
Cd2+ (50 μM)
PCs hPCs PCs hPCs
Figura 4.31. Síntesis de PCs y hPCs en A, Arabidopsis y B, Lotus en respuesta a distintos metales. Las plantas se trataron durante 4 d con Cd2+ 100 μM, Cu2+ 100 μM, Zn2+ 100 μM, Ni2+ 100 μM o Fe3+ 200-500 μM. La figura muestra el contenido de (h)PCs en las plantas enteras de Arabidopsis y en las raíces de Lotus. Las plantas control (sin tratar) y las tratadas con Fe3+ o Ni2+ no sintetizaron cantidades detectables de (h)PCs. El código de colores para las (h)PCs producidas es el mismo que en la Figura 4.25. Los valores son medias ± ES de 3-4 extractos de plantas y están expresados en nmoles de (h)PCs (equivalentes de GSH) por gramo de peso fresco.
Ion metálico (100 μM)
0
100
200
300
0
100
200
300
0
5
10
15
0
5
10
15
PCs hPCs PCs hPCs PCs hPCs
Arabidopsis Arabidopsis
Lotus Lotus
A
B
PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs
A
B
Cd2+ Cu2+ Zn2+
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )(h
)PC
s(n
mol
g-1 )
Ion metálico (100 μM)
0
100
200
300
0
100
200
300
0
5
10
15
0
5
10
15
PCs hPCs PCs hPCs PCs hPCs
Arabidopsis Arabidopsis
Lotus Lotus
A
B
PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs
A
B
Cd2+ Cu2+ Zn2+
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )(h
)PC
s(n
mol
g-1 )
0
100
200
300
0
100
200
300
0
5
10
15
0
5
10
15
PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs
Arabidopsis Arabidopsis
Lotus Lotus
A
B
PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs PCs hPCsPCs hPCs
A
B
Cd2+ Cu2+ Zn2+
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )(h
)PC
s(n
mol
g-1 )
Resultados
- 124 -
Nódulos Mitocondrias de nódulos Raíces
SAT (nmol min-1 mg-1) 10,1 ± 2,8 14,9 ± 2,6 1,2 ± 0,1
OASTL (nmol min-1 mg-1) 63,0 ± 11,7 25,2 ± 1,1 109,3 ± 7,9
a Los valores de actividad son medias ± ES de 4-5 muestras de al menos dos series independientes de plantas y están expresadas por mg de proteína.
Sin embargo, se observó una acumulación progresiva de (h)PCs en las plantas
de Lotus en respuesta al Cd2+ (Figura 4.34 A). Esta acumulación se hizo
especialmente evidente a partir de las 6 h de tratamiento, y alcanzó valores máximos
de (h)PCs cuando las plantas se trataron con Cd2+ 200 μM durante 96 h. Como puede
apreciarse (Figura 4.34 A), se sintetizó mayor cantidad de hPCs que de PCs en cada
punto del tratamiento, y las hPCs se acumularon en las raíces de Lotus siguiendo el
orden hPC3 >> hPC2 > hPC4. La concentración de (h)PCs en nódulos sólo resultó
significativa en los tratamientos con Cd2+ 100 μM y 200 μM durante 96 h (Figura
4.34 B). No pudieron detectarse (h)PCs en las hojas.
Tabla 4.8. Actividades SAT y OASTL en judía a.
Figura 4.33. Actividad OASTL en raíces de Lotus expuestas a Cd2+ 100 μM durante 0, 3, 6, 24 o 96 h, y a CdCl2 200 μM durante 96 h (96 h*). Los valores son medias ± ES de 5-6 muestras de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. La actividad está expresada por gramo de peso fresco.
Act
ivid
ad O
AST
L(n
mol
min
-1 g
-1)
0 h0
50
100
150
200
250
300
3 h 6 h 24 h 96 h 96 h*
Act
ivid
ad O
AST
L(n
mol
min
-1 g
-1)
0 h0
50
100
150
200
250
300
3 h 6 h 24 h 96 h 96 h*
Resultados
- 125 -
Figura 4.34. Acumulación de (h)PCs en plantas de Lotus expuestas a Cd2+ 100 μM durante 0, 3, 6, 24 o 96 h, y a Cd2+ 200 μM durante 96 h (96 h*). Los valores del contenido de (h)PCs son medias ± ES de 5-6 extractos de al menos dos series de plantas crecidas independientemente. Los valores están expresados por gramo de peso fresco. Se representa el contenido de (h)PCs de A, raíces y B, nódulos, puesto que no se detectaron (h)PCs en hojas. El gráfico interior en A muestra el detalle de la acumulación de (h)PCs hasta las 24 h de tratamiento con Cd2+ 100 μM. En el caso de los nódulos (B), sólo se han representado los tratamientos control (0 h), Cd2+ 100 μM 96 h y Cd2+ 200 μM 96 h (96 h*), puesto que no se observó una acumulación significativa de (h)PCs hasta las 96 h de tratamiento. Los códigos de colores empleados para las (h)PCs son los mismos que los de la Figura 4.25.
0
5
10
15
20
25
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )
0
50
100
150
200
0
10
20
30
0 h 3 h 6 h 24 h 96 h 96 h*
0 h 3 h 6 h 24 h
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )
A
B
Raíces
Nódulos
0 h 96 h 96 h*
PCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCs
PCs hPCsPCs hPCsPCs hPCs0
5
10
15
20
25
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )
0
50
100
150
200
0
10
20
30
0 h 3 h 6 h 24 h 96 h 96 h*
0 h 3 h 6 h 24 h
(h)P
Cs
(nm
olg-
1 )
A
B
Raíces
Nódulos
0 h 96 h 96 h*
PCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCsPCs hPCs
PCs hPCsPCs hPCsPCs hPCs
Discusión
Discusión
- 129 -
5. DISCUSIÓN
5.1. Metabolismo del ascorbato en nódulos
Los nódulos sintetizan ascorbato de novo
Los datos previos a la realización de esta Tesis indicaban que los nódulos de guisante
tienen una capacidad muy limitada para sintetizar ASC per se (Groten y cols, 2005).
Éstos y otros autores (Puppo y cols, 2005) propusieron que el ASC presente en los
nódulos proviene de otras partes de la planta, en particular de las raíces y, sobre todo,
de las hojas. Según esto, los nódulos dependerían de otros órganos de la planta para
obtener su antioxidante soluble más abundante y uno de los más importantes para el
correcto funcionamiento celular. Por este motivo, se decidió investigar si la baja
capacidad de los nódulos para sintetizar ASC es un hecho común a todas las
leguminosas.
En primer lugar se determinaron el contenido de ASC total y la actividad
GalLDH en cuatro especies de leguminosas, dos de nódulos de tipo indeterminado
(alfalfa y guisante) y dos de tipo determinado (judía y Lotus). La comparación de
ambos tipos de nódulos es interesante porque presentan características morfológicas y
fisiológicas distintas y podrían diferenciarse en su capacidad para sintetizar ASC.
También se midió la actividad APXc, una proteína muy abundante en el nódulo y que
consume gran cantidad de ASC (Dalton y cols, 1987). Estos experimentos permitieron
concluir que los nódulos de las cuatro especies presentan una actividad GalLDH
mayor que las correspondientes hojas y raíces. Por el contrario, el contenido de ASC
total en los nódulos fue mucho menor que en hojas y sólo ligeramente mayor que en
raíces. Estos resultados sugieren diferencias entre los distintos órganos de la planta en
la síntesis, transporte, consumo o degradación del ASC. El transporte y la degradación
son aspectos del metabolismo del ASC que están empezando a conocerse en la
actualidad (Hancock y Viola, 2005). Por tanto, no puede descartarse que el bajo
contenido de ASC total en el nódulo, en relación a la hoja, sea debido a un mayor
Discusión
- 130 -
consumo para actuar como precursor de otras moléculas (DeBolt y cols, 2007). Estas
diferencias también pueden deberse a la presencia de rutas alternativas de biosíntesis
de ASC (Valpuesta y Botella, 2004), a una regulación diferencial de la GalLDH por la
luz o a la inhibición de la enzima mediante un mecanismo de retroalimentación por
altas concentraciones de ASC en las hojas, tal como se observó en células de tabaco
(Tabata y cols, 2002). Podría también ocurrir que la enzima de hojas sea mucho más
lábil que la de nódulos. De hecho, se encontró que la actividad GalLDH en hojas que
fueron congeladas a -80ºC disminuyó ≈ 90% respecto a la actividad de las hojas
procesadas en fresco, mientras que en nódulos no sucedió lo mismo. Finalmente, es
posible que la GalLDH no sea la enzima reguladora de la ruta de biosíntesis de ASC y
que, por tanto, no pueda correlacionarse la actividad GalLDH con el contenido de
ASC. La identidad de la GalLDH se confirmó mediante la purificación de las
mitocondrias de nódulos de judía y la determinación de su actividad utilizando
diferentes sustratos. La GalLDH de mitocondrias purificadas de judía presenta una
especificidad absoluta por el sustrato L-GalL, como ya había sido descrito con
anterioridad en otras especies (Ôba y cols, 1995; Østergaard y cols, 1997), siendo
completamente inactiva con su isómero D-GalL o con el análogo L-GulL (Siendones y
cols, 1999).
Además de caracterizar por primera vez el gen GalLDH de Lotus, se determinó
su nivel de expresión en hojas, raíces y nódulos de esta especie, junto al de otros tres
genes implicados en la ruta principal de biosíntesis de ASC: GMP, GME y GalDH
(Wheeler y cols, 1998; Dowdle y cols, 2007). Los resultados demostraron que los
nódulos expresan algunos genes de enzimas clave de la biosíntesis de ASC, como
GalDH y GalLDH, cuya única función conocida es la de sintetizar este compuesto. No
obstante, recientemente se ha propuesto que la GalLDH, además de sintetizar ASC,
podría desempeñar un papel adicional en la regulación de procesos relacionados con el
crecimiento celular en plantas de tomate (Solanum lycopersicum) (Alhagdow y cols,
2007).
Asimismo, se localizó el transcrito de GalLDH en nódulos de alfalfa y Lotus
mediante hibridación in situ. Los resultados sugieren una estrecha correlación entre la
expresión del gen y la fijación de N2, ya que se observó que GalLDH se transcribe más
Discusión
- 131 -
abundantemente en la zona infectada de los nódulos de estas dos leguminosas.
Resultados similares se obtuvieron al determinar la actividad GalLDH y la
concentración de ASC total en las distintas zonas de nódulos diseccionados de alfalfa
y judía. No obstante, el ápice de los nódulos de alfalfa mostró niveles bajos de
expresión del gen, aunque la actividad GalLDH y el contenido de ASC total fueron
elevados. Esto sugiere que la concentración de ASC en nódulos está regulada, al
menos en parte, postranscripcionalmente, o bien que existe un un transporte de ASC
desde la zona infectada al ápice. La relación entre contenido de ASC y fijación de N2
fue establecida por primera vez hace más de 30 años (Swaraj y Garg, 1970; Bashor y
Dalton, 1999), vinculando el aumento en la nodulación con el aporte externo de ASC.
Nuestros resultados apoyan la idea de que el ASC es necesario para la nodulación y la
fijación de N2. La distribución del ASC en los distintos tejidos de los nódulos de
alfalfa y judía coincide con la hallada para el (h)GSH en nódulos de guisante y judía
(Matamoros y cols, 1999b). La abundancia de ASC y (h)GSH en la zona infectada de
los nódulos es indicativa de que ambos antioxidantes cooperan en la eliminación de
H2O2 mediante el ciclo ASC-GSH, ya que la APXc está localizada principalmente en
esta zona del nódulo (Dalton y cols, 1993a; Dalton y cols, 1998). El papel protector del
ASC y los tioles en la fijación de N2 puede ser importante porque la nitrogenasa, Lb y
otras proteínas abundantes en el nódulo son propensas a la oxidación por ROS (Dalton
y cols, 1986). Sin embargo, el ASC y los tioles son también muy abundantes en el
ápice nodular (Matamoros y cols, 1999b), lo que sugiere que pueden desempeñar
funciones adicionales en la simbiosis. Se ha sugerido que el ASC y el GSH son
necesarios para la división y la elongación celular (Vernoux y cols, 2000; Potters y
cols, 2004) y para la percepción del estrés y la señalización (Foyer y Noctor, 2005a).
Por tanto, es previsible que en los nódulos las elevadas tasas de división celular en el
meristemo (zona I) y la formación de los cordones de infección en la zona de invasión
(zona II) requieran ASC y tioles. Por ejemplo, el ASC es cofactor de la enzima prolil-
hidroxilasa (Arrigoni y cols, 1977), que interviene en la síntesis de las glicoproteínas
ricas en hidroxi-Pro, muy abundantes en el lumen de los cordones de infección en los
nódulos (Rathbun y cols, 2002). También se ha observado que las proteínas ricas en
hidroxi-Pro son abundantes en las paredes de las células corticales y meristemáticas en
Discusión
- 132 -
soja (Ye y Varner, 1991), y que la enzima MR está localizada fundamentalmente en
las paredes celulares de los nódulos. Esta enzima puede regenerar el ASC consumido
en las reacciones de hidroxilación de residuos de Pro e intervenir tanto en el
mantenimiento del estado redox de las proteínas de las paredes celulares como en la
lignificación (Dalton y cols, 1993a).
Una vez demostrado que el ASC presente en el nódulo, o al menos gran parte de
éste, es sintetizado por una genuina GalLDH, el siguiente objetivo fue estudiar el
metabolismo del ASC en nódulos de judía sometidos a distintos estreses y durante la
senescencia natural. Esta leguminosa fue escogida debido a su interés agronómico, la
gran producción de nódulos necesaria para los estudios de senescencia, la
disponibilidad de datos fisiológicos, bioquímicos y moleculares y su facilidad de
transformación (Gogorcena y cols, 1997; Matamoros y cols, 1999b; Ramírez y cols,
2005; Estrada-Navarrete y cols, 2007).
Metabolismo del ascorbato en nódulos en condiciones de estrés
Al igual que en el caso de Lotus, los resultados obtenidos en esta Tesis indican que
varios genes de la ruta principal de biosíntesis de ASC en plantas, en concreto GMP,
GME, GalPP, GalDH y GalLDH, se expresan en nódulos de judía. Sin embargo, de
los resultados obtenidos se concluye que los estreses abiótico y oxidativo no provocan
una regulación coordinada de la expresión de estos genes, salvo el descenso
generalizado observado en los niveles de mRNA tras el tratamiento con Cd2+. GalLDH
fue el gen que más moduló su expresión en respuesta a los diferentes estreses. Así,
además del descenso observado con Cd2+, la expresión de GalLDH disminuyó durante
el estrés oxidativo causado por H2O2. Por el contrario, el JA incrementó notablemente
los niveles de expresión de GalLDH. No obstante, ninguna de las variaciones
observadas en los niveles de mRNA de este gen se vieron reflejadas en la
correspondiente actividad GalLDH ni en el contenido de ASC total. La falta de
correlación entre expresión génica, actividad enzimática y contenido de ASC total
sugiere que la GalLDH es regulada, al menos, postranscripcionalmente, y que ésta no
es la enzima determinante del contenido de ASC en el nódulo en condiciones de estrés.
Esta conclusión contrasta con varios trabajos publicados, que muestran una estrecha
Discusión
- 133 -
correlación entre la expresión o la actividad de GalLDH y el contenido de ASC en
respuesta a la luz (Tabata y cols, 2002; Tamaoki y cols, 2003), maduración del fruto
(Pateraki y cols, 2004) y jasmonatos (Sasaki-Sekimoto y cols, 2005). Por el contrario,
otros autores no han encontrado ninguna relación entre el contenido de ASC y la
expresión y actividad de la GalLDH en hojas de trigo en condiciones control o de
estrés hídrico, sugiriendo una regulación postraduccional de la enzima (Bartoli y cols,
2005). En conjunto, estos resultados indican que el control de la síntesis de ASC puede
variar según la especie, el órgano estudiado o el tipo de estrés aplicado. Por otra parte,
no pudieron detectarse en los nódulos las actividades de otras dos enzimas que
participan en rutas alternativas de biosíntesis de ASC en plantas (D-galacturonato
reductasa y L-gulono-1,4-lactona oxidasa/deshidrogenasa). Este hecho sugiere que la
principal ruta de síntesis de ASC en nódulos es la ruta Smirnoff-Wheeler (Wheeler y
cols, 1998), al menos en las condiciones experimentales empleadas.
Los cocientes ASC/DHA, GSH/GSSG, Cys/cistina y NAD(P)H/NAD(P)+ se
consideran fundamentales en la regulación del estado redox celular y en la modulación
de señales celulares específicas (Noctor, 2006). Sin embargo, el estado redox del ASC
de nódulos de judía sólo disminuyó significativamente en respuesta al JA, como se
discutirá más adelante. Por tanto, estos resultados sugieren que los estreses abiótico y
oxidativo no dan lugar a cambios en el estado redox global del ASC en el nódulo
entero. No obstante, no se puede excluir la posibilidad de que los cambios en el estado
redox del ASC sean demasiado rápidos o sutiles como para ser detectados por los
métodos experimentales tradicionales, o bien que se produzcan variaciones
significativas en orgánulos o compartimentos específicos que sean los responsables de
transmitir la información que desencadene la respuesta de la planta al estrés. Por
ejemplo, se ha propuesto que los cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas y el
apoplasto son fuentes muy importantes de señales redox (Pignocchi y Foyer, 2003;
Fey y cols, 2005; Foyer y Noctor, 2005b). Por otra parte, hay otros factores de tipo
experimental que pueden modificar artefactualmente el estado de oxidación del ASC y
generar resultados erróneos. Así, nuestros datos muestran que existe una rápida caída
en el estado redox del ASC (del 85,4% al 45,7%) en los nódulos que se mantienen en
hielo durante 10 min después de cosecharlos, respecto a los sumergidos
Discusión
- 134 -
inmediatamente en N2 líquido. En las hojas, el efecto es aún mayor. El significado
biológico de esta rápida caída del estado redox del ASC es desconocido, pero podría
tratarse de una respuesta del nódulo ante una herida, provocada en este caso al arrancar
el nódulo de la raíz.
También se analizó la respuesta de las enzimas del ciclo ASC-GSH a las
situaciones de estrés inducidas en los nódulos. Este ciclo elimina H2O2 y proporciona
protección frente al estrés oxidativo (Noctor y Foyer, 1998; Hernández y cols, 2000).
Además, varios trabajos han mostrado que es esencial para el correcto funcionamiento
celular y el proceso de fijación de N2 (Dalton y cols, 1986; Dalton y cols, 1998). En
general, los resultados obtenidos en esta Tesis muestran que, bajo las condiciones
experimentales empleadas, las actividades APX, GR, MR y DR se mantienen
inalteradas en respuesta a situaciones de estrés. Sin embargo, estas actividades se
ensayaron en extractos de nódulos enteros, así que tampoco se puede descartar que
existan variaciones en la actividad de isoenzimas presentes en compartimentos
específicos de la célula (Gómez y cols, 1999; Leterrier y cols, 2005).
Efecto del jasmonato en el metabolismo del ascorbato en los nódulos
Existe, sin embargo, una excepción a la ausencia de cambios en las actividades de las
enzimas del ciclo ASC-GSH en los nódulos que merece ser discutida más
detalladamente: la inhibición de actividad DR en respuesta al JA. Los jasmonatos son
hormonas presentes ubicuamente en las plantas que están implicadas en procesos
como la germinación, crecimiento de la raíz, progresión del ciclo celular, maduración
de los frutos, senescencia y señalización en la defensa frente a estreses abióticos y
bióticos (Creelman y Mullet, 1997; Devoto y Turner, 2003; Wasternack, 2007). No
obstante, la función de los jasmonatos en el nódulo maduro es prácticamente
desconocida, mientras que unos pocos estudios han sugerido su implicación durante el
proceso de la nodulación (Fortes y cols, 2005; Miwa y cols, 2006; Nakagawa y
Kawaguchi, 2006; Sun y cols, 2006). Como ya se ha comentado anteriormente, el
tratamiento con JA causó un incremento en la expresión de GalLDH, pero la actividad
GalLDH y el contenido de ASC total en el nódulo se mantuvieron constantes, mientras
que el estado redox del ASC disminuyó significativamente. Sin embargo, el efecto más
Discusión
- 135 -
dramático causado por el JA fue la inhibición total de la actividad DR dependiente de
GSH. En Arabidopsis, por el contrario, el JA aumentó los niveles de mRNA de DR,
MR, γECS y GSHS, además de la actividad DR y el contenido de ASC (Xiang y
Oliver, 1998; Sasaki-Sekimoto y cols, 2005), y el metil-JA aumentó la expresión de
GME (Wolucka y cols, 2005). En brócoli (Brassica oleracea), el metil-JA también
aumentó los niveles de mRNA de AO y de las APX, MR y GR citosólicas, pero
disminuyó los de GalLDH y los de las enzimas cloroplásticas del ciclo ASC-GSH
(Nishikawa y cols, 2003). Con el fin de obtener más información sobre la inhibición de
la actividad DR por el JA, se decidió investigar en detalle el efecto temporal del JA
sobre los niveles de mRNA, proteína y actividad de esta enzima. También se incluyó
en este estudio a la AO, ya que esta enzima, junto a la DR, ha sido implicada en el
control del estado redox del ASC (Pignocchi y cols, 2003; Chen y Gallie, 2006).
La inhibición de la actividad DR por JA resultó ser específica de los nódulos, ya
que este efecto no se observó en hojas ni en raíces. La expresión de los genes de las
DR cloroplástica y citosólica de judía se mantuvo constante o aumentó
significativamente a lo largo del tiempo de exposición a JA. Estos datos, junto con el
análisis western en el que se observa una expresión similar de la proteína en nódulos
control y tratados con JA, sugieren una regulación postraduccional de la DR en
nódulos de judía en respuesta al JA. Recientemente, se ha sugerido una posible
regulación postraduccional mediante S-glutationilación de la DR en plantas de
Arabidopsis sometidas a estrés oxidativo (Dixon y cols, 2005).
De forma opuesta a la inhibición de la actividad DR, en nódulos de plantas de
judía tratadas con JA se pudo observar un aumento gradual de la actividad AO. En este
caso, los resultados obtenidos del análisis de la expresión del gen AO sugieren un
control transcripcional en respuesta al JA, ya que se observa un aumento considerable
en los niveles de mRNA a las 6 h de exposición, manteniéndose elevados durante el
resto del tratamiento. El desfase entre la rápida acumulación del transcrito (a las 6 h) y
el aumento de actividad (observada a partir de 24 h) se debe, probablemente, al retraso
entre la transcripción del gen en el núcleo y la traducción del mRNA a proteína en los
ribosomas. La función de la AO no está completamente establecida, aunque se piensa
que interviene en el crecimiento celular, en la percepción de situaciones de estrés y en
Discusión
- 136 -
la modulación de las respuestas de defensa mediante la regulación del estado redox del
ASC en el apoplasto (Pignocchi y Foyer, 2003; De Tullio y cols, 2004; Fotopoulos y
cols, 2006; Pignocchi y cols, 2006; De Tullio y cols, 2007). Otros autores también
observaron una inducción diferencial de la expresión de distintos genes de AO en
función del tejido, el estado de desarrollo y en respuesta a varios estímulos externos en
melón (Cucumis melo), incluido el tratamiento con JA, aunque no mostraron datos
sobre la actividad AO (Sanmartin y cols, 2007).
En nódulos de judía expuestos a JA, el aumento en la expresión y actividad de
la AO, junto con la inhibición de la actividad DR dependiente de GSH, nos lleva a
proponer el mecanismo representado en la Figura 5.1. Se ha sugerido un sistema de
transporte entre el apoplasto y la célula mediante el cual el ASC es transportado al
apoplasto, bien directamente (Maurino y cols, 2006), o bien mediante un intercambio
con DHA (Horemans y cols, 2000). El DHA apoplástico sería devuelto a la célula para
ser reciclado de nuevo a ASC mediante la actividad DR dependiente de GSH. El
efecto causado por el JA en los nódulos es un descenso en el estado redox del ASC del
nódulo entero. Presumiblemente, este efecto será más marcado en el apoplasto debido
al aumento de actividad AO con JA; además, existen otras proteínas con actividad DR
en el interior de la célula que pueden suplir, al menos en parte, la carencia de actividad
DR provocada por el JA. Es posible que la producción de esta hormona en la planta
actúe como una señal mediante la cual los nódulos perciben situaciones de estrés y que
implique la rápida oxidación del ASC en el apoplasto (Conklin y Barth, 2004). Por
ejemplo, se ha sugerido recientemente que el JA está implicado en la adaptación de la
cebada (Hordeum vulgare) al estrés salino (Walia y cols, 2007) y que el metil-JA
induce la acumulación de H2O2 en hojas de tomate como parte de la respuesta
defensiva de esta planta a las heridas (Orozco-Cárdenas y cols, 2001). Además, el
efecto del JA en los nódulos no se produce por una acción directa de la hormona sobre
las enzimas, puesto que la adición de JA a un extracto de nódulos no modifica las
actividades AO o DR. Más bien, el JA parece generar en el nódulo una señal que lleva
a la inducción transcripcional de la AO y a la inhibición postraduccional de la DR.
Como consecuencia, el estado redox del ASC desciende, lo cual se traduciría en una
señal para activar mecanismos de respuesta de los nódulos al estrés.
Discusión
- 137 -
Metabolismo del ascorbato durante la senescencia natural del nódulo
Varios estudios previos sobre la senescencia natural de los nódulos mostraron un
descenso en la síntesis y contenido de ASC y tioles, junto con un incremento en la
concentración de H2O2, peróxidos de lípidos, proteínas oxidadas y bases modificadas
del DNA (Evans y cols, 1999; Matamoros y cols, 1999a; Alesandrini y cols, 2003). No
obstante, en otros casos no se obtuvieron evidencias de un aumento en la producción
de ROS (Groten y cols, 2005; Puppo y cols, 2005). En esta Tesis se ha intentado
extender nuestro conocimiento sobre cómo la edad de la planta (y la de los nódulos)
afecta a las defensas antioxidantes en los nódulos de leguminosas, y sobre si éstas
tienen un papel importante en el proceso de la senescencia natural (regulación
endógena) o, por el contrario, son más importantes otros factores provenientes del
resto de la planta (regulación sistémica). Las plantas de judía de 50-53 d de edad
(nódulos de 43-46 d) empleadas con este fin presentaron al menos dos poblaciones de
Figura 5.1. Modelo propuesto de acción del JA en nódulos. El tratamiento con JA causa una activación (+) transcripcional de la AO y una inhibición (-) postraduccional de la DR dependiente de GSH. Esto provoca que el ASC se oxide rápidamente en el apoplasto y también en el interior de la célula, lo que actuaría como una señal celular. En negrita están representados aquellos cambios que significan aumentos, y en letras de color gris los cambios que suponen descensos.
ￚASC
MDHA
DHA
ASC
MDHA
DHA
JA
↓ % ASC/(ASC+DHA)
GSH
GSSGDR
Apoplasto Célula
AO
COOH
O
Señal
+ￚASC
MDHA
DHA
ASC
MDHA
DHA
JA
↓ % ASC/(ASC+DHA)
GSH
GSSGDR
Apoplasto Célula
AO
COOH
O
COOH
O
Señal
+
Discusión
- 138 -
nódulos, que se denominaron S1 y S2 de acuerdo a su contenido de Lb y proteína
soluble total. La oxidación de proteínas claramente aumentó con la edad del nódulo,
demostrando la existencia de un estrés oxidativo en los nódulos senescentes. No
obstante, los nódulos S1 presentaron un moderado descenso en el contenido de Lb y
proteínas solubles, por lo que, probablemente, todavía retienen cierta capacidad para
fijar N2.
Varios autores (Groten y cols, 2006), asumiendo que los nódulos son incapaces
de sintetizar ASC, han sugerido que el transporte de este metabolito desde las hojas
regula la senescencia nodular. No obstante, la coexistencia en plantas de judía de dos
poblaciones de nódulos en diferentes estadios de senescencia indica que el
envejecimiento del nódulo está determinado, al menos en parte, por factores
endógenos. Aunque la senescencia es un proceso muy complejo en el que intervienen
múltiples factores, como la proporción C:N en los nódulos o ciertas hormonas como el
ácido abscísico (Puppo y cols, 2005), los resultados presentados en esta Tesis sugieren
que los sistemas antioxidantes, y en particular el ASC, son cruciales en el progreso del
envejecimiento nodular. Así, los datos obtenidos muestran una pérdida progresiva del
contenido de ASC total con la senescencia. En los nódulos S1, éste disminuyó un 60%,
mientras que los nódulos S2 prácticamente carecieron de ASC. El estado redox del
ASC en nódulos S1 no sufrió variaciones significativas, probablemente porque la
actividad DR en los nódulos S1 es similar a la de nódulos control pero la actividad AO
disminuye, conservándose de esta forma la capacidad para mantener el ASC en un
estado mayoritariamente reducido. Por el contrario, los nódulos S2 presentan un estado
redox del ASC muy bajo en comparación con los nódulos S1 y los controles. Así pues,
en general podemos establecer una relación entre el descenso de la biosíntesis de ASC
en el nódulo y la senescencia natural, lo que sugiere un papel importante del ASC en el
progreso de la senescencia del nódulo (Groten y cols, 2006) y, probablemente, de la
planta entera (Barth y cols, 2004; Barth y cols, 2006).
Discusión
- 139 -
5.2. Metabolismo de los tioles en nódulos
Metabolismo de tioles en nódulos en condiciones de estrés
El metabolismo de los tioles en nódulos de judía sometidos a estreses abiótico y
oxidativo se investigó de manera similar a la descrita en el caso del ASC. Es decir, se
analizó el contenido de tioles, el estado redox del (h)GSH, la expresión de los genes y
proteínas tiol-sintetasas y sus correspondientes actividades enzimáticas. La expresión
de los genes γECS y hGSHS no sufrió modificaciones bajo las diferentes condiciones
de estrés, excepto en el caso del tratamiento con H2O2, en el que aumentaron
moderadamente los niveles de mRNA. Sin embargo, la actividad hGSHS se mantuvo
en valores similares a los controles, mientras que la actividad γECS disminuyó en
todos los casos. De forma similar, la utilización de un anticuerpo policlonal
monespecífico de γECS de judía obtenido en nuestro laboratorio reveló que la
expresión de esta proteína desciende en todos los tratamientos a los que se sometieron
las plantas, lo que sugiere una regulación traduccional de la γECS en nódulos de judía
en condiciones de estrés abiótico y oxidativo. A pesar del descenso en la actividad
γECS, el contenido de (h)GSH total no disminuyó respecto a los nódulos control en los
diferentes tratamientos, aunque sí lo hizo el contenido de Cys (en todos los estreses) y
de γEC (en los estreses por NaCl y Cd2+).
Los resultados obtenidos en esta Tesis indican que la expresión del gen γECS no
determina el nivel de la proteína ni su actividad enzimática, y que esta última se
encuentra sujeta a una regulación traduccional en los nódulos. Se ha propuesto que la
actividad γECS constituye la principal etapa reguladora de la homeostasis de GSH en
plantas (Noctor y Foyer, 1998; Xiang y Oliver, 1998). Por lo tanto, la falta de
correlación observada entre el descenso de la actividad γECS y el contenido constante
de (h)GSH total con los estreses abiótico y oxidativo podría explicarse por una lenta
degradación metabólica de estos tioles, o bien por su transporte desde otros órganos de
la planta, como las hojas y raíces. Por ejemplo, la síntesis de (h)PCs en nódulos es baja
en comparación con la de raíces (ver 4.4.4 y 5.4), por lo que la utilización de GSH y
hGSH como precursores de (h)PCs en los nódulos tras el tratamiento con Cd2+ puede
ser, presumiblemente, menor que en las raíces. Asimismo, hay evidencias de una
Discusión
- 140 -
regulación postraduccional mediada por el estado redox celular de la γECS de
Arabidopsis, tanto in vitro (Jez y cols, 2004) como in vivo (Hicks y cols, 2007), así
como de una regulación postranscripcional de la actividad de la enzima en células en
suspensión de esta misma especie (May y cols, 1998) y de un control traduccional de
la γECS mediante la unión de una proteína (todavía sin determinar) sensible al estado
redox de la célula en la región 5’-UTR del transcrito (Xiang y Bertrand, 2000;
Wachter y cols, 2005). Este último resultado coincide con el tipo de regulación de la
actividad γECS en nódulos de judía propuesta en esta Tesis.
Sólo unos pocos trabajos han investigado el papel de la GSHS en la regulación
de la síntesis de GSH (Rüegsegger y cols, 1990; Xiang y Oliver, 1998; Jez y Cahoon,
2004), especialmente en plantas tratadas con metales pesados o JA. Al igual que
sucede en el caso del ASC, el JA ha sido implicado en la activación general de la
síntesis de tioles en plantas (Xiang y Oliver, 1998; Sasaki-Sekimoto y cols, 2005). En
nuestros experimentos, tan sólo pudo detectarse un incremento en el contenido de
hGSH total en los nódulos tras el tratamiento con JA, mientras que no se observaron
variaciones en los niveles de mRNA de hGSHS ni en la actividad de la enzima. En
nódulos de judía, la actividad GSHS resultó insignificante respecto a la actividad
hGSHS, tal y como nuestro grupo había demostrado con anterioridad (Matamoros y
cols, 1999b). El GSH detectado en los nódulos de judía procede probablemente de los
bacteroides, ya que la extracción de los tioles en medio ácido rompe la membrana
bacteroidal (Iturbe-Ormaetxe y cols, 2001). Por lo tanto, es necesaria una investigación
en mayor profundidad para determinar con exactitud la implicación de la (h)GSHS en
la regulación de los niveles de (h)GSH en las plantas en general y en los nódulos en
particular.
Localización subcelular de la γECS
Otra consideración a tener en cuenta al analizar la regulación de la síntesis de tioles es
la compartimentalización de las enzimas responsables. Estudios recientes han
demostrado que la γECS se encuentra localizada exclusivamente en los plastidios en
Arabidopsis y B. juncea, mientras que la GSHS se encuentra mayoritariamente en el
citosol y minoritariamente en los plastidios (Wachter y cols, 2005). Teniendo en
Discusión
- 141 -
cuenta estos resultados (Meyer y Hell, 2005; Wachter y cols, 2005) y los obtenidos
con anterioridad por nuestro grupo (Moran y cols, 2000; Iturbe-Ormaetxe y cols,
2001), el modelo actual de biosíntesis de (h)GSH en leguminosas se muestra en la
Figura 5.2 A. Los experimentos realizados con raíces de judía utilizando el anticuerpo
de la γECS mostraron la presencia de una banda adicional de menor tamaño que el
esperado. No sólo esto, sino que el anticuerpo detectó la γECS también en
mitocondrias purificadas de nódulos. En la actualidad se está llevando a cabo la
identificación de las bandas que reconoce nuestro anticuerpo por técnicas de
proteómica y de inmunolocalización de la γECS con microscopía electrónica. De
confirmarse la identidad de estas bandas y la localización mitocondrial de la γECS, el
nuevo modelo propuesto de biosíntesis de (h)GSH en leguminosas quedaría como se
representa en la Figura 5.2 B. Hasta la fecha, tan sólo unos pocos artículos han
sugerido la posibilidad de que la γECS se localice en mitocondrias (Schäfer y cols,
1998; Moran y cols, 2000), pero no se han aportado pruebas de su localización
utilizando anticuerpos. Si éste fuera el caso, las consecuencias más importantes serían:
(a) la demostración de que en plantas existe más de una isoenzima de γECS, puesto
que hasta la fecha se han observado varias poblaciones de mRNAs pero sólo una
población de proteína (Wachter y cols, 2005); y (b) que las mitocondrias no dependen
de los plastidios (o del citosol) para la síntesis del (h)GSH, un metabolito necesario
para el correcto funcionamiento de la mitocondria. Quedaría por demostrar la
contribución de cada orgánulo al contenido total de (h)GSH de la célula entera.
Discusión
- 142 -
Figura 5.2. A, Modelo actual de síntesis de (h)GSH en nódulos a partir de la asimilación de SO4
2-. Esquema realizado según los resultados de Moran y cols (2000), Iturbe-Ormaetxe y cols (2001), Meyer y Hell (2005) y Wachter y cols (2005). B, Modelo sugerido tras la realización de esta Tesis. Las flechas discontinuas indican transporte de un metabolito, mientras que las flechas continuas indican una reacción química catalizada por una enzima (en cursiva). Las flechas en color rojo significan procesos cuya existencia se presume pero todavía no ha sido demostrada.
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
SO42-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
BacteroideCitosol
Apoplasto
A
γEC
GSH
Mitocondria
GSHS
SAT
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys
γEC
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
Bacteroide
Mitocondria
γECS
GSHS
Citosol
Apoplasto
BSO4
2-
S2-
OASTLSAT SAT
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
SO42-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
BacteroideCitosol
Apoplasto
A
γEC
GSH
Mitocondria
GSHS
SAT
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
SO42-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
BacteroideCitosol
Apoplasto
A
γEC
GSH
Mitocondria
GSHS
SAT
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys
γEC
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
Bacteroide
Mitocondria
γECS
GSHS
Citosol
Apoplasto
BSO4
2-
S2-
OASTLSAT SAT
Cys
γEC
GSHhGSH
S2-
Cys
γEChGSH
GSH
Cys
γEC
GSH
Cys γEC GSH
OASTL
γECS
GSHShGSHS
SO42-
GSHSγECS
hGSHS
GSHS
Proteínas
Plastidio
Bacteroide
Mitocondria
γECS
GSHS
Citosol
Apoplasto
BSO4
2-
S2-
OASTLSAT SAT
Discusión
- 143 -
Metabolismo de los tioles durante la senescencia natural del nódulo
Durante la senescencia natural del nódulo se encontraron diferencias significativas
entre el metabolismo del ASC y el de los tioles. Mientras que la expresión de los genes
implicados en la síntesis de ASC, la actividad GalLDH y el contenido de ASC total y
su estado redox disminuyeron drásticamente en los nódulos S2, en el caso del
metabolismo de tioles los descensos observados en la expresión y actividad de γECS y
hGSHS, el contenido de Cys, γEC y (h)GSH total, y el estado redox del (h)GSH,
fueron mucho menos pronunciados. Además, en nódulos S1 sólo se produjeron
descensos significativos, respecto a los nódulos jóvenes, en la actividad γECS y en el
contenido de Cys, mientras que la actividad GR aumentó significativamente, lo que
podría explicar, al menos en parte, que no disminuyera de forma apreciable el estado
redox del (h)GSH en dichos nódulos. Al igual que se comentó anteriormente, no puede
descartarse que se produzcan variaciones mayores en orgánulos concretos o en otras
localizaciones específicas. En nódulos de soja el porcentaje de (h)GSH respecto del
(h)GSH total disminuyó durante el envejecimiento de forma paralela al incremento de
daño oxidativo a proteínas (Evans y cols, 1999), lo que coincide con los datos
obtenidos en esta Tesis. En cualquier caso, de nuestros resultados puede desprenderse
un mayor grado de correlación entre el metabolismo del ASC y la senescencia que el
que puede establecerse entre ésta y el metabolismo de tioles en los nódulos.
5.3. Mecanismo enzimático de fitoquelatina sintasas recombinantes de
plantas
Otro aspecto importante del metabolismo de tioles es la utilización del (h)GSH para la
desintoxicación de metales pesados. En plantas, el principal mecanismo para lograrla
es la síntesis de (h)PCs. Las leguminosas pueden sintetizar hGSH y hPCs en lugar de
(o además de) GSH y PCs, siendo la proporción relativa GSH/hGSH y PCs/hPCs
dependiente de la especie y del órgano analizado (Klapheck y cols, 1995; Rauser,
1995; Matamoros y cols, 2003). Por ejemplo, las hojas y raíces de Lotus producen casi
exclusivamente (97%) hGSH (Matamoros y cols, 2003), mientras que Arabidopsis
sólo sintetiza GSH. Esto convierte a las leguminosas en un material muy interesante
Discusión
- 144 -
para estudiar los genes y proteínas PCS. En primer lugar se procedió a la
caracterización bioquímica y molecular de las PCS recombinantes de Lotus y
Arabidopsis, ya que la información disponible antes de la realización de esta Tesis
sobre estas proteínas en leguminosas era muy escasa. Posteriormente, se analizó la
síntesis de (h)PCs inducida por metales relevantes fisiológicamente y por Cd2+ (5.4).
Especificidad de sustrato de enzimas PCS recombinantes de plantas
La única PCS de leguminosas caracterizada previamente a la realización de esta Tesis
fue la de soja (GmhPCS1) (Oven y cols, 2002). Sin embargo, esta planta sintetiza
exclusivamente hPCs (Grill y cols, 1986; Oven y cols, 2002), mientras que Lotus es
capaz de sintetizar PCs y hPCs. Esto podría deberse a diferencias en la disponibilidad
de GSH y hGSH de las dos leguminosas o a la capacidad de sus enzimas PCS para
producir cada tipo de polipéptido. Por este motivo, se procedió a la caracterización
bioquímica y molecular de LjPCS1 y a su comparación con AtPCS1, que es la PCS de
plantas mejor estudiada (Ha y cols, 1999; Vatamaniuk y cols, 2000; Cazalé y Clemens,
2001; Oven y cols, 2002).
Cuando se expresó en E. coli, la proteína LjPCS1 fue capaz de catalizar la
síntesis de PCs a partir de GSH, tanto en el extracto crudo de bacterias como después
de purificarla mediante cromatografía de afinidad por metal inmovilizado [proteína
con poli(His)6] y de digerirla con trombina [proteína sin poli(His)6], lo que demuestra
que se trata de una auténtica PCS. La especificidad de sustrato de LjPCS1, y por
comparación de AtPCS1, se examinó empleando enzimas purificadas y Cd2+ como
cosustrato, además de GSH, hGSH o una mezcla equimolar de ambos, en las mismas
condiciones de ensayo y utilizando el mismo vector de expresión. AtPCS1, al igual
que LjPCS1, catalizó la síntesis de hPCs cuando el hGSH fue el único sustrato.
Además, la cantidad de hPCs producida por AtPCS1 purificada sin poli(His)6 fue más
del doble que la producida por LjPCS1, mientras que la cantidad de PCs sintetizadas
por ambas proteínas, con GSH como único sustrato, fue similar. En cualquier caso,
tanto AtPCS1 como LjPCS1 sintetizaron de forma más activa PCs a partir de GSH que
hPCs a partir de hGSH. Además, la combinación de GSH y hGSH como sustratos
produjo la síntesis de aproximadamente dos veces más hPCs que PCs por las dos
Discusión
- 145 -
enzimas. La cantidad de PCs sintetizadas en estas condiciones fue similar en los dos
casos, mientras que LjPCS1 produjo ligeramente más hPCs que AtPCS1. De acuerdo
con el mecanismo enzimático actualmente propuesto para las PCS (Rea y cols, 2004;
Vatamaniuk y cols, 2004; Vivares y cols, 2005; Rea, 2006; Romanyuk y cols, 2006),
una molécula de GSH se une a un sitio de acilación de la enzima formando un
intermediario (γEC)-enzima, el cual proporciona un grupo γEC a otra molécula de
GSH (para producir PC2) o de PCn (para producir PCn+1). La observación de que
AtPCS1 y LjPCS1 pueden sintetizar hPCs a bajas velocidades con hGSH como único
sustrato, y mayores cantidades de hPCs que de PCs con una combinación equimolar de
GSH y hGSH, revela que AtPCS1 y LjPCS1 son capaces de unir hGSH, aunque con
menor afinidad que GSH, en el primer sitio de acilación de la enzima. En otras
palabras, podemos concluir que el hGSH es un buen aceptor de grupos γEC pero un
mal dador de esta molécula en comparación con el GSH. Por lo tanto, AtPCS1 puede
sintetizar in vitro hPCs, lo que hace improbable la presencia de una hPCS específica
en leguminosas, aunque dicha posibilidad no pueda descartarse totalmente con los
resultados presentados aquí.
Activación de PCS recombinantes por distintos metales pesados
Los estudios sobre el efecto de la adición de distintos metales pesados sobre la
actividad PCS han mostrado resultados contradictorios (Chen y cols, 1997;
Vatamaniuk y cols, 2000; Oven y cols, 2002; Beck y cols, 2003). Los datos
presentados en esta Tesis utilizando AtPCS1 y LjPCS1 purificadas muestran que los
únicos metales presentes en la solución nutritiva de las plantas que son capaces de
activar in vitro a la enzima (a concentraciones de 50 μM) son Cu2+, Zn2+ y Fe2+ o Fe3+,
además del Cd2+ como metal de referencia. Las diferencias entre los resultados
obtenidos entre distintos laboratorios pueden deberse a una limitación en la cantidad y
calidad de las preparaciones enzimáticas o a las diferentes estrategias utilizadas para la
expresión y purificación de las proteínas. En este sentido, nuestros resultados permiten
concluir que no hay diferencias significativas entre la actividad de las enzimas
purificadas con poli(His)6 o sin ella, lo que descarta cualquier posible artefacto debido
a la presencia de poli(His)6. De especial importancia fue la obtención de grandes
Discusión
- 146 -
cantidades de proteína altamente purificada en la fase soluble del extracto mediante la
expresión a temperaturas (18ºC) y concentraciones de IPTG (0,1 mM) bajas, lo que
minimiza la formación de cuerpos de inclusión de proteínas recombinantes en E. coli
(Moore y cols, 1993; Carrió y Villaverde, 2002). El hecho de que las preparaciones de
LjPCS2 y LjPCS3, en las mismas condiciones que las de LjPCS1, no pudieran ser
purificadas a partir de extractos de E. coli puede deberse a diferencias en la solubilidad
u otras propiedades bioquímicas entre las tres proteínas. La expresión de LjPCS2 y
LjPCS3 en levaduras, con el fin de minimizar la formación de cuerpos de inclusión
observada en bacterias, mostró características diferenciales entre las distintas
poblaciones de proteínas (Ramos y cols, 2007). Un aspecto no analizado hasta el
momento, y que podría generar resultados interesantes, es la comparación de la
especificidad de sustrato y activación por metales entre LjPCS1, LjPCS2 y LjPCS3.
La activación por Fe observada con AtPCS1 y LjPCS1 merece una mención
especial, ya que es un descubrimiento totalmente novedoso. La especificidad de esta
activación fue confirmada mediante la determinación en las sales de Fe empleadas de
posibles metales contaminantes, la utilización de un sideróforo (DFO) con alta
especificidad por el Fe3+ (constante de estabilidad = 1031) (Gower y cols, 1989), y la
eliminación de otros metales unidos directamente a la enzima que pudieran producir la
activación no específica del Fe, mediante la diálisis de la enzima con la resina quelante
Chelex. Aunque la DFO une con gran especificidad el átomo de Fe3+, también puede
exhibir una potente actividad ferroxidasa sobre los átomos de Fe2+ (Gower y cols,
1989), lo que explicaría por qué la actividad con Fe2+ fue inhibida completamente por
DFO. Estudios previos con AtPCS1 no mostraron activación con este metal (Oven y
cols, 2002). Aunque no puede darse una explicación concluyente para esta
discrepancia, hay que destacar que la activación de la enzima se produjo tras incubar
con Fe3+ durante 30 min con AtPCS1 (31% respecto a Cd2+), pero sólo después de 60
min con LjPCS1 (18% respecto a Cd2+), mientras que en este último caso las
actividades con Cd2+, Cu2+ y Zn2+ fueron máximas después de 30 min. Esto podría
deberse a una unión más lenta del tiolato Fe·(GS)2 al sitio de unión de las PCS
(Vatamaniuk y cols, 2000) en relación a los complejos formados con el resto de
metales activadores de las enzimas.
Discusión
- 147 -
Una de las conclusiones obtenidas en los experimentos de activación por
metales es la posible implicación de las (h)PCs en la homeostasis de metales
esenciales en la planta. Ya se comentó anteriormente (1.5.4) que existen datos sobre la
implicación de las PCs en la homeostasis de Cu2+ y Zn2+ (Thumann y cols, 1991),
aunque las pruebas proporcionadas por estos autores no fueron concluyentes. Para
aportar más datos sobre esta cuestión, se estudió la síntesis de (h)PCs en plantas de
Arabidopsis y de Lotus expuestas a distintas concentraciones de los metales que
activaron AtPCS1 y LjPCS1 in vitro. La exposición a Cd2+ fue estudiada con mayor
detalle, realizando un experimento adicional para analizar la síntesis de (h)PCs en
función del tiempo en plantas de Lotus. Estos resultados se discuten en el siguiente
apartado (5.4).
5.4. Fitoquelatinas en plantas
Biosíntesis de (h)PCs en plantas expuestas a distintos metales pesados
La biosíntesis de (h)PCs en plantas expuestas a los metales activadores de la PCS in
vitro se analizó en plantas enteras de Arabidopsis y en raíces de Lotus, ya que no se
detectaron (h)PCs en hojas de Lotus y su concentración en nódulos fue baja (≈ 10%
respecto a raíces). Otros autores (Gupta y cols, 2004) también observaron la ausencia
de (h)PCs en hojas de garbanzo (Cicer arietinum), sugiriendo que las raíces son el
principal órgano implicado en la desintoxicación del Cd2+. De hecho, el Cd2+ se
acumuló en raíces de guisante y lupino y no alcanzó las hojas (Dixit y cols, 2001;
Zornoza y cols, 2002) debido a su inmovilización en las paredes celulares o a la
asociación con compuestos tiólicos, presumiblemente (h)PCs (Zornoza y cols, 2002).
Varios metales fisiológicamente importantes inducen la acumulación de (h)PCs
en plantas y en cultivos celulares. Por ejemplo, células de Rauvolfia serpentina (Grill y
cols, 1987) y tomate (Chen y cols, 1997) acumularon PCs en respuesta a un exceso de
Cu2+ o Zn2+. Por el contrario, se observó una acumulación de PCs y hPCs en plantas de
garbanzo tras su tratamiento con Cd2+ o As5+, pero no con Cu2+ o Zn2+ (Gupta y cols,
2004). Estas diferencias pueden ser debidas a variaciones en la concentración del
Discusión
- 148 -
metal, la duración del tratamiento o la accesibilidad del metal a la PCS en la planta.
Los resultados presentados en esta Tesis muestran que las plantas de Arabidopsis y de
Lotus sintetizan bajas cantidades de (h)PCs en respuesta a concentraciones 100 μM de
Cu2+ o Zn2+. Como estos metales, especialmente el Zn2+, son potentes activadores de la
síntesis de (h)PCs in vitro, puede concluirse que las (h)PCs no son un mecanismo
primario de eliminación del exceso de Cu2+ o Zn2+ in vivo, aunque no se puede
descartar que desempeñen funciones relacionadas con su homeostasis. Esta conclusión
está de acuerdo con trabajos anteriores (Ha y cols, 1999; Cobbett y Goldsbrough,
2002), en los que se demostró que el mutante de Arabidopsis deficiente en la síntesis
de PCs (cad1) y la correspondiente planta silvestre presentaron una sensibilidad
similar a la toxicidad por Cu2+ o Zn2+. La falta de correlación entre la activación de la
PCS in vitro y la acumulación de (h)PCs en las plantas in vivo podría explicarse por la
incapacidad de los iones para inducir su síntesis debido a la adsorción del metal a la
pared celular, su transporte a larga distancia, la acumulación de los metales en el
apoplasto o la existencia de mecanismos alternativos para su quelación. Éste sería el
caso de la unión del Cu2+ y del Zn2+ a las metalotioneínas (Cobbett y Goldsbrough,
2002) y del Fe3+ a la ferritina (Briat y Lobreaux, 1997). Además, en cultivos celulares
de tomate, un sistema experimental en el que los iones metálicos pueden alcanzar
fácilmente a la enzima, se observó que altas concentraciones (100-500 μM) de Ni2+ o
Fe2+ indujeron la producción de PCs, lo que apoyaría la hipótesis de que los metales no
acceden fácilmente a las PCS en la planta. Asimismo, hay otros factores a considerar
en la desintoxicación de metales pesados por las PCs, como son el transporte de estas
moléculas a larga distancia (Gong y cols, 2003; Chen y cols, 2006) o de los complejos
metal-PC a la vacuola (Salt y Rauser, 1995). Respecto a esto último, se ha sugerido en
trabajos realizados con plantas de Arabidopsis que sobreexpresan AtPCS1 y que
presentan una mayor sensibilidad al Cd2+ que las plantas silvestres, la posibilidad de
una deficiencia en el transporte de los complejos metal-PC a la vacuola (Lee y cols,
2003a; Lee y cols, 2003b; Li y cols, 2004). En cambio, plantas de Nicotiana glauca
que sobreexpresan la PCS1 de trigo muestran una mayor tolerancia al Cd2+ (Gisbert y
cols, 2003), lo mismo que se observa con Cd2+, Zn2+ y As5+ en plantas de B. juncea
que sobreexpresan AtPCS1 (Gasic y Korban, 2007a, 2007b).
Discusión
- 149 -
En las plantas de Lotus expuestas a Cd2+ se produjo una acumulación preferente
de hPCs respecto a PCs, de acuerdo con la mayor abundancia de hGSH relativa a GSH
en esta leguminosa. La acumulación de las PCs tuvo lugar en el orden PC3 > PC2 > PC4
en Arabidopsis y Lotus, mientras que la acumulación de hPCs en Lotus se produjo en
el orden hPC3 >> hPC4 > hPC2. Esto indica que, en las condiciones experimentales
empleadas, las PCS de Arabidopsis y Lotus son más eficientes sintetizando PC3 o
hPC3 que los polipéptidos de otros tamaños, o bien que PC3 y hPC3 son
particularmente estables. Otra observación cuyo significado fisiológico desconocemos
es que, tras la exposición de las plantas de Lotus a Cu2+, se acumuló una mayor
cantidad de PCs que de hPCs, al contrario de lo que ocurrió con Zn2+ o Cd2+.
El efecto del Cd2+ sobre los tioles se ha examinado en plantas esencialmente
productoras de GSH, como guisante (Rüegsegger y cols, 1990; Klapheck y cols, 1995)
y maíz (Rauser y cols, 1991; Rüegsegger y Brunold, 1992; Meuwly y cols, 1995), y en
plantas productoras de hGSH, como Lotus (Ramos y cols, 2007). En esta Tesis nos
hemos centrado específicamente en investigar el efecto temporal del Cd2+ sobre la
síntesis de Cys y de (h)PCs en raíces de Lotus, mientras que su efecto en la síntesis de
(h)GSH ha sido estudiada en un trabajo publicado recientemente por nuestro grupo
(Ramos y cols, 2007).
El tratamiento con Cd2+ no produjo diferencias significativas en la actividad
OASTL de Lotus respecto a las plantas control, lo cual contrasta con otros trabajos
publicados (Domínguez-Solís y cols, 2001) en los que se muestra un aumento de dicha
actividad en respuesta a altas concentraciones de Cd2+ en plantas de Arabidopsis.
Parece lógico pensar que, ya que el Cd2+ induce la acumulación de GSH (Ramos y
cols, 2007) y de (h)PCs en Lotus, sería necesario un aporte extra de Cys y γEC para la
síntesis de ambos tioles en estas condiciones. No obstante, recientemente se ha puesto
de manifiesto que la regulación de la síntesis de Cys es muy compleja (Saito, 2004;
Wirtz y Hell, 2007). El factor clave de la regulación de la síntesis de Cys en las plantas
es, más que el control de la actividad de las enzimas por separado, la formación del
complejo Cys sintasa mediante la asociación de las enzimas SAT y OASTL. Por lo
tanto, el que no se hayan encontrado aumentos en la actividad OASTL bajo nuestras
condiciones experimentales no excluye la posibilidad de que el complejo Cys sintasa
Discusión
- 150 -
se active in vivo tras el tratamiento con Cd2+. Otro aspecto a tener en cuenta es la
compartimentalización de las enzimas SAT y OASTL. Pese a que la asimilación de
SO42- en las plantas ocurre en los plastidios, existen isoformas de SAT y OASTL en el
citosol, las mitocondrias y también en los plastidios (Droux, 2004; Wirtz y cols, 2004).
De hecho, los resultados sobre la actividad SAT obtenidos en esta Tesis demuestran
que las mitocondrias purificadas de nódulos de judía presentan una actividad
específica muy elevada en comparación con la obtenida en raíces o en extractos de
nódulos enteros de judía. En cualquier caso, se desconoce la contribución específica de
cada isoforma a la síntesis total de Cys, o si actúan de forma concertada para regular el
contenido de este aminoácido. La optimización de una técnica cromatográfica de
HPLC para determinar las actividades SAT y OASTL nos permitirá un estudio más
detallado de la síntesis de Cys en leguminosas.
Por otra parte, las raíces de Lotus comenzaron a sintetizar (h)PCs muy
rápidamente, tras 3 h de exposición a Cd2+, de acuerdo con el requerimiento estricto
del metal para la activación de la PCS (Zenk, 1996; Clemens y cols, 1999; Rea y cols,
2004). Esta acumulación de (h)PCs fue progresivamente mayor hasta alcanzar un
máximo a las 96 h de exposición a CdCl2 100 o 200 μM.
Efecto del Cd2+ en la actividad fitoquelatina sintasa de plantas
El hecho ya comentado de que ni la síntesis de Cys (actividad OASTL) ni el contenido
de hGSH (Ramos y cols, 2007) resultaron afectados por el Cd2+, mientras que los
contenidos de GSH (Ramos y cols, 2007) y (h)PCs aumentaron, indica que el Cd2+
tiene un efecto complejo sobre la regulación del metabolismo de los tioles en la
leguminosa modelo Lotus (Figura 5.3).
Discusión
- 151 -
La determinación de la actividad PCS en raíces de Lotus hubiera arrojado luz
sobre muchos aspectos de la regulación del metabolismo de tioles. Sin embargo, no
pudo detectarse dicha actividad en esta especie. Puesto que en experimentos paralelos
con radículas de judía y guisante sí se pudo determinar dicha actividad, se concluye
que la actividad PCS en Lotus es muy baja, o muy lábil, en comparación con la de las
otras dos leguminosas. La actividad PCS en judías tratadas con Cd2+ fue muy superior
a la obtenida en guisantes. Una observación interesante es que, en los extractos de
raíces de judías y guisantes controles, no se detectó actividad PCS, ni siquiera cuando
Figura 5.3. Resumen del efecto del Cd2+ sobre el metabolismo de tioles en la leguminosa modelo Lotus. Los resultados provienen de esta Tesis y de Ramos y cols (2007). Los interrogantes indican efectos desconocidos que están siendo investigados en la actualidad.
O-AcSer
γGlu-Cys (γEC)
ATP
ADP + Pi
ATP ATP
ADP + Pi ADP + Pi
Gly βAla
γECS
Cys
Glu
PCs
S2-
hPCs
Ser
Acetil-CoA
SO42-
hGSHSGSHS
OASTL
SAT
PCSPCS
γGlu-Cys-Gly (GSH) γGlu-Cys-βAla (hGSH)
Cd2+
= actividad
↑[G
SH
]
= [h
GS
H]
↑ [(h)PCs]
= mRNA,↑ actividad recombinante
???
???
???
???
O-AcSer
γGlu-Cys (γEC)
ATP
ADP + Pi
ATP ATP
ADP + Pi ADP + Pi
Gly βAla
γECS
Cys
Glu
PCs
S2-
hPCs
Ser
Acetil-CoA
SO42-
hGSHSGSHS
OASTL
SAT
PCSPCS
γGlu-Cys-Gly (GSH) γGlu-Cys-βAla (hGSH)
Cd2+
= actividad
↑[G
SH
]
= [h
GS
H]
↑ [(h)PCs]
= mRNA,↑ actividad recombinante
???
???
???
???
Discusión
- 152 -
el extracto se incubó con Cd2+ 100 μM durante 60 min a 35ºC. Sin embargo, la
actividad sí pudo detectarse en las mismas condiciones empleando extractos de plantas
tratadas con Cd2+. Esto sugiere que el efecto del Cd2+ en la actividad PCS puede
deberse a la puesta en funcionamiento de rutas de señalización moleculares que
activen las PCS de plantas, además de la activación postraduccional directa de la
proteína por el Cd2+. No obstante, ambas opciones no son excluyentes. Hasta la fecha
no hay datos sobre las posibles señales moleculares que desencadena el Cd2+ para la
activación de las PCS, como pudieran ser la fosforilación, S-glutationilación o cambios
redox de los residuos de Cys de la proteína.
Expresión de proteínas PCS en plantas
Con el fin de estudiar la regulación de la síntesis de (h)PCs es conveniente disponer de
un anticuerpo frente a las PCS de plantas. Como ya se ha comentado (4.4.3), en
nuestro laboratorio hemos producido un anticuerpo policlonal monoespecífico
utilizando LjPCS1 recombinante. El análisis western de las mismas radículas de judía
empleadas para la determinación de actividad PCS mostró un resultado inesperado. En
judía, el anticuerpo reconoció dos bandas de PCS, una de ≈ 36 kD y otra de ≈ 20 kD.
Precisamente, el tamaño molecular esperado para las PCS de plantas superiores se
encuentra en el rango de 50-60 kD. La incubación de los extractos de plantas con
inhibidores de proteasas no modificó el patrón de bandas respecto al obtenido con los
mismos extractos sin inhibidores, lo que aparentemente excluye la posibilidad de que
las dos bandas obtenidas sean un artefacto del análisis. Por tanto, es posible sugerir la
presencia de una proteasa endógena que procese a las PCS de plantas, o bien que
ocurra una autolisis específica y selectiva de la enzima, y que sea ésta la forma activa
de la proteína necesaria para la síntesis de (h)PCs.
La comparación de estos resultados con otros similares resultó complicada, ya
que existen muy pocos estudios en los que se haya analizado la expresión de la PCS
nativa de plantas mediante análisis western. En uno de ellos (Heiss y cols, 2003), se
observó que la proteína presentaba una banda única de ≈ 59 kD que aumentaba su
expresión en hojas de B. juncea en respuesta al Cd2+, pero no en raíces. En cambio, en
trabajos con la proteína PCS de Silene cucubalus (Grill y cols, 1989), los autores
Discusión
- 153 -
concluyeron que la enzima consistía en un complejo de cuatro subunidades de ≈ 25
kD. Más recientemente, se ha demostrado que es necesaria la asociación in vivo de dos
monómeros de la PCS de Nostoc para que ésta sea activa (Vivares y cols, 2005).
Todavía no se ha encontrado algo parecido en las PCS de plantas, pero los resultados
presentados en esta Tesis indican que podría ocurrir algo similar. Una explicación
alternativa es que el Cd2+ (o la alteración del estado redox celular debida a este metal)
podría dar lugar a una modificación postraduccional de la conformación de la proteína
PCS, variando así su masa molecular aparente y su actividad. Esto mismo ya se ha
demostrado para la proteína γECS en Arabidopsis (Jez y cols, 2004; Hicks y cols,
2007), aunque en este caso la diferencia de masa molecular entre la proteína activa e
inactiva fue mucho menor que la diferencia que la que obtuvimos en judía. En la
actualidad, nuestro laboratorio participa junto con el Dr. J. Abián en la secuenciación
de los dos polipéptidos que reconoce el anticuerpo de la LjPCS1 para verificar que
ambos corresponden a una auténtica PCS. Este hecho parece más que probable, ya que
el anticuerpo fue purificado por cromatografía de afinidad, y también porque un
anticuerpo de la proteína PCS1 de B. juncea, cedido amablemente por el Dr. T.
Rausch, reconoce la banda de ≈ 36 kD (aunque no la de ≈ 20 kD) en los mismos
extractos que nuestro anticuerpo, incluso en presencia de inhibidores de proteasas.
Conclusiones
Conclusiones
- 157 -
6. CONCLUSIONES
1. Los nódulos de leguminosas poseen una auténtica L-galactono-1,4-lactona
deshidrogenasa mitocondrial con mayor actividad que la de hojas y raíces. El
mRNA se encuentra en hojas, raíces y nódulos, y es especialmente abundante en la
zona infectada de estos últimos, lo que sugiere un papel importante del ascorbato en
la fijación de N2. Por lo tanto, los nódulos de leguminosas son capaces de sintetizar
ascorbato de novo.
2. Los estreses abiótico y oxidativo tienen un efecto minoritario en la biosíntesis de
ascorbato en el nódulo, la actividad L-galactono-1,4-lactona deshidrogenasa, el
contenido de ascorbato total y su estado redox. La enzima L-galactono-1,4-lactona
deshidrogenasa parece estar regulada postranscripcionalmente en condiciones de
estrés y no determina el contenido de ascorbato total en nódulos.
3. El tratamiento con ácido jasmónico provoca un aumento transcripcional de la
actividad ascorbato oxidasa y una inhibición postraduccional de la actividad
deshidroascorbato reductasa dependiente de glutatión en los nódulos, pero no en
hojas o raíces. A su vez, estos cambios causan una disminución del estado redox del
ascorbato en el nódulo. El efecto del ácido jasmónico sobre la ascorbato oxidasa y
la deshidroascorbato reductasa en los nódulos no se debe a una interacción directa
con estas enzimas, sino que estaría relacionado con la ruta de señalización de estrés
por ácido jasmónico.
4. Los estreses abiótico y oxidativo tienen un efecto pequeño en los niveles de mRNA
de las tiol-sintetasas, la actividad homoglutatión sintetasa y el contenido de
(homo)glutatión total y su estado redox en los nódulos; sin embargo, provocan una
disminución de la actividad γ-glutamilcisteína sintetasa y del contenido de cisteína y
γ-glutamilcisteína. En estas condiciones de estrés, la actividad γ-glutamilcisteína
sintetasa está regulada a nivel traduccional.
Conclusiones
- 158 -
5. Las plantas senescentes de judía contienen al menos dos poblaciones de nódulos
que presentan distinto grado de senescencia y de estrés oxidativo. La actividad L-
galactono-1,4-lactona deshidrogenasa, el contenido de ascorbato total y su estado
redox disminuyen durante la senescencia nodular, pero el efecto de ésta sobre el
metabolismo de los tioles es mucho menor. Esto sugiere que el ascorbato es un
factor importante en la senescencia nodular. Además, la coexistencia de dos
poblaciones de nódulos senescentes en una misma planta indica que la vida del
nódulo está regulada, al menos en parte, por factores endógenos.
6. Las enzimas LjPCS1 de Lotus japonicus y AtPCS1 de Arabidopsis thaliana son
capaces de sintetizar homofitoquelatinas in vitro a partir de una mezcla de glutatión
y homoglutatión o, en menor medida, de homoglutatión como único sustrato.
Ambas enzimas son típicas fitoquelatina sintasas y no homofitoquelatina sintasas.
Algunos metales fisiológicamente importantes, como Cu, Zn o Fe, activan ambas
enzimas in vitro, lo que sugiere una función de las fitoquelatina sintasas en la
homeostasis de estos metales.
7. En Lotus japonicus, la síntesis de (homo)fitoquelatinas por la actividad fitoquelatina
sintasa no es inducida por un exceso de micronutrientes esenciales como Cu, Zn o
Fe, pero sí por el Cd y otros metales pesados. La actividad fitoquelatina sintasa se
detectó en raíces de leguminosas tratadas con Cd pero no en las raíces control, lo
que sugiere que la activación in vivo de esta enzima por el Cd no ocurre sólo a nivel
postraduccional.
Bibliografía
Bibliografía
- 161 -
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