Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Departamento de Genética y Producción Vegetal Estación Experimental de Aula Dei

Zaragoza

Tesis Doctoral

EMBRIOGÉNESIS DE LA MICROSPORA EN TRIGO PANADERO: OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE

PLANTAS DOBLEHAPLOIDES Y ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE GENES DE ESTRÉS DURANTE EL PRETRATAMIENTO

Memoria presentada por Dña. Mercedes Soriano Castán,

Licenciada en Biología, para optar al grado de Doctor en Ciencias

Zaragoza, Mayo de 2008

Dña. ANA MARÍA CASTILLO ALONSO Científico Titular del Consejo

Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y D. LUIS CISTUÉ

SOLA, Investigador Científico del Consejo Superior de Investigaciones

Científicas (CSIC), adscritos a la Estación Experimental de Aula Dei de

Zaragoza

CERTIFICAN:

Que la Tesis Doctoral titulada “Embriogénesis de la microspora en trigo panadero: optimización de la producción de plantas doblehaploides y estudio de la expresión de genes de estrés durante el pretratamiento” ha sido realizada por la licenciada

MERCEDES SORIANO CASTÁN en el Departamento de Genética y

Producción Vegetal de la Estación Experimental de Aula Dei (CSIC) de

Zaragoza bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones

requeridas para optar al grado de Doctor en Ciencias.

Zaragoza, Marzo de 2008

Fdo: Ana Mª Castillo Alonso Fdo: Luis Cistué Sola

MINISTERIO DE EDUCACION Y CIENCIA

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

ESTACIÓN EXPERIMENTAL DE AULA DEI

Este trabajo ha sido realizado con cargo a los Proyectos del Plan Nacional de Recursos y Tecnologías Agroalimentarias AGL2002-04139-C02-02, AGL2005-07195-C02-01 y AGL2004-03396 y con la ayuda de una beca de Formación de Personal Investigador concedida por el Ministerio de Educación y Ciencia.

Agradecimientos

Quisiera agradecer a mis directores de tesis, la Dra. Ana Mª Castillo y el Dr. Luis Cistué por haberme brindado la oportunidad de elaborar esta tesis. Debo agradecer a ambos su interés más allá de lo profesional y en particular, a Ana su gran dedicación y ayuda, gracias por compartir los aspectos más laboriosos de esta tesis, y a Luis, por sus consejos y su visión de la vida.

A la Dra. Consuelo de la Torre, por permitirme realizar una estancia en su grupo en el Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC, Madrid), por compartir sus grandes conocimientos sobre el ciclo celular y por su gran amabilidad.

Al Dr. Christophe Clément por permitirme realizar un estancia en el Laboratoire Stress Défenses et Reproduction des Plantes, (Université de Reims-Champagne Ardenes) para realizar el estudio de la expresión génica e histológico durante el pretratamiento de anteras de trigo. Al Dr. Cédric Jacquard, por enseñarme todo lo que allí aprendí y continuar los análisis cuando me fui.

Además, quiero agradecer a la Dra. Ángeles Cuadrado (Universidad de Alcalá de Henares), por recibirme en su laboratorio e introducirme en las técnicas de citogenética y al Dr. Ignacio Romagosa (Universitat de Lleida) por sus consejos sobre los análisis estadísticos. También al Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales (UPNA-CSIC, Pamplona), por permitirnos utilizar el citómetro de flujo.

Tanto a mis directores como al resto del grupo, al que entré a formar parte siendo una joven recién licenciada, les quiero dar las gracias por haberme ayudado no sólo a formarme como investigadora, sino también a crecer como persona. Por eso, a Miguel, Mª Jesús, Luis J., Luis C., Mapi, Ana, Begoña, Isabel, Raúl, Silvia, Patricia, Natalia y a María, que ha sido compañera de fatigas y que me ha ido abriendo camino con su tesis durante estos años. Gracias por todas las conversaciones, especialmente las poco científicas, que nos han animado los cafés.

A las chicas (lo siento chicos, os ganan por mayoría), gracias por las comidas en Conchita’s, por tomaros el trabajo con humor y por organizar siempre cosas interesantes, esta última fase no hubiera sido lo mismo sin vosotr@s, Marian, Ruth, Laura, Vanesa, Pilar, Joaquín, Sara S., Sara L., Sofía, María B., Raquel, Bea, Miren... a los becarios y “afines” Loreto, Jorge, Manu M., Manu L., Mariví, Miguel, Mª Carmen, María C., Irene, Rubén, Victoria, y a toda la gente que he conocido en Aula Dei y me ha ayudado siempre de una u otra forma, desde informática a biblioteca, administración... especialmente Pili A., José Carlos, Lola, Yolanda... siento no poder nombraros a todos.

A la gente de Peñaflor, porque hacen que sea el pueblo más agradable y acogedor del mundo, sobretodo para los que venimos de fuera. Espero poder disfrutarlo más a partir de ahora.

También a mis amigos de Monzón, porque da igual el tiempo que pasemos sin vernos, Serafín y Ana P., que me ayudasteis tanto cuando llegué a Zaragoza, y J.L., Ana, Carlón, Moni, Alberto… y las que se quedaron en Barcelona, Sandra, Elisa y Marta.

A mi familia, a mis hermanos Ramón y Loli, a Antonio y Mª José, porque siempre me han hecho sentir que están ahí para lo que haga falta y eso es lo más importante. A mi padre, Ramón y en especial a mi madre, Tere, que me han dado seguridad en todos los aspectos.

A Carlos, por su paciencia y todo lo que me cuida.

Gracias

"Ves, Momo, a veces tienes ante ti una calle que te parece tan terriblemente larga que nunca podrás terminar de barrer. Entonces te empiezas a dar prisa, cada vez más prisa. Cada vez que levantas la vista, ves que la calle sigue igual de larga. Y te esfuerzas más aún, empiezas a tener miedo, al final te has quedado sin aliento. Y la calle sigue estando por delante. Así no se debe hacer. Nunca se ha de pensar en toda la calle de una vez, ¿entiendes? Hay que pensar en el paso siguiente, en la inspiración siguiente, en la siguiente barrida. Entonces es divertido: eso es importante, porque entonces se hace bien la tarea. Y así ha de ser. De repente se da uno cuenta de que, paso a paso, se ha barrido toda la calle. Uno no se da cuenta de cómo ha sido, y no se queda sin aliento. Eso es importante."

Michael Ende –Momo-

I

ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................V ÍNDICE DE TABLAS................................................................................................................ IX ABREVIATURAS EMPLEADAS ..........................................................................................XIII

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1

1.1. Triticum aestivum: INTERÉS Y ASPECTOS GENERALES ........................................ 1

1.2. LA HAPLOIDÍA EN LA NATURALEZA .................................................................... 7

1.3. IMPORTANCIA DE LAS PLANTAS DOBLEHAPLOIDES EN MEJORA................ 8

1.4. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE PLANTAS DOBLEHAPLOIDES....................... 9

1.5. PRODUCCIÓN DE PLANTAS DH MEDIANTE ANDROGÉNESIS........................ 13

1.5.1. Factores que determinan la producción de plantas mediante androgénesis ....................................................................................................... 16 1.5.1.1. Genotipo ................................................................................................. 16 1.5.1.2. Estado fisiológico de las plantas donantes.............................................. 17 1.5.1.3. Estado de desarrollo de las microsporas................................................. 17 1.5.1.4. Pretratamiento de estrés.......................................................................... 18 1.5.1.5. Composición de los medios de cultivo ................................................... 21

1.5.1.5.1.Inducción ................................................................................. 21 1.5.1.5.2.Regeneración ........................................................................... 25

1.5.2. Características de las plantas regeneradas...................................................... 25 1.5.2.1. Estabilidad genética y potencial agronómico ......................................... 25 1.5.2.2. Albinismo ............................................................................................... 26 1.5.2.3. Nivel de ploidía ...................................................................................... 27

1.6. TRATAMIENTOS DE DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA ...................................... 27

1.6.1. Colchicina........................................................................................................... 27 1.6.1.1. Tratamientos en planta ........................................................................... 28 1.6.1.2. Tratamientos in vitro .............................................................................. 28

1.6.2. Control de los niveles de ploidía de las plantas regeneradas ......................... 30

1.7. CAMBIOS CELULARES EN LA MICROSPORA TRAS LA INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS................................................................................................. 30

1.7.1. Cambios estructurales y morfológicos ............................................................. 30 1.7.1.1. Rutas androgénicas ................................................................................. 32

1.7.2. Cambios a nivel molecular................................................................................ 34 1.7.2.1. Componentes de la respuesta al estrés en células vegetales ................... 34 1.7.2.2. Proteínas asociadas a la capacidad embriogénica in vitro ...................... 36 1.7.2.3. Cambios en la expresión génica durante la inducción de

androgénesis ........................................................................................... 37

2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 39

3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 41

3.1. MATERIAL VEGETAL............................................................................................... 41

3.1.1. Genotipos............................................................................................................ 41 3.1.2. Condiciones de crecimiento de las plantas madre .......................................... 41

Índice

II

3.2. METODOLOGÍA GENERAL.......................................................................................42

3.2.1. Esterilización.......................................................................................................42 3.2.2. Medios de cultivo ................................................................................................42

3.2.2.1. Medio de pretratamiento .........................................................................42 3.2.2.2. Medios de inducción MSM, MSM-F200 y MSM-F300 .........................43 3.2.2.3. Medio de regeneración J25-8 ..................................................................45 3.2.2.4. Medio de enraizamiento J25-8+ANA .....................................................45

3.2.3. Estado de desarrollo de las microsporas ..........................................................47 3.2.4. Pretratamiento de estrés ....................................................................................48 3.2.5. Medio preacondicionado con ovarios (OVCM) ...............................................48 3.2.6. Aislamiento y cultivo de microsporas ...............................................................49

3.2.6.1. Aislamiento de las microsporas...............................................................49 3.2.6.2. Cultivo.....................................................................................................50

3.2.7. Cultivo de anteras...............................................................................................50 3.2.8. Regeneración de plantas ....................................................................................50 3.2.9. Análisis del nivel de ploidía ...............................................................................51

3.3. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA..............................................................................53

3.3.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los estomas......................................................................................................53

3.3.2. Tratamientos diploidizantes en planta .............................................................54 3.3.2.1. Método de inmersión de la raíz ...............................................................54 3.3.2.2. Método del vial invertido ........................................................................54

3.3.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in vitro ......................................................................................................................55 3.3.3.1. Colchicina añadida al medio de pretratamiento de las anteras. ...............55 3.3.3.2. Colchicina aplicada durante las primeras horas de cultivo en el

medio de inducción. ................................................................................56 3.3.3.2.1.Cultivo de microsporas.............................................................56 3.3.3.2.2.Cultivo de anteras.....................................................................57

3.4. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS..............................................................................58

3.4.1. Pretratamiento en manitol 0,4 M líquido vs. 0,7 M sólido..............................58 3.4.2. Pretratamiento en manitol con ayuno de nitrógeno........................................58 3.4.3. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento mediante PCR cuantitativa a tiempo real .............................59 3.4.3.1. Recogida del material vegetal .................................................................59 3.4.3.2. Aislamiento de RNA ...............................................................................59 3.4.3.3. Síntesis de cDNA ....................................................................................61 3.4.3.4. Obtención de secuencias de mRNA y diseño de los cebadores ..............62 3.4.3.5. PCR cuantitativa a tiempo real ................................................................64

3.5. ADICIÓN DE INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS AL MEDIO DE CULTIVO DE ANTERAS ............................................................................................67

3.5.1. Medio preacondicionado con ovarios ...............................................................67 3.5.2. Arabinogalactanos y proteínas de arabinogalactanos.....................................67 3.5.3. Alcoholes butílicos ..............................................................................................68

3.5.3.1. Tratamiento con n-butanol .....................................................................68 3.5.3.2. Tratamiento con sec-, tert- y n-butanol .................................................68

3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO...........................................................................................70

4. RESULTADOS........................................................................................................................73

4.1. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA..............................................................................73

Índice

III

4.1.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los estomas..................................................................................................... 73

4.1.2. Tratamientos diploidizantes en planta............................................................. 75 4.1.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in

vitro...................................................................................................................... 76 4.1.3.1. Colchicina añadida al medio de pretratamiento de las anteras. .............. 76 4.1.3.2. Colchicina aplicada durante las primeras horas de cultivo en el

medio de inducción................................................................................. 79 4.1.3.2.1.Cultivo de microsporas............................................................ 79 4.1.3.2.2.Cultivo de anteras .................................................................... 83

4.2. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS ............................................................................. 86

4.2.1. Pretratamiento en manitol 0,4 M líquido vs. 0,7 M sólido ............................. 86 4.2.2. Pretratamiento en manitol con ayuno de nitrógeno. ...................................... 90 4.2.3. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento ................................................................................................... 93

4.3. ADICIÓN DE POSIBLES INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS AL MEDIO DE CULTIVO DE ANTERAS ....................................................................... 97

4.3.1. Medio preacondicionado con ovarios .............................................................. 97 4.3.2. Arabinogalactanos y Proteínas de arabinogalactanos.................................. 100 4.3.3. Alcoholes butílicos ........................................................................................... 105

5. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 115

5.1. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA........................................................................... 115

5.1.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los estomas................................................................................................... 115

5.1.2. Tratamientos diploidizantes en planta........................................................... 116 5.1.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in

vitro.................................................................................................................... 117

5.2. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS ........................................................................... 120

5.2.1. Optimización del pretratamiento en manitol ................................................ 120 5.2.2. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento ................................................................................................. 123

5.3. ADICIÓN DE POSIBLES INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS AL MEDIO DE CULTIVO DE ANTERAS ..................................................................... 127

5.3.1. OVCM y las fuentes de arabinogalactanos Larcoll y goma arábiga........... 127 5.3.2. Alcoholes butílicos ........................................................................................... 130

5.4. DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS FUTURAS ....................................... 133

6. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 139

BIBLIOGRAFÍA...................................................................................................................... 141

ANEXO ............................................................................................................................ 175

V

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1.1.- Historia evolutiva del trigo alotetraploide y del trigo alohexaploide......................3

Fig. 1.2.- Morfología de la inflorescencia de trigo. ................................................................5

Fig. 1.3.- Ciclo vegetativo del trigo. .......................................................................................6

Fig. 1.4.- Microgametogénesis y estructura del polen. .........................................................14

Fig. 1.5.- Producción de plantas mediante el cultivo de anteras y el cultivo de

microsporas, tanto por embriogénesis directa como con formación

intermedia de callo u organogénesis. .....................................................................15

Fig. 1.6.- Desarrollo normal del polen y diferentes rutas androgénicas. ..............................33

Fig. 3.1.- Espigas de trigo de la variedad Chris en diferentes estados de desarrollo............47

Fig. 3.2.- Espigas utilizadas para obtener ovarios, en el momento de la recogida. .............48

Fig. 3.3.- Medio MSM-F300 preacondicionado con ovarios de trigo panadero...................49

Fig. 3.4.- Análisis del nivel de ploidía mediante citometría de flujo....................................52

Fig. 3.5.- Tratamiento de anteras de trigo panadero con colchicina durante el

pretratamiento. .......................................................................................................55

Fig. 3.6.- Tratamiento de microsporas de trigo panadero con colchicina en el medio

de cultivo................................................................................................................56

Fig. 3.7.- Comprobación del estado del RNA mediante electroforesis en gel de

agarosa. ..................................................................................................................61

Fig. 3.8.- Curva de amplificación de la RT-PCR..................................................................65

Fig. 3.9.- Curva de disociación de la RT-PCR. ...................................................................66

Fig. 3.10.- Recuento de la viabilidad de microsporas de trigo con FDA..............................69

Fig. 4.1.- Longitud media de los estomas de las plantas H y DH producidas mediante

el cultivo de microsporas del cultivar Chris y del cruzamiento 40xS83. ..............74

Fig. 4.2.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. Número de

plantas DH por 100 anteras y porcentaje de duplicación cromosómica en los

cultivares Chris, Pavon y Caramba. ......................................................................78

Fig. 4.3.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

Estructuras y embriones producidos a los 30 días de cultivo. ...............................81

Fig. 4.4.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

Número de plantas DH por 100 anteras y porcentaje de duplicación

cromosómica en los cultivares Chris, Pavon y la línea DH24033.........................82

Índice de Figuras

VI

Fig. 4.5.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. Número de

plantas DH por 100 anteras y porcentaje de duplicación cromosómica en los

cultivares Pavon y Caramba. .................................................................................85

Fig. 4.6.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio

sólido con manitol 0,7 M. Estructuras y embriones formados a los 35 días de

cultivo en el cultivar Pavon. ..................................................................................88

Fig. 4.7.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio

sólido con manitol 0,7M. Número de plantas DH por 100 anteras y

porcentaje de duplicación cromosómica en los cultivares Pavon y Caramba. ......89

Fig. 4.8.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Número de plantas DH por 100 anteras

y porcentaje de duplicación cromosómica en los cultivares Pavon y

Caramba.................................................................................................................92

Fig. 4.9.- Niveles de expresión de cinco genes PR cuantificados mediante RT-PCR

durante el pretratamiento de estrés de anteras y durante el desarrollo in vivo. .....95

Fig. 4.10.- Niveles de expresión de los genes glutation-S-transferasa (GST) y

fenilalanina-amonio-liasa cuantificados mediante RT-PCR durante el

pretratamiento de estrés de anteras y durante el desarrollo in vivo. ......................96

Fig. 4.11.- Cultivo de anteras de Pavon (30 días). Cultivo sin ovarios y cultivo en

medio OVCM. .......................................................................................................99

Fig. 4.12.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. Interacciones genotipo × tratamiento para las

variables número de embriones, plantas verdes y plantas albinas.........................99

Fig. 4.13.- Cultivo de anteras en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma

arábiga a concentraciones de 10 mg/l y 30 mg/l. Embriones extraídos a los

28, 40 y 60 días del inicio del cultivo..................................................................102

Fig. 4.14.- Cultivo en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio con

Larcoll y goma arábiga. Plantas del cv Pavon regeneradas en medio J25-8. ......103

Fig. 4.15.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. Interacciones genotipo × tratamiento para la

variable número de anteras que responden en los cultivares Pavon y

Caramba...............................................................................................................103

Índice de Figuras

VII

Fig. 4.16.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga a

concentraciones de 10 mg/l y 30 mg/l. Número de plantas DH por 100

anteras y porcentaje de duplicación cromosómica. .............................................104

Fig. 4.17.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Porcentaje de

microsporas viables a las 48 h de cultivo. ...........................................................110

Fig. 4.18.- Tratamiento con 0,1% y 0,2% (v/v) de n-butanol. Embriones y estructuras

formadas a los 28 días de cultivo en dos cultivares de trigo panadero. ...............111

Fig. 4.19.- Tratamiento con diferentes isómeros de alcohol butílico al 2% (v/v).

Embriones y estructuras formadas a los 28 días de cultivo en dos cultivares

de trigo panadero. ................................................................................................111

Fig. 4.20.- Tratamiento con 0,1% y 0,2% (v/v) de n-butanol. Número de plantas DH

por 100 anteras y porcentaje de duplicación cromosómica. ...............................113

Fig. 4.21.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Número de plantas

DH por 100 anteras y porcentaje de duplicación cromosómica. .........................113

IX

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.1.- Producción mundial de cereales en 2005 (FAOSTAT 2008)...............................1

Tabla 1.2.- Producción de cereales en España en 2005 (MAPA 2007). .................................2

Tabla 1.3.- Lista de variedades de trigo producidas utilizando doblehaploides (COST

Action 581, 2005). ..............................................................................................12

Tabla 1.4.- Pretratamientos utilizados en trigo. ....................................................................20

Tabla 1.5.- Familias de proteínas relacionadas con patogénesis (van Loon et al. 2006)......36

Tabla 3.1.- Composición del medio de pretratamiento ........................................................42

Tabla 3.2.- Composición del medio MSM ...........................................................................44

Tabla 3.3.- Contenido de maltosa y Ficoll tipo 400 de los medios de cultivo MSM,

MSM-F200 y MSM-300.....................................................................................45

Tabla 3.4.- Composición del medio J25-8 (Jensen 1983).....................................................46

Tabla 3.5.- Contenido de manitol y agarosa de los medios de pretratamiento 0,4M-L y

0,7M-S. ...............................................................................................................58

Tabla 3.7.- Números de acceso del Genbank de los cDNA analizados y secuencias de

los pares de cebadores utilizados para cada uno de ellos....................................63

Tabla 4.1.- ANOVA de la longitud media de los estomas de plantas H y DH del

cultivar Chris en dos estados de desarrollo.........................................................73

Tabla 4.2.- ANOVA de la longitud media de los estomas del cultivar Chris y el

cruzamiento 40xS83............................................................................................74

Tabla 4.3.- Longitud media de los estomas para plantas DH y H en las líneas

derivadas de Chris y del cruzamiento 40xS83. ...................................................74

Tabla 4.4.- Tratamiento de plantas haploides con colchicina...............................................75

Tabla 4.5.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. ANOVA para

las variables de respuesta androgénica en el cultivo de microsporas de los

cultivares Chris, Pavon y Caramba. ....................................................................77

Tabla 4.6.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. Respuesta al

cultivo de microsporas y separación de medias en tres cultivares de trigo

panadero..............................................................................................................77

Tabla 4.7.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas

aisladas. ANOVA para las variables de respuesta androgénica de los

cultivares Chris, Pavon y la línea DH24033. ......................................................80

Índice de tablas

X

Tabla 4.8.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas

aisladas. Respuesta al cultivo en tres genotipos de trigo panadero. ...................81

Tabla 4.9.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. Respuesta

al cultivo y separación de medias en dos cultivares de trigo panadero. .............83

Tabla 4.10.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. ANOVA

para las variables de respuesta androgénica de los cultivares Pavon y

Caramba..............................................................................................................84

Tabla 4.11.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras.

Separación de medias para el factor genotipo. ...................................................84

Tabla 4.12.- Pretratamiento en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido

con manitol 0,7 M. Respuesta al cultivo de anteras en dos cultivares de

trigo panadero .....................................................................................................86

Tabla 4.13.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en

medio sólido con manitol 0,7 M. ANOVA para las variables de respuesta

androgénica en los cultivares Pavon y Caramba. ...............................................87

Tabla 4.14.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en

medio sólido con manitol 0,7 M. Separación de medias para el factor

genotipo. .............................................................................................................88

Tabla 4.15.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en

medio sólido con manitol 0,7 M. Separación de medias para el factor

tratamiento. .........................................................................................................88

Tabla 4.16.- Pretratamiento en manitol con y sin nitrógeno. Respuesta del cultivo de

anteras en dos cultivares de trigo panadero. .......................................................90

Tabla 4.17.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. ANOVA para las variables de

respuesta androgénica en los cultivares Pavon y Caramba. ...............................91

Tabla 4.18.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Separación de medias para el factor

genotipo. .............................................................................................................91

Tabla 4.19.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Separación de medias para el factor

tratamiento. .........................................................................................................91

Tabla 4.20.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. Respuesta al cultivo en dos cultivares de trigo

panadero..............................................................................................................97

Índice de Tablas

XI

Tabla 4.21.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. ANOVA de las variables de respuesta

androgénica en los cultivares Pavon y Caramba.................................................98

Tabla 4.22.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. Separación de medias para el factor genotipo. .......98

Tabla 4.23.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en

medio sin preacondicionar. Separación de medias para el factor

tratamiento. .........................................................................................................98

Tabla 4.24.- Cultivo en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

con Larcoll y goma arábiga. Respuesta al cultivo de anteras de dos

cultivares de trigo panadero. .............................................................................101

Tabla 4.25.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga.

ANOVA de las variables de respuesta androgénica en los cultivares Pavon

y Caramba. .......................................................................................................101

Tabla 4.26.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga.

Separación de medias para el factor genotipo...................................................101

Tabla 4.27.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga.

Separación de medias para el factor tratamiento. .............................................102

Tabla 4.28.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Respuesta al cultivo de

anteras de dos cultivares de trigo panadero. .....................................................106

Tabla 4.29.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Respuesta al

cultivo de anteras de dos cultivares de trigo panadero. ....................................106

Tabla 4.30.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol (Exp. 1) y tratamiento

con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol (Exp. 2). ANOVA para las

variables de respuesta androgénica en los cultivares Pavon y Caramba. .........107

Tabla 4.31.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Separación de medias

para el factor genotipo. .....................................................................................108

Tabla 4.32.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Separación de

medias para el factor genotipo. .........................................................................108

Tabla 4.33.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Separación de medias

para el factor tratamiento. .................................................................................108

Tabla 4.34.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Separación de

medias para el factor tratamiento. .....................................................................109

XIII

ABREVIATURAS EMPLEADAS

ABA: ácido abscísico AGs: arabinogalactanos AGPs: proteínas de arabinogalactanos ANA: ácido naftalenacético ANOVA: análisis de varianza BA: 6-bencilaminopurina ºC: grado centígrado cm: centímetros cv: cultivar 2,4 D: ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético DAPI: 4',6-Diamidino-2-fenilindol

diclorhidrato DEPC: dietilpirocarbonato DH: doblehaploide DMSO: dimetilsulfóxido DNA: ácido desoxirribonucleico dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato EDTA: etilendinitrilotetra-acétato de sodio EF-1α: factor de elongación de la

transcripción 1 alfa FAO: “Food and Agriculture Organization” FDA: fluoresceín diacetato Fig.: figura g: aceleración de la gravedad

(aproximadamente 9,8 m/s2) GST: glutatión-S-transferasa H: haploide JA: ácido jasmónico l: litro M: molar mg: miligramo

min: minutos ml: mililitros mM: milimolar mRNA: ácido ribonucleico mensajero nm: nanómetros OVCM: medio preacondicionado con

ovarios OxOx: oxalato oxidasa PA: ácido fosfatídico PAL: fenilalanina-amonio-liasa PCD: muerte celular programada o

“programmed cell death” PCR: reacción en cadena de la polimerasa PEG: polietilenglicol PLD: fosfolipasa D PR: relacionada con patogénesis REG: regeneración RNA: ácido ribonucleico RT-PCR: reacción en cadena de la

polimerasa en tiempo real s: segundos SA: ácido salicílico SAR: respuesta sistémica adquirida STD: desviación estándar v/v: volumen por volumen

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Triticum aestivum: INTERÉS Y ASPECTOS GENERALES

De las especies cultivadas por el hombre, los cereales son los más importantes en

la alimentación humana. En los países desarrollados, los cereales representan más de

un 30% de la energía que se ingiere en la dieta, mientras que a nivel mundial

representan casi un 50% del aporte calórico (FAOSTAT 2006). Aunque existe una

desaceleración en el crecimiento demográfico, la FAO prevé que será necesario

aumentar la producción anual mundial de cereales en unos 800 millones de toneladas,

en el periodo 2000-2030 (FAO 2006). Además, en el futuro la producción agrícola

deberá ser capaz de mantener la seguridad alimentaria de la población, y al mismo

tiempo atender la nueva demanda de biocombustibles.

A nivel mundial, el trigo es el cereal más cultivado en cuanto a superficie

utilizada y ocupa el tercer lugar en cuanto a producción después del maíz y el arroz

(Tabla 1.1). En España, es el segundo cereal en superficie y producción después de la

cebada (Tabla 1.2). Esto es debido a que la cebada es más resistente a los ambientes

semiáridos, por lo que puede ocupar zonas con menor pluviometría.

Tabla 1.1.- Producción mundial de cereales en 2005 (FAOSTAT 2008).

Cultivos Superficie Producción

(Miles de Hectáreas) (Miles de Toneladas)

Trigo 221.438 628.698

Arroz 154.476 631.509

Maíz 145.499 712.878

Cebada 56.282 141.334

Sorgo 44.092 59.214

Mijo 33.443 30.589

Avena 11.253 23.553

Centeno 6.806 15.223

Triticale 3.864 13.293

Mijo 33.443 30.589

Introducción

2

Como los demás cereales, el trigo es una planta monocotiledónea perteneciente a

la familia de las gramíneas. Pertenece a la tribu Triticeae, a la que pertenecen también

la cebada y el centeno.

El trigo es una especie alopoliploide. Según su número de cromosomas, las

especies del género Triticum se clasifican en diploides (2n=14), tetraploides (2n=28) y

hexaploides (2n=42), por lo que esta especie es uno de los mejores modelos en el

estudio del fenómeno de la alopoliploidía. En producción agrícola se utilizan

principalmente trigos blandos o panaderos (Triticum aestivum subespecie vulgaris),

que son hexaploides, y trigos duros o de pasta (Triticum turgidum subespecie durum),

que son tetraploides (Guerrero 1992).

Tabla 1.2.- Producción de cereales en España en 2005. (MAPA 2007).

El trigo blando (T. aestivum) es el más cultivado, tanto en España como a nivel

mundial. Sus granos se fraccionan de manera aleatoria, irregular, dando lugar a harinas

muy finas. La unión elástica de las proteínas del trigo forma el gluten, que permite la

retención de gases y agua durante la fermentación, haciendo posible la panificación.

Según la dureza del endospermo se clasifican como trigos flojos, fácilmente

molturables y utilizados principalmente en pastelería, o trigos fuertes, que requieren

más esfuerzo de molturación, por lo que contienen mayor cantidad de almidón

Cultivos Superficie Producción

(Miles de Hectáreas) (Miles de Toneladas)

Cebada total 3.156 4.626

Trigo blando 1.364 3.092

Trigo duro 910 935

Trigo total 2.274 4.027

Avena 458 542

Maíz 385 3.981

Arroz 119 824

Centeno 89 129

Triticale 38 52

Sorgo 7 22

Introducción

3

liberado, lo que los hace adecuados para la elaboración de pan. El grano de trigo duro

(T. durum) se fracciona de forma más regular, dando lugar a semolinas que se utilizan

primordialmente en la elaboración de pastas y sémolas (Peña 2002, Belderok 2000).

El trigo se usa también para fabricar cereales de desayuno y, en menor medida,

en la elaboración de cerveza, whisky y alcohol industrial. Los trigos de menor calidad

y los subproductos de la molienda y de la elaboración de cervezas y destilados se

aprovechan como piensos para el ganado. Se destinan pequeñas cantidades a fabricar

sucedáneos del café, sobre todo en Europa, y el almidón de trigo tiene diversas

aplicaciones industriales (Peña 2002, Belderok 2000).

Hace aproximadamente 4 m.a., las especies diploides de las que proceden estos

trigos se originaron por un proceso de evolución divergente a partir de un progenitor

común, a cuyo genoma nos referimos aquí como PP (Fig. 1.1). En una segunda etapa

de evolución convergente, hace aproximadamente 0,5 m.a., ocurrió la hibridación

intergenérica y posterior duplicación cromosómica, que dio lugar a un trigo

alotetraploide silvestre Triticum turgidum ssp. diccoides (AABB). El donante del

genoma A es Triticum urartu (Dvorâk et al. 1993) y el del genoma B se desconoce,

Fig. 1.1.- Historia evolutiva del trigo alotetraploide y del trigo alohexaploide. Esquema

basado en Levy y Feldman (2004).

T. turgidum ssp. durum

AABB

Híbrido estéril ABD

Común antecesor

PP

T. turgidum ssp.diccoides

AABB

Híbrido estérilAB

Error meiotico

Domesticación

Trigo similar Ae.speltoides

BB

T. urartu AA

Ae.tauschii DD

Error meiotico

T.aestivumAABBDD

Hace ~ 4 m. a. Hace ~ 9.500 años Hace ~ 0.5 m. a.

Introducción

4

aunque sería una especie cercana a Aegilops speltoides (Dvorâk et al. 1998). Tras la

domesticación de este trigo, hace unos 10.500 años, ocurrió una segunda hibridación

intergenérica con Aegilops tauschii y posterior duplicación cromosómica que dio lugar

a las especies hexaploides (AABBDD). Las duplicaciones cromosómicas que dieron

lugar a las nuevas especies pudieron tener lugar por duplicación somática de la planta

estéril, o como resultado de gametos no reducidos en ambos parentales o en el híbrido

estéril (Jauhar 2003).

El número básico de cada genomio de las especies de trigo es 7, por lo que

existen 7 grupos de homeología, en los que se agrupan los cromosomas que están

relacionados evolutivamente. Los cromosomas homeólogos están estrechamente

relacionados entre sí. Por eso la aparición del gen supresor del emparejamiento de

cromosomas homólogos (Ph1), que debió de ocurrir al tiempo que se originaba el trigo

tetraploide, fue esencial para conferir regularidad meiótica y estabilidad reproductiva

al trigo (Jauhar 2003).

El trigo es una planta autógama, lo que quiere decir que se reproduce por

autofecundación. La estrategia que emplea para ello es la cleistogamia; la fecundación

de la flor tiene lugar antes de su apertura, para que sea su propio polen el que llegue al

ovario. Esto hace que cada variedad de trigo conserve sus características agronómicas

de forma constante.

Las flores del trigo se reúnen en inflorescencias denominadas espigas. Dado que

ésta es la parte de la planta principalmente utilizada en esta tesis, su morfología se

describe a continuación.

Cada espiga consta de un eje principal o raquis sobre el que se distribuyen

lateralmente las espiguillas (Fig. 1.2a). Existe un gradiente dentro de la espiga, de

manera que es en la zona media donde se encuentran las espiguillas más grandes y

más avanzadas. Éstas constan de un eje principal (raquilla) del que nacen dos brácteas

llamadas glumas que encierran las flores (Fig. 1.2b). Dentro de cada espiguilla hay

unas 6 flores, entre 2 y 4 son potencialmente fértiles, las demás degeneran. Además de

las glumas, las flores se encuentran protegidas por otras dos brácteas: la interior,

denominada pálea y la exterior, llamada lemma. Esta última puede ser rematada por

una barba, que confiere a la espiga de trigo de algunas variedades su aspecto plumoso.

Cada flor contiene un único carpelo, constituido por el ovario y el estigma, y tres

estambres formados por el filamento y la antera (Fig. 1.2c).

Introducción

5

Fig. 1.2.- Morfología de la inflorescencia de trigo. Espiga (a), espiguilla (b) y flor dentro

de la espiguilla (c). Modificado a partir de Kirby (2002) y de Sierra Posada (2002).

En el ciclo vegetativo del trigo se distinguen tres periodos (Fig. 1.3):

• Periodo vegetativo: Desde la siembra hasta el comienzo del encañado,

comprende las etapas de germinación y ahijamiento.

• Periodo de reproducción: Desde el encañado hasta la terminación del espigado

y fecundación de la flor.

• Periodo de maduración: Desde el final del espigado hasta el momento de la

recolección, comprende el momento de acumulación de almidón en el grano.

a) b)

c)

Introducción

6

P. Vegetativo P. Reproductivo P. de Maduración

Germinación Ahijamiento Encañado Espigado Llenado y secado del grano

Fig. 1.3.- Ciclo vegetativo del trigo, modificado a partir de UPC (2008)

Pueden definirse tres tipos de variedades según su ciclo vegetativo:

• Variedades de otoño o ciclo largo: Se caracterizan por necesitar un periodo de

reposo invernal para poder emitir espigas y por poseer un alto poder de

ahijamiento.

• Variedades de primavera o ciclo corto: No necesitan pasar por un periodo de

reposo previo al espigado. Suelen caracterizarse por su sensibilidad al frío, su

poca capacidad de ahijamiento y por una alta calidad harino-panadera, con el fin

de compensar su baja productividad.

• Variedades alternativas: Son variedades que pueden alargar o acortar su ciclo

según el momento de la siembra, de manera que pueden espigar igualmente

cuando se realizan siembras tardías. Según su sensibilidad al frío se dividen en

alternativas tardías o de ciclo medio y alternativas precoces, más próximas a las

de tipo primaveral.

Para cumplir su ciclo vegetativo, cada variedad requiere una determinada

cantidad de calor que se conoce como integral térmica. Los valores aproximados para

las variedades de otoño serían de 1900 a 2400ºC y para las variedades de primavera,

de 1250 a 1550ºC (Guerrero 1992).

Introducción

7

1.2. LA HAPLOIDÍA EN LA NATURALEZA

El término haploide (H) es utilizado en un sentido genérico que comprende

aquellos esporofitos cuya constitución cromosómica es igual a la de los gametos

normales de la especie (Jauhar 2003). La haploidía (condición de un organismo, tejido

o célula, que posee uno solo de los cromosomas de cada pareja de homología) puede

ser un estado normal o anormal en la naturaleza. Individuos haploides normales son

las fases gametofíticas de las plantas inferiores, los hongos, y los machos de las

especies con determinismo sexual por haplo-diploidía (Lacadena 1981).

En el reino vegetal, la haploidía anormal puede ocurrir, aunque con poca

frecuencia, en un número elevado de especies (Kimber y Riley 1963, Harlow et al.

1996). Se han distinguido aquellos haploides provenientes de especies diploides (AA)

como monoploides, y los provenientes de especies poliploides (AAAA, o AABB, etc.)

como polihaploides (Fossard 1974).

En angiospermas, la formación de haploides puede producirse espontáneamente

a partir de: a) un gameto femenino no fecundado (partenogénesis), b) un gameto

masculino (partenogénesis masculina o androgénesis) y c) una célula del saco

embrionario distinta del gameto femenino (apogamia). La mayoría de esporofitos

haploides que ocurren en la naturaleza provienen del saco embrionario, la

androgénesis en mucho menos frecuente (Kimber y Riley 1963, Lanaud 1988).

La aparición de plantas haploides es frecuentemente debida al fenómeno de

poliembrionía, en la que la fertilización normal induce apogamia, con posibilidades de

que algún embrión apogámico sea haploide (Lanaud 1988). Aunque la embriogénesis

puede producirse también independientemente de la fecundación, en algunas especies

ésta es un requerimiento para la formación del endospermo y la producción de

semillas viables. La partenogénesis puede ser producida por seudogamia, que es la

estimulación de la ovocélula por una polinización, sin que haya fecundación, pero

también puede tener lugar sin polinización ni fecundación. En otras ocasiones, el

núcleo del gameto femenino y el núcleo del gameto masculino dividen

simultáneamente, dando lugar a un embrión haploide, mitad partenogenético y mitad

androgenético, en lo que se denomina semigamia (Lacadena 1981).

La plantas haploides son viables, pero estériles y normalmente de menor tamaño

(Powell et al. 1975, Kondorosi et al. 2000). La haploidía hace que todos los alelos se

Introducción

8

encuentren en hemicigosis, lo que pondrá de manifiesto los alelos recesivos deletéreos

en las plantas alógamas. Por tanto, la tolerancia a la haploidía debería ser mayor en

especies autógamas, que están en homocigosis en la naturaleza, y en especies

poliploides, que contienen mayor cantidad de información redundante que las

especies diploides (Riley 1974, Grimanelli et al. 2001).

1.3. IMPORTANCIA DE LAS PLANTAS DOBLEHAPLOIDES EN

MEJORA

La mejora en trigo se basa en el cruzamiento y la selección. El cruzamiento nos

permite combinar en una misma variedad caracteres de varios orígenes o simplemente

introducir en nuestro material caracteres de otras variedades, incluso de otras especies

que admiten la posibilidad de cruzamiento con la nuestra. La selección consiste en

elegir las mejores plantas de una población para constituir la generación del año

siguiente. Así en trigo, una vez elegidos los parentales para el cruzamiento se obtiene

la F1 y se inician varios ciclos de autofecundación, siendo a partir de la F2 ó F3 donde

comienza la selección para la obtención de líneas mejoradas. Los métodos de mejora

más utilizados en trigo son la selección masal, la selección genealógica y el

retrocruzamiento (Sánchez-Monge 1974).

En el proceso de obtención de nuevas variedades no es conveniente realizar una

selección intensiva hasta que las líneas están cercanas a la homocigosis, debido a los

efectos de la dominancia sobre el fenotipo. Además, debemos disponer de una

cantidad de semilla suficiente para realizar la selección y los ensayos en campo, en

diferentes localidades. Todo este proceso de autofecundación, selección, producción

de semilla e inscripción de la variedad, tradicionalmente, puede llevar unos 10-14

años.

La homocigosis es muy importante en mejora genética, tanto para obtener líneas

puras en especies alógamas, como para recuperar formas homocigóticas después de

realizar un cruzamiento en especies autógamas. Pero conseguir líneas prácticamente

puras mediante los métodos tradicionales de mejora es un proceso muy lento, que se

consigue tras sucesivas generaciones de autofecundación.

Mediante la duplicación de la dotación cromosómica de las plantas haploides, se

obtienen las plantas doblehaploides (DH), que son totalmente homocigotas y fértiles.

Introducción

9

Estas plantas se obtienen directamente a partir de un parental heterocigoto en una sola

generación, por lo que es la manera más rápida de conseguir la fijación de caracteres

(Hermsen y Ramanna 1981). La ventaja que aportan las plantas DH es que pueden ser

seleccionadas directamente por su fenotipo desde el primer momento, lo que permite

disminuir la laboriosidad y la duración del proceso de producción de nuevas

variedades, reduciéndolo unos 6 años (Thomas et al. 2003).

Además, las líneas DH son especialmente útiles en estudios genéticos y

actualmente se utilizan rutinariamente en la elaboración de mapas genéticos, análisis

de QTLs (“quantitative trait loci”), mutagénesis in vitro, transformación y selección

asistida por marcadores (revisado por Szarejko 2003, Forster y Thomas 2003, Devaux

y Pickering 2005, Forster y Thomas 2005).

En trigo, se han obtenido nuevas variedades a partir de la selección de líneas DH

(Tabla 1.3, COST Action 581, 2005) y también se han utilizado las líneas DH en la

elaboración de mapas de marcadores moleculares (Cadalen et al. 1998, Kato et al.

2001), en la identificación de QTLs (Sourdille et al. 2000, Torp et al. 2001) y en

selección asistida por marcadores (Cornish et al. 2001, William et al. 2002).

1.4. MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE PLANTAS

DOBLEHAPLOIDES

Las tres condiciones requeridas para que un sistema de producción de plantas

DH sea aplicable a un programa de mejora son que: 1) permita obtener grandes

cantidades de plantas DH de todos los genotipos incluidos en el programa de mejora,

2) produzca plantas genéticamente normales y estables, y 3) la población de plantas

doblehaploides represente de forma aleatoria la totalidad de los gametos de la planta

madre (Snape et al. 1986).

Actualmente se dispone de cuatro métodos que permiten producir un número de

plantas H y/o DH suficiente, como para ser aplicables en mejora:

• Ginogénesis: Ovarios cultivados in vitro, dan lugar a embriones formados a

partir de alguna de las células del saco embrionario.

La tasa de embriogénesis es normalmente baja, aunque se han obtenido buenos

resultados en algunas especies como remolacha y cebolla (Lux et al. 1990, Alan

Introducción

10

et al. 2004). La mayoría de las plantas regeneradas por este sistema son verdes.

Se ha utilizado en aquellos casos en los que otros métodos no han tenido éxito.

• Partenogénesis: Un embrión se desarrolla in vivo a partir de la ovocélula sin

intervención de un núcleo espermático.

Se puede inducir artificialmente mediante polen inactivado o mediante

tratamientos químicos. Aunque las frecuencias de inducción son muy bajas

(Kush y Virmani 1996) exceptuando algunas especies como la patata (Peloquin

et al. 1996), actualmente se utiliza en especies como melón, pepino y mandarino

(Lofti et al. 2003, Claveria et al. 2005, Froelicher et al. 2007).

• Cruzamiento interespecífico o intergenérico: Producción de un embrión

haploide mediante la eliminación del genoma del parental masculino.

Se describió por primera vez en la fecundación de H. vulgare con polen de H.

bulbosum (Kasha y Kao 1970). Este método está limitado a cereales y patata

(Kasha y Maluszynski 2003). Se utiliza ampliamente en cebada y también se

consiguen buenos resultados en trigo mediante la polinización con maíz (Laurie

y Bennett 1988; Kisana et al. 1993; Mujeeb-Kazi y Riera-Lizarazu 1996,

Maluszynski et al. 2003, COST Action 581, 2005).

• Embriogénesis de la microspora o androgénesis: Anteras o microsporas

aisladas cultivadas in vitro sufren embriogénesis directa, o bien organogénesis

mediante la formación intermedia de callo.

Hasta el año 1996 se habían obtenido plantas, por este sistema, de 13 especies

incluyendo varias especies de Brassica y Nicotiana, y otras como Datura

innoxia, arroz, cebada, trigo y maíz (Dunwell 1996). Gracias al desarrollo de

nuevos protocolos de cultivo de anteras o microsporas, su utilización tiende a

aumentar, tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. En la actualidad

se han publicado resultados en más de 250 especies y, aunque no en todas se ha

conseguido la regeneración de plantas doblehaploides (Maluszynski et al. 2003),

en cereales como la cebada y el trigo ha demostrado ser un sistema muy útil de

Introducción

11

producción de nuevas variedades de interés agronómico (Devaux et al. 1996,

COST Action 851 2005).

Los métodos de producción de plantas DH más utilizados en trigo, son el

cruzamiento interespecífico o intergenérico y la embriogénesis de la microspora.

Ambos han dado lugar al registro de nuevas variedades por parte de centros públicos y

compañías privadas (Tabla 1.3).

No existen grandes diferencias entre ellos en cuanto a laboriosidad, costes o

duración (Kasha y Maluszynski 2003).

El cruzamiento interespecífico o intergenérico presenta la ventaja de la falta de

albinismo y de variación gametoclonal (Kasha y Maluszynski 2003). Sin embargo,

todas las plantas que produce son haploides, lo que obliga a realizar tratamientos

diploidizantes. Otra de las dificultades que presenta radica en la disponibilidad de

polinizadores compatibles con los genotipos de interés. Además, es imprescindible

hacer coincidir el periodo de floración de ambas especies, por lo que es necesario un

cultivo muy controlado, en cámaras o invernaderos.

La embriogénesis gamética tiene el potencial de producir un número muy

elevado de plantas DH a partir de muy pocas plantas donantes, ya que se produce un

gran número de microsporas por flor. Además, un porcentaje variable de las plantas

que se producen duplican, de manera espontánea, su complemento genético. Las

limitaciones de este método son la producción de plantas albinas y la dependencia del

genotipo, de ahí la necesidad de desarrollar protocolos que puedan ser efectivos en un

amplio rango de genotipos.

Introducción

12

Tabla 1.3.- Lista de variedades de trigo producidas utilizando doblehaploides (COST Action

581, 2005)

Autoridad/ Referencia/

Método Variedad País comunicación personal

Cultivo de anteras BR-43 Brasil Andre Rosa OAC Montrose Canadá Tony Hunt

Huapei 1 China desconocido Jinghua 1 China Wenchun Zhou

Lunghua 1 China desconocido Florin Francia De Buyser et al., 1987 Raspail Francia Pierre Devaux Rubens Francia Pierre Devaux Korund Alemania Günter Müller Bill Alemania,

Dinamarca Ralf Schachschneider

GK Delibab Hungría Janos Pauk GK Szindbad Hungría Janos Pauk GK Tunder Hungría Janos Pauk MV Madrigal Hungría, Eire & UK Zoltan Bedo MV Szigma Hungría Zoltan Bedo SW Agaton Suecia Jan Jönsson

Polinización con maíz Napier UK Tony Rhodes/Monsanto Solstice UK Tony Rhodes/Advanta Xi19 UK, Eire, Alemania,

Francia Tony Rhodes/Advanta

Marshal UK & Eire Tony Rhodes/Advanta Savannah UK, Eire, Alemania,

Francia Tony Rhodes/Advanta

Agami Francia Tony Rhodes/Advanta Symbol Dinamarca Tony Rhodes/Advanta Warlock 24 UK, Bélgica Tony Rhodes/Advanta Scorpion 25 UK, Francia Tony Rhodes/Advanta Smuggler UK Tony Rhodes/Advanta Piranha UK Tony Rhodes/Advanta Director UK Tony Rhodes/Advanta Assegai UK Tony Rhodes/Advanta Zebedee UK Tony Rhodes/Advanta Gatsby UK Tony Rhodes/Advanta Faur Rumanía ARDI-Fundulea, Aurel Giura Glosa Rumanía ARDI-Fundulea, Aurel Giura

Introducción

13

1.5. PRODUCCIÓN DE PLANTAS DH MEDIANTE ANDROGÉNESIS

Debido al gran potencial de esta técnica para producir plantas doblehaploides,

hubo varios intentos de llevarla a cabo (Tulecke 1953, Yamada et al. 1963), antes de

que Guha y Maheshwari (1966) tuvieran éxito y consiguieran los primeros embriones

haploides formados a partir del cultivo in vitro de anteras de Datura.

Las células gaméticas son las encargadas de la reproducción sexual de los

organismos, y su dotación cromosómica es haploide (n). Las anteras son las

estructuras que contienen las células gaméticas masculinas. Estas células se llaman:

microsporas durante su desarrollo temprano, cuando todavía tienen un solo núcleo;

polen inmaduro tras la primera división mitótica, que da lugar a los núcleos vegetativo

y generativo; polen tras la segunda división mitótica, en la que se divide el núcleo

generativo, para dar lugar a las dos espermátidas o núcleos espermáticos (Fig. 1.4).

Por lo general, las plantas monocotiledóneas liberan polen en estado trinucleado, ya

que la segunda división mitótica ocurre dentro de la antera, mientras que las

dicotiledóneas liberan el polen en estado binucleado (Reynolds 1997).

La embriogénesis de la microspora, o androgénesis, se fundamenta en la

posibilidad de cambiar in vitro el patrón normal de desarrollo gametofítico de la

microspora, y en su lugar inducir un desarrollo esporofítico, que dé lugar a la

formación de un embrión o estructura organizada capaz de regenerar una planta

completa. Esto se puede conseguir mediante el cultivo de anteras o mediante el cultivo

de microsporas aisladas (Fig. 1.5).

Introducción

14

Fig. 1.4.- Microgametogénesis y estructura del polen (modificado a partir de

Buchanan et al. 2000).

Introducción

15

Fig. 1.5.- Producción de plantas mediante el cultivo de anteras y el cultivo de

microsporas, tanto por embriogénesis directa como con formación intermedia de callo

u organogénesis (Reynolds 1997).

El cultivo de microsporas presenta algunas ventajas frente al cultivo de anteras,

como: a) la eliminación de tejidos esporofíticos de la antera, que permite condiciones

más controladas de cultivo en cuanto a nutrientes disponibles, b) desechar la

posibilidad de que estos tejidos sufran embriogénesis somática, c) ofrece la posibilidad

de purificar las microsporas viables, eliminando sustancias perjudiciales generadas por

las no viables, y d) permite la observación directa durante el proceso de

embriogénesis.

Introducción

16

Las primeras plantas DH de trigo se obtuvieron mediante el cultivo de anteras, a

través de la formación intermedia de callo (Ouyang et al. 1973). La eficiencia de

inducción de androgénesis en este cereal ha aumentado considerablemente durante los

últimos años, mediante cambios en la composición de los medios y condiciones de

cultivo, que han hecho posible la inducción de embriogénesis directa, dejando atrás la

organogénesis a partir de callos (Cistué y Kasha 2006). En trigo, la utilización del

cultivo de microsporas ha dado mejores resultados que el cultivo de anteras (Holme et

al. 1999) y en algunos casos ha producido cantidades elevadas de plantas verdes (Liu

et al. 2002b).

1.5.1. Factores que determinan la producción de plantas mediante androgénesis

La eficiencia del proceso de producción de plantas DH mediante androgénesis

depende del número de microsporas que dividen, del número de embriones formados,

de su capacidad de regeneración y de los porcentajes de plantas verdes y de

duplicación cromosómica. Estas variables se ven afectadas por un gran número de

factores, tanto genéticos como fisiológicos.

1.5.1.1. Genotipo

Se han encontrado diferencias muy grandes en la respuesta androgénica de

diversas especies. Entre las especies que mejor responden y que son consideradas

especies modelo en androgénesis, se encuentran el tabaco, la colza y la cebada, aunque

los resultados varían enormemente entre los genotipos. En algunas especies, se han

obtenido resultados en tan solo algunos genotipos (Forster y Thomas 2005). En trigo,

las diferencias genotípicas explican la mayor parte de la variación en la respuesta

androgénica (Tuvesson et al. 1989, Zhou y Konzak 1992, Moieni y Sarrafi 1995,

Holme et al. 1999, Tuvesson et al. 2000). Es el factor con mayor influencia sobre la

frecuencia de embriogénesis y los porcentajes de regeneración y de plantas verdes

(Moieni et al. 1997, Holme et al. 1999). Se ha observado que es muy pequeño o

inexistente el efecto recíproco para estos caracteres, por lo que se concluye que son

caracteres que se transmiten mediante genes nucleares (Tuvesson et al. 1989). Se han

dedicado grandes esfuerzos en la identificación de marcadores moleculares asociados

con la respuesta androgénica en cereales como maíz, trigo, arroz, triticale y cebada

Introducción

17

(Beaumont et al. 1995, Torp et al. 2001, Kwon et al. 2002, González et al. 2005,

Muñoz-Amatriaín et al. 2008). En trigo se han identificado QTLs asociados con el

porcentaje de plantas verdes en los cromosomas 2AL, 2BL y 5BL (Torp et al. 2001).

1.5.1.2. Estado fisiológico de las plantas donantes

Aunque la respuesta androgénica esté bajo un fuerte efecto genotípico, los

factores ambientales también intervienen, y son capaces de cambiar esta respuesta. Las

condiciones de crecimiento de las plantas donantes deben asegurar un buen

ahijamiento y el correcto desarrollo de las anteras. Si las plantas no crecen en

condiciones óptimas de luz, nutrientes, humedad y temperatura tendrán problemas de

crecimiento que afectarán a la capacidad de respuesta de las microsporas a la

inducción de embriogénesis (Ouyang et al. 1987, Kasha et al. 1990). Por ello, para

obtener resultados reproducibles, normalmente se prefiere el cultivo controlado en

cámaras de cultivo (Hoekstra et al. 1992, Orshinsky y Sadasivaiah 1997, Bjørnstad et

al. 1989). Hay que tener en cuenta que las condiciones de crecimiento que aseguren

una mejor respuesta androgénica pueden variar entre genotipos, ya que existe

interacción genotipo × ambiente (Lazar et al. 1984). El estado fitosanitario también es

importante, y la necesidad de aplicar tratamientos plaguicidas puede tener efectos

adversos sobre la respuesta androgénica (Cistué et al. 2003).

1.5.1.3. Estado de desarrollo de las microsporas

Los primeros trabajos en embriogénesis de la microspora demostraron que el

estado de desarrollo podía ser el factor más importante y que los estadios adecuados

podían ser diferentes según la especie (Bourgin y Nitsch 1967, Nitsch y Nitsch 1969).

A medida que la técnica se ha ido desarrollando, se ha visto que los estadios

susceptibles de abandonar la ruta gametofítica y dar lugar a la formación de un

embrión, también varían según el tipo de estrés o su intensidad (Touraev et al. 1997).

Las microsporas de trigo dentro de una misma antera no están sincronizadas, por

lo que se define el estado de la antera de acuerdo con el de la mayoría de las

microsporas que contiene (He y Ouyang 1984). Tan solo en una fracción de ellas será

posible la inducción de embriogénesis (Liu et al. 2002b). Se sigue considerando que

los estadios cercanos a la primera división mitótica (uninucleado medio o tardío) son

Introducción

18

los más adecuados en trigo, aunque tanto en cebada como en trigo se ha visto que los

estadios ligeramente más avanzados de desarrollo (uninucleado tardío o binucleado

temprano) son más adecuados cuando se realiza el cultivo de las microsporas aisladas

(Hoekstra et al.1992, Touraev et al. 1996a, Pauk, comunicación personal).

1.5.1.4. Pretratamiento de estrés

El estrés es un factor esencial en la inducción de androgénesis. Se han aplicado

diferentes tipos de estrés dependiendo de la especie y del estado de desarrollo de las

microsporas (revisado por Zoriniants et al. 2005 y Shariatpanahi et al. 2006a). Los que

se han aplicado de manera mayoritaria son:

• Pretratamiento de frío

El frío aplicado en flores o anteras ha sido ampliamente utilizado en diversas

especies como cebada (Sunderland y Xu 1982), arroz (Cho y Zapata 1988), maíz

(Gaillard et al. 1991), trigo (Gustafson et al. 1995), triticale (Inmonen y Robison

2000), Citrus clementina (Germana y Chiancone 2003) y otras.

Se ha propuesto que durante el pretratamiento de frío las microsporas sufren un

estrés por ayuno de nutrientes, el cual sería responsable de la reprogramación. La

baja temperatura además, actuaría ralentizando los procesos celulares y

estimulando la protección frente el estrés, lo que ayudaría a que un mayor

número de microsporas sobrevivan al pretratamiento (Zoriniants et al. 2005).

• Choque de calor

El choque de calor se ha aplicado a microsporas aisladas, principalmente en

Brassica (Keller y Armstrong 1979, Custers et al. 1994), pero también en trigo

(Touraev et al. 1996a) y tabaco (Touraev et al. 1996b). Menos frecuentemente se

ha aplicado a anteras, en algunas especies como Hepatica nobilis (Nomizu et al.

2004) y avena (Kivaharju y Pehu 1998).

En Brassica, se ha observado que este pretratamiento produce múltiples cambios

celulares y estructurales (Telmer et al. 1993), especialmente en el citoesqueleto

(Simmods y Keller 1999) y también cambios en el ciclo celular (Binarova et al.

Introducción

19

1993) y en la expresión génica (Cordewener et al. 1995; Joosen et al. 2007;

Malik et al. 2007).

• Ayuno de carbohidratos y/o nitrógeno

Este pretratamiento se ha utilizado en numerosas especies. Se ha aplicado en

espigas de trigo (Touraev et al. 1996a), en anteras de arroz (Raina e Irfan 1998),

trigo (Gustafson et al. 1995, Hu y Kasha 1999), cebada (Roberts-Oehlschlager y

Dunwell 1990, Hoekstra et al. 1992, Cistué et al. 1999) y centeno (Guo y Pulli

2000) y en microsporas aisladas de tabaco (Kyo y Harada 1986), cebada (Wei et

al. 1986) y arroz (Ogawa et al. 1994). Para ello, se han utilizado medios en los

que no se incluye la fuente de carbono (Ogawa et al. 1994) o, como en el caso

del tabaco, ni la fuente de carbono ni la de nitrógeno (Kyo y Harada 1986).

Normalmente se han utilizado medios en los que se sustituye la fuente de C por

azúcares no metabolizables como el manitol (Wei et al. 1986, Roberts-

Oehlschlager y Dunwell 1990) o de muy baja metabolización como el sorbitol

(Wojnarowiez et al. 2004) para estabilizar la osmolaridad del medio. Altas

concentraciones de estos azúcares ejercen, además, un estrés osmótico adicional

al ayuno de carbohidratos (Ouyang 1986, Cistué et al. 1994).

Se ha observado que el ayuno produce cambios tanto nucleares como

citoplásmicos (Kyo y Harada 1990, Garrido et al. 1995), así como en el ciclo

celular (Zarsky et al. 1992) y en la expresión génica (Maraschin et al. 2006,

Muñoz-Ammatriain et al. 2006).

• Colchicina

El agente antitubulínico y diploidizante colchicina ((S)-N-(5,6,7,9-tetrahidro-

1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxobenceno (a)heptalen-7-il)acetamida) se ha utilizado en

combinación con el choque de calor para inducir embriogénesis en anteras y

microsporas aisladas principalmente en Brassica (Zaki y Dickinson 1995). En

maíz, la colchicina se ha aplicado durante el pretratamiento de frío de las anteras

(Antoine-Michard y Beckert 1997). También se ha comprobado que esta

sustancia, por sí sola, es capaz de inducir embriogénesis en microsporas de

Brassica (Zhao et al. 1996a,b, Zhou et al. 2002a,b) y de café (Herrera et al.

Introducción

20

2002). Esta sustancia se tratará con más detalle en el apartado 1.7.1 en relación

con la duplicación cromosómica.

Se han utilizado otros tipos de estrés, aunque de manera minoritaria, como la

radiación gamma en cebada (Arabi et al. 2005), la radiación gamma y el etanol en

Brassica (Pechan y Keller 1989) y otros (revisado por Shariatpanahi et al. 2006a).

En trigo se han utilizado diferentes tipos de estrés (Tabla 1.4). Principalmente se

ha utilizado el pretratamiento de frío aplicado a la espiga (4ºC durante 1-2 semanas) y

el pretratamiento de las anteras en manitol, y también combinaciones de diferentes

tipos de estrés.

Tabla 1.4.- Pretratamientos utilizados en trigo.

Explanto Pretratamiento Referencia

Espigas Frío (4ºC, 1-2 semanas) Lazar et al. 1990 Espigas Calor + ayuno (33ºC, 4 d) Touraev et al. 1996a Espigas Calor + ayuno + 2HNA 0,1 g/l (33ºC,

69 h) Liu et al. 2002a,b

Espigas Frío + manitol 0,4 M (4ºC, 4 d) Hu y Kasha 1999 Espigas y Anteras

Frío (espigas a 4ºC, 28 d) seguido de manitol 0,4 M (anteras, 28ºC, 7 d)

Hu y Kasha 1999

Anteras Manitol, sacarosa o KCl+MgSO4

0,8 M (1 h) Wang et al. 1981

Manitol 0,4 M (28ºC, 7 d) Hu et al. 1995, Gustafson et al. 1995 Calor + manitol 0,3 M (33ºC, 4 d) Touraev et al. 1996a, Kunz et al. 2000 Colchicina 400 mg/l (72 h, 29ºC) Barnabás et al. 1991 Microsporas Manitol 0,3 M (2 d) Indrianto et al. 1999 Frío + manitol 0,3M (4ºC, 2 d) Indrianto et al. 1999 Calor + manitol 0,3 M (33ºC, 2 d) Indrianto et al. 1999 2HNA 0,18 mM Zheng et al. 2001

También se ha descrito en trigo la obtención de plantas verdes mediante el

cultivo de microsporas en el que no se aplicó un tratamiento específico de estrés, tan

Introducción

21

solo el propio aislamiento en un medio sin fuente de C ni de N (Indrianto et al. 1999,

Shariatpanahi et al. 2006b).

El tipo de estrés aplicado puede afectar a variables como las frecuencias de

duplicación o de albinismo. Así, la combinación de frío y manitol produjo aumentos

en los porcentajes de duplicación en trigo (Indrianto et al. 1999) y en cebada (Li y

Devaux 2003), y la presión osmótica durante el pretratamiento parece ser importante

para conseguir plantas verdes en cebada (Hoekstra et al. 1993, Cistué et al. 1994,

1999, Wojnarowiez et al. 2004). También se ha observado que el pretratamiento de

frío puede producir mayores frecuencias de plantas albinas que el manitol en varias

especies como trigo (Labbani et al. 2005), tritordeo (Barceló et al. 1994) y cebada

(Cistué et al. 1999).

Como se mencionó en el apartado anterior, la efectividad del pretratamiento está

ligada al estado de desarrollo de la microspora. En Brassica napus, un choque térmico

induce eficientemente microsporas en estado vacuolado tardío o bicelular temprano

(Custers et al. 1994), mientras que es necesario un choque térmico mucho más severo

para inducir microsporas en estadios más avanzados (Binarova et al. 1997). En tabaco,

se utilizan condiciones de ayuno de carbohidratos y nitrógeno para inducir

microsporas en estado bicelular (Kyo y Harada 1986). El estrés por choque térmico no

es efectivo en este estadio, pero sí en cambio en momentos más tempranos, cuando se

utilizan microsporas de tabaco uninucleadas (Touraev et al. 1996b).

1.5.1.5. Composición de los medios de cultivo

1.5.1.5.1. Inducción

Las mejoras aplicadas en el medio de inducción han sido esenciales para

conseguir que esta técnica sea aplicable a un gran número de especies y cultivares. En

algunos cereales, estas mejoras han permitido la formación directa de embriones a

partir de microsporas, dejando atrás el paso intermedio de formación de callos y por

tanto, la variación gametoclonal que pueden implicar los periodos prolongados de

cultivo in vitro (Datta 2001).

En la actualidad, en trigo se utilizan medios basados en el P2 (Ouyang et al.

1983, Ouyang 1986), y otros medios como el W14 (Ouyang et al. 1989), el 190-2

(Wang y Hu 1984), el MMS4 (Kasha et al. 2003) y el NPB-99 (Zheng et al. 2003).

Introducción

22

Los principales componentes de los medios de cultivo de tejidos vegetales son

las sales inorgánicas, que aportan los macroelementos y microelementos, y la fuente

de carbono en forma de carbohidratos. Sustancias orgánicas, principalmente vitaminas,

aminoácidos y reguladores del crecimiento también son necesarios.

• Sales minerales

En el medio de inducción, el macroelemento más estudiado ha sido el nitrógeno.

La disponibilidad de N juega un papel muy importante en el crecimiento y la

morfogénesis. El nitrato es la forma más importante de N en los medios de cultivo de

tejidos vegetales, pero normalmente, un aporte de N reducido es necesario para inducir

embriogénesis en callos o suspensiones celulares. Éste puede añadirse en forma de

aminas, como el amonio y los aminoácidos, y menos frecuentemente en forma de

amidas como la urea, la alantoína y el ácido alantoico (George y Sherrington 1984).

Hunter (1987) consiguió muy buenos resultados en cebada con el medio FHG,

que contiene diez veces menos NH4NO3 que el medio MS (Murashige y Skoog 1962).

También mejoró la respuesta la incorporación de N orgánico en forma de

aminoácidos, en cebada (Olsen 1987, Muyuan et al. 1990) y trigo (Chu y Hill 1988,

Trottier et al. 1993). La glutamina, directamente implicada en la incorporación de N

durante la síntesis de aminoácidos, aumentó el número de plantas verdes producidas

en varios genotipos de trigo blando (Henry y De Buyser 1981, Zhang et al. 1987). Las

mayores frecuencias de regeneración de plantas de cebada se consiguieron utilizando

un ratio de nitrógeno inorgánico-orgánico de 90:10 (Mordhorst y Lörz 1993).

El microelemento más estudiado ha sido el Cu, implicado en la síntesis de

clorofila y en la fotosíntesis (Maksymiec 1997). La utilización de concentraciones

elevadas de Cu ejerce un efecto positivo reduciendo el albinismo producido en el

cultivo in vitro de diferentes explantos de cebada (Cho et al. 1998, Nuutila et al.

2000). Cuando se elevó la concentración de CuSO4 a 10 µM en los medios de

pretratamiento y de cultivo de anteras de cebada, se produjo el aumento de la respuesta

de las anteras y del porcentaje de regeneración además de la reducción del albinismo

(Wojnarowiez et al. 2002). También el incremento de la concentración de ZnSO4 en el

medio de cultivo de anteras de cebada estimuló la embriogénesis (Echavarri et al.

2008).

Introducción

23

• Fuente de carbono

En los primeros medios utilizados en cultivo de anteras de trigo, se observó la

existencia de un efecto regulador de la presión osmótica sobre la embriogénesis de la

microspora que hacía que concentraciones altas de sacarosa fueran beneficiosas, por lo

que se aumentó la concentración de sacarosa de 3% (medio MS) a entre 6 y 12%.

(Zhou et al. 1991, Ball et al. 1992). Sin embargo, la concentración óptima era muy

diferente entre los genotipos y el aumento de este azúcar tendía a producir un mayor

porcentaje de plantas albinas (Raina 1997).

La sustitución de la sacarosa, como fuente principal de carbono, por la maltosa

(Hunter 1987), supuso una gran diferencia en el cultivo de anteras de cereales como la

cebada (Finnie et al. 1989) y el trigo (Fadel y Wenzel 1990), aumentando la calidad de

los embriones y la producción de plantas verdes. Las microsporas hidrolizan la

sacarosa rápidamente, lo que produce deficiencia de oxígeno y acumulación de etanol,

además de un aumento de la presión osmótica del medio de cultivo (Scott et al. 1995).

Además, la fructosa procedente de esta hidrólisis inhibe la inducción de embriogénesis

(Last y Brettell 1990). El efecto positivo de la maltosa radica en que su metabolización

es más lenta, y en que produce una estabilización osmótica del medio, ya que la parte

consumida por las microsporas es pequeña (Indrianto et al. 1999).

• Reguladores del crecimiento y otras sustancias orgánicas

La presencia de auxinas en el medio de cultivo se considera un factor crítico en

cereales para una buena respuesta de anteras o microsporas (Ouyang1986, Liang et al.

1987, Ziauddin et al. 1992, Ball et al 1993, Zheng y Konzak 1999). El tipo de auxina,

su concentración y el tiempo de aplicación tienen una influencia importante en las

diferentes variables del cultivo. En trigo, se utiliza principalmente ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4D) y/o ácido fenilacético (PAA), en combinación con

kinetina (Kin) (Maluszynski et al. 2003).

Otras sustancias orgánicas como las vitaminas, los ácidos orgánicos y el mio-

inositol, son nutrientes que mejoran el crecimiento y la morfogénesis. Las plantas

enteras son capaces de suplir la demanda de estas sustancias, pero las células y tejidos

vegetales en cultivo pueden sufrir carencias, por lo que su adición al medio puede ser

beneficiosa (George y Sherrington 1984).

Introducción

24

• Presión osmótica y agente gelificante

El agar ha sido la sustancia gelificante más comúnmente utilizada en medios de

cultivo, pero puede liberar sustancias inhibitorias que afectan negativamente al cultivo

de anteras, por lo que generalmente se han utilizado diferentes tipos de almidón o

medio líquido (Calleberg y Johansson 1996). En trigo, se ha obtenido una mejor

respuesta de las anteras en medio líquido que en medio solidificado con agar o

agarosa, pero la regenerabilidad de los callos es muy baja, probablemente porque

sufren condiciones de anaerobiosis (Zhou y Konzak 1989, Patel et al. 2004).

El Ficoll, un polímero de alto peso molecular, se introdujo para aumentar la

densidad del medio de cultivo, de manera que las microsporas permanecieran en la

superficie y no sufrieran anoxia (Kao et al. 1991). Su utilización permitió mejorar los

porcentajes de regeneración en trigo, mejorando además la proporción de plantas

verdes con respecto al medio líquido y al medio solidificado con agar (Zhou et al.

1991, Trottier 1993). El Ficoll no puede penetrar en las células, por lo que produce la

estabilización de la presión osmótica durante el cultivo. Se ha observado que este

incremento de osmolaridad del medio, producido por altas concentraciones de maltosa,

por la hidrólisis de la sacarosa o por polímeros como Ficoll o PEG, tiene un efecto

positivo sobre el porcentaje de plantas verdes en trigo (Zhou et al. 1991, Kang et al.

2003) y cebada (Cistué et al. 1999, Wojnarowiez et al. 2004).

• Co-cultivo con diversos tejidos de la flor

En trigo es especialmente importante el co-cultivo con diversos tejidos de la flor.

El co-cultivo con ovarios es esencial para la obtención de embriones mediante el

cultivo de microsporas en esta especie (Datta y Wenzel 1987, Mezja et al. 1993, Hu y

Kasha 1997a). La utilización de otros tejidos de la flor, como glumas y anteras,

también ha inducido la formación de embriones aunque de forma menos efectiva

(Puolimatka y Pauk 1999).

Si no se utiliza el co-cultivo con ovarios, solamente es posible obtener embriones

de genotipos con muy buena respuesta androgénica. Es especialmente importante

utilizarlo durante los primeros 10 días de cultivo, ya que sin las sustancias liberadas

por los ovarios, las microsporas embriogénicas cesan las divisiones y se paraliza la

formación de embriones (Puolimatka y Pauk 1999, Liu et al. 2002b, Patel et al. 2004).

Introducción

25

Se ha conseguido mejorar su efecto utilizando medio preacondicionado, en el que los

ovarios se han cultivado días antes de inocular las microsporas (Zheng et al. 2002).

Se han propuesto diversas sustancias que podrían ser capaces de sustituir o

simular el efecto producido por las sustancias liberadas por los ovarios, como la

hormona PAA (ácido fenilacético), y el Larcoll o la goma arábiga, que son extractos

de arabinogalactanos (Clarke et al. 1979). En co-cultivo con ovarios, la adición de

Larcoll y goma arábiga permitió aumentar la producción de embriones (Letarte et al.

2006). Sin embargo, en ausencia de ovarios no se obtuvieron embriones con PAA ni

con Larcoll (Patel et al. 2004, Letarte et al. 2006) y se obtuvieron aunque en poca

cantidad con goma arábiga (Letarte et al. 2006).

1.5.1.5.2. Regeneración

La buena calidad de los embriones es la principal condición para obtener altos

porcentajes de regeneración. El requerimiento más importante en la etapa de

regeneración es la disminución de la concentración de factores de crecimiento, por lo

que se utilizan menores concentraciones de auxinas que en el medio de inducción, y la

reducción de la concentración de azúcares (Castillo et al. 2000, Maluszynski et al.

2003). El medio de regeneración más utilizado en trigo es el 190-2 de Wang y Hu

(1984).

1.5.2. Características de las plantas regeneradas

1.5.2.1. Estabilidad genética y potencial agronómico

Se ha estudiado la estabilidad genética y el potencial agronómico de las líneas

DH de trigo producidas por cultivo de anteras, en comparación con la hibridación con

maíz (Kisana et al. 1993, Sadasivaiah et al. 1999, Ma et al. 1999, Guzy-Wróbelska y

Szarejlo 2003) y con líneas generadas por mejora tradicional (Winzeler et al. 1987,

Baenziger et al. 1989, Mitchell et al. 1992, Skinnes y Bjørnstad 1995, Inagaki et al.

1998, Ma et al. 1999, Guzy-Wróbelska y Szarejlo 2003). Las líneas DH generadas

mediante estos dos sistemas representan mayoritariamente una muestra al azar de los

gametos parentales y presentan respuestas similares en el campo a las líneas generadas

por los métodos convencionales (Guzy-Wróbelska y Szarejlo 2003). En algunos casos,

Introducción

26

las líneas DH mostraron cierta distorsión de la segregación pero, cuando las

poblaciones tuvieron un tamaño suficientemente grande, no se encontraron diferencias

entre las medias ni variaciones en los caracteres (Guzy-Wróbelska y Szarejlo 2003).

En el caso del cultivo de microsporas, se ha encontrado que las líneas producidas

presentan gran fidelidad genética y similitud con los parentales (Hu y Kasha 1997b).

Los aspectos críticos a tener en cuenta en la distorsión de la segregación o selección

gamética son la elección de los parentales, que deben tener una respuesta androgénica

similar, y la optimización de la técnica de producción de líneas DH (Cistué et al.

2005).

1.5.2.2. Albinismo

Uno de los problemas de la producción de plantas mediante androgénesis es la

aparición de plantas albinas. El porcentaje de plantas verdes frente a plantas albinas

presenta variaciones que son debidas, principalmente, al genotipo (Andersen et al.

1987, Agache et al. 1989, Tuvesson et al. 1989) pero también a otros factores como el

estado de desarrollo de la microspora (He y Ouyang 1984, Liang et al. 1990), el

pretratamiento de estrés (Touraev et al 1996a, Kunz et al. 2000), las condiciones de

temperatura e iluminación durante la incubación (Huang 1987, Ekiz y Konzak 1997),

el medio de cultivo (Liang et al. 1990) y la duración del cultivo (Cistué et al. 1995,

Puolimatka y Pauk 2000).

En distintos cereales el fenotipo albino se ha asociado a delecciones presentes en

el genoma del plástido (Day y Ellis 1984, Day y Ellis 1985, Dunford y Walden 1991,

Harada et al. 1991), aunque también se han identificado plantas albinas cuyo genoma

plastídico no presenta delecciones ni alteraciones (Day y Ellis 1984, Dunford y

Walden 1991, Harada et al. 1991). Se ha demostrado que el control del albinismo es

nuclear (Tuvesson et al. 1989, Larsen et al. 1991). Los fenotipos albinos presentan

alteraciones en las primeras etapas de diferenciación y desarrollo de los plástidos

(Muñoz-amatriaín et al. 2007). Además presentan deficiencia de ribosomas plastídicos

y la alteración de los patrones de transcripción y traducción en comparación con las

plantas verdes (Hofinger et al. 2001).

Introducción

27

1.5.2.3. Nivel de ploidía

Cuando se obtienen las plantas mediante androgénesis, la duplicación

cromosómica puede ocurrir de manera espontánea en momentos muy tempranos de la

inducción, pero normalmente, un porcentaje variable de las plantas que regeneran son

haploides. Los porcentajes de duplicación espontánea en trigo pueden ser reducidos,

de entre un 20-60%, dependiendo de los cultivares, del tipo de pretratamiento utilizado

y de las condiciones de cultivo (Devaux 1992, Barnabás 2003, Kasha 2005).

1.6. TRATAMIENTOS DE DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA

Las plantas haploides son estériles, de ahí la necesidad de utilizar de sustancias

diploidizantes (colchicina, cafeína, trifluralina, orizalina, etc.) para duplicar su

dotación cromosómica, dando lugar a plantas doblehaploides (DH). Tanto en mejora

genética como para estudios genéticos, se requiere un número relativamente alto de

plantas DH, por lo que es necesario un método eficiente de duplicación, que sea

seguro y sencillo, que no produzca aneuploides ni cambios genéticos y que pueda ser

aplicado en un número elevado de plantas, siendo efectivo independientemente del

genotipo (Jensen 1974).

1.6.1. Colchicina

La colchicina es la sustancia más comúnmente utilizada para duplicar la dotación

cromosómica de las plantas haploides (Kasha 2005). Se trata de un alcaloide vegetal

con efecto alopático que se encuentra principalmente en Colchicum autumnale y

algunas otras especies de liliáceas (Eigsti y Dustin 1955). Esta sustancia es tóxica para

las células animales a concentraciones que ni siquiera tienen un efecto medible en

células vegetales (Jensen 1974). Su actividad antimitótica se describió por primera vez

en Datura (Blackeslee y Avery 1937). Se ha utilizado en citogenética, y también, por

su acción farmacológica, en tratamientos contra la gota aguda, algunas enfermedades

de hígado y de riñón, y el cáncer (Wallace 1975, Kershenobich et al. 1988, Meyers et

al. 1988, Jordan y Wilson 2004, Arrieta et al. 2006).

Esta sustancia difunde rápidamente a través de los tejidos de la planta y puede

viajar por el sistema vascular, por lo que la penetración en los tejidos es buena.

Introducción

28

Además, las células vegetales toleran concentraciones mucho más altas de colchicina

que las células animales. Éstas características, junto con la capacidad de recuperarse

que tienen las células vegetales por reversión, permiten la duplicación de la dotación

cromosómica en plantas (Eigsti y Dustin 1955).

1.6.1.1. Tratamientos en planta

Tradicionalmente, los tratamientos con colchicina se han llevado a cabo in vivo

sobre diferentes zonas de plantas enteras. La concentración de colchicina y la duración

del tratamiento son factores cruciales, pero además es importante que las condiciones

de crecimiento de las plantas sean las adecuadas, ya que es necesario que la tasa de

división del tejido sea alta para que la colchicina sea capaz de afectar las células

meristemáticas y lograr la máxima efectividad.

La colchicina ha sido aplicada mayoritariamente mediante la inmersión del

sistema radicular en una solución de colchicina (Jensen 1974) y también mediante la

técnica de “caping” o vial invertido (Bell 1950), que consiste en colocar un vial con

colchicina y taponado con parafina en un tallo cortado de la planta. Generalmente, una

concentración de colchicina 0,05-2% se aplica durante 3-5 horas en el método de

inmersión de la raíz y durante 1-3 días en el método del vial invertido (Maluszynski et

al. 2003).

El tratamiento con colchicina en planta tiene porcentajes de éxito muy variables.

Además es un proceso muy laborioso que requiere una gran inversión de tiempo y en

el que se utiliza una gran cantidad de colchicina, que es tóxica para el ser humano

(WHO 1998). Por otro lado, la duplicación cromosómica que se produce no es

completa, por lo que normalmente se generan plantas quimera que son sólo

parcialmente fértiles, y que requieren un ciclo reproductivo adicional para obtener

suficiente cantidad de semilla (Barceló et al. 1994). Estos tratamientos producen

efectos no deseados en las plantas, como retraso en el crecimiento y alta mortalidad

(Thiebaut et al. 1979, Loh e Ingram 1983).

1.6.1.2. Tratamientos in vitro

Se ha intentado facilitar los tratamientos de duplicación y mejorar sus resultados

aplicándolos en etapas más tempranas, como en medio de cultivo de anteras o

Introducción

29

microsporas, o en el medio de regeneración de plantas a partir de embriones o callos

embriogénicos. De esta manera, se reduce tanto el volumen como la concentración de

los agentes diploidizantes, y por tanto disminuyen también los costes y los problemas

de toxicidad.

Esta utilización más temprana de sustancias diploidizantes ha hecho posible

obtener plantas DH con una fertilidad comparable a las plantas procedentes de semilla

en trigo (Hassawi y Liang 1991) y superior a la de plantas tratadas por métodos

convencionales en tritordeo (Barceló et al. 1994). Los tratamientos diploidizantes

durante el cultivo in vitro han aumentado la eficiencia de producción de plantas

doblehaploides, si los comparamos con los métodos convencionales, en varias especies

como Brassica (Zaki y Dickinson 1995), tabaco (Takasima et al. 1995), maíz

(Saisingtong et al. 1996, Antoine-Michard y Beckert 1997) y trigo (Barnabás et al.

1991, Ouyang 1994). Estos tratamientos, no solo afectan al porcentaje de duplicación

cromosómica, sino también a todo el proceso de inducción de androgénesis. Se ha

visto que las concentraciones que consiguen aumentar los porcentajes de duplicación

pueden afectar negativamente la embriogénesis, la regeneración o los porcentajes de

plantas verdes en especies como trigo (Navarro-Álvarez et al. 1994, Mentewab y

Sarrafi 1997, Redha et al. 1998a,b, Zamani et al. 2000), maíz (Martin y Widholm

1996) o triticale (Arzani et al. 2001). Sin embargo, en algunos casos ha ocurrido un

aumento de la inducción de embriogénesis, principalmente en Brassica (Zaki y

Dickinson 1995, Zaki y Dickinson 1991, Zhao et al. 1996a,b, Zhou et al. 2002a,b). La

aplicación de colchicina ha producido aumentos en la proporción de divisiones

simétricas, paralelamente a un aumento de la embriogénesis (Szakacs y Barnabás

1995, Hu y Kasha 1999).

Ciertos herbicidas como las dinitroanilinas trifluralina y orizalina, y la amida

fosfórica amiprophos metyl (APM) también se han utilizado como sustancias

diploidizantes durante el cultivo in vitro. Al contrario que la colchicina, estas

sustancias se unen con mayor afinidad a los microtúbulos de plantas que a los de

animales (Bajer y Mole-Bajer 1986). Su utilización en Brassica napus produjo efectos

similares a la colchicina, tanto sobre la formación de embriones como sobre la

duplicación cromosómica (Hansen y Andersen 1996). Sin embargo, la colchicina fue

más efectiva que otras sustancias en la duplicación de callos androgénicos de maíz

(Martin y Widholm 1996) y de trigo (Hassawi y Liang 1991).

Introducción

30

1.6.2. Control de los niveles de ploidía de las plantas regeneradas

Los métodos directos de determinación del nivel de ploidía son los controles

cromosómicos y la citometría de flujo. El primero es el método más fiable, pero es

más laborioso, mientras que la citometría de flujo permite realizar los análisis mucho

más rápidamente (Wang 1998, Löschenberger et al. 1995). Se han utilizado métodos

indirectos para distinguir los diferentes niveles de ploidía, en relación con

características como el tamaño celular (Hao et al. 2002, Hassan y Wazuddin 2000), el

tamaño de las células guarda de los estomas (Borrino y Powell 1988), el número de

cloroplastos en las células guarda (Hassan y Wazuddin 2000) y el tamaño del polen

(Wang 1998). Pero éstos no son siempre marcadores seguros, y a menudo son tan

laboriosos como realizar controles cromosómicos.

Las plantas regeneradas pueden tener ploidías anormales, presentando diferentes

múltiplos del número de cromosomas monoplide. Estos organismos se denominan

poliploides y pueden ser de diferentes tipos: triploide, tetraploide, pentaploide, etc…

En cambio, un aneuploide es un organismo cuya dotación cromosómica difiere de la

normal de la especie por un número de cromosomas inferior al número monoploide.

La detección de aneuploides mediante citometría de flujo es posible, pero no es

siempre fácil, sobre todo en especies con un gran número de cromosomas como el

trigo blando (n=42), por lo que para su detección es imprescindible realizar controles

cromosómicos.

1.7. CAMBIOS CELULARES EN LA MICROSPORA TRAS LA

INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS

1.7.1. Cambios estructurales y morfológicos

Los cambios estructurales que ocurren durante la adquisición de capacidad

embriogénica de la microspora se han estudiado en muchas especies como tabaco

(Garrido et al. 1995, Dunwell y Sunderland 1974a,b), Datura (Sangwan y Camefort

1984), Brassica (Zaki y Dickinson 1990), cebada (Chen et al. 1984, Kasha et al. 2001,

Pulido et al. 2005, González-Melendi et al. 2005), maíz (Testillano et al. 2002,

Testillano et al. 2004), arroz (Chen 1977) y trigo (Bonet y Olmedilla 2000, Indrianto

et al. 2001). Las reestructuraciones subcelulares que sufre una célula gamética al

Introducción

31

transformarse en una célula embriogénica, convergen según estos trabajos en: 1)

fragmentación de la vacuola por la formación de hilos citoplasmáticos desde el núcleo

hacia el citoplasma subcortical, 2) movimiento del núcleo hacia el centro de la

microspora, 3) aumento del tamaño celular 4) formación de una pared celular bajo la

exina 5) reducción del tamaño nucleolar, 6) compactación de la cromatina, 7)

simplificación estructural de los plástidos, 8) reducción del tamaño de los granos de

almidón y 9) ningún cambio estructural marcado en las mitocondrias (Aionesei et al.

2005).

En las primeras fases de la inducción de embriogénesis en las microsporas

ocurren grandes cambios estructurales, que dan lugar a una morfología llamada

“estrellada” observada en muchas especies bajo condiciones de inducción de

androgénesis o de embriogénesis somática, y que se asocia a la activación de la

división celular tras la desdiferenciación (Indrianto et al. 2001, Maraschin et al.

2005a,b). Para que ocurran estos cambios es necesaria la reestructuración del

citoesqueleto pero además, se ha observado que la propia inducción de cambios en el

citoesqueleto mediante la utilización de colchicina o citocalasina D puede ser

suficiente para desencadenar la reprogramación de la microspora (Zhao et al. 1996a,b,

Barnabás et al. 1991, Gervais et al. 2000). El problema que presentan estas sustancias

es su toxicidad.

Se ha observado que el alcohol primario n-butanol es capaz de desestructurar los

microtúbulos corticales y de separarlos de la membrana plasmática en células BY-2 de

tabaco y plántulas de Arabidopsis (Dhonukshe et al. 2003, Gardiner et al. 2003, Hirase

et al. 2006). Este alcohol es un conocido activador de la fosfolipasa D (PLD), un

enzima fuertemente unido a la membrana plasmática y a los microtúbulos corticales

(Gardiner et al. 2001), y su estimulación se ha correlacionado con reestructuraciones

en el citoesqueleto. Este enzima hidroliza los fosfolípidos de membrana generando

ácido fosfatídico (PA). Tanto la PLD como su producto el PA, intervienen en el

desarrollo de la planta y se han relacionado con la respuesta al estrés (revisado por

Wang 2005, Bargmann y Munnik 2006). Otros isómeros del alcohol butílico, como el

sec-butanol, también pueden activar la PLD. Sin embargo, el sec-butanol no es capaz

de producir la desestructuración de los microtúbulos corticales. El alcohol terciario

tert-butanol no activa la PLD ni produce cambios sobre los microtúbulos, por lo que

normalmente se utiliza como un control de posibles efectos inespecíficos. Se ha

Introducción

32

observado que los efectos de estos alcoholes son reversibles y que no producen efectos

tóxicos a las concentraciones a las que son efectivos. Hasta el momento, ninguna de

estas sustancias ha sido utilizada en el cultivo de anteras o microsporas.

1.7.1.1. Rutas androgénicas

Tomando en consideración las pautas de división de cada uno de los núcleos,

Sunderland y Evans (1980) y Raghavan (1997) describieron las rutas más importantes

de desarrollo embriogénico de la microspora y las agruparon en las llamadas rutas

androgénicas (Fig. 1.6). Estas rutas varían según las especies y/o las condiciones de

inducción (revisado por Aionesei et al. 2005).

En la ruta A, la microspora divide asimétricamente y es la célula vegetativa la

que entra en división y da lugar a un embrión, mientras que la célula generativa

degenera. Se observó por primera vez en tabaco (Sunderland y Wicks 1971) y también

se ha visto en otras especies como Datura (Sunderland et al. 1974), Brassica (Fan et

al. 1988) y trigo (Reynolds 1993).

En la ruta B, la división mitótica da lugar a dos núcleos iguales, que dividen

repetidamente y dan lugar a un embrión. La división simétrica es la más frecuente en

microsporas embriogénicas de Brassica (Zaki y Dickinson 1991) y se ha descrito

también en trigo (Indrianto et al. 2001), cebada (Pulido et al. 2005) y tabaco

(Sunderland y Wicks 1971).

La ruta C es una variación de la ruta B en la que los dos núcleos procedentes de

una división simétrica se fusionan dando lugar a un aumento de la ploidía. La fusión

de los núcleos es el mecanismo principal por el que se produce la duplicación

cromosómica de manera espontánea en cebada (Kasha et al. 2001, González-Melendi

et al. 2005).

Otra variación de la ruta B, que se denomina ruta D, tiene lugar cuando no ocurre

citocinesis tras la división simétrica, lo que da lugar a la formación de un sincitio que,

si se celulariza, podrá dar lugar a un embrión. Se ha descrito en trigo, maíz y cebada

(Zhu et al. 1978, Pan et al. 1983, Testillano et al. 2002, González-Melendi et al. 2005).

En la ruta E, tras una división asimétrica el núcleo generativo o ambos núcleos,

comienzan sucesivas divisiones. En Hyoscyamus Níger, es el núcleo generativo el que

da lugar a un embrión, mientras que el vegetativo no divide, o si lo hace, da lugar a

una estructura similar a un suspensor (Raghavan 1976). Sin embargo, en otras especies

Introducción

33

la importancia de esta ruta en la formación de embriones o callos se desconoce

(Aionesei et al. 2005).

Desarrollo normal del

polen

A E D B, C

es

vc

ng nv

ga

Fig. 1.6.- Desarrollo normal del polen y diferentes rutas androgénicas. es: espermátidas, vc:

vacuola, ng: núcleo generativo, nv: núcleo vegetativo ga: gránulos de almidón Modificado a

partir de Reynolds (1997).

Todas estas rutas se han definido como embriogénicas, pero existen evidencias

que relacionan una primera división simétrica de la microspora con la ruta esporofítica

y una primera división asimétrica, con la gametofítica. Sin embargo, se ha observado

que cuando se produce una división simétrica, dando lugar a un solo núcleo o a dos

núcleos iguales, todavía puede ocurrir la germinación y elongación del tubo polínico

(Tanaka e Ito 1981, Eady et al. 1995, Touraev et al. 1995), lo que significa que este

Introducción

34

tipo de división no está relacionada causativamente con la embriogénesis, o que más

requisitos son necesarios para iniciar una ruta embriogénica.

1.7.2. Cambios a nivel molecular

Para inducir la embriogénesis en microsporas de manera eficiente, es esencial la

aplicación de un pretratamientos de estrés. Los mecanismos de defensa activados por

estos pretratamientos pueden tener un papel importante en su efectividad. Todavía no

se conocen los mecanismos por los que se induce la vía esporofítica en las

microsporas, aunque diversos estudios han abordado el análisis de las proteínas y

genes expresados diferencialmente, durante la reprogramación celular o en momentos

tempranos de la inducción de embriogénesis. La comprensión de estos mecanismos

podría ser de gran ayuda para optimizar la producción de plantas DH en gran número

de cultivares.

1.7.2.1. Componentes de la respuesta al estrés en células vegetales

Las diferentes defensas de las plantas se activan frente a estreses bióticos y

abióticos, por rutas en las que están implicados el calcio, las especies reactivas de

oxígeno, y hormonas como ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA), etileno (ET) y

ABA (Hammond-Kosack y Jones 1996, Moons et al. 1997, Leung y Giraudat 1998,

Mahalingam y Fedoroff 2003).

Las plantas tienden a activar diferencialmente las defensas dependientes de SA,

frente a infecciones microbianas, y las defensas dependientes de JA/etileno frente a

insectos herbívoros y patógenos necrofíticos (Pieterse y van Loon 2007). Entre ambas

vías de señalización se han descrito efectos antagónicos y sinérgicos. Además, estas

vías también pueden ser activadas por procesos abióticos, por lo que también tienen

gran importancia en la respuesta de las plantas a los estímulos ambientales (Pieterse y

van Loon 2007). El SA juega un papel clave en el establecimiento de la resistencia

sistémica adquirida (SAR), que ejerce una protección generalizada de la planta frente a

nuevas agresiones. A nivel molecular, la SAR se caracteriza por la acumulación de

proteínas PR (“pathogenesis related”) en diferentes tejidos, particularmente de la

familia PR-1 (van Loon et al. 2006).

Introducción

35

Las proteínas PR son aquellas cuya producción se induce frente al ataque de

patógenos o de sustancias que simulan este ataque, y se identificaron por primera vez

como proteínas sintetizadas de novo en plantas de tabaco infectadas por el virus del

mosaico del tabaco (TMV) (van Loon y van Kammen 1970). Estas proteínas se

caracterizan por su bajo peso molecular, su estabilidad a pH<3 y su resistencia a la

acción de las proteasas. Se acumulan en situaciones de infección por patógenos, tanto

en el caso de virus como de hongos o bacterias (revisado por van Loon y van Strien

1999, Edreva 2005), así como en respuesta a diversos tipos de estrés, incluyendo

herida (Grosset et al. 1990), metales pesados (Didierjean et al. 1996), calor (Eckey-

Kaltenbach et al. 1997), frío (Hon et al. 1995) y luz ultra violeta (Brederode et al.

1991), y en respuesta al tratamiento con SA (Chen et al. 1993) y etileno (Meller et al.

1993). Además de su función relacionada con la defensa de la planta, algunas

proteínas PR presentan una expresión ligada al desarrollo (Fraser 1981), y se pueden

encontrar en órganos asociados a la reproducción, como flores y semillas (Vigers et al.

1991, Lotan et al. 1989), lo que sugiere una función de barrera defensiva. Catorce

familias de proteínas PR fueron caracterizadas en función de su mecanismo de acción,

su estructura, su relación serológica y su homología de secuencia (van Loon y van

Strien 1999). Actualmente se clasifican en 17 familias (Tabla 1.4), y se ha observado

que algunos de estos genes pueden ser importantes en la adquisición de la capacidad

embriogénica.

Por otro lado, la hormona ácido abscísico (ABA) juega un papel importante en el

inicio de las respuestas adaptativas en condiciones de falta de agua, en el cierre

estomático y en el desarrollo vegetal (maduración y germinación de la semilla) (Leung

y Giraudat 1998). En el contexto de la inducción de androgénesis, el ABA es

especialmente interesante, ya que se ha asociado un contenido mayor de esta hormona

en anteras de trigo y cebada con un mayor potencial androgénico (Wang et al. 2000,

Gorbunova et al. 2001, van Bergen et al. 2001). Se ha observado en cultivos celulares

de trigo, que el ABA es capaz de inducir la secreción de proteínas homólogas a

proteínas PR relacionadas con resistencia a helada (Kuwabara et al. 1999). En general,

los tratamientos con ABA han producido una reducción de la expresión de genes de

defensa, por lo que se ha propuesto que esta hormona desempeñe un papel regulador

que permita a la planta priorizar la respuesta al estrés abiótico frente al estrés biótico

(Maunch-Mani y Maunch 2005, Mohr y Cahill 2007).

Introducción

36

Tabla 1.5.- Familias de proteínas relacionadas con patogénesis (van Loon et al. 2006)

Familia Miembro tipo Propiedad

PR-1 PR-1a de tabaco Antifúngica (?) PR-2 PR-2 de tabaco β-1,3-glucanasa PR-3 P, Q de tabaco quitinasa tipo I, II, IV, V, VI, VII PR-4 R de tabaco quitinasa tipo I, II PR-5 S de tabaco tipo taumatina PR-6 Inhibidor I de tomate inhibidor de proteasas PR-7 P69 de tomate endoproteinasa PR-8 quitinasa de pepino quitinasa tipo III PR-9 peroxidasa productora de lignina de tabaco peroxidasa PR-10 PR-1 de perejil tipo ribonucleasa PR-11 quitinasa clase V de tabaco quitinasa tipo I PR-12 Rs-AFP3 de rábano defensina PR-13 THI2.1 de Arabidopsis tionina PR-14 LTP4 de cebada proteína transferidora de lípidos PR-15 OxOx (germina) de cebada oxalato oxidasa PR-16 OxOlp (tipo germina) de cebada tipo oxalato oxidasa PR-17 PRp27 de tabaco desconocida

1.7.2.2. Proteínas asociadas a la capacidad embriogénica in vitro

Las proteínas secretadas durante el cultivo de estructuras androgénicas, son

capaces de estimular el desarrollo de embriones cigóticos in vitro (Paire et al. 2003).

Algunas de ellas parecen esenciales para el desarrollo de embriones, tanto derivados

de microsporas como somáticos. Entre estas sustancias, las proteínas de

arabinogalactanos (AGPs) parecen ser las más importantes, ya que impidiendo su

síntesis se inhibe también la formación de embriones a partir de microsporas de maíz

(Borderies et al. 2004). Los AGPs son una clase de proteoglucanos que se encuentra

en las paredes celulares, membranas plasmáticas y en la matriz extracelular. Están

involucradas en los procesos de proliferación celular, expansión celular,

embriogénesis y muerte celular (Majewska-Sawka y Nothnagel 2000, Showalter

2001). El mecanismo por el que las AGPs inducen embriogénesis probablemente

implica la liberación de oligosacáridos a partir de los arabinogalactanos, mediante la

acción de enzimas diversos (Pilling y Höfte 2003).

En el trabajo de Borderies et al. (2004) en maíz, además de AGPs, también se

identificó una invertasa de pared celular, una β-1,3- glucanasa, dos quitinasas y dos

Introducción

37

proteínas tipo taumatina. Todas ellas se engloban dentro de las proteínas PR, que son

aquellas que se expresan frente al ataque de patógenos o de sustancias que simulan

este ataque (Pieterse y van Loon 2007). En cultivos de células embriogénicas han sido

identificadas quitinasas homólogas a las familias PR-3 y PR-4 en zanahoria (Kragh et

al. 1996), β-1,3- glucanasas y quitinasas en Cichorium (Helleboid et al. 1998,

Helleboid et al. 2000) y cebada (Kragh et al. 1991), proteínas tipo germina en

coníferas (Domon et al. 1995, Mathieu et al. 2006) y una proteína de la familia PR-4

en fríjol (Nogueira et al. 2007). Todavía no se conoce la implicación de estos enzimas

en la estimulación de embriogénesis, pero sí se ha demostrado que las quitinasas están

implicadas en la generación de señales que estimulan la embriogénesis somática en

zanahoria (Kragh et al. 1996, van Hengel et al. 1998). Estudios del proteoma de

microsporas embriogénicas de Brassica indican el aumento de proteínas involucradas

en el metabolismo de carbohidratos, en procesos redox y en el metabolismo del

ascorbato (Joosen et al. 2007).

1.7.2.3. Cambios en la expresión génica durante la inducción de androgénesis

Se ha visto que la inducción de androgénesis induce la expresión de genes

característicos de los embriones cigóticos, como la glicoproteína 12S y la napina

BnmNAP, identificadas en B. napus y que tienen función de almacenamiento (Crouch

1982, Boutilier et al. 1994), y la ECMt, una metalotioneína de clase II identificada en

trigo e implicada en el metabolismo de metales como Zn, Cu y metales pesados

(Reynolds y Crawford 1996, 1997, 2000).

Por otro lado, se han identificado genes expresados específicamente en

microsporas inducidas frente a aquellas que continúan su desarrollo hacia polen. Así

fue descrita la inducción de distintos miembros de la familia de las HSPs (“heat shock

proteins”) en B. napus y tabaco durante el choque térmico por calor y la inanición

(Cordewener et al. 1995, Zarsky et al. 1995, Smykal y Pechan 2000). Sin embargo, su

implicación en la adquisición de potencial embriogénico no es clara, ya que los niveles

de expresión de las HSPs no aumenta cuando se produce la inducción de androgénesis

mediante el tratamiento con colchicina (Zhao et al. 2003). Utilizando la misma

estrategia se identificó la fosfoproteína NtEPc, expresada en microsporas tabaco (Kyo

et al. 2000). En cebada, se identificaron miembros de la familia de las glutation-S-

transferasas (GST), así como una proteína similar la familia de las AGPs (Vrinten et

Introducción

38

al. 1999). El factor de trascripción BBM (“baby boom”) perteneciente a la familia

AP2/ERF, se ha asociado a la embriogénesis de la microspora en Brassica y su sobre

expresión produce la formación de embriones en células con cierto grado de

desdiferenciación (Boutilier et al. 2002).

Más recientemente, los cambios en la expresión se han estudiado mediante el

análisis del transcriptoma en cebada (Maraschin et al. 2006, Muñoz-Ammatriain et al.

2006), tabaco (Hosp et al. 2007) y Brassica (Joosen et al. 2007, Malik et al. 2007). Se

ha observado que durante el pretratamiento de estrés ocurre una reprogramación en la

que se reprimen procesos específicos de polen. Por un lado se inhibe la síntesis de

almidón, que ocurre en polen tras la primera división mitótica, al tiempo que se

inducen genes como la maltasa y la invertasa, relacionados con la hidrólisis de

almidón y sacarosa; por otro lado, ocurre la inducción de genes que codifican,

principalmente, para proteínas de estrés y proteínas proteolíticas (Maraschin et al.

2006). El estrés por inanición también produce un aumento de genes de resistencia a

patógenos y de genes implicados en la resistencia sistémica adquirida, pero no induce

genes específicos de embriogénesis, lo que indica que el estrés consigue que las

microsporas lleguen a un estado de desdiferenciación (Muñoz-Ammatriain et al.

2006). El potencial embriogénico de microsporas de cebada se ha asociado a la

inducción de genes que codifican para proteínas relacionadas con: 1) patogénesis,

como glucanasas y osmotinas, 2) protección frente al estrés oxidativo, como alcohol

deshidrogenasa (ADH3), manitol deshidrogenasa (ELI3) y glutation-S-transferasa y 3)

degradación de proteínas (Maraschin et al. 2006, Muñoz-Amatriaín 2007).

Las estrategias defensivas se combinan durante el pretratamiento, dando lugar a

la reprogramación de las microsporas. En estos trabajos se ha estudiado la expresión

génica al final del pretratamiento de estrés, cuando las microsporas ya han abandonado

su ruta de formación de polen. Los procesos que ocurren en la antera durante las

primeras horas del pretratamiento, y que disparan los cambios en el programa de

desarrollo de la microspora, no se han estudiado por el momento.

39

2. OBJETIVOS

La producción de plantas DH verdes sigue siendo todavía un reto en muchos

cultivares de trigo panadero de interés agronómico, porque tienen una respuesta

androgénica media o baja. Entre los factores que limitan la producción de plantas en

estos materiales, se encuentran: el reducido número de microsporas que son capaces de

reprogramar su patrón de desarrollo para dar lugar a un embrión, la regeneración de

plantas albinas y la obtención de plantas haploides.

Esta tesis tiene como objetivo principal aumentar la eficiencia del proceso de

producción de plantas doblehaploides, mediante la inducción de embriogénesis de la

microspora en cultivares de trigo blando de media y baja respuesta androgénica. El

desarrollo de este objetivo se ha centrado en tres de las fases limitantes del proceso: la

duplicación cromosómica, el cambio del patrón de desarrollo durante el pretratamiento

y la inducción de embriogénesis. Para ello se han planteado los siguientes objetivos

específicos:

1.- Estudio de la aplicación de colchicina en planta e in vitro para aumentar los

porcentajes de duplicación cromosómica.

2.- Optimización del pretratamiento de estrés para incrementar el número de

microsporas que abandonan el patrón de desarrollo gametofítico.

3.- Análisis de la expresión de genes relacionados con la respuesta al estrés a lo

largo del pretratamiento.

4.- Estudio del efecto del co-cultivo con ovarios y del tratamiento con posibles

sustancias inductoras como los arabinogalactanos y el n-butanol, para

mejorar la inducción de embriogénesis en microsporas.

41

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

3.1.1. Genotipos

Como plantas donantes de anteras se han utilizado las variedades de primavera de

trigo blando Chris, Pavon y Caramba, y la línea DH24033 según se indica en cada

experimento.

Chris es un cultivar modelo para androgénesis. Pavon es un cultivar histórico que

ha sido ampliamente utilizado como parental de nuevas variedades, que presenta una

alta calidad harino-panadera y amplia adaptabilidad (Dr. Peña, CIMMYT,

comunicación personal). Este cultivar presenta una respuesta androgénica intermedia.

Caramba es un cultivar de interés agronómico en España con una calidad harino-

panadera equilibrada y productividad alta (GENVCE 2007), que presenta una baja

respuesta androgénica. La línea DH24033 se obtuvo en nuestro laboratorio a partir del

cruzamiento 40xS83 y se escogió por su bajo porcentaje de autoduplicación.

3.1.2. Condiciones de crecimiento de las plantas madre

Las semillas se sembraron en “paper pots” en un sustrato compuesto de turba,

vemiculita y arena (1:1:1) y se vernalizaron durante 5 semanas en una cámara con

condiciones controladas, a 4ºC con 8 h de luz. Posteriormente, las plantas se

trasplantaron a macetas de 15 cm de diámetro y se cultivaron en cámara de crecimiento

a 12ºC, con 12 h de luz y 70-80% de humedad relativa. A las 3 semanas de cultivo, se

aumentó la temperatura a 18-21ºC y el fotoperiodo a 16 h de luz. En el momento de la

preparación del sustrato, se añadió fertilizante N:P:K (15:15:15).

Materiales y Métodos

42

3.2. METODOLOGÍA GENERAL

3.2.1. Esterilización

Material vegetal: Las espigas envueltas en su vaina se rociaron con etanol al 70%

y se dejaron secar dentro de una cámara de flujo laminar, para su posterior

manipulación en condiciones de esterilidad.

Material de laboratorio: El material de vidrio, las cajas Magenta, las puntas de

pipeta, etc, se esterilizaron en autoclave durante 20 min a 120ºC y 1 Kg/cm2. El

material de acero, como las pinzas y las tijeras, se autoclavaron y después de cada

utilización se desinfectaron en etanol al 96%.

Medios de cultivo: Para evitar la posible degradación de algunos componentes

como los azúcares y reguladores del crecimiento, éstos se esterilizaron por filtración

utilizando filtros Millipore de 0,22 µm de poro y una bomba de vacío. Otros

componentes como el Fitagel, la agarosa y las sales minerales se autoclavaron durante

20 min a 120ºC y 1 Kg/cm2.

3.2.2. Medios de cultivo

Todos los productos y reactivos empleados fueron de la marca SIGMA si no se

especifica de otra manera.

3.2.2.1. Medio de pretratamiento

Tabla 3.1.- Composición del medio de pretratamiento

COMPONENTE mg/l

KNO3 1.900* NH4NO3 165* KH2PO4 170* CaCl2 2H2O 6.340 MgSO4 7H2O 370* Manitol 127.500 Agarosa Sea Plaque 8.000

*medio FHG (Hunter 1987)

Materiales y Métodos

43

Todos los componentes se disolvieron en agua. Las sales junto con la agarosa se

autoclavaron. El manitol se calentó sin llegar a ebullición (45ºC) en H2O destilada,

hasta su disolución, y se esterilizó por filtración. La parte filtrada y la parte autoclavada

se mezclaron y dispensaron en placas Petri de 6 cm de diámetro, en una cámara de flujo

laminar.

3.2.2.2. Medios de inducción MSM, MSM-F200 y MSM-F300

El medio MSM es una modificación del medio MMS3 (medio MS modificado por

Hu y Kasha 1997a) y está suplementado con vitaminas, aminoácidos y reguladores del

crecimiento (Tabla 3.2).

Se prepararon stocks concentrados de macronutrientes y micronutrientes (2x), y

de vitaminas y aminoácidos (1000x) y se conservaron a -20ºC. Las soluciones stock de

ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D) (1000x) y 6-bencilaminopurina (BA) (100x) se

conservaron a 4ºC.

Glicina y biotina se disolvieron en NaOH 0,5 M. El 2,4-D se disolvió en etanol y

la BA se disolvió en HCl 1 M. Los demás componentes se disolvieron en H2O

destilada.

Los medios MSM, MSM-F200 y MSM-F300 difirieron en su contenido en

maltosa y Ficoll tipo 400 (Ficoll-400) (Tabla 3.3).

El Ficoll-400 se disolvió calentándolo en H2O destilada hasta ebullición. Se dejó

enfriar a temperatura ambiente antes de mezclarlo con los demás componentes.

Se ajustó el pH a 5,8, se enrasó hasta el volumen final con H2O destilada y se

esterilizó por filtración.

Materiales y Métodos

44

Tabla 3.2.- Composición del medio MSM

MACRONUTRIENTES* mg/l

KNO3 1.400 NH4NO3 300 KH2PO4 170 CaCl2 2H2O 440 MgSO4 7H2O 370

MICRONUTRIENTES* mg/l

MnSO4 7H2O 22,3 ZnSO4 7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025 NaMoO4 2H2O 0,25

HIERRO* mg/l

FeNa(EDTA)2 40

VITAMINAS mg/l

Tiamina-HCl* 0,4 Piridoxina-HCl* 0,5 Ácido Nicotínico* 0,5 Inositol* 100 Biotina 0,25 Ácido ascórbico 0,5 Pantotenato de Ca 0,25

AMINOÁCIDOS mg/l

Glicina 1 Glutamina* 500

HORMONAS mg/l

2,4D 1 BA 1

*componentes del medio MMS3 (Hu y Kasha 1997a)

Materiales y Métodos

45

Tabla 3.3.- Contenido de maltosa y Ficoll tipo 400 de los medios de cultivo

MSM, MSM-F200 y MSM-300

MALTOSA

(g/l) FICOLL-400

(g/l)

MSM 90 MSM-F200 62 200 MSM-F300 62 300

3.2.2.3. Medio de regeneración J25-8

Se utilizó el medio J25-8 descrito por Jensen (1983) (Tabla 3.4).

Se prepararon soluciones stock de macronutrientes y micronutrientes (20x), y de

vitaminas y aminoácidos (1000x) y se conservaron a -20ºC.

El ácido málico se disolvió en 50 ml de agua y se ajustó el pH a 5,3 con NH4OH.

El resto de los componentes se disolvieron en H2O destilada.

Se ajustó el pH a 5,8 con KOH, se enrasó hasta la mitad del volumen final con

H2O destilada y se esterilizó por filtración.

El Fitagel se disolvió en la mitad del volumen final de H2O destilada y se

autoclavó.

La parte filtrada y la parte autoclavada se mezclaron y dispensaron en placas Petri

de 6 cm de diámetro, en una cámara de flujo laminar.

3.2.2.4. Medio de enraizamiento J25-8+ANA

Este medio incluye todos los componentes del J25-8 (Tabla 3.4) y ácido

naftalenacético (ANA) a una concentración final de 2 mg/l. El ANA se disolvió en

NaOH 1 M y se preparó un stock concentrado 1000x. Se esterilizó junto los demás

componentes del medio, excepto el Fitagel, por filtración.

El medio se preparó tal y como se detalla en el apartado anterior y se dispensó en

cajas Magenta (50 ml/caja) que habían sido previamente esterilizadas en el autoclave.

Materiales y Métodos

46

Tabla 3.4.- Composición del medio J25-8 (Jensen 1983)

MACRONUTRIENTES mg/l

KNO3 2.200 NH4NO3 600 MgSO4 7H2O 310 KH2PO4 H2O 170 NaH2PO4 H2O 75 (NH4)2SO4 67 CaCl2 2H2O 295

MICRONUTRIENTES mg/l

MnSO4 H2O 5 H3BO3 3 ZnSO4 7H2O 5 NaMoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025

HIERRO mg/l

FeNa(EDTA)2 40

AMINOÁCIDOS mg/l

Glutamina 120 Asparagina 50 Treonina 25 Arginina 25 Prolina 50

AZÚCARES mg/l

Sacarosa 20.000 Glucosa 7.000

OTROS COMPONENTES mg/l

Ácido málico 100 Leche de coco 25* Caseína 125 Carbón activo 4000 Fitagel 3000 *ml/l

Materiales y Métodos

47

3.2.3. Estado de desarrollo de las microsporas

Se determinó el estado de desarrollo de las microsporas mediante tinción con el

fluorocromo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato). Se preparó una solución

stock de DAPI en H2O destilada (4 µg/ml), se alicuotó y se conservó a -20ºC.

Las anteras centrales de varias espigas se colocaron sobre una gota de manitol

0,3 M y se cortaron en varios trozos con bisturí. Se añadieron aproximadamente

10 µl de la solución stock de DAPI y se cubrieron con un cubre. Se observaron los

núcleos en un microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse T300 con luz ultravioleta

(330-380 nm).

Para cada tanda de plantas, en el momento de la recogida del material vegetal se

estableció la relación entre el estado de desarrollo de las microsporas de varias espigas,

con la distancia existente desde el extremo superior de la espiga, hasta la base de la hoja

bandera (Fig. 3.1). Esto permitía recoger las espigas en el estado de desarrollo

adecuado para el cultivo y desechar las espigas más tempranas o más avanzadas.

Fig. 3.1.- Espigas de trigo de la variedad Chris con diferentes distancias (da, db, dc) desde el

extremo superior de la espiga hasta la base de la hoja bandera. Espiga con microsporas en

estado uninucleado temprano-medio (a), espiga con microsporas en estado uninucleado

medio-tardío (b) y espiga con microsporas en estado uninucleado tardío-binucleado

temprano (c).

a)

b)

c)

db dc

da

Materiales y Métodos

48

Para el cultivo de microsporas se utilizaron aquellas espigas cuyas anteras

centrales contenían microsporas en estado uninucleado tardío o binucleado temprano.

Para el cultivo de anteras se utilizaron espigas cuyas anteras centrales contenían

microsporas en estado uninucleado medio o tardío.

3.2.4. Pretratamiento de estrés

Las anteras se extrajeron de la flor bajo una lupa binocular, con ayuda de unas

pinzas. Exceptuando los experimentos en los que se especifique de otra manera, las

anteras fueron inoculadas en medio de pretratamiento (Tabla 3.1) y se incubaron

durante 5 días a 24ºC y en oscuridad.

3.2.5. Medio preacondicionado con ovarios (OVCM)

Los ovarios se obtuvieron de espigas que contenían microsporas en estado

binucleado tardío. Estas espigas se cubrieron con una bolsa de plástico estéril cuando

todavía estaban dentro de la vaina, para evitar contaminaciones. Cuando se recogieron

las espigas estaban fuera de la vaina (Fig.3.2).

Fig. 3.2.- Espigas utilizadas para

obtener ovarios, en el momento de la

recogida.

Estas espigas se esterilizaron como se indica en apartado 3.2.1. Los ovarios se

extrajeron de la flor bajo una lupa binocular, con ayuda de unas pinzas. Para evitar

variaciones debidas al estado fisiológico de los ovarios, se prepararon 6 u 8 ml de

Materiales y Métodos

49

medio, con 30 ó 40 ovarios respectivamente, procedentes de diferentes espigas en

placas de 6 cm de diámetro como muestra la Fig. 3.3. El medio y los ovarios

procedentes de la misma placa se repartieron entre los tratamientos de la misma réplica

(10 ovarios/placa). El medio con ovarios se incubó durante los 5-7 días anteriores al

cultivo de anteras o de microsporas aisladas, a 24ºC en oscuridad.

Fig. 3.3.- Medio MSM-F300

preacondicionado con ovarios de

trigo.

3.2.6. Aislamiento y cultivo de microsporas

3.2.6.1. Aislamiento de las microsporas

Homogeneización: Las anteras pretratadas se colocaron, con ayuda de unas

pinzas, en un vaso de precipitados con 5 ml de manitol 0,3 M (54,6 g/l de manitol en

H2O destilada, esterilizado por filtración). Después las anteras y el manitol se

trasladaron a un homogeneizador de vidrio. El émbolo se giró varias veces con

suavidad. El homogeneizado resultante se filtró, a través de una malla con un diámetro

de poro de 100 µm, a un tubo de centrífuga de 15 ml (Sterilin), con el fin de retener el

debrís y obtener una suspensión de microsporas.

Separación de microsporas viables sobre banda de maltosa: Se añadió solución de

manitol 0,3 M a la suspensión de microsporas, hasta un volumen de 15 ml.

Posteriormente se centrifugó durante 5 min a 100 g y se eliminó el sobrenadante. Las

microsporas se resuspendieron en 1,5 ml de manitol 0,3 M y se colocaron

cuidadosamente sobre 5-6 ml de maltosa al 20%. Tras una centrifugación de 5 min a

1 cm

Materiales y Métodos

50

100 g las microsporas viables permanecieron en la fase superior, sobre la banda de

maltosa, mientras que las no viables quedaron en el fondo del tubo.

Lavado: Se recogieron cuidadosamente con una pipeta Pasteur las microsporas

que quedaron en la fase superior y se trasladaron a un tubo nuevo. Se añadió manitol

0,3 M hasta un volumen de 15 ml, para lavar los restos de maltosa. Se centrifugó (5

min, 100 g) y se descartó el sobrenadante. Las microsporas se resuspendieron en unas

gotas de medio MSM (Tablas 3.2 y 3.3).

3.2.6.2. Cultivo

Las microsporas se inocularon en placas de 3 cm de diámetro con medio MSM-

F300 (Tablas 3.2 y 3.3) preacondicionado con ovarios como se indica en el apartado

3.2.5. Las microsporas se contaron en una cámara de Neubauer. Se ajustó el volumen

de medio para conseguir una densidad de 100.000 microsporas/ml. Aproximadamente

10 días después de haber inoculado las microsporas se añadió el mismo volumen de

medio fresco MSM-F300 (Tablas 3.2 y 3.3) a cada placa.

3.2.7. Cultivo de anteras

Las anteras pretratadas se inocularon en placas de 3 cm de diámetro que contenían

1,5 ml de medio MSM-F200 (Tablas 3.2 y 3.3) preacondicionado como se indica en el

apartado 3.2.5. En cada placa se inocularon entre 35 y 40 anteras. Aproximadamente a

los 10 días del comienzo del cultivo se añadió 1,5 ml de medio fresco MSM-F300

(Tablas 3.2 y 3.3) a cada placa.

3.2.8. Regeneración de plantas

Germinación: A los 28 días del cultivo de anteras o de microsporas aisladas los

embriones formados se transfirieron a placas de 6 cm de diámetro con medio de

regeneración J25-8 (Tabla 3.4) con ayuda de unas pinzas, bajo una lupa binocular. Las

placas de regeneración se mantuvieron a 24ºC, en oscuridad durante los primeros 2

días. Posteriormente se trasladaron a una cámara de crecimiento con 24 ºC, 16 h de luz

y 70% de humedad. Después de 20-30 días, se contaron las plantas verdes y albinas

regeneradas.

Materiales y Métodos

51

Enraizamiento: Las plantas verdes se traspasaron a cajas Magenta con 50 ml de

medio de enraizamiento J25-8+ANA (apartado 3.2.2.4) y se mantuvieron a 24 ºC con

16 h de luz durante 15 días más.

Vernalización: Las plantas se sometieron a vernalización en las mismas cajas

Magenta, durante 5 semanas a 4 ºC con 8 h de luz.

Aclimatación y cultivo: Tras la vernalización, las plantas se transfirieron a

macetas de 10 cm de diámetro y se aclimataron durante 15 días en una cámara de

cultivo a 16 ºC con 12 h de luz y 90% de humedad. Posteriormente se transfirieron a

macetas de 15 cm de diámetro y se cultivaron en el invernadero a 18-22ºC con 16 h de

luz (luz natural suplementada con focos) para producción de semilla.

3.2.9. Análisis del nivel de ploidía

El análisis del nivel de ploidía se efectuó en el momento del recuento de plantas,

antes de ser traspasadas a cajas Magenta, o bien durante la aclimatación en los casos en

que se continuó su cultivo para producción de semilla.

El nivel de ploidía se analizó al comienzo de esta tesis mediante el análisis de la

longitud de los estomas como se detalla en el apartado 3.3.1. En los demás

experimentos el nivel de ploidía se determinó mediante citometría de flujo. En este

caso, se tomaron muestras de hoja de plántulas en el estado de 4 a 5 hojas. Se colocó

aproximadamente 0,5 cm2 de hoja sobre una gota de la solución Cystain uv Ploidy

(Partec) en una placa de 3 cm de diámetro. Se cortó la hoja repetidamente con una

cuchilla afilada y se añadió 2 ml más de la solución Cystain uv Ploidy. La suspensión

resultante se recogió con una pipeta automática, se filtró a través de una malla de

30 µm, para eliminar los restos de tejido, y se recogió en un tubo. La muestra así

preparada se analizó en citómetros tipo PA o PAS (Partec) bajo luz ultravioleta,

obteniéndose un histograma del número de núcleos analizados frente a la cantidad de

fluorescencia emitida por estos núcleos, que es directamente proporcional a la cantidad

de DNA (Fig.3.4).

Materiales y Métodos

52

File: cebadaC_044 Date: 06-04-2005 Time: 15:22:01 Particles: 1172 Acq.-Time: 389 s Concentration: 1760 / ml

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

ts

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

tsPK1

PK2

partec PAS

File: 2A2.7_052 Date: 06-04-2005 Time: 16:13:21 Particles: 1507 Acq.-Time: 421 s Concentration: 2640 / ml

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

ts

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

ts

PK1

partec PAS

File: 2A2.2_047 Date: 06-04-2005 Time: 15:37:52 Particles: 3274 Acq.-Time: 408 s Concentration: 2820 / ml

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

ts

0 100 200 300 400 5000

80

160

240

320

400

FL4

coun

ts

PK1PK2

partec PAS

Fig. 3.4.- Análisis del nivel de ploidía mediante citometría de flujo. Los histogramas muestran el

número de núcleos (“counts”) frente a la cantidad de fluorescencia emitida por el fluorocromo DAPI

(FL4). Pico 1 (PK1) y pico 2 (PK2). PK2 producido por núcleos en G2 o endorreduplicación.

Cebada (2n=2x)

Trigo haploide (n=3x)

Trigo doblehaploide (2n=6x)

Materiales y Métodos

53

3.3. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA

3.3.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los

estomas

Material vegetal: Se utilizaron plantas haploides (H) o doblehaploides (DH)

producidas mediante cultivo de microsporas. Se analizaron 18 plantas de la variedad

Chris y 75 plantas procedentes del cruzamiento F1 de interés agronómico 40xS83.

Metodología:

Se recogieron secciones de la segunda o tercera hoja más joven, a unos tres

centímetros del extremo. Estas secciones se colocaron en una gota de agua bajo la lupa.

Con un bisturí se realizó un corte transversal en la parte adaxial de la hoja, y con ayuda

de unas pinzas se separó la epidermis y se colocó sobre una gota de agua en un

portaobjetos.

En el cultivar Chris, se calculó la longitud media de los estomas de plantas en dos

estadios de desarrollo distinto:

-Estadio 1: plántulas durante la fase de aclimatación en cámara de cultivo y que

están comenzando la etapa de ahijamiento (hasta 4 hojas).

-Estadio 2: plantas durante la fase de cultivo en el invernadero que están en el

comienzo de la etapa de encañado (8-12 hojas).

Los estomas se observaron bajo campo claro en un microscopio Nikon Eclipse

T300. Se hicieron fotos a 100 aumentos de 8-10 campos con el programa Cool Snap.

Para cada planta, se midió la longitud de 20 estomas.

Estas mismas plantas fueron analizadas mediante citometría de flujo (apartado

3.2.9) o se continuó su cultivo en el invernadero para obtener de semilla.

Materiales y Métodos

54

3.3.2. Tratamientos diploidizantes en planta

3.3.2.1. Método de inmersión de la raíz

Material vegetal: Se trataron plantas H, regeneradas a partir del cultivo de

microsporas de los cruzamientos F1 de interés agronómico 23x21, 5x18 y 40xS83.

Solución de colchicina: La colchicina (concentración final del 0,1%) se disolvió

en DMSO (2% del volumen final) y se enrasó hasta el volumen final con H2O destilada

(Jensen 1983).

Tratamiento: Las raíces se lavaron y se seccionaron a unos 5 cm de la corona. El

tratamiento se llevó a cabo sumergiendo las raíces en un vaso de precipitados con la

solución de colchicina, en la luz y con aireación. Plantas H de los cruzamientos 23x21 y

5x18 en estadio de 3-4 hojas fueron tratadas durante 3h y 5h. Plantas H del cruzamiento

40xS83 en estadio de 3-4 hojas y en estadio de encañado, fueron tratadas durante 5 h.

Una vez finalizado el tratamiento se lavaron las raíces en agua corriente y se

plantaron en macetas de 15 cm de diámetro en el invernadero para producción de

semilla.

3.3.2.2. Método del vial invertido

Material vegetal: Se utilizaron 45 plantas H del genotipo Chris, regeneradas a

partir del cultivo de microsporas.

Solución de colchicina: La colchicina se disolvió en DMSO (2% del volumen

final) y se enrasó hasta el volumen final con H2O destilada (Jensen 1983).

Tratamiento: Cuando las plantas comenzaron a espigar se cortaron los tallos más

avanzados, dejando solo los tallos más jóvenes. Se colocó un vial con la solución de

colchicina en una de las cañas cortadas y se fue rellenando durante el tratamiento, de

forma que el nivel del líquido superara siempre el extremo cortado (Bell 1950).

Se realizaron 4 tratamientos diferentes, en los que se utilizaron dos

concentraciones de colchicina (0.15% y 0.25%) y dos tiempos de duración del

tratamiento (48 y 72 h).

El tratamiento se realizó en el invernadero a 18-22ºC con 16 h de luz (luz natural

suplementada con focos).

Materiales y Métodos

55

3.3.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in vitro

3.3.3.1. Colchicina añadida al medio de pretratamiento de las anteras.

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Chris, Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras se inocularon en tres medios de pretratamiento (Tabla

3.1) a los que se había añadido diferentes concentraciones de colchicina: 0 mg/l, 150

mg/l y 300 mg/l (Fig. 3.5).

La colchicina se disolvió en H2O destilada y se esterilizó por filtración junto con

el manitol (apartado 3.2.2.1).

Las tres anteras de cada flor se distribuyeron de manera que cada tratamiento

tuviera una antera de cada flor, reduciendo así la variabilidad causada por la asincronía

en el estado de desarrollo de las microsporas dentro de una misma espiga. Se utilizaron

aproximadamente 30 espigas por réplica.

Control T1 T2

Paso 1

Pretratamiento con 0 mg/l de

colchicina

Pretratamiento con 150 mg/l de

colchicina

Pretratamiento con 300 mg/l de

colchicina

Paso 2

Aislamiento

Aislamiento

Aislamiento

Paso 3 Cultivo Cultivo Cultivo

Fig. 3.5.- Tratamiento de anteras de trigo panadero con colchicina durante

el pretratamiento. T: tratamiento.

Cultivo de microsporas: Se aislaron las microsporas de cada tratamiento por

separado. El cultivo se continuó como se detalla en el apartado 3.2.6.2.

Materiales y Métodos

56

3.3.3.2. Colchicina aplicada durante las primeras horas de cultivo en el medio de

inducción.

3.3.3.2.1. Cultivo de microsporas

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Chris y Pavon, y la línea DH 24033.

Esta línea DH se escogió por sus bajos porcentajes de autoduplicación.

Tratamiento: Cada réplica consistió en un aislamiento en el que se utilizaron

aproximadamente 50 espigas. Las microsporas procedentes de un mismo aislamiento se

dividieron en cuatro partes iguales. Una de estas partes se inoculó en medio MSM-F300

tal y como se ha descrito en el apartado 3.2.6.2., y se utilizó como control sin

tratamiento. Con las tres partes restantes se realizaron tres tratamientos en medio MSM:

un control sin colchicina (0 mg/l) y dos concentraciones de colchicina, 150 mg/l y

300 mg/l (Fig. 3.6).

Los medios se prepararon disolviendo la colchicina en H2O destilada con los

demás componentes y esterilizando por filtración.

El tratamiento se realizó inoculando las microsporas en placas de 3 cm de

diámetro con 2 ml de medio, durante 48 h a 24ºC en oscuridad.

Pretratamiento

Aislamiento de microsporas

Control T1 T2 T3

Paso 1 Cultivo Tratamiento

0 mg/l de colchicina

Tratamiento 150 mg/l de colchicina

Tratamiento 300 mg/l de colchicina

Paso 2 -- Lavado Lavado Lavado

Paso 3 -- Cultivo Cultivo Cultivo

Fig. 3.6.- Tratamiento de microsporas de trigo panadero con colchicina en el medio de

cultivo. T: tratamiento.

Materiales y Métodos

57

Lavado: Después de 48 h se recogieron cuidadosamente las microsporas en el

medio de tratamiento con una pipeta Pasteur y se traspasaron a un tubo de centrífuga de

15 ml. Para eliminar la colchicina se les añadió 12 ml de medio MSM fresco, se mezcló

suavemente durante 1 min y se centrifugaron durante 5 min a 100 g. Se descartó el

sobrenadante y las microsporas se suspendieron en unas gotas de medio MSM.

Cultivo: Las microsporas fueron inoculadas en medio preacondicionado MSM-

F300 y cultivadas con ovarios como se detalla en el apartado 3.2.6.2.

3.3.3.2.2. Cultivo de anteras

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras pretratadas se distribuyeron en tres tratamientos en

medio MSM: un control sin colchicina (0 mg/l), y dos concentraciones de colchicina

150 mg/l y 300 mg/l.

Los medios se prepararon disolviendo la colchicina en H2O destilada con los

demás componentes y esterilizando por filtración.

Las anteras procedentes de una misma espiga se repartieron aleatoriamente entre

los tres tratamientos. El tratamiento se realizó en placas de 3 cm de diámetro con 2 ml

de medio, durante 48 h a 24ºC en oscuridad. Para cada réplica se utilizaron anteras de

entre 2 y 3 espigas.

Lavado: El medio se extrajo con una pipeta Pasteur de punta fina de vidrio. Se

efectuó un lavado con 2 ml de medio MSM sin colchicina durante 4-6 minutos.

Cultivo: Tras el lavado, se añadió el medio preacondicionado y los ovarios, para

continuar con el cultivo como se detalla en el apartado 3.2.7.

Materiales y Métodos

58

3.4. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS

3.4.1. Pretratamiento en manitol 0,4 M líquido vs. 0,7 M sólido

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras se pretrataron en dos medios que contenían las mismas

sales que el medio de pretratamiento (Tabla 3.1) y que diferían en la concentración de

manitol (0,4 M o 0,7 M) y de agarosa (medio líquido –L– o medio sólido –S–) (Tabla

3.5). Se midió el potencial osmótico utilizando un osmómetro de presión de vapor

“Wescor 5500”.

Tabla 3.5.- Contenido de manitol y agarosa de los medios de pretratamiento

0,4M-L y 0,7M-S.

MANITOL (g/l)

AGAROSA (g/l) mOs/Kg

0,4M-L 72,9 532 0,7M-S 127,5 8 805

Las anteras de cada espiga se distribuyeron aleatoriamente entre los dos

pretratamientos y se incubaron durante 5 días a 24ºC en oscuridad. Para cada réplica se

utilizaron anteras de entre 1 y 2 espigas.

Cultivo: Transcurridos los 5 días de pretratamiento, las anteras se cultivaron tal y

como se detalla en el apartado 3.2.7.

3.4.2. Pretratamiento en manitol con ayuno de nitrógeno

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras de cada espiga se repartieron aleatoriamente entre un

medio de pretratamiento con todos los macronutrientes (Tabla 3.1) y el mismo medio

de pretratamiento sin nitrógeno, en el cual se eliminaron KNO3 y NH4NO3. Las anteras

se mantuvieron durante 5 días a 24ºC y en oscuridad. Para cada réplica se utilizaron

anteras de entre 1 y 2 espigas.

Cultivo: Transcurridos los 5 días de pretratamiento, las anteras se cultivaron tal y

como se detalla en el apartado 3.2.7.

Materiales y Métodos

59

3.4.3. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento mediante PCR cuantitativa a tiempo real.

3.4.3.1. Recogida del material vegetal

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Chris y Caramba. Se utilizaron

espigas cuyas microsporas estuvieran en un estadio de desarrollo uninucleado medio-

tardío.

Recogida de muestras: Las anteras se inocularon en medio de pretratamiento

(Tabla 3.1) y se tomaron muestras transcurridas 3, 6, 12, 24, 48, 84 y 120 horas desde el

momento de la inoculación.

Como control in vivo se marcaron, en la planta, espigas que contenían anteras en

estado uninucleado medio-tardío y se tomaron muestras durante el desarrollo del polen,

a las 0, 48 y 120 horas.

De cada uno de los puntos se tomaron tres muestras de aproximadamente 50 mg

de anteras. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 ºC.

3.4.3.2. Aislamiento de RNA

Todo el material utilizado se autoclavó previamente dos veces para eliminar las

RNAsas. Los reactivos se preparan con H2O ultra pura (MilliQ, Millipore).

El agua se trató agregando 1 ml de DEPC por cada 1000 ml de H2O. Se agitó

durante al menos 2 h y se autoclavó dos veces. Este H2O libre de RNAsas (H2O DEPC)

se utilizó para preparar el etanol al 70% y para la disolución final del RNA extraído.

El RNA total se extrajo utilizando la solución Trizol® (Invitrogen), siguiendo las

indicaciones de la casa comercial.

1.- Homogeneización: Las anteras se homogeneizaron en un Eppendorf de 2 ml

con 500 µl de Trizol en una campana de extracción de gases, utilizando un

homogenizador mecánico Heidolph RZR1.

2.- Separación de fases: Las muestras homogeneizadas se incubaron durante

5 min a temperatura ambiente para permitir la completa disolución de los complejos

nucleoproteicos. Se añadió 100 µl de cloroformo y se agitaron fuertemente los tubos

durante 15 s. Se incubaron 3 min a temperatura ambiente y posteriormente se

Materiales y Métodos

60

centrifugaron (12.000 g, 4ºC) durante 15 min. Se extrajo cuidadosamente el

sobrenadante y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf.

3.- Precipitación: Se añadió 250 µl de propanol, mezclando suavemente, y se

incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente se centrifugó (12.000 g,

4ºC) durante 10 min.

4.- Lavado: Se desechó el sobrenadante y se añadió 500 µl de etanol al 75% en

agua DEPC. Las muestras se mezclaron y centrifugaron (7.500 g, 4ºC) durante 6 min.

5.- Redisolución: Se desechó el sobrenadante y el pellet se dejó secar

ligeramente. Se añadió 100 µl de agua DEPC y se incubó a 55-60ºC durante 10 min

para la completa disolución del RNA.

6.- Medición y visualización del RNA:

La cuantificación del RNA se realizó espectrofotométricamente: Se utilizaron

capilares de cuarzo (Biochrom) y un espectrofotómetro GeneQuant (Pharmacia). Cada

unidad de absorbancia medida a 260 nm fue considerada como 40 µg de RNA. La

relación de las absorbancias a 260 y 280 nm inferior a 2 indicó la pureza de las

muestras.

Se comprobó el estado del RNA mediante electroforesis en gel de agarosa (Fig.

3.7).

Gel de agarosa 1,2%: agarosa (MS-12, Conda) 0.7 g

TBE (0,5x en H2O DEPC) 60 ml

Muestra: RNA (15 µg totales) n µl

Tampón BS 3 µl

Bromuro de Etidio (1:10) 1 µl

H2O DEPC x µl

Volumen total 15 µl

La electroforesis se efectuó a 100 V durante 20 min.

Materiales y Métodos

61

Fig. 3.7.- Comprobación del estado del RNA

mediante electroforesis en gel de agarosa.

3.4.3.3. Síntesis de cDNA

Se utilizó el SuperScript III First-Strand Synthesis System de Invitrogen. Todos

los componentes estaban incluidos excepto el H2O DEPC. Se siguieron las indicaciones

de la casa comercial:

1.- Preparación de la reacción:

RNA (3 µg totales) n µl

oligo DT (50 µM) 3 µl

dNTPmix (10 mM) 3 µl

H2O DEPC x µl

Volumen total 30 µl

2.- Desnaturalización: Incubación durante 5 min a 65ºC.

3.- Hibridación: Incubación durante 1 min a 4ºC

4.- Añadir mezcla de reacción (1): Añadir 30 µl a cada muestra.

Mezcla de reacción (1): tampón RT (10x) 6 µl

(30 µl/muestra) MgCl2 (25 mM) 12 µl

DTT (0,1 M) 6 µl

RNAse OUT (40 u/µl) 3 µl

SuperSprip III (200 u/µl) 3 µl

5.- Síntesis de cDNA: Incubación 50 min a 50ºC

Materiales y Métodos

62

6.- Fin de la reacción: Incubación 5 min a 85ºC

7.- PCR de comprobación: Tomar 0,5 µl de cDNA y añadirle 24,5 µl de mezcla

de reacción (2).

Mezcla de reacción (2): Tampón del enzima (x10) 2,5 µl

(24,5 µl/muestra) MgCl2 (50 mM) 0,75 µl

cebadorF,R (10 µM) 1 µl

dNTPs (10 mM) 0,5 µl

TAQ (5 u/µl) 0,1 µl

H2O 19,65 µl

Programa de PCR: 1 ciclo 94ºC 3 min

30 ciclos 94ºC 1 min

60ºC 1 min

72ºC 1 min

1 ciclo 72ºC 10 min

Una vez comprobada la amplificación, el cDNA se conservó a -20ºC.

3.4.3.4. Obtención de secuencias de mRNA y diseño de los cebadores

Las secuencias de mRNA se obtuvieron de la base de datos GenBank (Benson et

al. 1999) en la página http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ en junio de 2006 (Tabla 3.7).

Se diseñaron pares de cebadores para estas secuencias, utilizando el programa

PrimerExpress v2.0 (Applied Biosystems, CA, USA), según las indicaciones

específicas para el diseño de cebadores para RT-PCR de Applied Biosystems (2007):

− La longitud de los cebadores debe ser entre 15 y 30 pb.

− La Tm debe estar entre 58-60ºC. La diferencia de Tm entre los dos

cebadores no debe ser superior a 2ºC.

− El contenido de GCs debe estar entre 30-80%. Lo ideal, es que esté entre 40-

60%.

− Al contrario que en la PCR convencional, se deben evitar las GCs en el

extremo 3’, de manera que las últimas 5 bases no contengan más de 2 GCs.

Materiales y Métodos

63

− Es también importante evitar la complementariedad de bases en y entre los

cebadores, para que no se formen bucles (“hairpins”) en el cebador, y para

evitar la formación de dímeros.

− El amplicón resultante debe ser pequeño, entre 50 y 150 pb para aumentar la

eficiencia de PCR.

Los oligonucleótidos diseñados fueron sintetizados por Operon Biotechnologies.

Tabla 3.7.- Números de acceso del Genbank de los cDNA analizados y secuencias de los

pares de cebadores utilizados para cada uno de ellos.

SECUENCIA AMPLIFICADA

NÚM. ACCESO GENBANK NOMBRE SECUENCIA 5’→3’

EF-1α M90077 EF1w-902F EF1w-983R

-TTCACTCTTGGAGTGAAGCAGATG- -CATAACGCGCCTTTGAGTACTTG-

PR-1 AF384143 PR1w-620F PR1w-690R

-CATGCACCTTCGTATGCCTAACT- -TGGCTTATTACGGCATTCCTTT-

β-1,3-glucanasa (PR-2) AF112967 PR2w-1157F

PR2w-1223R -ACTGCGGGCTTTGTACTTGAA- -ATCCATGCAAAGCATGATGCT-

Quitinasa II (PR-3) AB029935 Chitw-681F

Chitw-762R -TTCAAGACGGCGATATGGTTCT-

-GAGTCCACAGCCCCGTGAT-

PR-4 AF092123 PR4w-257F PR4w--326R

-TGGACTGGGACACCGTCTTC- -ACATTAAGATGGCCTTGCTGGTA-

OxalatoOxidasa (Germina, PR-15) M21962 Germin-715F

Germin-788R -CAGGGTCGTGGAACTTCTCAAG-

-TTATCATTTCAGGGAAGGCTCCTA-

Glutation-S-transferasa (GST) AF479764 GSTw-576F

GSTw-646R -AGGCGTGCTGTCGTGGAT-

-GAGTCTTGGCAGCGTCGAA-

Fenilalanina-amonio-liasa (PAL)

AY005474 Palw-1049F Palw-1114R

-CCATTGACCTTCGCCACATT- -CCACCTGCATCACGCAGTT-

Materiales y Métodos

64

3.4.3.5. PCR cuantitativa a tiempo real

La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) se llevó a cabo en un aparato de

PCR ABI Prism 5700 (Applied Biosystems). La RT-PCR se realizó utilizando el

sistema Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG w/ROX de Invitrogen.

Se hizo una mezcla de reacción de RT-PCR para cada pareja de cebadores (20 µl

por pocillo):

SYBR® Green 12,5 µl

Cebadores F,R 10 μM 1,0 µl

H2O 6,5 µl

Se utilizaron placas de 96 pocillos. A cada uno de ellos se le añadió 5 µl de la

muestra de cDNA previamente diluida 1:10. Para cada pareja de cebadores se dejaron

al menos dos controles, en los que en lugar de cDNA se añadió 5 µl de H2O.

Las cuantificaciones se realizaron a partir de tres reacciones de PCR

independientes (en cada una se utilizó cDNA procedente de una extracción

independiente de RNA). En cada una de estas reacciones, cada muestra se analizó por

duplicado.

Como resultado de la amplificación por RT-PCR, apareció una curva de

amplificación (Fig. 3.8).

SYBR Green es un fluorocromo que se une al surco menor del DNA de doble

cadena, aumentando unas 1000 veces su fluorescencia. Por tanto, la cantidad total

emitida es directamente proporcional a la cantidad de producto amplificado. La línea de

fluorescencia basal (“baseline”) representa los ciclos iniciales donde no hay un cambio

sustancial de la fluorescencia. El umbral o “threshold” es un nivel de fluorescencia que

se sitúa en la zona de amplificación exponencial de la reacción, y permite determinar el

CT (ciclo umbral o “threshold cycle”), que es el ciclo de la PCR en el que la curva de

amplificación corta el umbral. Este valor es inversamente proporcional a la cantidad

inicial de moléculas molde (para más información sobre los términos referidos a RT-

PCR, ver glosario por Dorak 2008).

Materiales y Métodos

65

Fig. 3.8.- Curva de amplificación de la RT-PCR. Thresold: umbral, Baseline: línea de

fluorescencia basal, No template: control sin cDNA, Sample: muestra, ∆Rn: diferencia

de fluorescencia, CT: ciclo umbral.

Fuente: Applied Biosystems

La eficiencia de la PCR se determinó analizando series de diluciones (1, 1:10,

1:100) de cDNA y aplicando la ecuación 1:

E = (10 –1/pte –1) × 100 [1]

donde pte es la pendiente de la recta entre el logaritmo de las diluciones utilizadas y el

valor CT. Se consideraron válidas aquellas parejas de cebadores cuya eficiencia estuvo

entre el 90 y el 100%.

Los valores Ct obtenidos para cada gen en cada punto se corrigieron respecto a los

valores obtenidos para la expresión del gen constitutivo EF-1α (“transcription

elongation factor 1 alpha”), para eliminar la variación experimental (∆Ct). Después, se

aplicó la ecuación 2 utilizando el método CT de cuantificación relativa (Applied

Biosystems User Bulletin nº2).

2− (∆Ct tiempo n − ∆Ct tiempo 0) [2]

Los valores inferiores a 1 se trasformaron en factores de inducción (f.i.=-1/x). Los

factores de inducción con cuyo valor absoluto fue superior a 3 se consideraron

significativamente diferentes del control (0 h).

Materiales y Métodos

66

Al finalizar la reacción, el equipo de PCR aplicó un gradiente de temperaturas

creciente y monitorizó la cinética de disociación del fragmento amplificado. Esto nos

permitió descartar la presencia de dímeros de cebadores y amplificaciones inespecíficas

que en general tienen una Tm diferente a la del amplicón (Fig. 3.9).

Fig. 3.9.- Curva de disociación (dF/dT: derivada de la

fluorescencia). La presencia de productos de amplificación

inespecíficos se detectaría en forma de otro pico.

Fuente: Invitrogen

Materiales y Métodos

67

3.5. ADICIÓN DE INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS AL MEDIO

DE CULTIVO DE ANTERAS

3.5.1. Medio preacondicionado con ovarios

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Cultivo: Las anteras pretratadas se cultivaron en dos condiciones diferentes:

medio de cultivo MSM-F200 (Tablas 3.2 y 3.3) preacondicionado con ovarios (OVCM)

y sin preacondicionar (Control). En el primer caso, el medio MSM-F200 había sido

previamente preacondicionado con ovarios (10 ovarios por 1,5 ml) cultivados durante

5-7 días a 24ºC en oscuridad, como se describe en el apartado (3.2.5). Además, las

anteras se co-cultivaron con 10 ovarios por placa. En el Control, las anteras se

inocularon en medio MSM-F200 sin preacondicionar y sin la presencia de ovarios.

Las anteras pretratadas procedentes de una misma espiga se repartieron entre los

dos tratamientos. Para cada réplica se utilizaron anteras de entre 1 y 2 espigas.

3.5.2. Arabinogalactanos y proteínas de arabinogalactanos

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Cultivo: Las anteras pretratadas se cultivaron en tres medios diferentes: OCVM,

10LG y 30LG.

El medio OVCM había sido previamente preacondicionado (apartado 3.2.5) y las

anteras se co-cultivaron con 10 ovarios por placa. Este medio preacondicionado se

comparó con el cultivo en dos medios MSM-F200 no preacondicionados que contenían

10 mg/l de Larcoll y 10 mg/l de goma arábiga (10LG) ó 30 mg/l de Larcoll y 30 mg/l

de goma arábiga (30LG). Se prepararon soluciones stock 0,5 mg/ml de Larcoll y goma

arábiga estériles, que se añadieron directamente a las placas que contenían el medio

MSM-F200.

Las anteras pretratadas procedentes de una misma espiga se repartieron entre los

tres tratamientos. Para cada réplica se utilizaron anteras de entre 2 y 3 espigas.

Materiales y Métodos

68

3.5.3. Alcoholes butílicos

3.5.3.1. Tratamiento con n-butanol

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras pretratadas se inocularon en tres tratamientos en medio

MSM: un control, y dos concentraciones de n-butanol 0,1% y 0,2% (v/v).

Las anteras procedentes de una misma espiga se repartieron al azar entre los tres

tratamientos. El tratamiento se realizó en placas de 3 cm de diámetro con 2 ml de

medio, durante 5 h a 24 ºC y en oscuridad. Para cada réplica se utilizaron anteras de

entre 2 y 3 espigas.

Cultivo: Transcurridas las 5 h, el medio se extrajo con una pipeta Pasteur de

vidrio. Después se añadió directamente el medio MSM-F200 preacondicionado y los

ovarios, para continuar con el cultivo de anteras como se detalla en el apartado 3.2.7.

3.5.3.2. Tratamiento con sec-, tert- y n-butanol

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras pretratadas se inocularon en cuatro tratamientos en

medio MSM: un control y tres tratamientos con sec-butanol, tert-butanol y n-butanol,

todos a una concentración del 0,2% (v/v).

Las anteras procedentes de una misma espiga se repartieron aleatoriamente entre

los cuatro tratamientos. Entre 35 y 40 anteras fueron inoculadas en cada placa. El

tratamiento se realizó en placas de 3 cm de diámetro con 2 ml de medio, durante 5 h a

24 ºC y en oscuridad.

Cultivo: Transcurridas las 5 h, el medio se extrajo con una pipeta Pasteur de punta

fina de vidrio. Después se añadió directamente el medio MSM-F200 preacondicionado

y los ovarios, para continuar con el cultivo de anteras como se detalla en el apartado

3.2.7.

Para cada réplica se utilizaron anteras de entre 2 y 3 espigas.

Las plantas regeneradas del cultivar Pavon se vernalizaron y cultivaron en el

invernadero como se describe en el apartado 3.2.8, para obtener producción de semilla.

Materiales y Métodos

69

Recuento de la viabilidad de las microsporas: Transcurridas 48 h de cultivo se

realizó el recuento de la viabilidad de las microsporas mediante tinción con fluorescein

diacetato (FDA) (Widholm 1972). El FDA se preparó como una solución stock

disolviendo 0,5 mg/ml de FDA en acetona y se conservó a -20 ºC. La solución de uso

se preparó añadiendo 48 µl de la solución stock de FDA en 1 ml de solución manitol

0,3 M (concentración final de 24 µg/ml). La viabilidad de las microsporas se analizó

colocando cada antera en una gota de la solución de FDA sobre una placa Petri y

cortándola en 2 ó 3 secciones con un bisturí. La placa cerrada se mantuvo en oscuridad

durante unos 10 min.

Se analizaron 14 anteras de cada tratamiento. Las microsporas se observaron en

un microscopio Nikon Eclipse T300. Para cada antera se tomaron fotos digitales de 3

campos distintos a 200 aumentos tras la exposición con luz ultravioleta (330-380 nm) y

con luz azul (465–495 nm) con el programa Cool Snap (Fig. 3.10). Esto nos permitió

contar las microsporas totales, gracias a su autofluorescencia bajo luz ultravioleta, y las

microsporas viables teñidas por la fluoresceína producida por la actividad de esterasas

citosólicas sobre la molécula de FDA. Las fotos se tomaron para eliminar el riesgo de

que la fluorescencia se desvaneciera por el tiempo en exposición a la luz durante el

recuento.

Fig. 3.10.- Recuento de la viabilidad de microsporas de trigo con FDA. Autofluorescencia de

las microsporas tras la excitación con luz ultravioleta 330-380 nm (A) y microsporas viables

teñidas con FDA tras excitación con luz azul 450-490 nm (B).

50 µm

A B

50 µm

A B

Materiales y Métodos

70

3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El diseño fue completamente aleatorizado o en bloques completamente

aleatorizados. Cada bloque correspondió a un grupo de plantas procedente de la misma

siembra y cultivadas en la misma cámara de crecimiento. La unidad experimental fue la

placa de cultivo. En el cultivo de microsporas, cada aislamiento fue considerado una

réplica. Para cada genotipo se realizaron de 4 a 6 réplicas de diferentes grupos de

plantas. En el cultivo de anteras se utilizó un total de 8 a 12 réplicas de cada genotipo,

de uno o dos grupos de plantas.

Se analizaron las variables anteras que responden, divisiones, embriones, plantas

verdes, plantas albinas y plantas DH, todas por 100 anteras sembradas, y el porcentaje

de viabilidad de las microsporas (microsporas viables por 100 microsporas), así como

los porcentajes de regeneración (plantas regeneradas por 100 embriones) y de plantas

verdes (plantas verdes por 100 plantas totales). El número de divisiones se calculó

sumando el número de callos y de embriones de cada placa. El número de callos se

calculó haciendo un recuento sobre papel milimetrado, de los callos que había en el

10% de la superficie de la placa Petri. Los porcentajes de duplicación cromosómica de

las plantas regeneradas se determinó analizando el nivel de ploidía de entre 50 y 100

plantas elegidas al azar de cada tratamiento, mediante citometría de flujo. En el

experimento de tratamientos diploidizantes en planta, se consideraron duplicadas

aquellas plantas que produjeron semilla y se analizó, además la variable mortalidad de

las plantas tratadas (plantas muertas por 100 plantas tratadas).

El análisis de los resultados se llevó a cabo con el programa SAS (SAS Institute

Inc., Cary, NC, Versión 9.1). Se analizó la normalidad de las variables mediante el test

de Kolmogorov-Smirnoff y la homogeneidad de varianza utilizando el test de Levene.

Cuando fue necesario para cumplir con los supuestos paramétricos se realizaron

transformaciones logarítmica (y=Log(x+1)), raíz cuadrada (y=raíz(x+0,5) o angular

(y=arco seno(raízX)). Los análisis de varianza (ANOVA) se realizaron mediante el

procedimiento GLM (General Linear Model), válido para diseños desequilibrados, y se

utilizó la suma de cuadrados de tipo III. Los ANOVA se realizaron para el conjunto de

los genotipos excepto en los casos en que la heterogeneidad de la varianza entre los

genotipos era muy elevada (apartados 4.1.3.1 y 4.1.3.2). La variable número de plantas

DH por 100 anteras se analizó en todos los casos para cada genotipo por separado. Para

Materiales y Métodos

71

las separaciones de medias se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan (p<0,05).

Las variables porcentaje de viabilidad, porcentaje de mortalidad de plantas y porcentaje

de duplicación cromosómica se analizaron mediante el test X2, utilizando el

procedimiento FREQ (tablas de frecuencia), comparando los tratamientos de dos en

dos.

73

4. RESULTADOS

4.1. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA

4.1.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los

estomas

Con el fin de estudiar si la longitud de los estomas podría utilizarse como

indicador del nivel de ploidía de las plantas regeneradas, se calculó la longitud media

de los estomas en plantas H (n=3x=21) y DH (2n=6x=42) del cv Chris en dos estadios

de desarrollo. El análisis estadístico mostró diferencias significativas en la longitud

estomática para los dos niveles de ploidía estudiados (Tabla 4.1). No hubo diferencias

significativas debidas a los estadios de desarrollo 1 (plantas al comienzo de la etapa de

ahijamiento) y 2 (plantas al comienzo de la etapa de encañado).

Tabla 4.1.- ANOVA de la longitud media de los estomas de

plantas H y DH del cv Chris en dos estados de desarrollo.

FUENTE gl CUADRADOS MEDIOS

LONG. ESTOMAS Ploidía 1 2681,04 ***

Estado 1 36,93 ns

Ploidía × Estado 1 0,47 ns

Error 38 25,20 ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Interesaba saber si esto sería válido en el caso de plantas producidas a partir de

cruzamientos F1, o si por el contrario, la variabilidad de la descendencia afectaría a esta

discriminación. Para ello se analizaron plantas producidas mediante cultivo de

microsporas de plantas F1 del cruzamiento 40xS83 y del cv Chris. Se observó que

también existían diferencias significativas entre la longitud media de los estomas de las

plantas H y DH, con longitud media de 52 y 69 μm respectivamente, y que no había

diferencias significativas en la longitud de los estomas entre las plantas procedentes del

cruzamiento 40xS83 y el cv Chris (Tabla 4.2, Tabla 4.3).

Resultados

74

En la Fig. 4.1 se puede observar que aunque parece existir una mayor variabilidad

en la longitud de los estomas de las plantas H derivadas del cruzamiento 40xS83 que en

el cv Chris, se puede establecer una clara discriminación entre plantas H y DH.

Tabla 4.2.- ANOVA de la longitud media de los estomas del cv

Chris y el cruzamiento 40xS83.

FUENTE gl CUADRADOS MEDIOS

LONG. ESTOMAS Ploidía 1 3345 ***

Parental 1 171 ns

Ploidía × Parental 1 24 ns

Error 39 27 ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.3.- Longitud media de los estomas para plantas DH y

H en las líneas derivadas de Chris y del cruzamiento 40xS83.

PLOIDÍA LONGITUD (µm) ± STD DH (6x) 69 ± 5,4

H (3x) 52 ± 4,0

Fig. 4.1.- Longitud media de los estomas de las plantas H y DH producidas mediante el

cultivo de microsporas del cv Chris y del cruzamiento 40xS83.

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Mic

ras

40xS83 (DH) Chris (DH)40xS83 (H) Chris (H)

DH

H

Resultados

75

4.1.2. Tratamientos diploidizantes en planta

La aplicación de colchicina en planta se llevó a cabo mediante los métodos de

inmersión de la raíz y del vial invertido. Las plantas tratadas se cultivaron hasta la

obtención de semilla. Los tratamientos por el método de inmersión de la raíz de plantas

H en estado de 3-4 hojas, produjeron altos porcentajes de plantas duplicadas con

semilla (50-93%) (Tabla 4.4). Los resultados dependieron del genotipo, ya que tanto el

porcentaje de plantas duplicadas como la cantidad se semilla obtenida fueron mayores

en las plantas procedentes del cruzamiento 5x18 que en las plantas procedentes del

cruzamiento 23x21.

Tabla 4.4.- Tratamiento de plantas haploides con colchicina.

PLANTAS SEMILLAS

MÉTODO PARENTAL COLCHICINA

(%) DURACIÓN

(h) TRATADAS

(Núm.)

CON SEMILLA

(%) MUERTAS

(%)

POR PLANTA (Núm.)

Inmersión 5x18 0,10 3 15 93 a 0 32 a de la Raíz 5x18 0,10 5 15 87 a 0 34 a

23x21 0,10 3 10 50 a 0 22 a 23x21 0,10 5 10 60 a 0 26 a 40xS83 0,10 5 16 75 a 0 - 40xS83* 0,10 5 25 32 b 0 -

Vial Chris 0,15 48 10 70 a 10b 15 b invertido Chris 0,15 72 12 30 b 36a 28 a

Chris 0,25 48 11 55 a 18b 18 b Chris 0,25 72 12 58 a 30a 35 a

*Plantas en etapa de encañado. Los valores seguidos de letras diferentes dentro del mismo cultivar son significativamente diferentes (p<0,05).

No hubo diferencias significativas entre los tratamientos de 3 y 5 h en el

porcentaje de plantas con semilla ni en el número de semillas por planta, en ninguno de

los dos cruzamientos. Las líneas generadas a partir del cruzamiento 40xS83 fueron

tratadas mediante el método de inmersión de la raíz, en el estadio de 3-4 hojas y en el

estadio de encañado. Este método produjo un porcentaje significativamente inferior de

plantas con semilla en plantas en estado de encañado (32%) que cuando se trataron los

Resultados

76

estadios más jóvenes (75%). El método de inmersión de la raíz no produjo mortalidad

en ninguno de los cruzamientos ni de los estadios de desarrollo.

Los tratamientos realizados mediante el método del vial invertido produjeron

porcentajes variables de duplicación (30-70%). En general, los porcentajes de plantas

con semilla obtenidos en Chris por este método fueron inferiores a los obtenidos

mediante el método de inmersión de la raíz aplicado en etapas tempranas en plantas

procedentes de diversos cruzamientos. El número de semillas por planta duplicada en

los tratamientos aplicados durante 72 h fue dos veces superior al obtenido en los

tratamientos de 48 h de duración. Sin embargo, en los tratamientos de larga duración la

mortalidad producida en las plantas fue más elevada (30-36%), y muchas plantas

morían antes de producir nuevas espigas.

4.1.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in vitro

Se estudió el efecto de la colchicina, sobre la respuesta androgénica y el

porcentaje de duplicación cromosómica. Se estudiaron dos momentos de aplicación:

durante la fase de pretratamiento de estrés y durante las primeras 48 h de cultivo en el

medio de inducción.

4.1.3.1. Colchicina añadida al medio de pretratamiento de las anteras.

Dada la heterogeneidad de varianza entre los genotipos, los análisis de varianza se

realizaron para cada uno de ellos por separado. Los ANOVA indicaron que la adición

de colchicina al medio de pretratamiento no afectó a ninguna de las variables de

respuesta al cultivo de microsporas en Chris (Tabla 4.5). En Pavon, tan solo se vio

afectado el número de plantas verdes y en Caramba los porcentajes de regeneración y

plantas verdes. En el cv Pavon el número de plantas verdes aumentó significativamente

de 7 en el control a 11 en el pretratamiento con 300 mg/l de colchicina (Tabla 4.6). En

Caramba, el pretratamiento con 150 mg/l de colchicina afectó negativamente al

porcentaje de regeneración y al porcentaje de plantas verdes, reduciéndose esta última

variable casi 2 veces respecto al control. Sin embargo la aplicación de 300 mg/l de

colchicina produjo porcentajes de regeneración y de plantas verdes similares al control.

Resultados

77

Tabla 4.5.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. ANOVA

para las variables de respuesta androgénica en el cultivo de microsporas de los

cultivares Chris, Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

CULTIVAR FUENTE df EMBRIONESa PLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REG. (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Chris

Tratamiento 2 1205,43 ns 0,06 ns 0,12 ns 0,01 ns 0,75 ns

Error 9 594,25 0,02 0,05 0,01 0,25

Pavon

Tratamiento 2 1043,73 ns 61,94 * 0,51 ns 0,01 ns 1,00 ns

Error 27 630,74 17,80 2,14 0,05 0,59

Caramba

Tratamiento 2 95,27 ns 10,57 ns 0,91 ns 0,14 * 2789,96 *

Error 21 266,85 18,14 1,24 0,04 774,99 a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.6.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. Respuesta al cultivo

de microsporas y separación de medias en tres cultivares de trigo panadero.

COLCHICINA PLANTAS REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR (mg/l) EMBRIONES a VERDES a ALBINASa (%) (%)

Chris 0 90 61 1 69 98 150 123 79 1 65 99 300 96 66 1 70 98 Pavon 0 46 7 b 12 54 37 150 34 8 ab 14 49 37 300 55 11 a 15 49 43 Caramba 0 21 6 6 56 a 50 a 150 27 4 10 49 b 28 b 300 21 5 6 52 ab 45 a

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes dentro del mismo cultivar son significativamente diferentes (p<0,05).

Resultados

78

El porcentaje de duplicación cromosómica no se vio afectado por la adición de

150 mg/l de colchicina en ninguno de los tres genotipos (Fig. 4.2). En cambio, la

adición de 300 mg/l de colchicina afectó a la duplicación de diferente forma en cada

genotipo, ya que disminuyó en Pavon, aumentó en Caramba y no tuvo ningún efecto en

Chris.

El número de plantas DH producidas por 100 anteras, no varió significativamente

con la adición de colchicina en Chris ni en Caramba (Fig. 4.2). Sin embargo, en Pavon

se produjo un aumento de 4 a 6 plantas DH por 100 anteras al incorporar 300 mg/l de

colchicina en el pretratamiento a pesar de la disminución en el porcentaje de

duplicación cromosómica. Esto fue debido al mayor número de plantas verdes en este

tratamiento (Tabla 4.6). En Caramba, el aumento producido en el porcentaje de

duplicación con 300 mg/l de colchicina no llegó a producir un aumento significativo del

número de plantas DH.

0

10

20

30

40

50

60

70

0150 300 0

150 300 0150 300

Colchicina (mg/l)

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

A B C

aa

bb

b

a

b b aa a a

a

a

a

a

aa

Fig. 4.2.- Incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento. Número de plantas DH

por 100 anteras (barras grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), en los

cultivares Chris (A), Pavon (B) y Caramba (C). Letras diferentes en cada cultivar indican

diferencias significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación (rojo) y el número de

plantas DH (azul).

Resultados

79

4.1.3.2. Colchicina aplicada durante las primeras horas de cultivo en el medio de

inducción.

Se estudió el efecto de la incorporación de colchicina durante las primeras 48 h de

cultivo sobre la respuesta androgénica y la duplicación cromosómica, tanto en el cultivo

de microsporas aisladas como en el cultivo de anteras.

4.1.3.2.1. Cultivo de microsporas

Los tratamientos con colchicina durante el cultivo de microsporas afectaron a

diferentes variables del cultivo dependiendo del genotipo (Tabla 4.7). El tratamiento

produjo cambios significativos sobre el número de plantas verdes y albinas en el cv

Chris, sobre el número de embriones, plantas albinas y porcentaje de plantas verdes en

el cv Pavon y no afectó a ninguna de las variables de respuesta al cultivo en la línea

DH24033.

Para estudiar el efecto de la manipulación de las microsporas durante las primeras

horas de cultivo sobre la respuesta androgénica, se utilizó un control en el que las

microsporas se cultivaron sin haber sido tratadas (control) y se comparó con el cultivo

de microsporas tratadas en medio sin colchicina (0 mg/l de colchicina).

Se observó que el procedimiento utilizado para tratar las microsporas, cultivo en

medio líquido durante 48 h y posterior lavado y centrifugado, tuvo un efecto negativo

sobre la respuesta al cultivo en Pavon (Tabla 4.8). El porcentaje de plantas verdes se

redujo significativamente del 66% en el control al 18% tras el tratamiento con 0 mg/l de

colchicina, lo que causó la reducción, aunque no significativa, del número de plantas

verdes, que fue 4 veces inferior al control. No se observaron diferencias

estadísticamente significativas en el cv Chris, aunque el tratamiento redujo casi a la

mitad el número de plantas verdes producidas. En cambio, sí se observó una

disminución del número de plantas albinas producidas, que fue 4 veces menor en el

tratamiento con 0 mg/l de colchicina. Al contrario que en estos dos cultivares, en la

línea DH24033 se produjo un aumento, aunque no significativo, del número de

embriones (Fig. 4.3C), que resultó en un número de plantas verdes 4 veces superior al

control sin tratamiento.

El tratamiento de las microsporas en medio sin colchicina también afectó a los

porcentajes de duplicación, que aumentaron significativamente en Pavon del 35% al

Resultados

80

50% y en DH24033 del 22% al 34% (Fig. 4.4). A pesar de esto, en Pavon el número de

plantas DH disminuyó 5 veces con el tratamiento, a causa de la reducción en el

porcentaje de plantas verdes (Tabla 4.8). Aunque se observó una disminución en el

número de plantas DH producidas en Chris y un aumento en línea DH24033, las

diferencias no fueron significativas estadísticamente.

Tabla 4.7.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

ANOVA para las variables de respuesta androgénica de los cultivares Chris, Pavon y la

línea DH24033.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df EMBRIONESaPLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REG. (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Chris Tratamiento 3 3,9 ns 285,5 * 0,2 * 0,3 ns 2,1 ns

Error 22 6,4 90,6 0,0 0,2 0,9

Pavon Tratamiento 3 198,9 * 14,4 ns 40,7 * 0,2 ns 1,6 **

Error 20 44,0 7,9 8,3 0,3 0,2

DH24033 Tratamiento 3 1,1 ns 77,1 ns 0,5 ns 0,6 ns 0,9 ns

Error 16 0,4 103,3 0,2 0,6 0,3

a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

La incorporación de 150 mg/l y 300 mg/l de colchicina durante las primeras 48 h

de cultivo de las microsporas, afectó de forma diferente a la respuesta androgénica

dependiendo del genotipo (Tabla 4.8). En el cv Pavon se observó un aumento del

número de embriones producido con 150 mg/l y 300 mg/l, que fue 2 veces superior al

tratamiento con 0 mg/l (Fig. 4.3B), y además se produjo un aumento del porcentaje de

plantas verdes, que se duplicó en el tratamiento con 300 mg/l respecto al tratamiento

con 0 mg/l de colchicina. Como resultado, el número de plantas verdes por 100 anteras

aumentó, aunque de forma no significativa, de 1 en el tratamiento con 0 mg/l, a 3 en los

tratamientos con 150 y 300 mg/l de colchicina. El número de plantas albinas fue

significativamente superior en el tratamiento con 150 mg/l de colchicina con respecto a

los tratamientos con 0 mg/l y 300 mg/l. En el cv Chris y la línea DH24033, no se

observaron diferencias entre los tratamientos con 0, 150 y 300 mg/l de colchicina para

Resultados

81

el número de embriones (Fig. 4.3A y Fig. 4.3C), de plantas verdes y de plantas albinas,

ni para los porcentajes de regeneración y plantas verdes (Tabla 4.8).

Tabla 4.8.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

Respuesta al cultivo y separación de medias en tres genotipos de trigo panadero.

COLCHICINA PLANTAS REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR (mg/l) EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%) (%)

Chris Control 58 23 a 0,4 a 41 98 0 44 13 ab 0,1 b 29 99 150 33 12 ab 0,0 b 37 100 300 37 9 b 0,1 b 26 99

Pavon Control 13 ab 4 2,1 b 47 66 a 0 9 b 1 2,8 b 37 18 b 150 21 a 3 7,9 a 55 30 ab 300 21 a 3 4,6 b 36 38 a

DH24033 Control 9 1 0,2 17 87 0 28 4 0,3 14 93 150 34 10 0,6 32 94 300 32 8 0,9 27 90 a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes dentro del mismo cultivar son significativamente diferentes (p<0,05).

Fig. 4.3.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

Estructuras y embriones producidos a los 30 días de cultivo. Cultivos sin tratar (Control) y

tratados con diferentes concentraciones de colchicina (C0 = 0 mg/l, C150 = 150 mg/l,

C300 = 300 mg/l), en los cultivares Chris (A), Pavon (B) y la línea DH24033 (C).

A B C

Resultados

82

El porcentaje de duplicación cromosómica aumentó significativamente en el

tratamiento con 300 mg/l de colchicina respecto al tratamiento con 0 mg/l de

colchicina, en los tres genotipos utilizados (Fig. 4.4). Los mayores efectos sobre la

duplicación se produjeron en la línea DH24033 y en el cv Pavon, en los que los

porcentajes de duplicación aumentaron un 118% y un 76% respectivamente.

El número de plantas verdes DH del cv Chris que se produjo en los tres

tratamientos fue muy similar (Fig. 4.4). Sin embargo, en Pavon el número de plantas

DH aumentó 8 veces en el tratamiento con 300 mg/l de colchicina respecto al

tratamiento con 0 mg/l. Este aumento fue consecuencia, no solo de los mayores

porcentajes de duplicación, sino también del mayor número de embriones producido y

del aumento en el porcentaje de plantas verdes (Tabla 4.8). En la línea DH24033 esta

variable aumentó, aunque no significativamente, de 1,2 plantas DH por 100 anteras en

el tratamiento con 0 mg/l de colchicina a 5,6 en el tratamiento con 300 mg/l.

0

5

10

15

20

Control

0 mg/l

150 m

g/l

300 m

g/l

Control

0 mg/l

150 m

g/l

300 m

g/l

Control

0 mg/l

150 m

g/l

300 m

g/l

Tratamiento

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

aA B C

b

b

c

a

bb

b

a

a

b

c

ab

aa

aa

abb

a

a aa

Fig. 4.4.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de microsporas aisladas.

Número de plantas DH por 100 anteras (barras grises) y porcentaje de duplicación

cromosómica (▲) en los cultivares Chris (A), Pavon (B) y la línea DH24033 (C). Cultivos sin

tratar (Control) y tratados con diferentes concentraciones de colchicina. Letras diferentes en

cada cultivar indican diferencias significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación

(rojo) y el número de plantas DH (azul).

Resultados

83

4.1.3.2.2. Cultivo de anteras

La incorporación de colchicina durante el cultivo de anteras produjo un número

de embriones, plantas verdes y albinas similar en los tres tratamientos en Pavon,

mientras que en el cv Caramba estas variables fueron inferiores en el tratamiento con

150 mg/l de colchicina que en los tratamientos con 0 y 300 mg/l (Tabla 4.9). El número

de anteras que responden y los porcentajes de regeneración y plantas verdes no se

vieron afectados por la incorporación de colchicina en ninguno de los dos cultivares.

Los porcentajes de regeneración y de plantas verdes fueron similares en ambos

genotipos, alrededor del 50 y del 60%, respectivamente.

Tabla 4.9.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. Respuesta al

cultivo en dos cultivares de trigo panadero.

COLCHICINA ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR (mg/l) RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%) (%)

Pavon 0 44 419 117 66 50 62 150 43 361 144 47 51 66 300 43 376 129 68 48 60

Caramba 0 23 178 68 27 49 61 150 21 103 32 18 46 61 300 22 159 70 24 58 64

a Valores por 100 anteras.

Dada la homogeneidad de varianza entre los genotipos, el análisis de varianza se

realizó para el conjunto de los dos genotipos. El ANOVA indicó que existieron

diferencias significativas entre genotipos para las variables número de anteras que

responden, embriones, plantas verdes y plantas albinas (Tabla 4.10). Los valores de

estas variables fueron aproximadamente 2 veces superiores en Pavon que en Caramba,

obteniéndose una media de 122 plantas verdes de Pavon y 55 plantas verdes de

Caramba (Tabla 4.11). No se encontraron diferencias entre genotipos para los

porcentajes de regeneración y plantas verdes (Tabla 4.10). Ni el factor tratamiento ni la

interacción genotipo × tratamiento fueron significativos para ninguna de las variables

de respuesta al cultivo.

Resultados

84

Tabla 4.10.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. ANOVA para las

variables de respuesta androgénica de los cultivares Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df Anteras

Responden EMBRIONESa PLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REG. (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Genotipo 1 48,8 ** 733,8 *** 206,0 *** 106,9 *** 3,2 ns 1,8 ns

Tratamiento 2 0,0 ns 20,6 ns 6,2 ns 10,0 ns 452,9 ns 0,4 ns

Genotipo × Tratamiento 2 0,3 ns 4,7 ns 8,8 ns 0,6 ns 252,5 ns 2,1 ns

Error 48 3,17 50,0 25,2 7,6 318,6 2,7 a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.11.- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. Separación de

medias para el factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

CULTIVAR RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a Pavon 44 a 385 a 122 a 57 a Caramba 22 b 147 b 55 b 23 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

La duplicación cromosómica aumentó significativamente en los tratamientos con

colchicina en Pavon y Caramba (Fig. 4.5). En ambos cultivares se obtuvieron

porcentajes de duplicación cromosómica similares (33%), que aumentaron en el

tratamiento con 300 mg/l de colchicina hasta el 50% en Pavon y hasta el 58% en

Caramba. Estos aumentos hicieron que la producción de plantas DH también se

incrementara significativamente en los dos cultivares en el tratamiento con 300 mg/l de

colchicina, llegando a obtenerse 60 plantas DH de Pavon y 35 plantas DH de Caramba

por 100 anteras.

Conviene destacar que las plantas DH producidas en los tratamientos con

colchicina tuvieron una fertilidad (semillas/número de flores) comparable a la de

plantas DH producidas en las placas control, y que su producción de semilla fue

superior a la de las plantas H sometidas a tratamientos diploidizantes.

Resultados

85

0

10

20

30

40

50

60

70

0150 300 0

150 300

Colchicina (mg/l)

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

A B

bb

a

b

aa

b

b

a

b

b

a

Fig. 4.5- Incorporación de colchicina en el medio de cultivo de anteras. Número de plantas

DH por 100 anteras (barras grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), en los

cultivares Pavon (A) y Caramba (B). Letras diferentes en cada cultivar indican diferencias

significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación (rojo) y el número de plantas DH

(azul).

Resultados

86

4.2. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS

4.2.1. Pretratamiento en manitol 0,4 M líquido vs. 0,7 M sólido

Se comparó el medio de pretratamiento más comúnmente utilizado en trigo,

manitol 0,4 M líquido (532 mOs/Kg) con una concentración de manitol mayor, 0,7 M

en medio sólido (805 mOs/Kg). En ambos genotipos el pretratamiento en medio 0,7 M

sólido (0,7M-S) produjo un mayor número de embriones y plantas verdes que el

pretratamiento en medio 0,4 M líquido (0,4M-L) (Tabla 4.12). En el cv Caramba estas

variables se incrementaron más de 2 veces respecto al pretratamiento 0,4M-L, mientras

que en el cv Pavon el número de embriones aumentó un 30% y el número de plantas

verdes un 50%. El porcentaje de regeneración no cambió con el pretratamiento en

ninguno de los genotipos, ni el porcentaje de plantas verdes en Pavon. En Caramba, el

porcentaje de plantas verdes fue del 73% en el medio 0,7M-S y del 52% en el medio

0,4M-L.

Tabla 4.12.- Pretratamiento en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido con

manitol 0,7 M. Respuesta al cultivo de anteras en dos cultivares de trigo panadero.

PLANTAS REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR PRETRAT. EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%) (%)

Pavon 0,4M-L 183 70 45 63 63 0,7M-S 233 107 48 64 61

Caramba 0,4M-L 34 8 6 45 52 0,7M-S 67 24 10 48 73 a Valores por 100 anteras.

El ANOVA mostró cambios muy significativos debidos al genotipo sobre las

variables número de embriones, plantas verdes, planta albinas y porcentaje de

regeneración (Tabla 4.13). En Pavon se produjeron resultados superiores que en

Caramba en estas variables, y como resultado se obtuvo un número de plantas verdes 4

Resultados

87

veces mayor (Tabla 4.14). El tratamiento tuvo un efecto significativo sobre el número

de embriones y de plantas verdes (Tabla 4.13). En los cultivos de anteras pretratadas en

manitol 0,7M-S, el número de embriones producidos fue significativamente superior

que el obtenido en el pretratamiento en 0,4M-L (Tabla 4.15, Fig. 4.6). Esto produjo un

aumento del 70% en el número de plantas verdes producidas en el pretratamiento

0,7M-S.

No existieron interacciones genotipo × tratamiento para ninguna de las variables,

lo que quiere decir que el pretratamiento afectó de forma similar a los dos genotipos

(Tabla 4.13). Se obtuvieron diferencias significativas entre bloques para el número de

embriones y de plantas albinas. La variable porcentaje de plantas verdes no se vio

afectada significativamente por ninguno de los factores.

Tabla 4.13.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido

con manitol 0,7 M. ANOVA para las variables de respuesta androgénica en los cultivares

Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df EMBRIONESa PLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REGENERACIÓN (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Genotipo 1 349,9 *** 181,2 *** 100,4 *** 2834,5 ** 1,72 ns

Tratamiento 1 60,2 * 49,4 * 5,0 ns 46,5 ns 9,25 ns

Genotipo × Tratamiento 1 0,5 ns 0,4 ns 0,0 ns 37,6 ns 7,6 ns

Bloque 1 114,2 *** 34,4 ns 18,5 * 59,0 ns 0,61 ns

Error 52 14,2 8,9 3,36 322,9 4,18 a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tras la inducción de androgénesis, se obtuvieron diferentes tipos de estructuras

(Fig. 4.6), principalmente: 1) embriones completos, en los que se puede distinguir

perfectamente el eje embrionario con meristemo apical y radicular (e), 2) estructuras

embriogénicas en las que se puede distinguir el meristemo apical (se) y 3) estructuras

de crecimiento indeterminado o callos.

Resultados

88

Tabla 4.14.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido

con manitol 0,7 M. Separación de medias para el factor genotipo.

PLANTAS REGENERADAS REG.

CULTIVAR EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%)

Pavon 177 a 81 a 42 a 68 a Caramba 65 b 19 b 10 b 44 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Tabla 4.15.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido

con manitol 0,7 M. Separación de medias para el factor tratamiento.

PRETRATAMIENTO. EMBRIONES a PLANTAS VERDES a

0,4M-L 95 b 34 b 0,7M-S 135 a 59 a

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

ov

e

ov

ov

e

a

a

s

se

s

A B

e

ov

e

ov

ov

e

a

a

s

se

s

A B

e

Fig. 4.6.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M (A) y en medio

sólido con manitol 0,7 M (B). Estructuras y embriones formados a los 35 días de cultivo en el

cultivar Pavon. a: antera, e: embrión completo, s: callo, se: estructura embriogénica,

ov: ovario

Resultados

89

Los porcentajes de duplicación cromosómica de las plantas regeneradas en ambos

pretratamientos fueron similares (Fig. 4.7). El pretratamiento en medio 0,7M-S produjo

un número superior de plantas DH que el pretratamiento en medio 0,4M-L, a causa de

un mayor número de plantas verdes regeneradas (Tabla 4.15), aunque esta diferencia no

fue estadísticamente significativa en Pavon.

0

10

20

30

40

0,4M-L

0,7M-S

0,4M-L

0,7M-S

Medio de Pretratamiento

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

A B

a

b

a

a

aa a

a

Fig. 4.7.- Pretratamiento de anteras en medio líquido con manitol 0,4 M y en medio sólido

con manitol 0,7 M. Número de plantas DH por 100 anteras (barras grises) y porcentaje de

duplicación cromosómica (▲), en los cultivares Pavon (A) y Caramba (B). Letras diferentes

en cada cultivar indican diferencias significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación

(rojo) y el número de plantas DH (azul).

Resultados

90

4.2.2. Pretratamiento en manitol con ayuno de nitrógeno.

La eliminación del nitrógeno del medio de pretratamiento en Caramba, redujo el

número de anteras que responden y el número de embriones casi a la mitad. Sin

embargo estas variables fueron muy similares en los dos tratamientos en Pavon. En

ausencia de nitrógeno se produjo una disminución en los porcentajes de plantas verdes

del 30 y del 40% en Pavon y Caramba, respectivamente. El número de plantas verdes

producidas en los cultivos de anteras pretratadas en ausencia de nitrógeno disminuyó de

114 a 78 en Pavon y de 74 a 24 en Caramba.

Tabla 4.16.- Pretratamiento en manitol con y sin nitrógeno. Respuesta del cultivo de anteras

en dos cultivares de trigo panadero.

ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR PRETRAT. RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%) (%)

Pavon +N 61 180 114 13 67 86 −N 60 182 78 32 59 66

Caramba +N 23 108 74 12 71 69 −N 14 55 24 13 67 50

a Valores por 100 anteras.

El ANOVA mostró efectos significativos del genotipo sobre las variables anteras

que responden, número de embriones, plantas verdes y plantas albinas (Tabla 4.17).

Como en experimentos anteriores, estas variables fueron entre 2 y 3 veces superiores en

Pavon que en Caramba (Tabla 4.18). Se encontraron diferencias significativas entre

tratamientos para las variables número de plantas verdes y plantas albinas, y porcentaje

de plantas verdes (Tabla 4.17). Al eliminar el nitrógeno del medio de pretratamiento, el

porcentaje de plantas verdes se redujo más de un 20%, y como consecuencia el número

de plantas verdes se redujo casi a la mitad, mientras que el número de plantas albinas se

duplicó (Tabla 4.19). El porcentaje de regeneración no se vio afectado por el genotipo

ni por el tratamiento (Tabla 4.17). No existieron interacciones genotipo × tratamiento

para ninguna de las variables.

Resultados

91

Tabla 4.17.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. ANOVA para las variables de respuesta

androgénica en los cultivares Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df ANTERAS

RESPONDENa EMBRIONESa PLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REG. (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Genotipo 1 103,8 *** 89974 ** 132 ** 940 * 273 ns 2599 ns

Tratamiento 1 3,1 ns 5876 ns 62 * 897 * 351 ns 3321 *

Genotipo × Tratamiento 1 0,4 ns 6521 ns 5 ns 662 ns 57 ns 4 ns

Error 33 3,5 8137 14 187 257 632

a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.18.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Separación de medias para

el factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

CULTIVAR RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a Pavon 60 a 181 a 95 a 23 a Caramba 18 b 81 b 49 b 12 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Tabla 4.19.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Separación de medias para

el factor tratamiento.

PLANTAS REGENERADAS PLANTAS VERDES.

PRETRATAMIENTO VERDES a ALBINAS a (%)

+N 96 a 12 b 78 a -N 55 b 24 a 60 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Resultados

92

No hubo cambios significativos de los porcentajes de duplicación cromosómica

entre los dos pretratamientos. Además, en los dos cultivares esta variable fue muy

similar, alrededor del 60% (Fig.4.8). En ambos genotipos hubo una disminución en el

número de plantas DH producido al utilizar el pretratamiento en ausencia de nitrógeno,

debido al menor número de plantas verdes regeneradas en este tratamiento (Tabla 4.19),

aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa en el cv Pavon.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

Con N Sin N Con N Sin N

Medio de Pretratamiento

Núm

. Pla

ntas

DH

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

Dup

licac

ión

(%)

A B

a aaa

b

a

a

a

Fig. 4.8.- Pretratamiento con y sin nitrógeno. Número de plantas DH por 100 anteras (barras

grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), producidos en los cultivares Pavon (A)

y Caramba (B). Letras diferentes en cada cultivar indican diferencias significativas (p<0,05)

para el porcentaje de duplicación (rojo) y el número de plantas DH (azul).

Resultados

93

4.2.3. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento

Se estudió la expresión de diferentes genes de trigo relacionados con la respuesta

al estrés (Tabla 3.7). Entre los genes de proteínas PR, se estudió la expresión de PR-1,

β-1,3-glucanasa (PR-2), quitinasa de tipo II (PR-3), PR-4 y Oxalato Oxidasa (OxOx)

(PR-15). Además, se estudió la expresión de una GST (glutation-S-transferasa) y de

PAL (fenilalanina-amonio-liasa). En todos los casos se analizó la cantidad de mRNA

durante el pretratamiento de las anteras y durante el desarrollo in vivo.

Durante el desarrollo in vivo, tres de las secuencias de genes PR aumentaron su

expresión en las anteras en ambos genotipos, la PR-1, la β-1,3-glucanasa y la PR-4

(Fig. 4.9). Entre ellas, el mayor aumento se produjo en la expresión de PR-1 que llegó

a aumentar con un factor de inducción (f.i.) de 25 en Caramba, y el menor aumento se

produjo en la β-1,3-glucanasa que se indujo 7 veces en Chris. La expresión de GST

durante el desarrollo de las anteras en la planta fue distinta en los dos cultivares, ya que

aumentó de forma significativa (f.i. >3) en Caramba a las 84 y 120 h de desarrollo in

vivo y disminuyó casi 5 veces en Chris a las 84 h (Fig. 4.10).

Durante el pretratamiento, se observó un rápido aumento de tres de los genes PR

estudiados: la OxOx, la quitinasa y la PR-4 (Fig. 4.9), alcanzándose un pico de máxima

expresión a las 24 h de pretratamiento en los tres casos. La OxOx fue la secuencia que

mostró mayores cambios de expresión durante el pretratamiento en ambos cultivares.

Su expresión se indujo más en Caramba que en Chris, aumentando hasta 632 y 280

veces, respectivamente. En segundo lugar, la secuencia que más aumentó su expresión

fue la quitinasa. Al contrario que la OxOx, tanto la quitinasa como la PR-4 se

indujeron más en Chris que en Caramba. La quitinasa se indujo hasta 128 veces en

Chris y 34 veces en Caramba. Por último, la expresión de PR-4 aumentó 26 veces en

Chris y 13 veces en Caramba.

Después de haber alcanzado un pico máximo a las 24 h, la transcripción de estos

genes disminuyó en ambos cultivares. En Caramba, la expresión de quitinasa y de PR-

4 disminuyó hasta recuperar su nivel basal, igual al punto 0 h y al desarrollo in vivo.

En cambio, estos genes mantuvieron factores de inducción significativos durante todo

el pretratamento en Chris. En este cultivar la expresión de quitinasa permanecía

inducida cerca de 7 veces a las 120 h de pretratamiento. La PR-4 disminuyó, después

Resultados

94

del pico de máxima expresión a las 24 h, un 65% a las 48 h y posteriormente volvió a

aumentar a las 84 h, dando lugar a un segundo pico de inducción menor que el anterior

(f.i.=19). Al finalizar el pretratamiento, la expresión de PR-4 en Chris se mantenía

inducida 8 veces sobre el punto 0 h. La expresión de OxOx disminuyó después del pico

de máxima expresión a las 24 h, pero se mantuvo inducida en ambos genotipos hasta el

final del pretratamiento (84 h y 120 h), del orden de 20 veces en Chris y cerca de 30

veces en Caramba.

Los cambios en la expresión de PR-1 y β-1,3-glucanasa durante el pretratamiento

fueron mucho menores que los de los demás genes PR (Fig. 4.9). Se encontró la

inhibición de la PR-1 a las 3 h de pretratamiento en Caramba y a las 12 h en Chris, con

factores de inducción cercanos a -4 en ambos casos. Posteriormente la expresión se

recuperó y se mantuvo igual al punto 0 h durante el resto del pretratamiento. También

se encontró la inhibición de la β-1,3-glucanasa, al igual que en el caso de la PR-1, a las

3 h en Caramba y a las 12 h en Chris, aunque esta reducción no fue significativamente

diferente del punto 0 h. La expresión de β-1,3-glucanasa aumentó significativamente

en ambos genotipos, alcanzando el máximo en Chris a las 24 h y en Caramba a las

48 h, y reduciéndose posteriormente hasta el nivel basal a las 120 h en Caramba y a las

84 h en Chris.

La expresión de GST se activó rápidamente en las anteras tras ser inoculadas en

medio de pretratamiento. La máxima expresión ocurrió en los dos cultivares a las 3 h,

alcanzando un factor de inducción de 44 en Caramba y de 19 en Chris (Fig.4.10).

Posteriormente disminuyó, alcanzando el nivel basal a las 24 h en Chris y a las 48 h en

Caramba.

El mRNA del gen PAL se mantuvo constante durante las primeras 84 h en Chris y

durante las primeras 48 h en Caramba y después su expresión se inhibió

significativamente, hasta 18 veces en Chris y hasta 15 veces en Caramba a las 120 h de

pretratamiento (Fig. 4.10). Esta fue la única secuencia en la que los mayores cambios se

produjeron durante las últimas horas del pretratamiento.

Al finalizar el pretratamiento, tan solo los genes OxOx y PAL en ambos cultivares

y quitinasa y PR-4 en Chris tenían niveles de expresión significativamente diferentes a

los del comienzo del pretratamiento.

Resultados

95

-30

-20

-10

0

10

20

30

-30

-20

-10

0

10

20

30

-20-15

-10-50

510

1520

-20-15

-10-50

510

1520

-30-101030507090

110130150

-30-101030507090

110130150

-3070

170270370470570670770870970

0 24 48 72 96 120

-3070

170270370470570670770870970

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120-3070

170270370470570670770870970

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 1200

100

200

300

400

500

600

700

0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

PR-1

quitinasa 2 (PR-3)

β-1,3-glucanasa (PR-2)

Chris Caramba

OxOx (PR-15)

PR-4

horashoras

Fig. 4.9.- Niveles de expresión de cinco genes PR, cuantificados mediante RT-PCR en

anteras de los cultivares Chris y Caramba, durante el pretratamiento de estrés ( ■■■) y durante

el desarrollo in vivo (▲).

Resultados

96

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 24 48 72 96 120-30

-20

-10

0

10

20

30

0 24 48 72 96 120-30

-20

-10

0

10

20

30

0 24 48 72 96 120-30

-20

-10

0

10

20

30

0 24 48 72 96 120

-30-20-10

0102030405060

-30-20-10

0102030405060

Chris Caramba

GST

PAL

horas horas

Fig. 4.10.- Niveles de expresión de los genes glutation-S-transferasa (GST) y fenilalanina-

amonio-liasa (PAL) cuantificados mediante RT-PCR en anteras de los cultivares Chris y

Caramba durante el pretratamiento de estrés de anteras ( ■■■) y durante el

desarrollo in vivo (▲).

Resultados

97

4.3. ADICIÓN DE POSIBLES INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS

AL MEDIO DE CULTIVO DE ANTERAS

4.3.1. Medio preacondicionado con ovarios

Se estudió el efecto de la utilización del co-cultivo con ovarios en medio

preacondicionado (OVCM) en el cultivo de anteras. El medio OVCM tuvo un efecto

muy positivo sobre el cultivo de anteras tanto en Pavon como en Caramba (Tabla 4.20).

En los dos cultivares se produjo un aumento similar, de más de 3 veces, en el número

de anteras que responden. Como consecuencia, el número de embriones, plantas verdes

y plantas albinas regeneradas se incrementó entre 3 y 22 veces. El número de plantas

verdes obtenidas aumentó de 3 a 45 en Pavon y de 5 a 18 en Caramba con la utilización

del medio OVCM.

Tabla 4.20.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

sin preacondicionar. Respuesta al cultivo en dos cultivares de trigo panadero.

MEDIO ANTERAS PLANTAS

REGENERADASa REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR INDUCCIÓN RESPONDENa EMBRIONESa VERDES ALBINAS (%) (%)

Pavon Control 11 7 3 2 47 54 OVCM 39 152 45 26 43 61 Caramba Control 5 13 5 3 58 48 OVCM 16 39 18 9 61 58

a Valores por 100 anteras.

El ANOVA mostró efectos muy significativos del tratamiento y del genotipo

sobre las variables anteras que responden, número de embriones, plantas verdes y

plantas albinas (Tabla 4.21). En el cv Pavon estas variables fueron entre 2 y 3 veces

superiores al cv Caramba. El número de plantas verdes producidas fue 2 veces superior

en Pavon que en Caramba (Tabla 4.22). La utilización de medio OVCM y del co-

cultivo con ovarios dio lugar a un número de anteras que responden casi 4 veces mayor

que el control (Tabla 4.23). Además, mejoró notablemente la formación de embriones,

que fue casi 9 veces superior al control, como se puede observar claramente en la Fig.

Resultados

98

4.11. La producción de plantas verdes y albinas aumentó más de 7 veces en el medio

OVCM respecto al control (Tabla 4.23). No hubo diferencias significativas entre

genotipos ni entre tratamientos para las variables porcentaje de regeneración y

porcentaje de plantas verdes (Tabla 4.21).

Tabla 4.21.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

sin preacondicionar. ANOVA de las variables de respuesta androgénica en los cultivares

Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df ANTERAS

RESPONDENa EMBRIONESa PLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REGENERACIÓN (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Genotipo 1 26 *** 77 *** 16 * 544 ** 1225 ns 3,6 ns

Tratamiento 1 56 *** 352 *** 105 *** 1945 *** 96 ns 1,3 ns

Genotipo × Tratamiento 1 3 ns 107 *** 22 * 649 ** 1 ns 0,8 ns

Error 30 2 6 4 51 878 2,2

a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.22.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

sin preacondicionar. Separación de medias para el factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

CULTIVAR RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a Pavon 25 a 80 a 24 a 14 a Caramba 10 b 26 b 11 b 6 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Tabla 4.23.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

sin preacondicionar. Separación de medias para el factor tratamiento.

MEDIO DE ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

INDUCCIÓN RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a Control 7 b 10 b 4 b 2 b OVCM 26 a 86 a 29 a 16 a

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Resultados

99

Fig. 4.11.- Cultivo de anteras de Pavon (30 días). Cultivo sin ovarios (A) y cultivo en medio

OVCM (B).

Se encontraron interacciones genotipo × tratamiento en las variables número de

embriones, plantas verdes y plantas albinas (Tabla 4.21), lo que significa que el cultivo

en medio OVCM afectó de forma diferente a estas variables en cada genotipo. Estas

variables aumentaron significativamente en el medio OVCM, aunque como puede

observarse en la Fig. 4.12, el número de embriones aumentó 22 veces en Pavon y tan

solo 3 veces en Caramba. El incremento producido en el número de plantas verdes y

albinas, también fue superior en el cv Pavon. Estas variables aumentaron alrededor de

13 veces en Pavon y 3 veces en Caramba con la utilización de medio OVCM.

020406080

100120140160

ControlOVCM

ControlOVCM

ControlOVCM

A B C

Núm

.

Fig. 4.12.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio

sin preacondicionar. Interacciones genotipo × tratamiento para las variables número de

embriones (A), plantas verdes (B) y plantas albinas (C) en los cultivares Pavon (▲) y

Caramba (●).

Debido al escaso número de plantas obtenidas en el cultivo sin ovarios, no se

analizaron los porcentajes de ploidía en este experimento.

Resultados

100

4.3.2. Arabinogalactanos y Proteínas de arabinogalactanos

Se estudió la posibilidad de sustituir el medio OVCM por un medio de

composición definida que contenía Larcoll y goma arábiga. La adición de Larcoll y

goma arábiga al medio de cultivo afectó de forma diferente a los cultivares Pavon y

Caramba (Tabla 4.24). En Pavon, el número de anteras que responden y de plantas

albinas fue unas 2 veces superior en estos medios en comparación con el medio

OVCM. Sin embargo, el número de embriones fue similar en los tres medios de cultivo.

En Caramba, el número de anteras que responden y de embriones se redujo a menos de

la mitad en los medios 10LG y 30LG, y no hubo cambios en el número de plantas

albinas regeneradas. En los medios con Larcoll y goma arábiga disminuyó el número de

plantas verdes regeneradas, de 18 a 3 en Pavon y de 6 a 1 en Caramba, y el porcentaje

de plantas verdes, de 83 a 26 en Pavon y de 86 a 49 en Caramba.

Se realizó el ANOVA para el conjunto de los dos genotipos (Tabla 4.25). Se

encontraron efectos muy significativos del genotipo sobre las variables anteras que

responden, número de embriones, plantas verdes y plantas albinas, que fueron más de

tres veces superiores en Pavon que en Caramba (Tabla 4.26). También se encontraron

diferencias significativas para el porcentaje de plantas verdes que fue un 33% superior

en Pavon.

Aunque no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos en el

número de embriones producidos (Tabla 4.25), en los dos cultivares se observó un

retraso en la formación de embriones en los medios 10LG y 30LG, en comparación con

el medio OVCM (Fig. 4.13). En los tratamientos con Larcoll y goma arábiga, no se

formó ningún embrión durante los primeros 28 días de cultivo y aproximadamente el

70% de los embriones se formaron a partir de los 40 días de cultivo. En cambio, en el

cultivo en medio OVCM alrededor del 75% de los embriones se formaron durante los

primeros 40 días de cultivo.

El tratamiento afectó significativamente el número de plantas verdes regeneradas

y el porcentaje de plantas verdes (Tabla 4.25). Los contrastes ortogonales revelaron que

existieron diferencias entre los medios con Larcoll y goma arábiga y el medio OVCM

en las variables número de plantas verdes, plantas albinas y porcentaje de plantas

verdes. No hubo diferencias entre las dos concentraciones utilizadas de Larcoll y goma

arábiga (10 mg/l y 30 mg/l) en ninguna de las variables del cultivo.

Resultados

101

Tabla 4.24.- Cultivo en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio con

Larcoll y goma arábiga a concentraciones de 10 mg/l (10LG) y 30 mg/l (30LG). Respuesta al

cultivo de anteras de dos cultivares de trigo panadero.

MEDIO DE ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR INDUCCIÓN RESPONDENa EMBRIONESa VERDES ALBINAS (%) (%)

Pavon OVCM 20 28 18 4 77 83 10LG 38 27 6 11 63 26 30LG 31 22 3 9 52 26

Caramba OVCM 13 11 6 1 61 86 10LG 6 3 1 1 56 58 30LG 4 4 1 1 48 49

a Valores por 100 anteras.

Tabla 4.25.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga a

concentraciones de 10mg/l (10LG) y 30mg/l (30LG). ANOVA de las variables de respuesta

androgénica en los cultivares Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df ANTERAS

RESPONDENa EMBRIONESaPLANTAS VERDESa

PLANTAS ALBINASa

REG. (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Genotipo 1 96,1 *** 87,4 *** 16,7 ** 29,9 *** 772,9 ns 3675,4 **

Tratamiento 2 1,3 ns 1,2 ns 10,7 ** 2,1 ns 1275,1 ns 8410,7 ***

10LG-30LG 1 1,9 ns 0,0 ns 0,2 ns 0,1 ns 671,5 ns 106,7 ns

LG-OVCM 1 0,6 ns 2,3 ns 21,2 ** 4,0 * 1796,7 ns 16685,7 ***

Genotipo × Tratamiento 2 12,0 ** 1,7 ns 1,7 ns 2,3 ns 134,7 ns 669,2 ns

Error 48 1,9 3,8 1,8 0,7 577,3 472,2 a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

Tabla 4.26.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga. Separación de

medias para el factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

PLANTAS VERDES

CULTIVAR RESPONDEN a EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%)

Pavon 30 a 26 a 9 a 8 a 64 a Caramba 8 b 6 b 3 b 1 b 43 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Resultados

102

28d 40d 60d28d 40d 60d

30LG10LG

OVCM 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Núm

. Em

brio

nes

Días de cultivo

AB

Fig. 4.13.- Cultivo de anteras en medio OVCM (barras amarillas) y en medio con Larcoll y

goma arábiga a concentraciones de 10 mg/l (barras moradas) y 30 mg/l (barras azules).

Embriones extraídos a los 28, 40 y 60 días del inicio del cultivo en los genotipos Pavon (A) y

Caramba (B).

Tabla 4.27.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga. Separación de

medias para el factor tratamiento.

MEDIO DE PLANTAS REGENERADAS PLANTAS VERDES

CULTIVO VERDES a ALBINAS a (%)

OVCM 13 a 2 b 84 a LG 3 b 6 a 35 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

La utilización de medio con Larcoll y goma arábiga afectó negativamente el

número de plantas verdes, que se redujo 4 veces respecto del medio OVCM, y el

porcentaje de plantas verdes, que se redujo en un 60% (Tabla 4.27, Fig. 4.14).

Resultados

103

El número de plantas albinas producidas fue superior en los medios 10LG y 30LG

que en el OVCM. El porcentaje de regeneración no se vio afectado por el genotipo ni

por el medio de cultivo utilizado (Tabla 4.25). La interacción genotipo × tratamiento

fue significativa para la variable número de anteras que responden. La adición de

Larcoll y goma arábiga al medio de cultivo produjo efectos opuestos sobre esta

variable, ya que produjo un aumento de hasta 2 veces en Pavon y en cambio disminuyó

esta variable entre 2 y 3 veces en Caramba (Fig. 4.15).

Fig. 4.14.- Cultivo en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y en medio con Larcoll

y goma arábiga a concentraciones de 10 mg/l (10LG) y 30 mg/l (30LG). Plantas del cv Pavon

regeneradas en medio J25-8.

05

1015202530354045

OVCM 10LG 30LG

Núm

.

Fig. 4.15.- Cultivo de anteras en medio preacondicionado con ovarios (OVCM) y

en medio con Larcoll y goma arábiga. Interacciones genotipo × tratamiento para

la variable número de anteras que responden en los cultivares Pavon (▲) y

Caramba (●).

OVCM 10LG 30LG

Resultados

104

El porcentaje de plantas DH no se analizó en el cv Caramba porque el número de

plantas verdes regeneradas en los medios 10LG y 30LG fue muy bajo. En el cv Pavon

el porcentaje de duplicación cromosómica fue muy superior en las plantas verdes

regeneradas del medio OVCM (60%) que en los medios 10LG y 30LG, y entre éstos no

se observó ninguna diferencia (17%) (Fig. 4.16). Como consecuencia del menor

número de plantas verdes regeneradas y de la menor frecuencia de duplicación

cromosómica en los medios de cultivo 10LG y 30LG, en estos tratamientos se produjo

un número significativamente inferior de plantas DH que en el medio OVCM (Fig.

4.16).

0

2

4

6

8

10

12

14

OVCM 10LG 30LG

Medio de Cultivo

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

a

b b

a

bb

Fig. 4.16.- Cultivo en medio OVCM y en medio con Larcoll y goma arábiga a

concentraciones de 10 mg/l y 30 mg/l. Número de plantas DH por 100 anteras (barras

grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), producidos en el cv Pavon. Letras

diferentes en cada cultivar indican diferencias significativas (p<0,05) para el porcentaje de

duplicación (rojo) y el número de plantas DH (azul).

Resultados

105

4.3.3. Alcoholes butílicos

El efecto del n-butanol sobre el cultivo de anteras se estudió en dos experimentos.

En el primero se aplicaron dos concentraciones de n-butanol (0,1% y 0,2%) y se

compararon con cultivos control. Se observó que ambas concentraciones de n-butanol

mejoraban la respuesta al cultivo, aumentando tanto el número de anteras que

responden como el número de microsporas que dividen y duplicando el número de

embriones formados en ambos genotipos (Tabla 4.28). Además, la adición de n-butanol

no produjo efectos negativos sobre las variables porcentaje de regeneración ni

porcentaje de plantas verdes en ninguno de los dos cultivares, e incluso mejoró

ligeramente el porcentaje de plantas verdes, del 70 hasta el 82-86% en Pavon. En

consecuencia, los tratamientos con 0,1 y 0,2% de n-butanol aumentaron unas 2 veces el

número de plantas verdes regeneradas en ambos genotipos (de 121 a 300 en Pavon y de

46 a 90 en Caramba).

En el segundo experimento se aplicaron otros alcoholes butílicos para comprobar

la especificidad de los efectos producidos por el n-butanol. El tratamiento con sec- y

tert-butanol, no produjo cambios en el número de anteras que responden ni en ninguna

otra variable, en ninguno de los genotipos (Tabla 4.29). El n-butanol en este caso

produjo resultados muy similares al experimento anterior, mejorando la respuesta al

cultivo y la producción de plantas verdes, que aumentó 5 veces (de 23 a 130) en Pavon

y más de tres veces (de 52 a 169) en Caramba, respecto al control.

El ANOVA se realizó para el conjunto de los dos genotipos. En los dos

experimentos se encontraron diferencias muy significativas entre los genotipos para las

variables anteras que responden, número de divisiones, embriones y plantas verdes

(Tabla 4.30). Además, en el primer experimento el genotipo también afectó las

variables porcentaje de regeneración y porcentaje de plantas verdes. Sin embargo, el

comportamiento de los genotipos no fue el mismo en los dos experimentos. Como en

resultados obtenidos anteriormente, en el experimento 1 el número de anteras que

responden y de embriones fue más del doble en Pavon que en Caramba y el número de

plantas verdes fue 3 veces superior en Pavon (Tabla 4.31). Sorprendentemente, en el

experimento 2 los resultados fueron muy superiores en Caramba, ya que en este

experimento el número de anteras que responden y de embriones producido fue 2 veces

Resultados

106

superior, y el número de plantas verdes superó en un 60% al número de plantas verdes

obtenido en Pavon (Tabla 4.32).

Tabla 4.28.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Respuesta al cultivo de anteras

de dos cultivares de trigo panadero.

n-BUTANOL ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR (%) RESPONDENa DIVISIONESa EMBRIONESa VERDESa ALBINASa (%) (%)

Pavon 0 54 447 237 121 45 67 70 0,1 81 1044 456 300 47 75 86 0,2 80 1148 457 283 53 72 82

Caramba 0 23 327 94 46 23 58 68 0,1 42 587 173 89 39 66 63 0,2 46 635 186 90 37 62 68

a Valores por 100 anteras.

Tabla 4.29.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Respuesta al cultivo de

anteras de dos cultivares de trigo panadero.

ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR BUTIL-OH RESPONDENa DIVISIONESa EMBRIONESa VERDESa ALBINASa (%) (%)

Pavon Control 11 109 63 23 25 78 44 n- 31 507 250 130 68 77 54 Sec- 14 118 80 23 35 68 29 Tert- 10 101 53 20 20 77 42

Caramba Control 30 546 154 52 58 71 45 n- 58 1224 330 169 67 70 68 Sec- 31 572 152 44 55 63 41 Tert- 32 665 167 47 73 67 35

a Valores por 100 anteras.

Resultados

107

Tabla 4.30.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol (Exp. 1) tratamiento con 0,2%

(v/v) de n-, sec-, y tert- butanol (Exp. 2). ANOVA para las variables de respuesta

androgénica en los cultivares Pavon y Caramba.

CUADRADOS MEDIOS

FUENTE df ANTERAS

RESPONDENa DIVISIONESa EMBRIONESaPLANTAS VERDESa

REGENERACIÓN (%)

PLANTAS VERDES

(%)

Exp. 1:

Genotipo 1 168,4 *** 1885,5 *** 1067,7 *** 889,8 *** 1174,7 * 2237,7 *

Tratamiento 2 23,2 * 728,5 *** 243,5 *** 183,8 *** 270,6 ns 327,6 ns

Genotipo ×Tratamiento 2 0,2 ns 74,2 ns 3,6 ns 17,2 ns 5,9 ns 565,2 ns

Bloque 1 3,1 ns 1079,2 *** 200,4 *** 167,5 *** 2604,0 ** 82,9 ns

Error 58 3,3 79,5 14,4 14,0 269,1 242,6

Exp. 2:

Genotipo 1 98,5 *** 3861,9 *** 458,1 *** 142,1 ** 771,6 ns 330,1 ns

Tratamiento 3 80,6 *** 800,6 *** 314,2 *** 220,3 *** 327,5 ns 2298,1 **

Genotipo ×Tratamiento 3 2,1 ns 33,2 ns 17,0 ns 0,9 ns 16,0 ns 421,2 ns

Error 76 3,4 69,6 25,6 15,4 218,9 491,5

a Valores por 100 anteras. ns, *, **, ***: p>0,05, p<0,05, p<0,001, y p<0,0001 respectivamente.

El tratamiento con n-butanol produjo diferencias significativas en el número de

anteras que responden, divisiones, embriones y plantas verdes en ambos experimentos

(Tabla 4.30). Cuando se estudió el efecto del tratamiento con diferentes alcoholes

butílicos (Exp. 2) se encontraron efectos significativos del tratamiento sobre las mismas

variables, y además, sobre la variable porcentaje de plantas verdes. En ninguno de los

dos experimentos el tratamiento con alcoholes butílicos afectó los porcentajes de

regeneración.

Resultados

108

Tabla 4.31.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Separación de medias para el

factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS REG. PLANTAS VERDES

CULTIVAR RESPONDEN a DIVISIONESº EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%) (%) Pavon 73 a 893 a 388 a 236 a 49 a 71 a 79 a Caramba 33 b 517 b 151 b 75 b 33 b 66 b 67 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Tabla 4.32.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Separación de medias

para el factor genotipo.

ANTERAS PLANTAS REGENERADAS

CULTIVAR RESPONDEN a DIVISIONESº EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a Pavon 16 b 209 b 112 b 49 b 5 b Caramba 38 a 752 a 201 a 78 a 8 a

a Valores por 100 anteras. Las letras indican la separación de medias en cada variable (p<0,05).

Tabla 4.33.- Tratamiento con 0, 0,1 y 0,2% (v/v) de n-butanol. Separación de medias para el

factor tratamiento.

n-BUTANOL (%)

ANTERAS RESPONDEN a DIVISIONESº EMBRIONES a

PLANTAS VERDES a

0 40 b 400 b 174 b 88 b 0,1 62 a 844 a 330 a 205 a 0,2 63 a 923 a 336 a 197 a

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

Resultados

109

Tabla 4.34.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Separación de medias

para el factor tratamiento.

ALCOHOL ANTERAS PLANTAS

REGENERADAS PLANTAS

VERDES

BUTÍLICO RESPONDEN a DIVISIONESº EMBRIONES a VERDES a ALBINAS a (%)

Control 17 b 255 b 93 b 33 b 36 b 45 ab n-butanol 40 a 746 a 277 a 143 a 68 a 59 a Sec-butanol 17 b 289 b 91 b 29 b 38 b 39 b Tert-butanol 19 b 269 b 104 b 30 b 42 b 34 b

a Valores por 100 anteras. Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes (p<0,05).

No se observaron diferencias entre las dos concentraciones de n-butanol

utilizadas, 0,1 y 0,2% (Tabla 4.33). Ambas produjeron una mejora de la respuesta de las

anteras, que aumentó un 50% respecto del control. Como puede observarse en la

Fig. 4.18, el número de divisiones y de embriones en estos tratamientos se duplicó

respecto del control en ambos genotipos. Como consecuencia, el número de plantas

verdes producido por 100 anteras aumentó de 88 en el control hasta alrededor de 200 en

los tratamientos con n-butanol (Tabla 4.33). Sin embargo, el número de plantas albinas

regeneradas no aumentó en estos tratamientos.

Las separaciones de medias de los tratamientos con n-, sec- y tert-butanol

indicaron que no existieron diferencias entre el control y los alcoholes sec- y tert-

butanol en ninguna de las variables estudiadas (Tabla 4.34). El sec- y el tert-butanol

mostraron diferencias significativas con el n-butanol en el porcentaje de plantas verdes,

que fue un 66% superior en el tratamiento con n-butanol. En comparación con el

control, el n-butanol duplicó el número de anteras que responden, y triplicó el número

de divisiones y de embriones (Fig. 4.19). Además, produjo un gran incremento en el

número de plantas verdes regeneradas, que aumentó más de 4 veces, de 33 en el control

a 143 en el tratamiento con n-butanol (Tabla 4.34). En menor proporción que las

plantas verdes, también aumentó la producción de plantas albinas en este experimento,

que fue 2 veces superior al control en el tratamiento con n-butanol.

Resultados

110

Durante las primeras horas del cultivo se producen altas tasas de mortalidad entre

las microsporas. Para descartar que el aumento en el número de divisiones producido en

los tratamientos con n-butanol pudiera deberse a un efecto sobre la mortalidad de las

microsporas, se hizo un recuento de la viabilidad con FDA a las 48 h de cultivo, en los

tratamientos con diversos alcoholes butílicos. En este recuento no se detectaron

diferencias significativas en los porcentajes de microsporas viables entre el control y

los tratamientos con n-, sec- y tert-butanol (Fig. 4.17) (datos del ANOVA no

mostrados).

Fig. 4.17.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Porcentaje de microsporas

viables (verde) a las 48h de cultivo. Letras diferentes indican diferencias significativas

(p<0,05).

0% 20% 40% 60% 80% 100%

tert-butanol

sec-butanol

n-butanol

Control

Viabilidad

a

a

a

a

Resultados

111

0 0,1 0,2

n-butanol (%)

Fig. 4.18.- Tratamiento con 0,1% y 0,2% (v/v) de n-butanol. Embriones y estructuras

formadas a los 28 días de cultivo en dos cultivares de trigo panadero.

Control Sec-butanol Tert-butanol n-butanol

Fig. 4.19.- Tratamiento con diferentes isómeros de alcohol butílico al 2% (v/v). Embriones y

estructuras formadas a los 28 días de cultivo en dos cultivares de trigo panadero.

1 cm

Pavon

Caramba

Pavon

Caramba

Resultados

112

Generalmente, el porcentaje de duplicación cromosómica fue ligeramente inferior

en los tratamientos con n-butanol que en el control y en los tratamientos con sec- y tert-

butanol (Fig. 4.20 y 4.21). Sin embargo, tan solo se encontraron diferencias

significativas estadísticamente en esta variable entre el control (61%) y el tratamiento

con n-butanol (38%) para Pavon, en el experimento con diversos alcoholes butílicos

(Fig. 4.21). Los porcentajes de duplicación cromosómica obtenidos en los tratamientos

con sec- y tert- butanol fueron similares al control.

Los tratamientos con n-butanol produjeron un número significativamente superior

de plantas DH, como consecuencia del mayor número de plantas verdes producidas en

estos tratamientos (Tablas 4.33 y 4.34). En el cv Caramba, el número de plantas DH

producido en los tratamientos con n-butanol fue 2 veces superior al control en ambos

experimentos, aumentando de 16 hasta 36 (Fig. 4.20) y de 27 a 60 (Fig. 4.21). En el cv

Pavon, el número de plantas DH se incrementó un 67% (de 59 a 99) en los tratamientos

con 0,1 y 0,2% de n-butanol (Fig. 4.20) y aumentó casi 4 veces (de 13 a 48 plantas DH)

en el tratamiento con n-butanol en el experimento 2 (Fig. 4.21).

Las plantas DH del cv Pavon se desarrollaron en el invernadero de manera similar

a las plantas producidas en las placas control. No se observaron diferencias en su

morfología ni en la fecha de espigado. Los porcentajes de formación de grano de las

espigas varió entre el 80% y el 91%, independientemente del tratamiento del que

provenían las plantas.

Resultados

113

0

20

40

60

80

100

120

0 0,1 0,2 0 0,1 0,2n-butanol (% )

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

A Ba

a

b

b

a a

a

a

a

a

a a

Fig. 4.20.- Tratamiento con 0,1% y 0,2% (v/v) de n-butanol. Número de plantas DH por 100

anteras (barras grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), producidos en los

cultivares Pavon (A) y Caramba (B). Letras diferentes en cada cultivar indican diferencias

significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación (rojo) y el número de plantas DH

(azul).

0

20

40

60

80

Contro

l n-Sec- Tert

-

Contro

l n-Sec- Tert

-

Núm

. Pla

ntas

DH

0

25

50

75

100

Dup

licac

ión

(%)

A B

a

a

bb

b

bbbb

a

a

a a a a

a

Fig. 4.21.- Tratamiento con 0,2% (v/v) de n-, sec-, y tert- butanol. Número de plantas DH por

100 anteras (barras grises) y porcentaje de duplicación cromosómica (▲), producidos en los

cultivares Pavon (A) y Caramba (B). Letras diferentes en cada cultivar indican diferencias

significativas (p<0,05) para el porcentaje de duplicación (rojo) y el número de plantas DH

(azul).

115

5. DISCUSIÓN

La embriogénesis de la microspora tiene el potencial de producir un número muy

elevado de plantas DH, por lo que cada vez es mayor el número de especies cultivadas

en las que se han utilizado las técnicas de cultivo de anteras o microsporas. En trigo

panadero, se han optimizado protocolos de producción de plantas a partir de cultivares

modelo para androgénesis. Sin embargo, todavía sigue siendo un reto la obtención de

plantas verdes en cultivares de media y baja respuesta androgénica, entre los cuales se

encuentran la mayoría de cultivares de interés agronómico. El objetivo principal de esta

tesis ha sido aumentar la eficiencia de la embriogenesis gamética en este tipo de

materiales. En este trabajo se ha utilizado el cv Chris, que es un cultivar modelo para

androgénesis, el cv Pavon que es un cultivar ampliamente utilizado como parental de

nuevas variedades y que presenta una respuesta androgénica media y el cultivar de

interés agronómico Caramba, que presenta una respuesta baja. Nos hemos centrado en

la optimización de tres de las fases limitantes del proceso, la duplicación cromosómica,

el pretratamiento de estrés necesario para que las microsporas abandonen su patrón de

desarrollo hacia polen y la inducción de embriogénesis durante el cultivo in vitro.

5.1. DUPLICACIÓN CROMOSÓMICA

5.1.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los

estomas

Entre los métodos directos de determinación del nivel de ploidía, la citometría de

flujo es el más rápido y sencillo. Otro método directo para determinar la ploidía es la

realización de controles cromosómicos, pero éste es un método laborioso y requiere una

gran inversión de tiempo. Al comienzo de esta tesis, no disponíamos de un citómetro de

flujo en nuestro laboratorio, por lo que la determinación del nivel de ploidía se realizó

en el Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales (UPNA-CSIC) en Pamplona,

mediante un citómetro de flujo de tipo PA (Partec). Aunque este método es el más

rápido, requería un desplazamiento, lo que hacía necesario acumular muestras de

plantas en diferentes estadios de desarrollo para hacer este tipo de análisis. Es necesario

distinguir las plantas haploides en estadios muy tempranos del desarrollo, ya que la

Discusión

116

duplicación con colchicina es más efectiva en plantas en el estadio de 3-4 hojas como

se observó en el apartado 4.1.2.

Se ha descrito que hay criterios morfológicos que pueden asociarse a la dotación

cromosómica de la planta, como la longitud de las células guarda de los estomas y el

número de cloroplastos en dichas células (Borrino y Powell 1988, Wang 1998,

Aryavand et al. 2003). La longitud de las células guarda es un parámetro fácil de medir,

ya que la preparación de muestras de epidermis de trigo para su observación en el

microscopio es rápida y no necesita tinción, por lo que se decidió estudiar la posibilidad

de utilizar este parámetro como método indirecto de determinación del nivel de ploidía

de las plantas regeneradas.

En la parte adaxial de las hojas la frecuencia estomática es superior que en la

parte abaxial y existe menos variabilidad (Teare et al. 1971), por lo que las mediciones

se realizaron siempre en esta parte de la hoja. Los resultados obtenidos en el presente

trabajo indican que la longitud de los estomas es similar en plantas al comienzo del

ahijamiento y en plantas al comienzo del encañado. Además, no se encontraron

diferencias entre plantas procedentes del cruzamiento 40xS83 y del cv Chris. La

longitud media de los estomas de las plantas DH analizadas en este trabajo, fueron algo

superiores (69 µm) a los obtenidos en dos especies hexaploides de trigo (58 y 67 µm)

por Rajendra et al. (1978). De las plantas H analizadas en el presente trabajo, no hubo

ninguna que presentara valores superiores a 60 µm. Además, el número de plantas DH

con valores iguales o inferiores a 60 fue muy bajo, el 5%. Por tanto, se estableció que

todas aquellas plantas producidas con una longitud media de los estomas igual o

inferior a 60 µm se sometieran a tratamientos de duplicación cromosómica para

asegurar que no se dejaran plantas H sin tratar. Estos resultados indican que la longitud

de los estomas permite distinguir las plantas H y DH.

5.1.2. Tratamientos diploidizantes en planta

Los métodos de duplicación cromosómica mediante inmersión de la raíz y vial

invertido están siendo utilizados rutinariamente por diferentes laboratorios, por ejemplo

el método de inmersión de la raíz en Florimont Desprez (Devaux, comunicación

personal) y el método del vial invertido en el Centro de Agricultura Sostenible (CSIC,

Córdoba) (Ballesteros et al. 2005). En este trabajo el tratamiento de las plantas H

mediante el método de inmersión de la raíz resultó en general más efectivo que el

Discusión

117

método del vial invertido, ya que se obtuvieron porcentajes elevados de plantas

duplicadas (50-93% dependiendo del cruzamiento) y no se produjo mortalidad en las

plantas tratadas. Teniendo en cuenta estos resultados, el método de inmersión de la raíz

es el que se está utilizando en planta en nuestro laboratorio, con una concentración de

colchicina de 0,1% durante 5 h. Además, el método del vial invertido presenta varias

desventajas. La duración del tratamiento y la concentración utilizada de colchicina

suele ser mayor en este método que en el método de inmersión de la raíz. Además es

mucho más laborioso y requiere una mayor manipulación de la colchicina. Sin

embargo, el método del vial invertido puede ser muy útil para tratar las plantas H que

han llegado a la etapa de espigado sin ser duplicadas, sobre todo cuando se utilizan

genotipos recalcitrantes en los que es más difícil la obtención de plantas verdes. La

utilización de un tratamiento con colchicina al 0,15% durante 48 h, fue el que produjo

los porcentajes más altos de plantas duplicadas (70%) y menos efectos nocivos sobre

las plantas.

5.1.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in vitro

Esta es la primera vez que se estudia el efecto de la incorporación de colchicina

en el medio de pretratamiento en manitol sobre el proceso de inducción de

androgénesis. El pretratamiento de anteras de trigo en manitol a 4ºC retrasa la división

nuclear de manera que la mayoría de las microsporas se encuentran en estado

uninucleado al final del pretratamiento, y al mismo tiempo produce un aumento del

número de plantas verdes (Hu y Kasha 1999). La colchicina tiene un efecto inhibitorio

sobre la formación del huso acromático, por lo que produce la acumulación de células

en mitosis (Eigsti y Dustin 1955). Por lo tanto la aplicación de colchicina durante el

pretratamiento podría retrasar la división produciendo un aumento del número de

plantas verdes. Sin embargo, en este trabajo solo aumentó el número de plantas verdes

producidas cuando se añadió 300 mg/l de colchicina en el genotipo Pavon. La

incorporación de colchicina durante el pretratamiento de frío en maíz mejoró la

respuesta androgénica sin afectar al porcentaje de duplicación cromosómica (Antoine-

Michard y Beckert, 1997). Sin embargo, nuestros resultados muestran un aumento

significativo del porcentaje de duplicación en el cv Caramba con 300 mg/l de

colchicina, mientras que esta misma concentración produjo una disminución de la

Discusión

118

duplicación en Pavon. Esto indica que los efectos de la colchicina sobre la producción

de plantas verdes y sobre los porcentajes de duplicación son dependientes del genotipo.

Cuando la colchicina se aplicó en el medio de inducción, sus efectos sobre el

número de embriones y sobre el porcentaje de plantas verdes dependió del genotipo y

del método de cultivo. En el cultivo de microsporas la colchicina mejoró ambas

variables, únicamente en el cv Pavon. En el cultivo de anteras, la colchicina no tuvo

ningún efecto sobre estas variables en ninguno de los dos genotipos utilizados. Se han

encontrado aumentos de la embriogénesis en cultivo de microsporas de Brassica (Zhou

et al. 2002a,b), mientras que en cultivo de microsporas de trigo no se observó este

efecto (Hansen y Andersen 1998). En el cultivo de anteras de trigo se han descrito tanto

efectos promotores de la embriogénesis (Barnabás et al. 1991) como efectos tóxicos

(Navarro-Álvarez et al. 1994; Redha et al. 1998a,b). La diferencia entre estos estudios

podría explicarse por los diferentes genotipos utilizados. También se encontraron

efectos tóxicos de la aplicación de colchicina en el cultivo de anteras de híbridos F1 de

trigo duro × blando (Tersi et al. 2006). La estimulación de la embriogénesis se ha

observado también en arroz y maíz (Alemanno y Guiderdoni 1994, Obert y Barnabás

2004).

Se han propuesto diferentes mecanismos por los que la colchicina podría tener

efectos positivos sobre la embriogénesis, como el aumento de las divisiones simétricas

(Szakacs y Barnabás 1995), la represión de la síntesis de tubulinas específicas de polen

(Cleveland et al. 1983, Carpenter et al. 1992) y la reestructuración del citoesqueleto

(Shariatpanahi et al. 2006a).

En trigo se han descrito efectos negativos de la colchicina sobre el porcentaje de

plantas verdes cuando se aplica en el cultivo de microsporas (Hansen y Andersen 1998)

y efectos tanto negativos como positivos cuando se aplica en el cultivo de anteras

(Barnabás et al. 1991, Redha et al. 1998a,b, Zamani et al. 2000). Se ha propuesto que la

colchicina podría producir una reducción de las anormalidades en el DNA cloroplástico

(Aubry et al. 1989), o una eliminación selectiva de las microsporas con anormalidades

(Barnabás et al. 1991), aumentando los porcentajes de plantas verdes.

En este trabajo, la aplicación de colchicina durante las primeras horas del cultivo

de anteras o de microsporas, aumentó significativamente los porcentajes de duplicación

en todos los genotipos, lo cual está de acuerdo con otros resultados obtenidos en trigo,

tanto en cultivo de anteras (Barnabás et al. 1991, Navarro–Álvarez et al. 1994, Redha et

Discusión

119

al. 1998a,b, Zamani et al. 2000, Zhou et al., 2002a,b), como de microsporas (Hansen y

Andersen 1998) y también en otras especies como maíz (Saisingtong et al. 1996,

Barnabás et al. 1999), triticale (Arzani y Darvey 2001) y Brassica (Möllers et al. 1994,

Hansen y Andersen 1996, Zhou et al. 2002a,b). Las tasas de duplicación cromosómica

aumentaron más pronunciadamente en Pavon y en la línea DH24033 que en Chris. La

variación genotípica también se ha descrito previamente en trigo (Barnabás 2003,

Zamani et al. 2003) y en Brassica (Möllers et al. 1994, Weber et al. 2005). Las

diferencias entre genotipos podrían estar relacionadas con las diferentes cinéticas de la

división mitótica en cultivo (Zaki and Dickinson 1991).

En los tratamientos aplicados se debe llegar a un compromiso entre la

concentración de colchicina utilizada y la duración del tratamiento. Las concentraciones

superiores a 120 mg/l, aplicadas durante 48 h en el cultivo de microsporas (Hansen and

Andersen 1998) y concentraciones entre 100-200 mg/l durante 72 h en cultivo de

anteras (Navarro-Álvarez et al. 1994, Redha et al.1998a), produjeron aumentos de los

porcentajes de duplicación pero también redujeron la embriogénesis y/o la regeneración

de plantas verdes en trigo. En este trabajo, las concentraciones utilizadas no tuvieron

efectos negativos, e incluso se produjeron efectos positivos sobre los parámetros del

cultivo. Esto sugiere que concentraciones mayores de colchicina podrían ser evaluadas

para producir un mayor número de plantas DH.

Los incrementos producidos en los porcentajes de duplicación fueron inferiores en

el cultivo de anteras que en el cultivo de microsporas de Pavon (51 y 76%

respectivamente con 300 mg/l de colchicina). Por otro lado, los efectos positivos sobre

la embriogénesis y el porcentaje de plantas verdes producidos por la colchicina en el

cultivo de microsporas de Pavon no se observaron en el cultivo de anteras de este

mismo cultivar. Esta variación de los efectos producidos por la colchicina entre los dos

métodos de cultivo podría deberse a que se utilizaron microsporas en diferentes

estadios de desarrollo, o a que la pared de la antera pudiera actuar como un filtro

(Pulido et al. 2005), evitando en cierta medida la penetración de la colchicina. En este

caso, deberían utilizarse mayores concentraciones en el cultivo de anteras que en el

cultivo de microsporas para observar los mismos efectos.

Los efectos negativos producidos en Chris y Pavon por la manipulación de las

microsporas durante el tratamiento, aun sin haber añadido colchicina, también se han

descrito con anterioridad en trigo (Hansen y Andersen 1998) y en Brassica (Hansen y

Discusión

120

Andersen 1996, Zhao et al. 1996b). Sin embargo, en este trabajo también se observó

que la manipulación durante el tratamiento aumentó tres veces el número de embriones

producido en la línea DH24033. Este efecto puede deberse a una alta mortalidad de las

microsporas de esta línea durante las primeras 48 h de cultivo, de manera que los

lavados podrían eliminar sustancias tóxicas liberadas por microsporas muertas o

dañadas. Estos resultados estarían de acuerdo con Fletcher et al. (1988) y Zhou et al.

(2002b), que encontraron que un cambio del medio de inducción 15-24 h después del

aislamiento de microsporas, era esencial para permitir que los embriones de Brassica

iniciaran su crecimiento y se desarrollaran con normalidad.

La incorporación de colchicina durante las primeras horas del cultivo de anteras o

microsporas aumentó el número de plantas DH obtenidas en comparación con los

controles tratados, en dos cultivares y una línea DH, mientras que la aplicación de

colchicina durante el pretratamiento de estrés tan solo aumentó el número de plantas

DH producidas en uno de los dos cultivares utilizados. La aplicación de colchicina

durante las primeras horas de cultivo parece, por tanto, más efectiva que la aplicación

durante el pretratamiento. La colchicina se utilizó con éxito tanto en cultivo de anteras

como en cultivo de microsporas, en genotipos con porcentajes de duplicación

intermedios o bajos. Estos resultados apoyan la introducción de esta metodología en

programas de mejora de trigo.

5.2. PRETRATAMIENTO DE ESTRÉS

5.2.1. Optimización del medio de pretratamiento

La aplicación de un pretratamiento de estrés es esencial para que la microspora

abandone la ruta gametofítica (Muñoz-Amatriaín et al. 2006). Éste es un factor

determinante en la eficiencia de producción de plantas, que afecta a diversas variables

del cultivo. De los distintos tipos de pretratamiento, los más ampliamente utilizados en

trigo han sido el pretratamiento de las espigas a 4ºC y el pretratamiento de las anteras

en manitol. Frecuentemente se ha utilizado una concentración de manitol de 0,3 M ó

0,4 M en medio líquido en ausencia de otros azúcares (Lazar et al. 1990, Hu et al. 1995,

Gustafson et al. 1995, Indrianto et al. 1999, Hu y Kasha 1999).

En este trabajo hemos estudiado el efecto de una concentración de manitol mayor

a las que normalmente se utilizan. La utilización de diferentes potenciales osmóticos

Discusión

121

durante el pretratamiento en manitol se ha estudiado con anterioridad en el cultivar

modelo de cebada Igri (Hoekstra et al. 1993, Wojnarowiez et al. 2004). Hoekstra et al.

(1993) observaron que el aumento del potencial osmótico hasta 440 mOs/Kg tenía un

efecto positivo sobre el número de embriones producidos, mientras que Wojnarowiez et

al. (2004) obtuvieron valores óptimos de plantas verdes a 300 mOs/Kg, aunque no se

apreciaron grandes diferencias entre 300 y 480 mOs/Kg. En nuestro trabajo en trigo, se

aplicó un estrés osmótico muy superior al utilizado por estos autores (805 mOs/Kg en

el medio manitol 0,7 M). Este medio de pretratamiento aumentó significativamente

tanto el número de embriones como el número de plantas verdes regeneradas en dos

cultivares distintos, en comparación con el pretratamiento en manitol 0,4 M (532

mOs/Kg). Esto se tradujo en un aumento de las plantas DH, aunque este aumento no

fue estadísticamente significativo en el cv Pavon.

Nuestros resultados indican que no sólo es importante el estrés por inanición

producido por el manitol, sino que el estrés osmótico también tiene una gran

importancia en la desdiferenciación de la microspora en trigo. Estos resultados no se

habían descrito previamente en trigo, aunque sí se habían obtenido resultados similares

en nuestro laboratorio en cebada (Cistué et al. 1994). En el sistema de producción de

plantas DH establecido en nuestro grupo para cebada, se utiliza el medio de

pretratamiento con manitol 0,7 M solidificado con 8 g/l de agarosa. Se ha observado

que este pretratamiento produce un aumento de la embriogénesis, así como un aumento

en el número y en el porcentaje de plantas verdes en genotipos de diferente respuesta

androgénica, en comparación con el medio 0,4 M (Cistué et al. 1994). La adición de

agarosa al medio produce un cambio mínimo en el potencial osmótico (George y

Sherrington 1984). En cebada, se observó que la adición o no de agarosa (8 g/l) al

medio de pretratamiento no tenía ningún efecto sobre las variables del cultivo (Cistué et

al. 1994). En este trabajo se ha escogido la utilización de medio solidificado con

agarosa, ya que permite seleccionar y recoger mucho más fácilmente las anteras que

han respondido al pretratamiento que el medio líquido. Además, las contaminaciones

son más probables cuando se maneja medio líquido.

La utilización de manitol produjo el aumento de los porcentajes de duplicación

cromosómica en trigo al ser utilizado junto con pretratamientos de frío o calor

(Indrianto et al. 1999) y cebada (Li y Devaux 2003). En este trabajo, la utilización de

una concentración alta de manitol no ha ejercido ningún efecto sobre la duplicación

Discusión

122

cromosómica, por lo que el efecto del manitol sobre esta variable parece no depender

de la concentración utilizada.

Frecuentemente en cebada se ha utilizado el pretratamiento en manitol en

ausencia de macronutrientes (Cistué et al. 2003, Kasha et al. 2003, Jacquard et al. 2003)

o en presencia de CaCl2 (Cistué et al. 2005). El ayuno de nitrógeno adicionalmente al

de carbono se ha utilizado en tabaco (Kyo y Harada 1986, Zarsky et al. 1992) y también

en trigo (Touraev 1996a, Zheng et al. 2003), en presencia de macronutrientes. Sin

embargo, no conocemos estudios en los que se haya evaluado el efecto específico de la

ausencia de nitrógeno. La deficiencia de nitrógeno causa grandes cambios, tanto en el

metabolismo del nitrógeno como en el del carbono, y afecta en particular a la cantidad

de aminoácidos y proteínas (Scheible et al. 2004). Por tanto, sería esperable que

produjera la degradación de proteínas específicas de la ruta gametofítica y ayudara a un

cambio en el patrón de desarrollo. Sin embargo, en este trabajo no se ha producido el

efecto inductor de la embriogénesis que podría esperarse, y sí un efecto negativo sobre

el porcentaje de plantas verdes en ambos genotipos. Esto hizo que en el pretratamiento

sin nitrógeno se redujera casi a la mitad el número de plantas verdes producidas,

mientras que el número de plantas albinas aumentó.

La disminución en el porcentaje de plantas verdes podría ser debida a cambios en

los cloroplastos, ya que en varias especies se ha observado que la deficiencia de

nitrógeno produce grandes cambios en la ultraestructura de los cloroplastos, como la

reducción de los tilacoides y del contenido de clorofila, y la acumulación de almidón

(Doncheva et al. 2001, Sinetova et al. 2006, Gaude et al. 2007).

En genotipos recalcitrantes de trigo se ha observado que la disponibilidad de

macronutrientes durante el pretratamiento puede ser necesaria para que se induzca la

división y la embriogénesis en microsporas (Hu et al. 1995) y para mejorar la calidad

de los embriones y el porcentaje de plantas verdes (Liu et al. 2002a). Nuestros

resultados mostraron que en el cultivar Caramba el pretratamiento en presencia de

nitrógeno produjo, además, un mayor número de anteras que responden y de embriones,

que aumentaron un 64% y un 96% respectivamente. Esto podría indicar la necesidad de

un aporte suficiente de nutrientes para mejorar la respuesta de genotipos más

recalcitrantes, de acuerdo con los resultados de Hu et al. (1995) y de Liu et al. (2002a).

El nitrógeno es un componente estructural primordial, además de ser importante para el

crecimiento y la morfogénesis (George y Sherrington 1984). Por otro lado, un aporte

Discusión

123

suficiente de nitrógeno parece importante para mantener los cultivos celulares en un

estado desdiferenciado (George y Sherrington 1984). Nuestros resultados podrían

indicar que en trigo, el efecto beneficioso de los macronutrientes en el medio de

pretratamiento podría, en gran parte, deberse a la disponibilidad de nitrógeno.

5.2.2. Estudio de la expresión de genes relacionados con estrés durante el

pretratamiento

En este trabajo se ha estudiado la expresión de genes relacionados con la

respuesta al estrés en dos cultivares de trigo blando, el cultivar modelo de alta respuesta

androgénica Chris y el cv Caramba, que presenta una respuesta media-baja.

Algunas proteínas PR aumentaron su expresión durante el desarrollo in vivo de las

anteras, para dar lugar a polen. En ambos genotipos aumentó la transcripción de PR-1,

β-1,3-glucanasa (PR-2) y PR-4 a las 120 h de desarrollo de las anteras en la planta.

Frecuentemente se ha encontrado que las plantas presentan un mayor nivel de

resistencia a medida que avanza su desarrollo, y las proteínas PR son uno de los

factores importantes en este fenómeno que se ha denominado resistencia asociada a la

edad (“age-related resistance”) (Allen et al. 1983, Memelink et al. 1990). Además, se

conoce la expresión de genes PR a lo largo del desarrollo del polen, incluyendo las

proteínas PR-1 y β-1,3-glucanasa (van Loon et al. 2006).

Durante el pretratamiento de estrés, los cambios de expresión fueron muy

similares en los dos cultivares. En ambos se encontró la inducción de OxOx, quitinasa,

PR-4 y GST y la inhibición del gen PAL. Además, en ambos cultivares se observaron

picos de máxima expresión de GST a las 3 h, y de OxOx, quitinasa y PR-4 a las 24 h de

pretratamiento. Estos resultados indican que los cambios transcripcionales producidos

por el estrés en las anteras ocurren rápidamente y están de acuerdo con los resultados

obtenidos en cebada por Jacquard (2007).

El gen OxOx fue el que más aumentó su expresión durante el pretratamiento. Se

encontraron diferencias importantes entre los cultivares ya que la inducción de OxOx

fue más de 2 veces superior en Caramba que en Chris. Al finalizar el pretratamiento, la

expresión de OxOx era 20 y 28 veces superior al punto 0 h en Chris y Caramba,

respectivamente. La inducción de OxOx se asocia a la respuesta al estrés y al ataque de

patógenos (Wei et al. 1998, Bernier y Berna 2001), pero también está asociada al

comienzo de la germinación de embriones de trigo, por lo que reciben el nombre de

Discusión

124

germinas (Lane 1991, Lane et al. 1993). La actividad oxalato oxidasa (OxOx) cataliza

la oxidación del oxalato produciendo H2O2 (EC 1.2.3.4), que representa una de las

principales fuentes de especies reactivas del oxígeno (ROS) (Caliskan et al. 2004).

Además de cumplir una función directamente antimicrobiana (Neill et al. 2002) la

producción intracelular de H2O2 tiene un efecto promotor de la embriogénesis, y se ha

observado que el tratamiento con H2O2 extracelular también tiene este efecto en Lycium

barbarum (Kairong et al. 1999). La inducción de OxOx se ha descrito durante la

embriogénesis somática en trigo (Caliskan et al. 2004) y coníferas (Domon et al. 1995,

Mathieu et al. 2006). Se ha propuesto que podría intervenir en la adaptación a cambios

osmóticos y la expansión celular durante la embriogénesis (Domon et al. 1995), ya que

el H2O2 es necesario en las modificaciones de la pared (Lane 2002). Podría estar

relacionada con el aumento de tamaño que se observa en las microsporas al adquirir

potencial embriogénico (Indrianto et al. 2001).

A diferencia del gen OxOx, la expresión de quitinasa se indujo casi 4 veces más

en el cultivar con mayor respuesta androgénica Chris que en Caramba, y al finalizar el

pretratamiento se mantuvo inducida casi 7 veces en Chris. Las quitinasas catalizan la

hidrólisis de la quitina (E.C.3.2.1.14), un polímero de N-acetil-glucosamina que, junto

con el glucano, es un componente mayoritario de las paredes celulares de la mayoría de

los hongos (Bartnicki-Garcia 1968). La inducción de la expresión de quitinasa se ha

observado tras el pretratamiento de estrés en microsporas embriogénicas de tabaco

(Hosp et al. 2007). Estudios en embriogénesis somática de otras especies han

relacionado la actividad de estos enzimas con la capacidad embriogénica. En zanahoria,

la quitinasa EP3 fue capaz de restituir la capacidad embriogénica de un mutante

sensible a la temperatura (Kragh et al. 1996) y además, aumentó el efecto promotor de

la embriogénesis de las AGPs (van Hengel et al. 1998). Recientemente, se ha

encontrado que una proteína similar a la EP3 de zanahoria sirve como marcador de

embriogénesis en suspensiones celulares de Dactylis glomerata (Tchorbadjieva y

Pantchev 2006). Se demostró que el sustrato de quitinasas en planta son las AGPs,

glucoproteínas muy frecuentes en los tejidos vegetales, ya que contienen residuos de N-

acetil-D-glucosamina (van Hengel et al. 2001). La actividad reguladora del desarrollo

de las quitinasas seguramente implica la producción de oligosacáridos capaces de

estimular respuestas en las células vegetales, como ocurre en el caso de los factores de

Discusión

125

nodulación de Rhizobium y de los quitooligosacáridos liberados de las paredes fúngicas

(Brunner et al. 1998, Cullimore et al. 2001, Kasprzewska 2003).

En coincidencia con nuestros resultados, a lo largo del pretratamiento en manitol

de dos cultivares de cebada se observó la inducción de la expresión de quitinasa y

OxOx (Jacquard 2007). Es interesante destacar que la expresión de OxOx se indujo

más durante las primeras horas en el cultivar de menor respuesta androgénica Cork,

mientras que la inducción de quitinasa fue superior en el cultivar modelo en

androgénesis, Igri. Sin embargo, a diferencia de nuestros resultados en trigo, en cebada

estos genes se indujeron de forma progresiva a lo largo del pretratamiento.

Al contrario que en el cultivar Caramba, la PR-4 se mantuvo elevada en Chris

durante todo el pretratamiento, mostrando un segundo pico de expresión a las 84 h y al

finalizar el pretratamiento se mantuvo inducida 8 veces en Chris. Aunque las proteínas

de la familia PR-4 (wheatwins) fueron clasificadas como quitinasas, todavía no se ha

determinado su mecanismo de acción. Recientemente, se ha identificado en trigo una

proteína PR-4 con actividad ribonucleasa (Caporale et al. 2004). La expresión de

proteínas PR-4 de trigo está regulada por el desarrollo y aumenta en respuesta a altas

temperaturas (Altenbach et al. 2007). Puesto que los mayores niveles de transcritos

coinciden con el proceso de PCD en el endospermo, y al menos una de estas proteínas

tiene actividad RNAsa, se ha propuesto que estas proteínas podrían tener un papel

importante poniendo fin a procesos metabólicos determinados (Altenbach et al. 2007).

La expresión de GST fue la que más rápidamente alcanzó su pico máximo (3 h) y

la primera en recuperar el nivel basal (24 h). Las glutation-S-transferasas (GSTs)

catalizan la unión entre el glutation reducido y una gran variedad de sustratos

electrofílicos (E.C. 2.5.1.18.). Muchas GSTs se expresan en respuesta a ROS y tienen

una función detoxificadora de los productos de peroxidación de la membrana y de

xenobióticos (Ulmasov et al. 1995, Marrs 1996). La rápida inducción de la expresión de

GST en nuestro trabajo podría ser provocada por el estrés producido en la extracción de

las anteras, y no por un efecto específico del pretratamiento. Esta rápida inducción

también apoyaría su papel como generador de señales (Dixon et al. 2002, Moon 2005),

como se ha observado en embriogénesis somática de trigo (Singla et al. 2007). La

expresión de varios miembros de GSTs es inducida durante el pretratamiento en cebada

(Vrinten et al. 1999, Maraschin et al. 2006, Muñoz-Amatriaín et al. 2006) y Brassica

(Joosen et al. 2007) y también durante la embriogénesis somática en varias especies

Discusión

126

(Nagata et al. 1994, Galland et al. 2001, Thibaud-Nissen et al. 2003). Este enzima

podría actuar sobre el estado redox del glutation, el cual se ha observado que interviene

en el desarrollo embriogénico de microsporas de Brassica napus (Belmonte et al.

2006).

El gen de β-1,3-glucanasa (PR-2) analizado en este estudio aumentó ligeramente

su expresión durante el pretratamiento de las anteras. Las β-1,3-glucanasas catalizan la

hidrólisis del β-1,3-glucano (E.C. 3.2.1.39), que es un componente mayoritario de las

paredes celulares de los hongos (Bartnicki-Garcia 1968). El polímero de β-1,3-glucano

(o callosa) es también un componente de la pared vegetal durante momentos

determinados del desarrollo. Aparece por ejemplo durante la citocinesis y frente a

agresiones o heridas, además de durante la formación del grano de polen (Verma y

Hong 2001). Existen diferentes isoformas de β-1,3-glucanasas que se expresan de

forma específica en diferentes tejidos e intervienen en procesos como la división

celular, el crecimiento del tubo polínico, la formación de semilla, la dormancia y la

movilización de reservas del endospermo de cereales (Hird et al. 1993, Leubner-

Metzger y Meins 1999). Anteriormente se habían identificado β-1,3-glucanasas en

microsporas embriogénicas de maíz (Borderies et al. 2004) así como durante la

embriogénesis somática de cebada y de un híbrido del genero Cichorium (Kragh et al.

1991, Helleboid et al. 1998).

Por otro lado, se ha estudiado la expresión de genes relacionados con la respuesta

sistémica adquirida (SAR). La inducción del gen PAL analizado en este trabajo

(AY005474) se ha asociado con la respuesta SAR mediada por SA (Roy-Barman et al.

2006). Además codifica para el primer enzima en la ruta de síntesis de SA, considerado

esencial en la inducción de SAR en muchas plantas. La expresión de PAL se mantuvo

constante durante las primeras 48 h de pretratamiento y posteriormente disminuyó,

reduciéndose hasta 18 veces en Chris y 14 veces en Caramba a las 120 h. Esto parece

señalar la ausencia de respuesta mediada por SA durante las primeras horas y muy

probablemente una disminución en la producción de SA al final del pretratamiento.

Esta idea estaría apoyada por la falta de cambios importantes en la expresión de PR-1,

que se ha utilizado frecuentemente como marcador de SAR (Pritsch et al. 2001).

Los cambios de OxOx y PAL están de acuerdo con un estudio previo del

transcriptoma en anteras pretratadas de cebada (Muñoz-Amatriaín et al. 2006). Tras

96 h en manitol 0,7 M, se observó la inducción de 4 genes de OxOx y de 6 genes de

Discusión

127

proteínas tipo OxOx, y la inhibición de 6 genes de PAL (Muñoz-Amatriaín et al. 2006

−datos suplementarios−). En cebada se observó el aumento de la expresión de PR-1

(Muñoz-Amatriaín et al. 2006, Jacquard 2007), y se correlacionó una mayor expresión

de β-1,3-glucanasa y de GST después del pretratamiento de estrés con una mejor

respuesta androgénica (Muñoz-Amatriaín 2007). Sin embargo, en nuestros resultados

en trigo no se indujo la expresión de PR-1 y no se observó una mayor expresión de

β-1,3-glucanasa y de GST en el cultivar modelo Chris que en el cultivar de baja

respuesta Caramba. Estas diferencias pueden deberse a la existencia de diferentes

genes en cada especie que pueden responder a diferentes estímulos, como se ha

observado para las proteínas PR-1 en Arabidopsis y arroz (van Loon et al. 2006,

Mitsuhara et al. 2008).

5.3. ADICIÓN DE POSIBLES INDUCTORES DE EMBRIOGÉNESIS

AL MEDIO DE CULTIVO DE ANTERAS

5.3.1. OVCM y las fuentes de arabinogalactanos Larcoll y goma arábiga

La utilización de medio preacondicionado ha sido ampliamente estudiado en el

cultivo de microsporas de trigo. De los diferentes explantes utilizados, los ovarios son

los que han dado mejores resultados. En el cultivo de microsporas de trigo, en ausencia

de ovarios solamente es posible obtener embriones de genotipos con muy buena

respuesta (Mezja et al. 1993, Hu y Kasha 1997a, Puolimatka and Pauk 1999, Zheng et

al. 2002, Liu et al. 2002b). Éste ha sido el primer estudio sobre el co-cultivo con

ovarios en cultivos de anteras. Su utilización mejoró la respuesta al cultivo,

aumentando significativamente el número de embriones. Esto se tradujo en un aumento

en la producción de plantas verdes, que superó al control sin ovarios, más de 3 veces en

Caramba y 15 veces en Pavon.

Se sabe que los péptidos y carbohidratos secretados durante el cultivo son factores

importantes que afectan a la división y muerte celular, así como a la embriogénesis y

organogénesis (Paire 2003). Entre estas sustancias, los arabinogalactanos (AGs) tienen

especial importancia, ya que impidiendo su síntesis se inhibe también la formación de

embriones a partir de microsporas de maíz. Esta deficiencia de proteínas de

arabinogalactanos (AGPs), fue compensada efectivamente con la adición de goma

arábiga al medio de cultivo (Borderies et al. 2004).

Discusión

128

Las AGPs son una clase de proteoglucanos que se encuentra en las paredes

celulares, membranas plasmáticas y en la matriz extracelular. Están involucradas en los

procesos de proliferación celular, expansión celular, embriogénesis y muerte celular

(Majewska-Sawka and Nothnagel 2000). El mecanismo por el que las AGPs son

capaces de inducir embriogénesis probablemente implica la liberación de

oligosacáridos a partir de los arabinogalactanos, mediante la acción de enzimas

diversos (Pilling and Höfte 2003). Aunque no se conocen las sustancias liberadas por

los ovarios que son determinantes en la inducción de androgénesis en trigo, se ha

propuesto que la adición de arabinogalactanos podría evitar la necesidad de utilizar el

co-cultivo con ovarios, consiguiéndose además medios más definidos (Letarte et al.

2006).

La incorporación de AGs (Larcoll) redujo la mortalidad de las microsporas de

trigo durante los primeros días de cultivo (Letarte et al. 2006). La adición de Larcoll y

goma arábiga al cultivo de microsporas en presencia de ovarios aumentó la producción

de plantas verdes. En ausencia de ovarios, consiguieron obtener un número reducido de

plantas verdes del cultivar modelo Chris (10 plantas por espiga, aproximadamente 5

plantas por 100 anteras) mediante la adición de goma arábiga (10 ó 100 mg/l). En

nuestros resultados en cultivo de anteras, la adición de Larcoll y goma arábiga permitió

obtener un número de embriones que no fue significativamente diferente del obtenido

con OVCM, en genotipos de media o baja respuesta. Sin embargo, el mayor número de

plantas verdes se obtuvo en medio OVCM, gracias principalmente al mayor porcentaje

de plantas verdes frente a albinas en ambos genotipos. El aumento del albinismo en los

medios que contenían Larcoll y goma arábiga podría estar relacionado con el gran

retraso que sufrió la formación de embriones en estos tratamientos (Fig. 4.13), dado que

el porcentaje de plantas albinas aumenta al prolongarse la duración del cultivo de

microsporas (Cistué et al. 1995).

Las proteínas de arabinogalactanos (AGPs) son específicas de diferentes tejidos y

estadios de desarrollo vegetales. Su cantidad, así como su composición puede variar

entre diferentes líneas celulares (Showalter 2001). Knox et al. (1989) demostraron la

existencia de polimorfismos en las AGPs y Pennell et al. (1992) encontraron una

correlación entre el nivel de células reactivas a anticuerpos contra el epítopo de

arabinogalactanos JIM8, y la cantidad de embriones formados. Sin embargo,

descubrieron que la mayoría de los embriones procedían de células no reactivas, lo que

Discusión

129

demostró que en el cultivo había células con una función acondicionadora. En el caso

de la inducción de androgénesis en trigo, podríamos considerar que esta función la

realizan los ovarios en cultivo.

La goma arábiga y el Larcoll son fuentes de AGs provenientes de Acacia Senegal

y Larix Occidentales, respectivamente (Clarke et al. 1979), por lo que quizá no sean lo

suficientemente específicas para ser utilizadas en cultivos de anteras de trigo. Las AGPs

purificadas de suspensiones celulares embriogénicas de zanahoria, incluso en

concentraciones nanomolares, fueron capaces de inducir embriogénesis en células no

embriogénicas de esta misma especie (Kreuger y Van Holst 1993, Kreuger y Van Holst

1995). Por tanto, la especificidad de las AGPs puede tener gran importancia en el

control de diferentes procesos morfogénicos y además, es posible que sea la

combinación de diferentes AGPs la que determine el potencial embriogénico (Chugh y

Khurana 2002). La utilización de otras fuentes de AGPs más adecuadas podría permitir

la formación de embriones de calidad y reducir las tasas de albinismo producidas por el

Larcoll y la goma arábiga en el cultivo de anteras de trigo.

Por otro lado, en Pavon se observaron unas tasas de duplicación cromosómica

muy inferiores en los medios con Larcoll y goma arábiga, en comparación con el medio

OVCM. Este fenómeno podría estar relacionado con cambios producidos en el

citoesqueleto, ya que recientemente se ha revelado que la alteración de la localización

de las AGPs en la superficie celular, produce la desorganización de los microtúbulos

corticales (Sardar et al. 2006, Nguema-Ona et al. 2007). La utilización de sustancias

capaces de desestructurar los microtúbulos corticales, como el n-butanol, puede

producir la reducción del porcentaje de duplicación cromosómica (ver apartado 5.3.2.).

Discusión

130

5.3.2. Alcoholes butílicos

Esta es la primera vez que se estudian los efectos del n-butanol sobre la inducción

de androgénesis. Los resultados obtenidos sugieren que esta sustancia es capaz de

aumentar el número de microsporas que entran en la ruta esporofítica, como muestran

los aumentos en el número de anteras que responden, el número de divisiones y la

formación de embriones. El recuento de microsporas viables después del tratamiento

demuestra que las mayores tasas de división y formación de embriones no son debidas

a un aumento de la viabilidad.

Los efectos producidos por el n-butanol fueron específicos, ya que no se

observaron al aplicar otros isómeros del butanol. De los diferentes alcoholes butílicos

utilizados, el n-butanol es el único capaz de desestructurar los microtúbulos corticales

(Dhonukshe et al. 2003, Gardiner et al. 2003, Hirase et al. 2006), lo que apoyaría la

hipótesis de que esta capacidad del n-butanol es responsable de la mejora en la

respuesta al cultivo. Este resultado es acorde con la capacidad de estimular la

embriogénesis de algunas sustancias antitubulínicas aplicadas en cultivos de anteras y

de microsporas de trigo (apartado 4.1.3.2, Castillo et al. 2008), así como de otras

especies como café y Brassica (Herrera et al. 2002, Zhou et al. 2002a,b). En algunos

casos, el tratamiento con n-butanol produjo mejoras en los porcentajes de plantas

verdes, un efecto también observado en algunos trabajos en los que se ha utilizado

colchicina (Barnabás et al. 1991, Redha et al. 1998a,b, Zamani et al. 2000).

Al contrario de lo que ocurre con las sustancias antitubulínicas, el tratamiento con

n-butanol no produjo el aumento de los porcentajes de duplicación, probablemente,

porque la actividad del n-butanol sobre el citosqueleto solamente afecta a los

microtúbulos corticales (Dhonukshe et al. 2003). Se ha visto que estos microtúbulos, y

no solo los que forman el huso acromático, intervienen en el proceso de división

asimétrica, típica de la primera división mitótica en el desarrollo del polen (Tanaka e

Ito 1981). Los porcentajes de duplicación cromosómica producidos en los tratamientos

con n-butanol fueron ligeramente inferiores a los controles, aunque tan solo hubo

diferencias significativas en Pavon. Se ha propuesto que la fusión nuclear es el

principal mecanismo de duplicación espontánea en microsporas de cebada (Kasha et al.

2001, González-Melendi et al. 2005) y maíz (Testillano et al. 2004), y se ha observado

que los tratamientos que bloquean la formación de la pared durante las primeras

Discusión

131

divisiones celulares pueden producir altas frecuencias de duplicación (Shim et al.

2006). En consecuencia, la causa de que el n-butanol produzca frecuencias ligeramente

inferiores de duplicación podría deberse a que ocurre una citocinesis completa tras el

tratamiento o, más probablemente, a que la desestructuración de los microtúbulos

corticales interfiere con la fusión nuclear.

En los tratamientos con n-butanol los embriones se desarrollaron a densidades de

cultivo más altas, debido al aumento en el número de divisiones y de embriones. En

este tratamiento se observó que el tamaño de los embriones era ligeramente inferior a

los tratamientos control (datos no mostrados). Aunque un menor tamaño de los

embriones se ha relacionado con menores porcentajes de regeneración y con mayores

porcentajes de plantas albinas en cebada y en trigo (Roberts-Oehlschlager y Dunwell

1990, Kunz et al. 2000), estas dos variables no se vieron afectadas por el n-butanol, e

incluso se observaron algunas mejoras en los porcentajes de plantas verdes.

El n-butanol es un conocido activador de la fosfolipasa D (PLD). Además, puede

sustituir la molécula de H2O que la PLD necesita como sustrato, dando lugar a la

formación de fosfatidil-butanol y reduciendo así parte del ácido fosfatídico (PA)

producido por este enzima (Dawson 1967; Yang et al. 1967). De los tres alcoholes

butílicos utilizados en este trabajo, tan solo el n-butanol puede servir de sustrato a la

PLD (Munnik et al. 1995), lo que podría implicar una disminución en los niveles de

PA, que actúa como mensajero secundario en muchos procesos celulares (Laxalt y

Munnik 2002, Wang et al. 2006).

Tratamientos con n-butanol al 0,35-0,75% bloquearon el crecimiento del tubo

polínico en tabaco, y éste pudo ser reiniciado tras la aplicación externa de PA (Potocký

et al. 2003). La aplicación de taxol también permitió superar la inhibición producida

por el n-butanol, lo que indica que el papel de la PLD en la germinación del polen

podría estar relacionado con la regulación del citosqueleto. En los trabajos de Thiery et

al. (2004) en Arabidopsis y de Navari-Izzo et al. (2006) en trigo duro, tras la aplicación

de n-butanol al 0,5% y al 0,2% respectivamente, se encontró que el aumento en

fosfatidilbutanol no estaba acompañado por una disminución significativa de los

niveles celulares de PA. Sin embargo, aunque las concentraciones de n-butanol que se

utilizaron en este trabajo fueron bajas, debemos tener en cuenta que la reducción de los

niveles de PA podría ser responsable de los efectos producidos por el n-butanol sobre la

embriogénesis de la microspora.

Discusión

132

Se ha propuesto que la PLD podría establecer una conexión entre los estímulos

externos y la señalización intercelular mediante la producción de PA y la interacción

con el citosqueleto (Munnik y Musgrave 2001). La actividad de la PLD se ha asociado

con el estrés hiperosmótico y el exceso de cobre en trigo duro (Komis et al. 2006,

Navari-Izzo et al. 2006), y con la respuesta al frío en trigo blando (Skinner et al. 2005).

El pretratamiento de estrés es uno de los requerimientos más importantes para la

inducción de androgénesis en microsporas. El frío y el ayuno han sido los

pretratamientos más utilizados en trigo (para revisión ver Maluszynski et al. 2003). Por

tanto, sería de especial interés estudiar el papel de este enzima en la regulación del

citosqueleto y la morfogénesis, especialmente durante el proceso de inducción de

embriogénesis en microsporas.

Discusión

133

5.4. DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS FUTURAS

Los tratamientos diploidizantes con colchicina tanto en planta como in vitro,

permiten aumentar las tasas de duplicación cromosómica, una de las fases limitantes en

el proceso de producción de plantas DH de trigo. El desarrollo de protocolos eficientes

de duplicación cromosómica es esencial para poder utilizar las técnicas de producción

de plantas DH de trigo en programas de mejora. Para conseguir resultados óptimos es

aconsejable combinar los tratamientos in vitro con los tratamientos en planta. Esto es

especialmente interesante cuando se trabaja con genotipos de baja respuesta

androgénica. El éxito en la duplicación cromosómica por ambos métodos requiere un

compromiso entre la concentración de colchicina utilizada y la duración del

tratamiento. Además, en los tratamientos en planta es importante que las plantas se

encuentren en un estadio de desarrollo temprano.

De los métodos de aplicación in vitro, la aplicación de colchicina durante las

primeras horas de cultivo fue más efectiva que la aplicación durante el pretratamiento.

La colchicina aplicada en el medio de inducción aumentó el número de plantas DH en

dos cultivares y una línea DH, mientras que la aplicación durante el pretratamiento sólo

consiguió aumentar el número de plantas DH producidas en uno de los tres cultivares

utilizados. Los métodos de aplicación durante el cultivo podrían mejorarse mediante la

modificación del procedimiento de aplicación en el cultivo de microsporas y mediante

la aplicación de tratamientos más largos o con mayores concentraciones de colchicina,

en el cultivo de anteras. La aplicación de la colchicina durante el cultivo de anteras

aumentó los porcentajes de duplicación, aunque no llegaron a ser tan elevados como los

del cultivo de microsporas. Además, se evitaron los efectos negativos de la

manipulación durante los lavados que se presentaron cuando se aplicó en el cultivo de

microsporas. La ausencia de efectos negativos cuando se aplicó la colchicina durante el

cultivo de anteras parece indicar que la utilización de concentraciones mayores de

colchicina todavía podrían mejorar los resultados obtenidos.

Puesto que la utilización de diferentes pretratamientos puede afectar a la

duplicación cromosómica (Kasha 2005), los mecanismos por los que esto ocurre y la

aplicación de sustancias diploidizantes durante el pretratamiento deberían ser

estudiados con más detalle. Por otro lado, la duplicación cromosómica es altamente

dependiente del genotipo, por lo que sería interesante realizar estudios moleculares para

Discusión

134

aumentar el conocimiento sobre los genes que intervienen en este proceso y su

regulación.

En esta tesis también se ha estudiado otra de las fases limitantes en la producción

de plantas DH, que es la utilización de un pretratamiento de estrés para conseguir que

las microsporas abandonen la ruta gametofítica. Por un lado, la utilización de una

concentración elevada de manitol (0,7 M) permitió aumentar la producción de

embriones y por otro lado, el pretratamiento en presencia de nitrógeno dio como

resultado un mayor porcentaje de plantas verdes en cultivares con media y baja

respuesta. Estas mejoras produjeron el aumento del número de plantas DH en ambos

genotipos, si bien solamente fue significativo en el cultivar con peor respuesta

androgénica, Caramba. Esto demuestra que en genotipos más recalcitrantes el

pretratamiento de estrés es un factor crítico en la inducción de androgénesis y que las

modificaciones en esta fase pueden mejorar la producción de plantas de este tipo de

genotipos.

El pretratamiento de estrés induce cambios en las microsporas que hacen posible

el abandono de la vía de desarrollo gametofítica. Los mecanismos de defensa que se

inducen tienen un papel clave para permitir que esto ocurra, y que un gran número de

microsporas sean posteriormente capaces de dividirse y seguir una vía esporofítica

durante el cultivo in vitro. Recientemente, se ha estudiado el transcriptoma de

microsporas y anteras de cebada pretratadas en manitol (Maraschin et al. 2006, Muñoz-

Amatriaín et al. 2006). Especialmente, el trabajo de Muñoz-Amatriaín et al. (2006)

estudió los cambios producidos por un pretratamiento muy similar al utilizado en este

trabajo. Se estudió la expresión génica de anteras una vez finalizado el pretratamiento,

cuando las microsporas ya habían abandonado su vía de desarrollo hacia polen. Nuestro

trabajo en trigo ha estudiado los cambios que se producen en la antera en las primeras

etapas de la respuesta al estrés. Esto ha demostrado ser importante en trigo, ya que las

mayores variaciones observadas en la expresión ocurren durante las primeras horas de

pretratamiento.

En el trabajo de Jacquard (2007) también se analizó la expresión de genes

relacionados con estrés a lo largo del pretratamiento en manitol en cebada. Se observó

que los mayores cambios de expresión ocurren durante las primeras 48 h de

pretratamiento, pero a diferencia de nuestro trabajo en trigo, los niveles de inducción de

la OxOx, la quitinasa, la PR-4 y GST se mantuvieron hasta el final del pretratamiento.

Discusión

135

Es interesante destacar que coincidiendo con nuestros resultados en trigo, la inducción

de quitinasa y PR-4 fue superior en el cultivar modelo de androgénesis que en el

cultivar de peor respuesta androgénica. En el trabajo de Jacquard (2007) la expresión de

PAL no disminuyó durante el pretratamiento, sino que aumentó. Este aumento fue

significativamente superior en el cultivar de peor respuesta androgénica Cork, en

comparación con el cultivar modelo Igri.

En nuestro trabajo, la inhibición del gen PAL comenzó cuando el tejido de la

pared de la antera ya estaba casi completamente degenerado. Esto podría indicar el

abandono por parte de la microspora del patrón de desarrollo gametofítico, ya que el

gen PAL codifica el primer enzima en ruta de síntesis los fenilpropanoides, necesarios

para la síntesis de esporopolenina y el desarrollo del polen (van der Meer et al. 1992,

Matsuda et al. 1996). También podría deberse a la degeneración de la pared de la antera

durante el pretratamiento. Por tanto, queda pendiente comprobar si los cambios de

expresión ocurren en las microsporas o tan solo en los tejidos esporofíticos que las

envuelven, ya que al finalizar el pretratamiento (120 h) tan solo se encontraron

diferencias en la expresión de OxOx y PAL en ambos genotipos y de quitinasa y PR-4

en Chris.

Para que ocurra la inducción de embriogénesis en el cultivo de microsporas de

trigo, es esencial la utilización de medio preacondicionado (Hu y Kasha 1997a, Liu et

al. 2002b). Los resultados obtenidos en esta tesis indican que el co-cultivo con ovarios

es también esencial para aumentar la eficiencia en el caso del cultivo de anteras. Sin

embargo, sería conveniente identificar compuestos químicos que permitieran sustituir la

presencia de ovarios en el medio, lo que permitiría reducir enormemente el material

vegetal necesario y además disponer de medios de cultivo con una composición

química definida. La utilización de Larcoll y goma arábiga permitió obtener un número

de embriones equiparable al cultivo con ovarios, pero las plantas regeneradas

presentaron altas tasas de albinismo y una muy baja frecuencia de duplicación

cromosómica, por lo que debería estudiarse la utilización de fuentes de AGs más

específicas.

Curiosamente, se encontraron interacciones significativas genotipo × tratamiento

al añadir AGPs al medio de cultivo (apartado 4.3.2), en las que se observa claramente

como el número de anteras que responden aumentó en Pavon, mientras que disminuyó

en Caramba, que es un cultivar de menor respuesta androgénica (Fig. 4.15). También

Discusión

136

cuando se utilizó medio OVCM (apartado 4.3.1) existieron interacciones genotipo ×

tratamiento, en las que se observa que el incremento del número de embriones y del

número de plantas verdes producido por el medio OVCM es mucho menor en el cv

Caramba que en Pavon (Fig. 4.12). Es interesante observar que la inducción de la

expresión de quitinasa durante el pretratamiento fue muy inferior en el cv Caramba que

en el cv de alta respuesta Chris. Estos resultados sugieren que la peor respuesta del cv

Caramba al cultivo en presencia de ovarios y su peor respuesta a la adición de

arabinogalactanos al medio de cultivo, podrían estar relacionados con la menor

capacidad del cv Caramba para hidrolizar las AGPs mediante la acción de quitinasas.

La embriogénesis puede ser inducida por sustancias antitubulínicas como la

colchicina (apartados 1.5.1.4 y 1.6.1.2). La mayor desventaja de los tratamientos con

este tipo de sustancias, son la toxicidad y la dependencia del genotipo (Navarro-Álvarez

et al. 1994; Zamani et al. 2003). El n-butanol no se había aplicado anteriormente en la

inducción de androgénesis, aunque sí se había demostrado su capacidad para

desestructurar los microtúbulos corticales en células vegetales. La respuesta al

tratamiento con esta sustancia fue muy significativa, aumentando la respuesta al cultivo

(anteras que responden, divisiones y embriones) y la producción de plantas DH. La

respuesta fue similar en los dos cultivares utilizados en este estudio, Pavon y Caramba,

mientras que estos mismos genotipos mostraron diferente respuesta al tratamiento con

colchicina durante el cultivo de microsporas (apartado 4.1.3.2). Además, la viabilidad

de las microsporas no se vio afectada por el tratamiento con n-butanol, ni se observaron

otro tipo de efectos nocivos. En el futuro, puede suponer un gran avance ampliar la

utilización de esta sustancia en la producción de plantas DH de otras especies.

Los tratamientos con colchicina y con n-butanol durante las primeras horas de

cultivo in vitro nos han permitido mejorar dos de las fases limitantes de la androgénesis

en trigo: la duplicación de la dotación cromosómica para obtener plantas fértiles y la

inducción de la ruta esporofítica en las microsporas para dar lugar a la formación de

embriones. Además, la utilización combinada de las dos sustancias, n-butanol y

colchicina, tiene el potencial de producir un elevado número de embriones con la

dotación cromosómica duplicada, por lo que la combinación de estos tratamientos

debería ser estudiada.

En los trabajos de Hu (1986) y de Hu y Kasha (1997a) se observaron mayores

índices de embriogénesis y una más rápida regeneración de plantas en cultivo de

Discusión

137

microsporas que en cultivo de anteras del cv de trigo Chris. En cambio, nuestros

resultados muestran resultados muy superiores en el cultivo de anteras. En el apartado

4.1.3. se obtuvieron 4 y 7 plantas verdes por 100 anteras en los cultivos de microsporas

control del cv Pavon. En el cultivo de anteras de Pavon en ausencia de OVCM también

se produjeron 7 plantas verdes. En cambio, los resultados obtenidos en los tratamientos

control a lo largo de esta tesis muestran resultados muy superiores, de entre 18 y 117

plantas verdes por 100 anteras, gracias a la utilización de medio preacondicionado.

Además, la utilización del cultivo de anteras en lugar del cultivo de microsporas nos ha

permitido disponer de un mayor número de réplicas utilizando una cantidad menor de

anteras, aumentando la reproducibilidad de los experimentos y reduciendo los riesgos

de contaminación por ser menor la manipulación.

Los factores ambientales tienen efectos importantes sobre la respuesta

androgénica, ya que afectan a la fisiología de las plantas donantes de anteras (Bjørnstad

et al. 1989). En el cultivo de microsporas de cebada, se ha observado que existen

grandes variaciones estacionales (Ritala et al. 2001) y diferencias entre cada siembra

(Cho 1991), en plantas cultivadas en cámaras de crecimiento. Aunque las plantas

utilizadas en este trabajo se cultivaron bajo condiciones controladas de luz, humedad y

temperatura, los experimentos se llevaron a cabo en diferentes estaciones del año. La

variación estacional y factores como la irrigación o el estado fitosanitario pueden

generar variaciones en el estado fisiológico de las anteras, y de los ovarios utilizados

para el co-cultivo y que son cruciales para una buena respuesta en trigo. Esto podría

explicar las diferencias que existen entre los experimentos en la respuesta al cultivo,

aun tratándose de los mismos cultivares. Por ejemplo, Pavon ha producido en general

entre 2 y 3 veces más embriones y plantas verdes que Caramba, y sin embargo en uno

de los experimentos (apartado 4.3.3), la respuesta del cv Caramba fue superior, ya que

respondieron 3 veces más anteras que en Pavon, y produjo un número de embriones y

plantas verdes más de 2 veces superior a Pavon.

Desde el punto de vista de la mejora vegetal, es necesario disponer de protocolos

eficientes para un amplio rango de cultivares de interés agronómico. En esta tesis se ha

conseguido aumentar significativamente el número de plantas verdes DH de cultivares

de trigo panadero que tienen una respuesta medio o baja. Los factores claves para

conseguir una alta eficiencia han sido: 1) la utilización de un pretratamiento de estrés

en manitol 0,7 M sólido en presencia de nitrógeno, 2) el cultivo en medio OVCM, 3) la

Discusión

138

incorporación del n-butanol durante las primeras 5 h de cultivo, y 4) el tratamiento con

colchicina durante las primeras 48 h de cultivo y posteriormente, si es necesario, en

planta. Conviene destacar que la aplicación de este protocolo ha dado muy buenos

resultados en otros cultivares de trigo panadero de interés agronómico como Alabanza,

Bitácora, Kilopondio y Recital.

139

6. CONCLUSIONES

1.- La longitud de los estomas permitió distinguir las plantas haploides y

doblehaploides. Las plantas doblehaploides tienen una longitud estomática superior a la

de las plantas haploides.

2.- De los dos métodos de aplicación de colchicina in vivo (en planta), el método

de inmersión de la raíz produjo porcentajes de duplicación cromosómica mayores y

tasas de mortalidad de plantas menores que el método del vial invertido. Se aconseja la

utilización de plantas en estado de 3-4 hojas y la aplicación de colchicina al 0,1%

durante 5 h.

3.- El efecto de la incorporación de colchicina en el medio de pretratamiento

sobre la duplicación cromosómica dependió del genotipo. La colchicina aumentó el

número de plantas verdes en uno de los genotipos utilizados.

4.- La incorporación de colchicina durante las primeras horas de cultivo aumentó

significativamente el porcentaje de duplicación cromosómica en todos los genotipos

utilizados. Las concentraciones y tiempos de aplicación utilizados no produjeron

efectos negativos sobre el proceso de producción de plantas verdes en el cultivo de

anteras o de microsporas. La utilización de colchicina aumentó significativamente el

número de embriones y los porcentajes de plantas verdes en el cultivo de microsporas

del cv Pavon.

5.- El pretratamiento de estrés en medio de manitol 0,7 M sólido indujo un mayor

número de embriones y plantas verdes que el pretratamiento en manitol 0,4 M líquido.

Un ayuno adicional de nitrógeno durante el pretratamiento de las anteras en manitol

0,7 M redujo el porcentaje de plantas verdes. Por tanto, se recomienda la aplicación de

un pretratamiento de estrés en medio 0,7 M sólido en presencia de nitrógeno.

6.- Los genes GST, quitinasa de tipo 2, OxOx y PR-4 se indujeron rápidamente

durante el pretratamiento en los cultivares Chris y Caramba, mostrando picos de

máxima expresión durante las primeras 24 horas. Posteriormente sus niveles de

expresión se redujeron. Al finalizar el pretratamiento (120 h), únicamente la expresión

de OxOx en los dos cultivares y de quitinasa y PR-4 en Chris, fue superior a la de

microsporas sin pretratar (0 h).

7.-La expresión del gen PAL, asociada a la respuesta sistémica adquirida mediada

por ácido salicílico, permaneció constante durante las primeras 48 horas del

Conclusiones

140

pretratamiento en el cv Caramba y las primeras 84 horas en el cv Chris y

posteriormente su expresión disminuyó significativamente.

8.- La utilización del co-cultivo con ovarios en medio preacondicionado (OVCM)

permitió aumentar significativamente la eficiencia del cultivo de anteras, debido

fundamentalmente al mayor número de anteras que responden y al mayor número de

embriones.

9.- El cultivo en OVCM no pudo ser sustituido por medio con Larcoll y goma

arábiga. La adición de estos compuestos produjo un retraso en el desarrollo de los

embriones, lo que dio lugar a un aumento del porcentaje de plantas albinas. Además,

estas sustancias produjeron una disminución en el porcentaje de autoduplicación

cromosómica.

10.- El tratamiento con n-butanol, compuesto que desestabiliza los microtúbulos

corticales en células vegetales, indujo la división y la embriogénesis de las microsporas,

aumentando la eficiencia de producción de plantas DH. Los efectos producidos por el

n-butanol fueron específicos, ya que otros alcoholes butílicos no produjeron efectos

similares.

141

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1

Chromosome doubling in monocots

AM Castillo, L Cistué, MP Vallés, M Soriano

Abstract

The development of efficient chromosome doubling protocols is essential for the useful

application of doubled haploid (DH) plants in breeding programs, since frequency of

spontaneous doubling is most of the time too low. Chromosome doubling has been

traditionally applied to plantlets, being the colchicine the most widely anti-microtubule agent

used in vivo and in vitro. However during the last 15 years, protocols have been developed

for the incorporation of different anti-microtubule agents during the early stages of

androgenesis or gynogenesis. Factors affecting frequencies of spontaneous and induced

chromosome doubling are summarized. For a successful chemical induction, a compromise

between toxicity (which can result from high concentration and/or long time of application)

and genome doubling efficiency should be adopted in order to obtain the highest number of

green DH plants.

Keywords: monocots, doubled haploid, chromosome doubling, anti-microtubule agents

2

Introduction

Haploid plants are highly valuable in breeding programmes, genetic and mutation analysis.

Great achievements have been obtained in the production of haploid plants in monocots by

androgenesis, interespecific or intergeneric crosses and gynogenesis during the last 20 years.

However, the successful utilization of haploid plants depends not only on the production of a

large number of plants, but also on the development of efficient chromosome doubling

protocols. Chromosome doubling can occur spontaneously or be induced by the application

of duplication agents. There are three excellent previous reviews on chromosome doubling:

Jensen (1974), Rao and Suprasanna (1996) and Kasha (2005). In this chapter we update and

summarize the information on spontaneous and induced doubling, and more specifically the

research performed to induce chromosome doubling at early stages of gametic

embryogenesis.

Spontaneous doubling

Spontaneous doubling can occur through somatic diploidization, but it is known to be rare in

nature. On the contrary, the meiotic chromosome doubling resulting from the production of

2n gametes (unreduced gametes), has played a major role in the evolution of plant species

by the production of autopolyploids and allopolyploids (Harlan and De Wet 1975), and

especially in the Poaceae family, which has a preponderance of allopolyploids. Meiotic

restitution has also given rise to seed in haploid plants of oat (Rines et al. 1997), bread and

durum wheat (Jauhar et al. 2000; Jauhar 2007).

Different rates of spontaneous doubling are found among the methods used for obtaining

DH plants. No or low doubling (10-15%) is produced in interspecific or intergeneric crosses

and gynogenesis, respectively (Maluszynski et al. 2003). Androgenesis has the potential for

spontaneous chromosome doubling during the first divisions of microspores, thus producing

completely doubled and fertile plants. The frequency of doubling varies depending on the

species. Averages of 70-90% have been reported in barley, 25 to 70% in bread wheat, 50-

60% in rice, 50-90% in rye (Maluszynski et al. 2003), 20% in maize (Martin and Widholm

1996) and 70% in durum wheat (Cistué et al. 2006).

3

Factors affecting chromosome doubling in androgenesis

The genotype, the developmental stage of the microspores at the time of culture, the type of

preteatment, and the pathway of nuclear development also influence percentage of doubling.

In bread wheat, frequencies of doubling varied from 25 to 68% in winter cultivars from

Central and Eastern Europe (Barnabás 2003). Spontaneous doubling rates of wheat

microspores at late uni-nucleate to early bi-nucleate stage (54-66%) were higher than that of

mid to late uni-nucleate (33%) (Soriano et al. 2007).

A mannitol starvation or a cold pretreatment have given consistently high percentage of

chromosome doubling (Kasha et al. 2001). Furthermore, a mannitol pretreatment applied

with a cold or a heat pretreatment seemed to enhance doubling efficiency in wheat

(Indrianto et al. 1999) and barley (Li and Devaux 2003). As suggested by Kasha et al.

(2001), mannitol may act in the disruption of microtubules. In this sense it has been

proposed that the term “spontaneous doubling” produced by mannitol should be considered

as “induced doubling” (Kasha 2005). For an extensive review on how the pathway of

microspore development influences chromosome doubling see Kasha (2005).

Mechanism of chromosome doubling in androgenesis

Nuclear fusion, after both a symmetric or an asymmetric division, has been proposed to be

the main mechanism of spontaneous doubling after mannitol or cold stress pretreatment in

barley (Kasha et al. 2001; Gonzalez-Melendi et al. 2005; Shim et al. 2006) and maize

(Testillano et al. 2004) microspore embryogenesis. Dynamics and mechanism of

diploidization in barley microspore embryogenesis after cold pretreatment was studied by

confocal and electron microscopy, showing that diploidization can start after the first

embryogenic division and continues in multinuclear pro-embryos during culture (Gonzalez-

Melendi et al. 2005). Similar results have also been described in maize (Testillano et al.

2004).

Induced chromosome doubling

Frequencies of spontaneous doubling are (most of the time) too low to be useful in plant breeding,

and thus justify the application of duplication agents. Doubling procedures should allow the handling

of a large number of plants, from a wide range of genotypes, with a safe and simple technique, and

render stable DH plants efficiently without any genetic change. Different duplication agents have

4

been applied to several tissues in vivo (plantlets) or in vitro. The most frequently used doubling

agents an explants, with special attention to the gametic cells or gametic embryos, are presented

below (for a more extensive revision see Jensen 1974 and Rao and Suprasanna 1996).

Anti-microtubule agents

Among the different anti-microtubule agents used successfully, colchicine has been the most

widely used in vivo and in vitro. Herbicides such as amiprophos-methyl (APM), oryzalin,

trifluralin, and pronamide, have also been used in vitro. All these compounds, with the

exception of pronamide, inhibit spindle formation by binding to tubulin, disrupting the

normal polar segregation of sister chromatids and results in doubling chromosome number

(C-mitosis) (Levan 1938, Morejohn and Fosket 1984, Bartels and Hilton 1973). Pronamide

apparently causes shortening of the microtubule (Vaugahn and Vaughan 1987). Colchicine

has a much lower affinity to plant tubulins than anti-microtubule herbicides, and therefore

these are used at micromolar concentrations to induce the same effect as colchicine at

millimolar concentrations (Bartels and Hilton 1973; Morejohn and Fosket 1984).

Chromosome doubling in vivo (to plantlets)

Treatments for chromosome doubling are traditionally applied to plants, colchicine being the

most widely used agent. Colchicine is applied to plants at the 3-4 tillering stage by the

capping technique (Bell 1950) or at the 3-4 leaves stages by the immersion method (Jensen

1974). Generally, 0.05-2% colchicine is applied for 3-5 hours in the immersion method and

1-3 days in the capping method in combination with DMSO (0.1-4%) (for review see

Maluszynski et al. 2003).

Besides the factors mentioned above, the efficiency of chromosome doubling with

colchicine varies between species (80 % in barley, 60-70% in bread wheat, 40-70% in

durum wheat, 50-80 % in triticale, 40% in rice, 40% in maize) and even between genotypes

(Eder and Chalyk 2002; Maluszynski et al. 2003; Ballesteros et al. 2005). Chromosomal

doubling in onion and maize plantlets is difficult due to the inaccessibility of the meristem,

and the lack of tillering and, in the case of maize, the separation of female and male flowers.

The application of colchicine to plants has several disadvantages such as: a) the high

concentration and solution volume needed b) the high rate of mortality, and c) production of

5

mixoploids or chimeric plants, that can lead to production of low seed set and therefore

requiring an additional growth cycle for seed multiplication before evaluation in the field. In

interspecific or intergeneric crosses, some of these problems can be avoided by colchicine

treatment after pollination through tiller injections (Sood et al. 2003).

Chromosome doubling at early stages of gametic embryogenesis

In order to minimize the problems of colchicine application in vivo described above,

colchicine, pronamide, APM trifluralin and/or oryzalin have been successfully incorporated

in the induction medium of anthers, microspores or callus and in the regeneration medium of

embryos (Table 1). Percentage of chromosome doubling at early stages of gametic

embryogenesis varies with the genotype, the anti-microtubule agent, the concentration and

the period of application. Genotypic dependence has been described in wheat (Soriano et al.

2007) and maize (Barnabás et al. 1999). The differences among genotypes in their responses

to colchicine might be related to the kinetics of mitotic division in culture (Zaki and

Dickinson 1991). Comparison studies among duplication agents showed different results

depending on the specie. Colchicine induced higher duplication rates than anti-microtubular

herbicides in wheat and maize (Hassawi and Liang 1991; Martin and Widholm 1996).

However, trifluralin, oryzalin or APM produced higher doubling efficiencies than colchicine

in gynogenic embryos of onion (Grzebelus and Adamus 2004).

The concentration of duplication agent and period of application that rendered the

highest percentage of chromosome doubling in different monocots are shown in Table 1.

These agents affect not only the percentage of doubling but also the whole androgenetic or

gynogenetic process. The best concentration and time of application for chromosome

doubling can have negative effects on embryogenesis, regeneration and/or percentage of

green plants (Table 1). Positive effects of the anti-microtubule agents have also been

described. Different actions of colchicine have been proposed to explain the positive effects

on embryogenesis, as an increase of symmetrical divisions, the depression in the synthesis of

pollen specific tubulins, and cytoskeletal restructuration (for review see Shariatpanahi et al.

2006). Colchicine could also cause a reduction of chloroplast DNA abnormalities (Aubry et

al. 1989) or a selective elimination of microspores having abnormalities (Barnabás et al.

1991), increasing the percentage of green plants.

6

Table 1. Chromosome doubling at early stages of gametic embryogenesis. Highest

chromosome doubling percentages produced with anti-microtubular agents and its effect

on culture phases. Effects on culture

parameters

Specie Expl Appl Agent/µM/days Doubling (%)

Ind Reg Green % References

Wheat Ant Ind Col / 500 / 3 69 + No + Barnabás et al. 1991 Ant Ind Col / 500 / 3 72 - No No Navarro-Alvarez et al.

1994 Ant Ind Col / 250 / 5 100 - + / No + / No Redha et al. 1998 Ant Ind Col / 751 / 3 0-100 + / - - / No + Zamani et al. 2000 Ant Ind Col / 751 / 2 50-58 No No No Soriano et al. 2007 Callus

(Ant) Ind Col / 375 / 4 79-91 + - - Ouyang et al. 1994

Callus (Ant)

Ind Col / 313 / 2 Trif / 10 / 3 Oryz / 10 / 3

50-100 0-36 0-50

nd nd nd

nd nd nd

Hassawi and Liang 1991

Emb (Ant)

Reg Col / 1250 / 1 0-100 - - Mentewab and Sarrafi 1997

Mic Ind Col / 1000 / 2 53 No No - Hansen and Andersen 1998a

Mic Ind Trifl / 10 / 2 APM / 10 / 2

74 65

- -

No No

- -

Hansen and Andersen 1998b

Mic Ind Col / 751 / 2 73-88 + / No

No + / No Soriano et al. 2007

Mic Pret Col / 751 / 2 69 No No No Soriano et al. 2007 Maize Ant Ind Col / 626 / 7 56 - - / No nd Saisingtong et al. 1996 Ant Ind Col / 750 / 3 80-100 No No No Barnabás et al. 1999 Ant Ind Col / 500 / 3 20 (ns) + (ns) nd nd Obert and Barnabas 2004 Ant Pret Col / 1250 / 7 38 (ns) + No nd Antoine-Michard and

Beckert 1997 Ant Ind Col / 50 / 4

Prona / 1 / 4 Oryz / 1-5 / 4

43 0 0

- - -

Martin and Widholm 1996

Callus (Ant)

Ind Oryza / 10 / 2 APM / 15 / 3 Pron / 5 / 3 Trif / 5 / 3

78 67 73

100

- + + -

nd nd nd nd

Wan et al. 1991

Rice Ant Ind Col / 626 / 2 78 No No No Alemanno and Guiderdoni 1994

Onion Emb (Gyno)

Elon APM / 50 / 3 Oryz / 50 / 3

70 90

- -

Jakse and Bohanec 2000

Emb (Gyno)

Elon APM / 50 / 2 37 - Jakse et al. 2003

Emb (Gyno)

Reg APM / 50 / 3 Oryz / 50 / 2 Trif / 50 / 3 Col / 313 / 3

35 47 47 35

No - -

No

No - - -

Grzebelus and Adamus 2004

Col= colchicine; APM = amyprosphos methyl; Trif = trifluralin; Oryz = Oryzaline; Pron = pronamide; + = induction effect; - = inhibition effect; No = no effect; nd = not determined; ns t= no significant.

7

It has been suggested that any microtubule disrupting agent exhibiting a symmetric first

mitotic division in microspores would also lead to both embryo induction and spontaneous

chromosome doubling (Kasha 2005). In Brassica, the application colchicine produced high

frequency of embryogenesis and chromosome doubling (Zhou et al. 2002), and could even

substitute a heat stress pretreatment (Zhao et al. 1996). However, studies performed in

maize, with a wide range of colchicine concentrations, indicated that although colchicine

can induce embryogenesis, optimal concentration for embryogenesis and chromosomal

doubling are not the same (Saisington et al. 1996; Obert and Barnabás 2004).

Application of colchicine during cold or mannitol stress pretreatment has only been studied

in maize (Antoine–Michard and Beckert 1997) and wheat (Soriano et al. 2007), respectively.

In the first study, increased rate of embryogenesis but no effect on doubling was observed.

In the second one, the colchicine effect on green plant production and percentage of

doubling was genotype dependent.

Anti-microtubule agents at early stages of gametic embryogenesis have been applied at the

Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Science (Dr. Barnabás), with

maize and bread wheat genotypes that have low rates of spontaneous doubling, and at the

Center for Plant Biotechnology and Breeding, University of Ljubljana (Dr. Bohanec) with

gynogenetic embryos in onion (Maluszynski et al. 2003).

Conclusion and further perspectives

Chromosome doubling induced to plantlets is most common in monocots. During the last 15

years protocols have been developed for the application of anti-microtubule agents in vitro

to microspores of maize and wheat, and embryos of onion. The use of both strategies

combined can maximize the recovery of DH plants. Efforts in order to improve the protocols

for application to isolated microspores, in the induction medium in gynogenesis and

immediately after pollination in wide crosses could further increase the production of DH

plants.

Successful chemical induction of chromosome doubling in vivo and in vitro depends on a

compromise between toxicity and genome doubling efficiency. The concentration and time

of application should be optimized to obtain the highest number of DH plants. Anti-

microtubule herbicides have been used in vitro successfully as an alternative to colchicine in

8

onion due to their lower toxicity. The possibility of using these agents in other monocot

species should be studied further.

Microscopy studies can shed light on of how different types of stress pretreatment can affect

cytoskeleton and produce chromosome doubling. Application of duplication agents at the

time of stress pretreatment should be investigated further. Since genotype is one of the main

factors affecting chromosome doubling, molecular approaches would be necessary to gain

knowledge about the genes, and their regulation, involved in chromosome doubling.

Acknowledgements We are grateful for financial support from the Plan Nacional de

Recursos y Tecnologías Agroalimentarias (AGL2002-04139-C02-02 and AGL2005-07195-

C02-01).

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CELL BIOLOGY AND MORPHOGENESIS

Enhanced induction of microspore embryogenesis after n-butanoltreatment in wheat (Triticum aestivum L.) anther culture

M. Soriano Æ L. Cistue Æ A. M. Castillo

Received: 9 November 2007 / Revised: 21 December 2007 / Accepted: 21 December 2007 / Published online: 24 January 2008

� Springer-Verlag 2008

Abstract The aim of this study was the improvement of

embryo production in wheat anther culture. Three butanol

alcohols, n-butanol, sec-butanol and tert-butanol, were

evaluated for their effect on microspore embryogenesis in

two spring cultivars of wheat, Pavon and Caramba.

Application of n-butanol, at 0.1 and 0.2% (v/v) in the

induction media for 5 h, highly improved embryo pro-

duction in both cultivars. Sec- and tert-butanol performed

similarly to control plates. Regeneration ability was unaf-

fected by any butyl-alcohol treatment. As a consequence of

the higher embryo production after n-butanol treatment, the

number of green regenerated plants increased up to five

times in cultivar Pavon and up to three times in cultivar

Caramba. The percentage of green plants was improved or

unaffected by the treatment. Doubled haploid plant pro-

duction was between 2 and 4 times higher after n-butanol

treatment than in control plates. Therefore, n-butanol was

successfully applied in the production of wheat doubled

haploids. This primary alcohol is known as an activator of

phospholipase D and has been previously reported to dis-

rupt cortical microtubules and detach them from the plasma

membrane in plants. Its effects on androgenetic induction

could confirm the importance of microtubule regulation in

plant cell fate, specifically in microspore development.

A possible implication of phospholipase D is discussed.

Keywords Doubled haploid � Androgenesis �Bread wheat � n-butanol

Abbreviations

DH Doubled haploid

MT Microtubule

PA Phosphatidic acid

PLD Phospholipase D

Introduction

In conventional breeding, several segregating generations

must be grown in order to reach a certain level of homo-

zygosity that allows the selection for traits of interest. For

this reason, the production of doubled haploid (DH) plants

is especially valuable, since it enables breeders to obtain

homozygous plants directly from hybrid individuals. DH

plants have been successfully applied to breeding programs

and genetic analysis (Palmer et al. 2005). In wheat, DH

plants are produced either by intergeneric crosses with

maize or by induction of androgenesis through anther or

microspore culture (for review see Maluszynski et al.

2003). Androgenesis can potentially produce a large

amount of DH plants due to the high number of microsp-

ores per anther. After exposure to a stress treatment,

microspores can exit the gametophytic pathway, aimed at

the formation of a pollen grain, and start a sporophytic

program, in which they form an embryo and then give rise

to a whole plant. However, it is still necessary to broaden

the application of these techniques, since there are many

bread wheat cultivars of agronomic importance that show

very low or no response to androgenetic induction. The

main factors that hinder the application of anther and

Communicated by P. Ozias-Akins.

M. Soriano (&) � L. Cistue � A. M. Castillo

Departamento de Genetica y Produccion Vegetal,

Estacion Experimental Aula Dei, Consejo Superior de

Investigaciones Cientıficas (CSIC), Avda Montanana 1005,

50059 Zaragoza, Spain

e-mail: soriano@eead.csic.es

123

Plant Cell Rep (2008) 27:805–811

DOI 10.1007/s00299-007-0500-y

microspore culture, are the low rates of embryogenesis and

the high frequency of albinism among regenerants.

Cytoskeletal changes are required at the first steps of

microspore induction towards the sporophytic pathway.

Profound cellular reshaping is produced by vacuole frag-

mentation and nucleus migration to the centre of the cell,

allowing the formation of the ‘‘star-like’’ morphology

observed under induction of microspore embryogenesis

(Indrianto et al. 2001; Maraschin et al. 2005). The forma-

tion of a pre-prophase band formed by microtubules (MTs)

is a good indicator for embryogenic potential in microsp-

ores of Brassica (Simmonds and Keller 1999). Most

importantly, cytoskeletal rearrangements themselves can

trigger changes in development, since the utilization of

colchicine or cytochalasin D is sufficient to induce

embryogenesis in microspores (Zhao et al. 1996; Gervais

et al. 2000). MT depolymerising substances such as col-

chicine and amiprophosmethyl, applied in order to interrupt

mitosis and induce duplication of the haploid genome, have

produced inductive effects on microspore embryogenesis in

some genotypes of Brassica (Hansen and Andersen 1996;

Zhou et al. 2002), rice (Alemanno and Guiderdoni 1994),

coffee (Herrera et al. 2002) and wheat (Barnabas et al.

1991; Soriano et al. 2007).

The primary alcohol n-butanol has been reported to

disrupt cortical MTs and detach them from the plasma

membrane in tobacco BY-2 cells (Dhonukshe et al. 2003;

Hirase et al. 2006). Treatment of Arabidopsis seedlings

with n-butanol also produced cortical MT disruption, and

inhibited seed germination and seedling growth (Gardiner

et al. 2003). The effect of n-butanol on plant MTs, is

thought to be mediated by its known ability to activate

phospholipase D (PLD) (Munnik et al. 1995). This enzyme

is tightly associated with plasma membrane and with the

MT cytoskeleton (Gardiner et al. 2001), and its stimulation

has been correlated with microtubular rearrangements

(Dhonukshe et al. 2003). PLD hydrolyses membrane

phospholipids into the second messenger phosphatidic acid

(PA) and free head groups. To date, 12 PLDs have been

identified in Arabidopsis with distinct catalytic and regu-

latory properties. Both PLD and its product PA play key

roles in plant growth and development, hormone effects

and stress responses (reviewed by Wang 2005; Bargmann

and Munnik 2006). PLD activity in plants, has been gen-

erally related with a wide range of stress responses, such as

pathogen attack (Young et al. 1996), wounding (Ryu and

Wang 1996), freezing tolerance (Li et al. 2004), water

stress (Munnik et al. 2000; Thiery et al. 2004) and ABA

signalling (Zhang et al. 2004).

Both the primary alcohol, n-butanol, and the secondary

alcohol, sec-butanol, can activate PLD via G-proteins

(Munnik et al. 1995), but only the former produces MT

detachment from the plasma membrane. The tertiary

alcohol, tert-butanol, neither activates PLD nor acts on MT

cytoskeleton, and therefore can be used as a control for any

non-specific effect of butyl-alcohols (Munnik et al. 1995;

Dhonukshe et al. 2003). The reported activities of these

butanol isomers have been shown to be reversible and non-

toxic (Dhonukshe et al. 2003; Gardiner et al. 2003).

Therefore, in this work we applied n-butanol, sec-butanol

and tert-butanol during the first hours of bread wheat anther

culture, in order to evaluate if n-butanol could specifically

stimulate microspore embryogenesis.

Materials and methods

The spring cultivars of bread wheat (Triticum aestivum L.)

Pavon and Caramba, were used as anther donor plants.

Pavon is a medium–high responding cultivar for andro-

genesis, whereas Caramba is an agronomically important

cultivar in Spain, with low androgenetic response.

Seeds of donor plants were sown in a paper-pot of 3 cm

in diameter with a mixture of peat, vermiculite and sand

(1:1:1). Plants were vernalized for 5 weeks in a growth

chamber at 4�C, under an 8 h photoperiod. Plants were

transplanted to 15 cm diameter pots (two plants per pot)

with the above soil mixture and cultivated in a growth

chamber at 12�C with a 12 h photoperiod. There were

approximately 40 plants per batch of plants and genotype.

After 5 weeks, the temperature was increased to 21/18�C

and the photoperiod lengthened to 16 h. Relative humidity

was kept at 70–80%. A N:P:K (15:15:15) fertilizer was

mixed into the soil and a foliar fertilizer was applied once a

week.

Microspore developmental stage was determined by

DAPI (40,60-diamidino-2-phenylindole) staining (Vergne

et al. 1987). Anthers containing the majority of microsp-

ores at the mid- to late-uninucleate stage were pretreated

for 5 days in 127.5 g l-1 mannitol, 5.9 g l-1 CaCl2 2H2O

plus macronutrients from FHG medium (Hunter 1987)

solidified with 8 g l-1 Sea Plaque agarose. Two experi-

ments were performed. In experiment 1 (Exp. 1), pretreated

anthers were inoculated in 2 ml liquid MS3M (MS medium

modified by Hu and Kasha (1997), containing 90 g l-1

maltose, 1 mg l-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

and 1 mg l-1 benzyladenine (BA)) with n-butanol at 0.1%

or 0.2% (v/v). In experiment 2 (Exp. 2) anthers were

inoculated in 2 ml liquid MS3M, with tert-butanol, sec-

butanol or n-butanol, at 0.2% (v/v). Both experiments

included a control plate, in which anthers were inoculated

in liquid MS3M without any butyl-alcohol. Within repli-

cates, anthers coming from the same spike were randomly

distributed among treatments. Between 35 and 40 anthers

were inoculated per plate. Approximately 3–4 spikes were

used per replicate. After 5 h, liquid medium was removed

806 Plant Cell Rep (2008) 27:805–811

123

and replaced with 1.5 ml MS3M with 62 g l-1 maltose and

supplemented with 200 g l-1 Ficoll type 400

(MS3MF200), which had been previously conditioned with

40 ovaries per 6 ml for 5 days. All cultures were main-

tained in the dark at 25�C. After 10–12 days, plates were

replenished with 1.5 ml of MS3M supplemented with

300 g l-1 Ficoll type 400 (MS3MF300).

After 28 days, embryos were transferred to J25-8 med-

ium (Jensen 1977) for regeneration. Embryos were kept in

the dark at 25�C for 2 days and then transferred to the light.

After 20–30 days, plants were counted and transferred to

Magenta boxes containing J25-8 medium plus naphtha-

leneacetic acid (NAA) (2 mg l-1) for root development.

Plants at the stage of 2–4 leaves were vernalized for

5 weeks at 4�C and 8 h photoperiod before transferring to

soil. Ploidy was estimated by flow cytometry after trans-

ferring plants to soil. Between 90 and 100 plants were

analyzed per treatment and genotype for every batch of

plants. Young leaves were chopped in 2 ml Cystain UV

ploidy solution (Partec) and filtered through a 30 lm nylon

filter. Samples were analyzed in a PAS cytometer (Partec).

Young leaves from seed derived plantlets were used as

control. DH plants of cultivar Pavon produced in Exp. 1

were further cultivated in the greenhouse at 18–22�C under

a 16 h photoperiod for seed production.

The following variables were recorded: number of

responsive anthers, number of calluses, number of

embryos, number of green and albino plants, all per 100

anthers, and percentage of chromosome doubling expres-

sed as number of doubled haploids per 100 analyzed plants.

The variable number of calluses was estimated by counting

one tenth of the Petri dish area under a stereoscopic

microscope, on a millimetre paper. The number of divi-

sions (number of calluses plus number of embryos),

percentage of regeneration (number of regenerated plants

per 100 embryos), percentage of green plants (number of

green plants per 100 total plants) and number of green DH

plants per 100 anthers were calculated.

Both experiments were established in a completely

randomized design. In Exp. 1, spikes came from two bat-

ches of donor plants whereas for Exp. 2, all the spikes came

from the same batch of plants. In Exp. 1 there were, in

total, twelve replicates for cultivar Pavon and ten for cul-

tivar Caramba. In Exp. 2 there were 12 replicates for

cultivar Pavon and nine replicates for cultivar Caramba.

Statistical analysis was performed using SAS software

(SAS Institute Inc., Cary, NC, Version 9.1). Normality and

homogeneity of variance were tested using Kolmogorov–

Smirnoff and Levene’s test, respectively. Data were

transformed using square root (x + 0.5), except for per-

centage of regeneration and percentage of green plants that

needed no transformation. ANOVA was performed using

the GLM (Generalized Linear Model) procedure for all the

variables except for percentage of chromosome doubling

which was analyzed using the Chi square test. Mean sep-

aration was tested by the Duncan method (a B 0.05).

Results

In both experiments, ANOVA showed that the number of

responsive anthers, divisions, embryos and green plants

were strongly affected by treatment and genotype

(Table 1). Genotype affected the percentages of regenera-

tion and green plants in Exp. 1. Treatment had a significant

effect on green plant percentage in Exp. 2 and did not show

any influence on the percentage of regeneration. For Exp.

1, also the factor batch of plants was highly significant for

all the variables except for responsive anthers and green

plant percentage. Interestingly, genotype 9 treatment

Table 1 ANOVA of Exp. 1 and Exp. 2 for the variables responsive anthers, number of divisions, embryo and green plant production, and

percentages of regeneration and green plants

Source df Mean squares

Responsive anthersa Divisionsa Embryosa Green plantsa Regeneration (%) Green plant (%)

Exp 1 Genotype 1 168.4*** 1,885.5*** 1,067.7*** 889.8*** 1174.7* 2,237.7*

Treatment 2 46.5* 728.5*** 243.5*** 183.8*** 270.6ns 327.6ns

GenotypeX treatment 2 0.3ns 74.2ns 3.6ns 17.2ns 5.9ns 565.2ns

Batch 1 6.1ns 1,079.2*** 200.4*** 167.5*** 2,604.0** 82.9ns

Error 59 191.4 79.5 14.4 14.0 269.1 242.6

Exp 2 Genotype 1 98.5*** 3861.9*** 458.1*** 142.1** 771.6ns 330.1ns

Treatment 3 80.6*** 800.6*** 314.2*** 220.3*** 327.5ns 2,298.1**

GenotypeX treatment 3 2.1ns 33.2ns 17.0ns 0.9ns 16.0ns 421.2ns

Error 76 3.4 69.6 25.6 15.4 218.9 491.5

a Values based on 100 anthers

ns, *, **, *** Not significant, significant at 0.05, 0.001 and 0.0001 levels of probability respectively

Plant Cell Rep (2008) 27:805–811 807

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interaction effects were not found in any case, meaning that

treatments performed similarly in the two spring cultivars

of bread wheat. Further analyses were performed for each

genotype separately.

The results obtained in Exp. 1 show that both 0.1 and

0.2% of n-butanol produced an improved response to

anther culture in cultivars Pavon and Caramba, and that

there were no differences between the two concentrations

of n-butanol assayed (Table 2). The number of responsive

anthers and the production of embryos, total plants and

green plants, were significantly higher in n-butanol

treatments than in control plates. In cultivar Pavon, also

the number of divisions and the percentage of green

plants were improved by the treatment. As a result, the

number of green plants produced per 100 anthers was

increased from 121 to 300 in Pavon and from 46 to 90 in

Caramba.

Exp. 2 was performed in order to assess if similar effects

could be produced by other butyl-alcohols. All variables in

the treatments with sec- and tert-butanol were similar to

control, whereas n-butanol performed differently in many

of them (Table 3). Treatment with n-butanol showed con-

sistent results with Exp. 1 in the production of the highest

percentages of responding anthers and the highest

production of embryos, total plants and green plants in both

Pavon and Caramba. In this experiment, the number of

divisions was improved, not only in cultivar Pavon, but

also in cultivar Caramba, and the percentage of green

plants was improved only in cultivar Caramba. In Pavon,

green plant percentage was significantly superior in n-

butanol than in sec-butanol treatments. The resulting

number of green plants was increased five times (from 23

to 130) in cultivar Pavon and more than three times (from

52 to 169) in cultivar Caramba, after n-butanol treatment.

Regeneration ability was unaffected by any butyl-alcohol

treatment (Tables 2,3).

The number of DH plants produced in the treatments

with n-butanol was increased twice in cultivar Caramba

(Figs. 1,2) and up to four times in Pavon (Fig. 2). As

shown in the figures, lower rates of chromosome doubling

were generally produced in these treatments. However,

significant differences in this variable were only found

between n-butanol and control treatments in Exp. 2 for

cultivar Pavon. Doubled haploid plants of cultivar Pavon

performed similarly in the greenhouse. No observable

differences were found in plant morphology or heading

date. Percentages of seed set in DH plants ranged between

80 and 91%, irrespectively of the treatment.

Table 2 Wheat anther culture response after treatment with 0, 0.1 or 0.2% (v/v) of n-butanol for 5 h in liquid induction media

Cultivar n-Butanol

(%)

Responsive

anthersaDivisionsa Embryosa Total

plantsaGreen

plantsaAlbino

plantsaRegeneration

(%)

Green plant

(%)

Pavon 0 54b 447b 237b 166b 121b 45a 67a 70b

0.1 81a 1044a 456a 347a 300a 47a 75a 86a

0.2 80a 1148a 457a 336a 283a 53a 72a 82a

Caramba 0 23b 327a 94b 69b 46b 23a 58a 68a

0.1 42a 587a 173a 128a 89a 39a 66a 63a

0.2 46a 635a 186a 127a 90a 37a 62a 68a

a Values based on 100 anthers

Values followed by a different letter within each genotype are significantly different

Table 3 Wheat anther culture response after treatment with 0.2% (v/v) of n-butanol, sec-butanol or tert-butanol for 5 h in liquid induction media

Cultivar Butyl-OH Responsive

anthersaDivisionsa Embryosa Total

plants aGreen

plants aAlbino

plants aRegeneration

(%)

Green plant

(%)

Pavon Control 11b 109b 63b 48b 23b 25b 78a 44ab

n-but 31a 507a 250a 198a 130a 68a 77a 54a

Sec-but 14b 118b 80b 59b 23b 35b 68a 29b

Tert-but 10b 101b 53b 41b 20b 20b 77a 42ab

Caramba Control 30b 546b 154b 109b 52b 58a 71a 45b

n-but 58a 1224a 330a 236a 169a 67a 70a 68a

Sec-but 31b 572b 152b 99b 44b 55a 63a 41b

Tert-but 32b 665b 167b 119b 47b 73a 67a 35b

a Values based on 100 anthers

Values followed by a different letter within each genotype are significantly different

808 Plant Cell Rep (2008) 27:805–811

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Discussion

This is the first report describing the effects of n-butanol on

androgenesis. The results obtained suggest that this sub-

stance increases the number of wheat microspores that

enter the sporophytic pathway, as revealed by the increase

in responding anthers, divisions and embryo formation.

Response to n-butanol treatment was significant and simi-

lar for both spring cultivars included in this study. Among

the three butanol isomers applied, only n-butanol had a

clearly observable effect on anther culture response. This

confirms that the effects of n-butanol were specific and

could be attributable to the ability of n-butanol to disrupt

cortical MT arrays (Dhonukshe et al. 2003; Gardiner et al.

2003; Hirase et al. 2006). This is in accordance with the

stimulation of microspore embryogenesis produced by

antimicrotubule agents, as previously reported in anther

and microspore culture of wheat (Barnabas et al. 1991;

Soriano et al. 2007) and in other species (Herrera et al.

2002; Zhou et al. 2002). Also, some improvements in the

percentage of green plants have been produced in this study

after n-butanol treatments, an effect that has also been

observed after application of colchicine (Redha et al.

1998). Toxicity, along with genotypic effects, are the main

drawbacks when applying these substances (Navarro-

Alvarez et al. 1994; Zamani et al. 2003). In the present

work, toxicity was not detected at the low concentrations

(0.1–0.2%) of n-butanol applied, as previously reported by

Dhonukshe et al. 2003 and Gardiner et al. 2003. Both

Pavon and Caramba showed similar response to n-butanol

treatments. Conversely, the same cultivars showed geno-

typic differences in embryogenic induction when

microspore cultures were treated with colchicine (Soriano

et al. 2007). These results need further research, but sug-

gest that the effects of n-butanol could be independent of

the genotype.

Treatment with n-butanol, unlike antimicrotubular

agents, did not produce improvements on doubling rates.

This could be due to the fact that, in contrast to antimi-

crotubular agents, the activity of n-butanol on cytoskeleton

affects only cortical MTs (Dhonukshe et al. 2003). These,

and not only spindle MTs, are involved in the process of

alignment for a typical asymmetric mitosis in pollen

development (Tanaka and Ito 1981). A tendency for lower

doubling rates was observed after n-butanol treatments,

although significant differences were only found in Pavon.

Nuclear fusion has been proposed to be the main mecha-

nism of spontaneous doubling in barley (Gonzalez-Melendi

et al. 2005; Kasha et al. 2001) and maize (Testillano et al.

2004) microspore embryogenesis. High frequencies of

spontaneous doubling in cereals appear to be induced by

treatments that block cell wall formation during the first

cell divisions (Shim et al. 2006). Complete cytokinesis

after n-butanol treatment or a likely role of cortical MTs in

nuclear fusion could interfere with this process.

In n-butanol treatments embryos developed at high

culture density. Probably due to some level of competition

for nutrients, embryo size was smaller in these treatments

than in control plates (data not shown). Smaller embryo

size has been correlated, in barley and wheat, with lower

regeneration ability and higher formation of albinos

(Roberts-Oehlschlager and Dunwell 1990; Kunz et al.

2000). On the contrary, our results show no effect on

embryo regeneration ability and no effect or even some

improvements in green plant percentage (Tables 1,2).

It is known that anther response and albinism are not

only dependent on the genotype, but also on environmental

factors, that affect physiological conditions of donor plants

(Bjørnstad et al. 1989). In microspore cultures of barley,

strong seasonal variations (Ritala et al. 2001) and batch to

batch differences (Cho 1991) have been described for

Fig. 1 Number of DH plants per 100 anthers (grey bars) ±SE and

percentage of doubling (filled triangle), produced in response to

different concentrations of n-butanol in wheat cultivars Pavon (a) and

Caramba (b)

Fig. 2 Number of DH plants per 100 anthers (grey bars) ±SE and

percentage of doubling (filled triangle), produced in response to

butanol isomers n-, sec-, tert-butanol applied to 0.2% (v/v) in cultivars

Pavon (a) and Caramba (b)

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plants grown in growth chambers. Although in this work

donor plants were grown in growth chambers with con-

trolled light, humidity and temperature, the experiments

were performed at different seasons of the years 2006 and

2007. Seasonal variation and factors such as irrigation or

the phytosanitary state of donor plants, could have an

influence on the physiological state of the anthers and of

the ovaries used for co-culture, crucial in the good andro-

genic response of wheat. This could account for the

difference in anther response in cultivar Pavon between the

two experiments, and for the fact that significant increases

in green plant percentage after n-butanol treatments, were

produced in Pavon in Exp. 1 and in Caramba in Exp. 2.

Apart from the effects of n-butanol on plant MTs, this

substance is an activator of PLD that can also partially

divert the formation of PA by this enzyme. PLD has the

unique ability to transfer the phosphatidyl group of its

substrate, instead of water, to a primary alcohol forming

phosphatidyl alcohols (Dawson 1967; Yang et al. 1967).

Among the three alcohols used in this study, only n-butanol

can be used by PLD as a transphosphatidylation substrate

(Munnik et al. 1995). This occurs at the expense of PA

formation, which is known to act as a second messenger in

several processes (Laxalt and Munnik 2002; Wang et al.

2006). In tobacco, pollen tube growth is blocked by treat-

ment with 0.35–0.75% of n-butanol, and can be reinstated

by external application of PA (Potocky et al. 2003). Taxol

could effectively overcome n-butanol inhibition, suggest-

ing that the role of PLD in pollen tube growth and

germination is also related to pollen cytoskeleton. Other

studies by Thiery et al. (2004) in Arabidopsis and by

Navari-Izzo et al. (2006) in durum wheat, applying 0.5 and

0.2% n-butanol respectively, observed that the increase in

phosphatidylbutanol was not accompanied by a significant

decrease in PA formation, suggesting a low impact of the

activated PLDs to this PA pool. The concentrations of n-

butanol applied in this study are low, but still, we must take

into consideration that a reduction in PA production by

PLD could also account for n-butanol effects.

PLD has been proposed to link external stimuli with

intracellular signalling through PA production and inter-

action with the cytoskeleton (Munnik and Musgrave 2001).

PLD activity has been associated with hyperosmotic stress

(Komis et al. 2006) and copper excess (Navari-Izzo et al.

2006) in durum wheat, and with response to cold in bread

wheat (Skinner et al. 2005). Stress pre-treatment is one of

the most important requirements for induction of andro-

genesis in microspores. Cold and starvation by mannitol

are the most frequently used pre-treatments in wheat (for

review, see Maluszynski et al. 2003). Further research is

essential to gain knowledge about the possible implication

of this enzyme in cytoskeletal regulation and morphogen-

esis, and specifically in microspore embryogenesis.

The treatment with n-butanol can be used as a trigger for

microspore division and embryogenesis. This substance

produced a strong improvement in embryo and green plant

production, and allowed us to increase the number of DH

plants from two cultivars of bread wheat. More studies of

the effects produced by n-butanol will be crucial for

broadening its applicability in the production of doubled

haploids in other species.

Acknowledgments The authors are grateful to Dr. M.P. Valles for

her complete support in research. MS was the recipient of a fellow-

ship from the Ministerio de Educacion y Ciencia of the Spanish

Government. The research was supported by the Proyects from the

Plan Nacional de Recursos y Tecnologıas Agroalimentarias

AGL2005-07195-C02-01 and AGL2004-03396.

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123

ORIGINAL PAPER

Effects of colchicine on anther and microspore cultureof bread wheat (Triticum aestivum L.)

Mercedes Soriano Æ Luis Cistue ÆMarıa P. Valles Æ Ana M. Castillo

Received: 24 May 2007 / Accepted: 6 August 2007 / Published online: 2 October 2007

� Springer Science+Business Media B.V. 2007

Abstract The aim of this work was to study the

effects of colchicine application on chromosome

doubling and androgenic response in anther and

microspore culture of different bread wheat geno-

types. Colchicine was applied during a mannitol

stress pretreatment or during the first 48 h of culture

at concentrations of 0, 150 and 300 mg l–1. When

colchicine was applied during stress pretreatment, the

percentage of doubling depended on genotype and

concentration. A significant increase in doubling was

observed with 300 mg l–1 in the low androgenic

responding cv. Caramba. Colchicine incorporation

during the first hours of culture improved percentage

of doubling in all genotypes, in both anther and

microspore culture. Application of 300 mg l–1 col-

chicine improved the percentage of doubling in the

two low responding genotypes, to 118% of control in

DH24033, and 75% in Caramba in microspore and

anther culture, respectively. Concerning the andro-

genic response, the effect of colchicine on embryo

formation and percentage of green plants depended

on the genotype and on the culture method. In cv.

Pavon, a 2- and a 3-fold increase in percentage of

embryogenesis and green plants, respectively, were

obtained with 300 mg l–1 colchicine in microspore

culture. However, no significant differences in these

two variables were observed in anther culture. The

number of green doubled haploid (DH) plants reflects

the index of success of the procedure. Regardless of

the culture method, when colchicine was incorpo-

rated during the first hours of culture, the number of

green DH plants increased significantly in three of

four genotypes. These results confirm the usefulness

of colchicine application during the first hours of

culture in wheat breeding programs.

Keywords Doubled haploid �Chromosome doubling � Androgenesis �Poaceae � Stress pretreatment

Introduction

Doubled haploid (DH) plants are useful in plant

breeding programmes, since homozygous plants may

be obtained in a few months, thus reducing the

time needed to release new cultivars. Several bread

wheat cultivars selected from DH lines, obtained by

microspore embryogenesis (Ouyang et al. 1983) or

intersepecific crosses with maize (Laurie and Bennett

1987), have been commercialized (http://www.scri.

sari.ac.uk/assoc/COST851/Default.htm). Microspore

embryogenesis has greater potential for DH production

than interspecific crosses in wheat, due to the

abundance of microspores per flower compared to the

M. Soriano � L. Cistue � M. P. Valles � A.

M. Castillo (&)

Departamento de Genetica y Produccion Vegetal,

Estacion Experimental de Aula Dei, Consejo Superior de

Investigaciones Cientıficas (CSIC), Avda Montanana

1005, Zaragoza 50059, Spain

e-mail: amcast@eead.csic.es

123

Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234

DOI 10.1007/s11240-007-9288-2

single ovule per floret. However, there are still several

factors that hinder the application of anther and

microspore culture at a commercial level, specifically

the low rates of embryogenesis and regeneration, the

high frequency of albinism among regenerants and the

low frequency of chromosome doubling in some

cultivars.

The spontaneous doubling rate in wheat depends on

the genotype. Stober and Hess (1997) obtained 15–

44% spontaneous doubling in German cultivars of

spring wheat, whereas Barnabas (2003) reported

frequencies from 25 to 68% in winter cultivars from

Central and Eastern Europe. Of the different chromo-

some doubling agents, colchicine has been the most

successful when applied to plants or callus of bread

wheat (Hassawi and Liang 1991). Colchicine inhibits

spindle formation during mitosis and disturbs normal

polar segregation of sister chromatids resulting in

doubling chromosome number (Levan 1938). Colchi-

cine is traditionally applied to young plants at the

3–4 tillering stage by the capping technique (inverted

vial) (Bell 1950) or by the immersion method (Jensen

1974). However, the application of colchicine at this

stage has several disadvantages such as: (a) the high

concentration and volume of colchicine solution

needed, that implies dangerous handling and costly

treatments, (b) a high rate of mortality in plants, and

(c) production of mixoploids or chimeric plants that

leads to low seed production and therefore, an

additional growth cycle for seed multiplication before

evaluation in the field (Chen et al. 1994). The

application of colchicine during in vitro culture, in

the induction medium (Barnabas et al. 1991) or in the

regeneration medium (Mentewab and Sarrafi 1997)

could minimize some of these problems.

Colchicine has been successfully applied during

the first hours of anther and microspore culture,

resulting in an increase of chromosome doubling in

different species such as wheat (Barnabas et al. 1991,

Hansen and Andersen 1998), tritordeum (Barcelo

et al. 1994), maize (Saisingtong et al. 1996), rice

(Alemanno and Guiderdoni 1994), Miscanthus (Pet-

ersen et al. 2002), Brassica (Mollers et al. 1994) and

tobacco (Takashima et al. 1995). Colchicine can

affect not only the percentage of doubling but also

the whole androgenetic process. In Brassica, the

application of colchicine to isolated microspore

cultures resulted in a high embryo induction rate and

almost synchronized embryogenesis (Mollers et al.

1994; Zaki and Dickinson 1995; Zhao et al. 1996a, b;

Zhou et al. 2002a, b). Studies performed in tobacco

and maize indicated that the optimal concentration for

embryogenesis had no effect on chromosome dou-

bling while optimal concentration for doubling had

negative effects on plant production (Eady et al. 1995;

Saisingtong et al. 1996). In bread wheat, application

of colchicine during the first hours of anther culture

produced contradictory results regarding embryogen-

esis and percentages of green plants (Barnabas et al.

1991; Navarro-Alvarez et al. 1994; Redha et al.

1998a, b; Zamani et al. 2000, 2003). Only the study

from Hansen and Andersen (1998) reported the effect

of colchicine on isolated microspore culture in wheat.

The application of a stress pretreatment is neces-

sary for efficient induction of microspore embryo-

genesis in cereals. Sugar starvation by placing anthers

on a medium with mannitol as the carbohydrate

source is one the most commonly used stress

pretreatments. This pretreatment has provided con-

sistently high chromosome doubling rates in barley

(Kasha et al. 2001; Shim et al. 2006) and wheat (Hu

and Kasha 1997). In wheat, a stress pretreatment that

delayed nuclear division and retained microspores at

the uninucleate stage produced more green plants

than pretreatments in which microspore division

occurred (Hu and Kasha 1999). There is only one

report in maize in which colchicine was applied

during a cold stress pretreatment (Antoine–Michard

and Beckert 1997). In that study, colchicine had no

effect on percentage of doubling but significantly

increased the number of fertile DH plants.

The aim of this work was to study the effect of

colchicine on chromosome doubling and on the andro-

genic response when applied not only during the first

hours of anther and microspore culture, but also during

mannitol stress pretreatment in bread wheat.

Materials and methods

Plant material

Spring wheat cvs. Chris, Pavon, Caramba and the

doubled haploid line DH24033 were used as donor

plants for isolated microspore and anther culture.

Chris is a model cultivar for microspore embryogen-

esis, Pavon is a medium-high responding cultivar,

whereas Caramba and DH24033 are low responding.

226 Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234

123

The DH line was chosen because of its low percent-

age of spontaneous chromosome doubling.

Seeds of donor plants were sown in a paper-pot of

3 cm in diameter with a mixture of peat, vermiculite

and sand (1:1:1). Plants were vernalized for 5 weeks in

a growth chamber at 4�C, under an 8 h photoperiod.

Plants were transplanted to 15 cm diameter pots with

the above soil mixture and cultivated in a growth

chamber at 12�C with a 12 h photoperiod. After

5 weeks, the temperature was increased to 21/18�C and

the photoperiod lengthened to 16 h. Relative humidity

was kept at 70–80%. Fertilization of the plants was

performed as described by Cistue et al. (2006).

Anther and microspore culture

Microspore developmental stage assessment

For every genotype and batch of plants, four spikes

were chosen in order to associate their morphology to

the developmental stage of the microspores. One or

two anthers were taken from the central flower and

squashed in 127.5 g l–1 mannitol. A drop of 40, 60-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stock solution

(4 lg ll–1 with 0.01% Tween 20) was added (Vergne

et al. 1987) and incubation was performed until

nuclei were visible under a UV lamp in an epifluo-

rescent microscope (Nikon Eclipse T300).

Stress pretreatment

Anthers containing the majority of microspores at

the mid- to late-uninucleate stage for anther culture or

at late-uninucleate to early-binucleate stages for

microspore culture were excised from the flower

and plated in 127.5 g l–1 mannitol, 5.9 g l–1 CaCl2plus FHG macronutrients (Hunter 1988) solidified

with 0.8 g l–1 Sea Plaque agarose.

Ovary preconditioned medium

Ovaries from flowers containing microspores at the

late binucleate or trinucleate stages were excised and

used for preconditioning MMS3 medium (MS

medium modified by Hu and Kasha 1997), containing

62 g l–1 maltose, 1 mg l–1 2,4-dichlorophenoxyacetic

acid (2,4-D) and 1 mg l–1 benzyladenine (BA)

(MS3M). This medium was supplemented with

200 g l–1 (MS3MF200) or 300 g l–1 Ficoll 400

(MS3MF300) for anther and microspore culture,

respectively. Medium was preconditioned for 5 days

at 25�C with 10 ovaries per 1.5 ml of culture media

in 3 cm Petri plates.

Microspore isolation and culture

After 5 days of pretreatment, anthers were harvested

in 54.7 g l–1 mannitol and microspores were released

using a glass rod homogeneizer. The isolation

procedure was performed including viable micro-

spore enrichment by centrifugation on a maltose

band, as described by Castillo et al. (2000). Around

50 spikes were used for each isolation. The total

number of microspores was estimated using a haem-

ocytometer (Neubauer) and the percentage of viable

microspores was determined by the fluorescein

diacetate technique (Widholm 1972). After counting,

we centrifuged the microspore suspension (5 min,

110 g), removed the mannitol solution with at Pasteur

pipet and resuspended the pellet in MS3M medium.

Microspores were inoculated at a final density of

80–100 · 103 microspores/ml in 3 cm Petri plates

containing ovary preconditioned MS3MF300. After

8–10 days of culture, an equal amount of similar

fresh medium was added to each plate.

Anther culture

After mannitol pretreatment, anthers were inoculated

in 3 cm plates containing 1.5 ml ovary precondi-

tioned MS3MF200 medium. Around 40 anthers were

cultured per plate. Ten to 12 days after culture, an

equal amount of MS3MF300 was added to each Petri

dish.

Plant regeneration and soil transfer

Embryos that developed after 30–60 days of culture

were transferred to J25-8 medium (Jensen 1983) for

regeneration. Embryos were kept in the dark at 25�C

for 2 days and transferred to the light. After

20–30 days, plants were counted and transferred to

Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234 227

123

Magenta boxes containing similar medium plus NAA

(2 mg l–1) for root development. Plants were vernal-

ized for 5 weeks at 4�C and 8 h photoperiod before

transfer to soil. Afterwards, plants were transferred to

the greenhouse for seed production. Plants with seed

set greater than 90% were considered doubled

haploids.

Colchicine application

Colchicine application during mannitol

pretreatment

The three anthers of each flower were randomly

distributed to three pretreatment media containing

different concentrations of colchicine: 0 (Control), 150

(Col 150) and 300 mg l–1 (Col 300), so that each

pretreatment medium contained one anther from every

flower. After 5 days of pretreatment, microspores were

isolated and cultivated as previously described.

Colchicine application during the first hours

of microspore and anther culture

In microspore culture, four treatments were used: one

untreated control in which microspores were cultivated

as previously described; two treatments in liquid

MS3M with colchicine (150 and 300 mg l–1); and

one control treatment in liquid MS3M without colchi-

cine. In anther culture, three treatments were applied:

0, 150 and 300 mg l–1 colchicine in liquid MS3M

medium. In both types of culture, colchicine treatments

were conducted in 3 cm plates containing 1.5 ml

medium for 48 h. After this time, treated microspores

were transferred to a 15 ml centrifuge tube and washed

in liquid MS3M by centrifugation (5 min, 110 g).

Treated anthers were washed with 2 ml liquid MS3M.

Afterwards, microspore and anther cultures were

performed as previously described.

Ploidy analysis

Ploidy was estimated by flow cytometry after trans-

ferring plants to soil. Young leaves were chopped in

2 ml Cystain UV ploidy solution (Partec) and filtered

through a 30 lm nylon filter. Samples were analyzed

in PA or PAS cytometer (Partec). Leaves from young

seedlings were used as control. At least 50 plants

from each treatment were analyzed, unless the

number of green plants was lower.

Data analysis

For microspore cultures, each microspore isolation was

considered a replicate. Four replicates from different

batches of plants were used for studying the effect of

colchicine application during pretreatment or culture.

Anther culture experiments consisted of ten replicates

of approx. 40 anthers per treatment and genotype. The

following variables were recorded: number of embryos

(nEmb), number of green plants (nGP), and total

plants, all per 100 anthers, and percentage of doubling

expressed as number of doubled haploids per 100

analyzed plants (pDH). Percentage of regeneration

(number of regenerated plants per 100 embryos; pReg),

percentage of green plants (number of green plants per

100 total plants; pGP) and number of green DH plants

per 100 anthers (nGDH) were calculated.

All experiments were established in a completely

randomized design. Standard SAS/STAT procedures

were used for statistical analysis (SAS 1988).

ANOVA was conducted for each genotype sepa-

rately, using the GLM (Generalized Linear Model)

procedure for all the variables, except for pDH which

was analyzed using the v2-test. Mean separation was

tested by the Duncan method (a £ 0.05).

Results

Colchicine application during mannitol

pretreatment

In the model cv. Chris, either of the two colchicine

concentrations used did not significantly affect any of

the variables related to plant production: nEmb, nGP,

pReg or pGP (Table 1). Among these variables, only

nGP was significantly increased in the medium-high

responding cv. Pavon, from 7 in control to 11 with

300 mg l–1 colchicine. In Caramba, similar percent-

ages of regeneration and green plants were obtained

in control and 300 mg l–1 colchicine cultures,

although a detrimental effect was observed with

150 mg l–1. Similar numbers of embryos and green

plants were obtained in control and colchicine treated

cultures of Caramba.

228 Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234

123

Regarding percentage of chromosome doubling

(pDH), the 150 mg l–1 colchicine treatment did not

differ significantly from controls of any cultivar

(Table 1). However, the 300 mg l–1 treatment was

detrimental in cv. Pavon, stimulatory in cv. Caramba

and ineffective in cv. Chris.

The number of green DH plants, which expresses

the index of success of the procedure, was unaf-

fected by colchicine in Chris and Caramba.

However, this variable was significantly improved

in Pavon, from 4 in control to 6 with 300 mg l–1

colchicine, mainly due to the greater number of

green plants produced.

Colchicine application during the first hours of

microspore and anther culture

Effect of the application method in microspore

culture

To study the effect of the application method itself,

we compared untreated microspores (Control) and

microspores treated with 0 mg l–1 colchicine (Col 0)

(Table 2). There was a negative effect of the

treatment procedure in cvs. Chris and Pavon. The

percentage of green plants in cv. Pavon was reduced

significantly from 66% to 18%. This led to a decrease

Table 1 Effect of the incorporation of colchicine during the mannitol stress pretreatment applied to anthers, on microspore culture

response of three cultivars of bread wheat

Cultivar Treatment (mg l–1) nEmb* pReg pGP nGP* pDH nGDH*

Chris Col 0 90 a+ 69 a 98 a 61 a 70 a 42 a

Col 150 123 a 65 a 99 a 79 a 60 a 50 a

Col 300 96 a 70 a 98 a 66 a 67 a 44 a

Pavon Col 0 34 a 54 a 37 a 7 b 66 a 4 b

Col 150 46 a 49 a 37 a 8 ab 72 a 5 ab

Col 300 55 a 49 a 43 a 11 a 56 b 6 a

Caramba Col 0 21 a 56 a 50 a 6 a 55 b 4 a

Col 150 27 a 49 b 28 b 4 a 60 ab 3 a

Col 300 21 a 52 ab 45 a 5 a 69 a 3 a

* Values are based on 100 anthers+ Values followed by the same letter within cultivars and columns are not significantly different (P \ 0.05)

Table 2 Effect of the incorporation of colchicine during the first 48 h of microspore culture of three genotypes of bread wheat

Genotype Treatment (mg l–1) nEmb* pReg pGP nGP* pDH nGDH*

Chris Control 58 a+ 41 a 98 a 23 a 62 b 14.3 a

Col 0 44 a 29 a 99 a 13 ab 53 b 6.7 a

Col 150 33 a 37 a 100 a 12 ab 55 b 6.6 a

Col 300 37 a 26 a 99 a 9 b 77 a 7.2 a

Pavon Control 13 ab 47 a 66 a 4 a 35 c 1.4 a

Col 0 9 b 37 a 18 b 1 a 50 b 0.3 b

Col 150 21 a 55 a 30 ab 3 a 57 b 1.9 a

Col 300 21 a 36 a 38 a 3 a 88 a 2.5 a

DH24033 Control 9 a 17 a 87 a 1 a 22 c 0.3 b

Col 0 28 a 14 a 93 a 4 a 34 b 1.2 ab

Col 150 34 a 32 a 94 a 10 a 60 a 6.2 a

Col 300 32 a 27 a 90 a 8 a 73 a 5.6 a

* Values are based on 100 anthers+ Values followed by the same letter within genotypes and columns are not significantly different (P \ 0.05)

Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234 229

123

in the nGP, with a two-fold and a four-fold decrease

in Chris and Pavon, respectively. However, in the

DH24033 line, the method of application enhanced

nEmb, without affecting pReg or pGP, and thus

resulted in a four-fold increase in the number of green

plants.

The percentage of spontaneous doubling was

significantly increased by the application method in

cv. Pavon (from 35% to 50%) and DH24033 (from

22% to 34%) (Table 2). The number of green DH

plants was also affected by the application method. A

two-fold and a five-fold decrease in this variable were

observed in cvs. Chris and Pavon, respectively,

mainly due to the lower number of green plants

produced in the treated control. Conversely, the

number of green DH plants from DH24033 was

increased from 0.3 in control cultures to 1.2 in treated

control, because of the greater number of embryos in

this treatment.

Effect of the colchicine application during the first

hours of microspore culture

The effect of colchicine at 0 (Col 0), 150 (Col 150)

and 300 mg l–1 (Col 300) in the induction medium on

green plant production varied with the genotype

(Table 2). In Pavon, a 2-fold increase in nEmb was

observed with both concentrations compared with

0 mg l–1. Percentage of green plants was also signif-

icantly increased up to 2-fold with 300 mg l–1 in

Pavon. As a consequence, the number of green plants

increased from 1 with 0 mg l–1 to 3 with 150 mg l–1.

No significant differences were observed in nEmb,

pReg, nGP and pGP in cv. Chris and DH24033.

The percentage of chromosome doubling was

significantly increased with 300 mg l–1 colchicine

compared with 0 mg l–1 in the three genotypes used.

The greatest effect was observed for DH24033 and

cv. Pavon with a 118% and 76% increase in the

percentage of doubling, respectively.

Similar numbers of green DH plants in cv. Chris

were obtained with 0 mg l–1 and the two colchicine

concentrations used. In Pavon, the number of green

DH plants increased up to 8 times with 300 mg l–1,

due not only to the greater percentage of chromosome

doubling but also to the greater number of embryos

and percentage of green plants obtained compared

with 0 mg l–1. In DH24033 this variable increased,

although not significantly, from 1.2 with 0 mg l–1 to

5.6 with 300 mg l–1 colchicine.

Effect of the colchicine application during the first

hours of anther culture

Colchicine did not significantly affect the number of

responding anthers, embryos and green plants, or

percentages of regeneration and green plants in either

of the two cultivars used (Table 3), although a slight

decrease in the number of embryos occurred in

Caramba with 150 mg l–1.

Chromosome doubling significantly increased in

colchicine treatments in both cultivars (Table 3).

Similar percentages of spontaneous doubling were

obtained in the control treatment for both cultivars

(33%), and it improved significantly up to 50% in

Pavon and 58% in Caramba, after treatment with

300 mg l–1 of colchicine. As a consequence, the

number of green DH plants also increased signifi-

cantly (about 50%) in both cultivars when 300 mg l–1

colchicine was incorporated during the first hours in

the induction medium.

Table 3 Effect of the incorporation of colchicine during the first 48 h of anther culture of two cultivars of bread wheat

Cultivar Treatment (mg l–1) Resp. Ant (%) nEmb* pReg pGP nGP* pDH nGDH*

Pavon Col 0 44 a+ 419 a 50 a 62 a 117 a 33 b 38 b

Col 150 43 a 361 a 51 a 66 a 144 a 35 b 46 b

Col 300 43 a 376 a 48 a 60 a 129 a 50 a 60 a

Caramba Col 0 23 a 178 a 49 a 61 a 68 a 33 b 23 b

Col 150 21 a 103 a 46 a 61 a 32 a 54 a 15 b

Col 300 22 a 159 a 58 a 64 a 70 a 58 a 35 a

* Values are based on 100 anthers+ Values followed by the same letter within cultivar and columns are not significantly different (P \ 0.05)

230 Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234

123

Comparison of ploidy and plant fertility measured

by percent seed set was performed. The correlation

between ploidy determined by flow cytometry and

fertility of plants was high (r2 = 87.8, P = 0.01). The

percentage of aneuploid plants that produced few

seeds was 0.1%. Seed set from DH plants from

colchicine treated cultures was similar to that of

control plants.

Discussion

This is the first report of the influence of colchicine

incorporated into the mannitol stress pretreatment on

the androgenetic process. Mannitol pretreatments at

28�C to wheat uninucleate microspores have delayed

nuclear division and produced more green plants (Hu

and Kasha 1999). Since colchicine inhibits spindle

formation, and thus could have accumulated mi-

crospores at mitosis, an increase in the number of

green plants might have been expected by the

application of colchicine during the pretreatment.

However, in this study, a significant increase in the

number of green plants was observed with 300 mg l–1

only for cv. Pavon. Incorporation of colchicine during

cold pretreatment in maize improved anther response

and embryogenesis, without affecting percentage of

doubling (Antoine-Michard and Beckert 1997). On

the contrary, in this study, a significant increase in

percentage of doubling was observed in cv. Caramba

with 300 mg l–1 whereas this concentration produced

a significant decrease in cv. Pavon. These results

show that the colchicine effect on green plant

production and percentage of doubling was genotype

dependent.

When colchicine was applied during the first hours

of culture, its effects on number of embryos and on

percentage of green plants depended on the genotype

and on the culture method. In microspore culture,

colchicine improved these two variables only in

cultivar Pavon, but had no influence in either of the

two cultivars used in anther culture. An increase in

embryogenesis was also reported in microspore

culture of Brassica (Zhou et al. 2002a, b), whereas

no effect was observed in wheat microspore culture

(Hansen and Andersen 1998). In wheat anther

culture, enhancement of embryogenesis (Barnabas

et al. 1991) and toxic effects (Navarro-Alvarez et al.

1994; Redha et al. 1998a, b) have been described.

The different genotypes used in these studies could

explain these contradictory results. Also, toxics

effects have been reported in F1 durum · wheat

hybrids (Tersi et al. 2006). Stimulation of embryo-

genesis has also been reported in anther culture of

some genotypes of maize (Obert and Barnabas 2004)

and rice (Alemanno and Guiderdoni 1994). Different

actions of colchicine have been proposed that could

explain the positive effects on embryogenesis, as an

increase of symmetrical divisions (Szakacs and

Barnabas 1995), the depression in the synthesis of

pollen specific tubulins (Cleveland et al. 1983; Car-

penter et al. 1992), and cytoskeletal restructuration

(Shariatpanahi et al. 2006).

Negative effects on percentage of green plants in

microspore culture (Hansen and Andersen 1998) and

negative and positive effects in anther culture (Bar-

nabas et al. 2001; Ouyang et al. 1994; Redha et al.

1998a, b; Zamani et al. 2000) have been previously

described in wheat. It has been suggested that

colchicine could cause a reduction of chloroplast

DNA abnormalities (Aubry et al. 1989) or a selective

elimination of microspores having abnormalities

(Barnabas et al. 1991), increasing the percentage of

green plants.

In this study, colchicine application during the first

hours of microspore or anther culture resulted in

higher rates of chromosome doubling in all the

genotypes. These results are in accordance with those

previously reported in anther culture (Barnabas et al.

1991; Navarro–Alvarez et al. 1994; Redha et al.

1998a, b; Zamani et al. 2000) and microspore culture

of wheat (Hansen and Andersen 1998), as in other

species, such as maize (Saisingtong et al. 1996;

Barnabas et al. 1999), triticale (Arzani and Darvey

2001) and Brassica (Mollers et al. 1994; Hansen and

Andersen 1996; Zhou et al. 2002a, b). The doubling

rate increased more significantly in cv. Pavon and

DH24033 than in cv. Chris. Genotypic dependence

has also been described previously in wheat (Barna-

bas 2003; Zamani et al. 2003) and Brassica (Mollers

et al. 1994; Weber et al. 2005). The differences

among genotypes in their responses to colchicine

might be related to the kinetics of mitotic division in

culture (Zaki and Dickinson 1991).

A compromise should be adopted for the selection

of concentration and treatment duration. Colchicine

concentrations above 120 mg/l for 48 h in micro-

spore culture (Hansen and Andersen 1998) and

Plant Cell Tiss Organ Cult (2007) 91:225–234 231

123

100–200 mg l–1 for 72 h in anther culture (Navarro-

Alvarez et al. 1994; Redha et al.1998a) have been

reported to increase percentage of doubling but also

reduced embryogenesis and/or green plant regenera-

tion in wheat. However, the concentrations of

colchicine applied in the present study allowed us

to increase percentage of doubling and still no

deleterious effects, or even positive effects on

androgenic response were produced. This suggests

that higher concentration of colchicine could further

improve DH plant production.

We observed a lower increase in the percentage of

chromosome doubling in anther culture than in

microspore culture of cv. Pavon with 300 mg l–1

colchicine (51% and 76%, respectively). Also,

positive effects produced by colchicine on embryo-

genesis and percentage of green plants in microspore

culture of Pavon were not observed in anther culture.

This variation of colchicine effects between micro-

spore and anther culture could be due to the fact that

different microspore stages were used. Also, the

anther wall could be acting as a filter (Pulido et al.

2005), avoiding complete absorption of colchicine. If

so, longer treatments or higher concentrations of

colchicine would be necessary in anther than in

microspore culture to produce the same effect.

The negative effect of the application method itself

in cvs. Chris and Pavon could be due to the initial

culture of microspores in liquid medium and

subsequent manipulation of microspores during

washing. Similar effects have been described in

wheat (Hansen and Andersen 1998) and in Brassica

(Hansen and Andersen 1996; Zhao et al. 1996b).

However, in this study around a 3-fold increase in the

number of embryos was produced by the application

method in the DH line. This positive effect could be

explained by the high percentage of mortality of the

microspores during the first 2 days of culture in this

cultivar. Washing microspores could be helpful for

the elimination of toxic compounds released by dead

or deteriorating microspores into the culture medium,

thus increasing the number of embryos. These results

agree with those reported in Brassica by Fletcher

et al. (1988) and Zhou et al. (2002b) who found that

a change of the induction medium 15–24 h after

microspore isolation could be essential to allow

normal embryo initiation and development.

The incorporation of colchicine during the first

hours of anther and microspore culture increased the

number of green DH plants compared with treated

controls in two cultivars and the DH24033 whereas

colchicine application during the stress pretreatment

only increased the number of green DH plants in one

of the two cultivars used. From these results we

conclude that colchicine application during the first

hours of culture is more effective than during the

stress pretreatment. Colchicine was successfully used

in both anther and microspore culture, in cultivars

with medium or low rates of doubling. These results

encourage the introduction of this methodology into

wheat breeding programs. Further improvements

could be achieved by optimization of the application

method in microspore culture and by the application

of longer treatments in anther culture.

Acknowledgements MS was the recipient of a fellowship

from the Ministerio de Educacion y Ciencia of the Spanish

Government. We thank the Instituto de Agrobiotecnologıa y

Recursos Naturales (UPNA-CSIC) for the use of the PA flow

cytometer. The research was supported by Proyects from the

Plan Nacional de Recursos y Tecnologıas Agroalimentarias

AGL2002-04139-C02-02 and AGL2005-07195-C02-01.

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