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CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO FITOQUÍMICO DE FRUTOS DE Syzygium
paniculatum (G.) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
DIEGO ORLANDO CAMELO MUNEVAR
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, 2016
CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO FITOQUÍMICO DE FRUTOS DE Syzygium
paniculatum (G.) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
DIEGO ORLANDO CAMELO MUNEVAR
MODALIDAD INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN
Director:
CHIARA CARAZZONE
PhD EN QUÍMICA Y TECNOLOGÍAS FARMACEÚTICAS
Codirector:
JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ
LICENCIADO EN QUÍMICA, ESPECIALISTA EN ANÁLISIS QUÍMICO
INSTRUMENTAL, MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS CON ÉNFASIS EN
FITOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, 2016
Nota de Aceptación
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
Jurado
___________________________
Jurado
Bogotá 18 de Julio de 2016
AGRADECIMIENTOS
A mis padres que son el motor de mi vida, que me han apoyado en los momentos más
difíciles y me han alentado a culminar este pasó en mi proyecto de vida. Señora Hilda y
señor Manolo gracias infinitas por siempre creer en mí.
A Laura y Rodrigo porque llenan de alegría mi vida, porque me inspiran todos los días.
Al Laboratorio de Fitoquímica y Etnofarmacia de la Universidad de los Andes que me abrió
las puertas para realizar esta investigación. A las profesoras Chiara Carazzone y Clara
Quijano y a mis compañeros de laboratorio Paula Galeano, Gerson López, Danny Díaz, Lina
Gómez y Jerson Benavides por su calidez humana, su acompañamiento y apoyo incesante.
Al profesor Javier Matulevich de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su
valiosa orientación y acompañamiento.
A mi amada Universidad Distrital Francisco José de Caldas en donde me formé como
profesional y como persona, procuraré ser siempre un digno embajador de su excelencia y
compromiso.
6
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 11
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 12
2.1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .................................................................. 12
2.2. HIPÓTESIS ............................................................................................. 12
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN ...................................................................... 13
4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 15
4.1. OBJETIVO GENERAL ............................................................................... 15
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 15
5. MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 16
5.1. FAMILIA MYRTACEAE ............................................................................ 16
5.1.1. Características generales de la familia Myrtaceae ............................... 16
5.1.2. Características morfológicas de la familia Myrtaceae .......................... 16
5.1.3. Usos etnobotánicos de la familia Myrtaceae ....................................... 17
5.1.4. Actividades biológicas evaluadas en especies de la familia Myrtaceae . 18
5.1.5. Quimiotaxonomía de la familia Myrtaceae ......................................... 18
5.2. GÉNERO SYZYGIUM ............................................................................... 21
5.2.1. Características generales del género Syzygium .................................... 21
5.2.2. Características morfológicas del género Syzygium ............................... 22
5.2.3. Usos etnobotánicos del género Syzygium ........................................... 23
5.2.4. Actividad biológica de especies del género Syzygium .......................... 24
5.3. Especie Syzygium paniculatum .............................................................. 24
5.3.1. Características generales de la especie Syzygium paniculatum ............ 24
5.3.2. Características morfológicas de la especie Syzygium paniculatum ....... 25
5.3.3. Usos etnobotánicos de la especie Syzygium paniculatum .................... 25
5.3.4. Actividad biológica de la especie Syzygium paniculatum ..................... 26
5.3.5. Estudios fitoquímicos de la especie Syzygium paniculatum ................. 26
5.4. Actividad antioxidante ........................................................................... 26
5.4.1. Ensayo de decoloración del catión radical ABTS+• ................................ 27
6. METODOLOGÍA ................................................................................................ 28
7
6.1. Generalidades ....................................................................................... 28
6.2. Métodos de separación cromatográfica ................................................. 28
6.3. Técnicas para la elucidación estructural .............................................. 28
6.3.1. Espectrometría UV-Vis .................................................... 28
6.3.2. Espectrometría de masas ................................................ 28
6.4. Estudio fitoquímico de frutos de Syzygium paniculatum ........................ 29
6.4.1. Productos químicos y reactivos .......................................................... 29
6.4.2. Recolección, identificación y caracterización del material vegetal ........ 29
6.4.3. Extracción con metanol, acetato de etilo, cloroformo y hexano ........... 30
6.4.4. Evaluación de la actividad antioxidante .............................................. 30
6.4.5. Identificación de grupos de metabolitos secundarios .......................... 31
6.4.6. Extracción y caracterización química de metabolitos secundarios de alta
polaridad ........................................................................................................ 31
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS .................................................................................. 32
7.1. Análisis fitoquímico preliminar .............................................................. 32
7.2. Evaluación de la actividad antioxidante ................................................. 33
7.3 Caracterización de metabolitos secundarios en extracto metanólico de SP .. 35
7.3.1. Ácidos orgánicos pequeños .................................................................... 36
7.3.2 Derivados de ácidos hidroxicinámicos ..................................................... 39
8. CONCLUSIONES ................................................................................................ 43
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 44
10. ANEXOS ............................................................................................................ 48
8
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1 Distribución de la familia Myrtaceae. (Global Biodiversity Information Facility, s.f.) ............ 16
Fig. 2 Características morfológicas de la familia Myrtaceae ............................................................ 17
Fig. 3 Distribución del género Syzygium. (Global Biodiversity Information Facility, s.f.) ................. 22
Fig. 4 Caraterísticas morfológicas del género Syzygium .................................................................. 23
Fig. 5 Fruto maduro de Syzygium paniculatum (G.) ......................................................................... 25
Fig. 6 Formación del radical ABTS+• en presencia de agente oxidante (41) ..................................... 27
Fig. 7 Fórmula estructural del Trolox (Upert et al, 2009) ................................................................. 27
Fig. 8 Extracción con solventes de polaridad creciente ................................................................... 30
Fig. 9 Porcentaje de inhibición de agentes oxidantes en extractos de Syzygium paniculatum (G.) 35
Fig. 10. Cromatograma de iones totales (TIC) de extracto MeOH de Syzygium paniculatum (G.) .. 36
Fig. 11 Espectro MS2 del ácido málico.............................................................................................. 37
Fig. 12 Principales fragmentaciones del ácido málico ..................................................................... 37
Fig. 13 Espectro MS2 del ácido quínico ............................................................................................ 38
Fig. 14 Principales fragmentaciones del ácido quínico .................................................................... 38
Fig. 15 Fórmula estructural del resveratrol ...................................................................................... 39
Fig. 16. Espectro MS2 del ácido caféico ............................................................................................ 39
Fig. 17 Descarboxilación del ácido caféico ....................................................................................... 40
Fig. 18 Espectro MS2 de derivado del ácido quínico ........................................................................ 40
Fig. 19 Fragmentación del derivado de ácido quínico ..................................................................... 41
Fig. 20 Patrón de fragmentación desde t=5 min hasta t=80 min ..................................................... 41
Fig. 21 Patrón de fragmentación desde t=80 min hasta t=90 min .................................................... 42
9
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Actividad biológica reportada en especies de la familia Myrtaceae .................................... 18
Tabla 2 Estudios químicos realizados a la Familia Myrtaceae. ......................................................... 19
Tabla 3 Actividad biológica reportada en especies del género Syzygium ........................................ 24
Tabla 4 Información de reactivos ...................................................................................................... 29
Tabla 5 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................................ 32
Tabla 6 Absorbancia soluciones de extractos SP y patrón de Trolox a diferentes ........................... 33
Tabla 7 Inhibición del radical ABTS+• por acción de soluciones de extractos y Trolox ..................... 34
Tabla 8. Datos MS y MSn de metabolitos en extracto MeOH de SP ................................................. 36
Tabla 9 Prueba ANOVA de un factor para extractos del SP y Trolox ................................................ 48
10
RESUMEN
La Syzygium paniculatum (G.) (SP), conocida como ciruela sabanera bogotana, es una
planta ornamental nativa de las costas australianas y naturalizada en algunos países de
América Latina. El fruto es consumido tradicionalmente en preparación de jaleas,
mermeladas y jarabes. El estudio químico de frutos de Syzygium paniculatum (G.) se ha
enfocado en analizar la composición de sus volátiles y de algunos compuestos fenólicos,
así como la capacidad antiproliferativa de estos frente al cáncer pancreático. La presente
investigación tuvo como objetivo determinar la capacidad antioxidante de cuatro
extractos del fruto de polaridad diferente y la identificación de los metabolitos
secundarios mayoritarios presentes en el extracto con la mayor actividad biológica
evaluada.
Se recolectaron frutos en estado de madurez, color magenta a morado, diámetro axial de
1.5 a 2.0 cm y ecuatorial de 0.9 a 1.3 cm, pH 4.2 a 4.5, °Brix 7.7 a 8, 0.330 a 0.410 kg/cm2
de dureza y una humedad de 80.5%. Al extracto etanólico total obtenido por extracción a
reflujo por Soxhlet, se efectuó el análisis fitoquímico que indicó la presencia de taninos,
flavonoides y carbohidratos; los metabolitos fijos del fruto fueron extraídos mediante
sistema de extracción sólido-líquido asistido por ultrasonido en metanol, acetato de etilo,
cloroformo y hexano, para cada extracto obtenido se evaluó la actividad antioxidante
mediante el ensayo de decoloración del catión radical ABTS+• encontrando bioactividad
alta en el extracto de metanol. El extracto metanólico fue analizado por cromatografía
líquida de alta resolución acoplada a espectrómetro de masas (HPLC-PDA-ESI-MS/MS),
identificando a campo bajo ésteres de ácidos orgánicos como ácido málico y quínico;
mientras que a campo medio y alto se identificaron polímeros con unidades de fenol y un
compuesto de m/z 136, probablemente 4-etilbenceno-1,2 diol. Los resultados obtenidos
perfilan a la ciruela sabanera como un fruto promisorio con alto contenido antioxidante.
11
1. INTRODUCCIÓN
La química de los productos naturales es una de las líneas de investigación química más
ampliamente desarrollada y promovida en el mundo debido al alto impacto que sus
resultados han tenido en todo tipo de industrias y al creciente interés generalizado de
optimizar los procesos con el menor impacto ambiental y toxicológico posible, un aporte
reciente desde los productos naturales a la humanidad se dio por ejemplo en el
tratamiento contra la malaria donde la artemisina, una molécula encontrada en extractos
del ajenjo dulce (Artemisia annua) ha mostrado la mejor eficacia combatiendo los
parásitos que producen esta enfermedad además de ser tolerada por la mayoría de
pacientes, este aporte de la científica china Youyou Tu mereció el reconocimiento en el
año 2015 del premio nobel de medicina (1). En cuanto a definiciones, un producto natural
se define como cualquier compuesto orgánico producto del metabolismo secundario de
un organismo vivo que posee en su estructura química uno o varios puntos con actividad
biológica en animales y humanos. La obtención de dichos compuestos a partir de la fuente
natural involucra básicamente las etapas de extracción, aislamiento, purificación y
determinación estructural para lo cual se hace uso de pruebas preliminares ampliamente
estudiadas y de técnicas instrumentales como la espectrofotometría UV-visible,
espectroscopia de masas, resonancia magnética nuclear, cromatografía liquida de alta
resolución, entre otras (2).
El desarrollo de múltiples técnicas en cada una de las etapas de obtención del metabolito
ha permitido vincular los estudios de la química de productos naturales con diversas
ramas del conocimiento lo cual se refleja en la cantidad de proyectos que desde el siglo
pasado logran integrar los resultados de las investigaciones científicas a la sociedad a
través de la técnica y la tecnología, es el caso de varios estudios fitoquímicos desarrollados
en los últimos años que han permitido encontrar relación entre el riesgo de padecer
Alzheimer, una enfermedad neurodegenerativa, y el estrés oxidativo generado a nivel
cerebral por diferentes factores. Además, algunos estudios reportan el potencial de los
compuestos fenólicos de diversos extractos naturales para combatir dicho estrés
presentándolos como alternativa a los antioxidantes naturales más ampliamente
utilizados como la vitamina C y la E (3,4).
12
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
2.1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Desde el punto de vista fitoquímico el estudio de los frutos de Syzygium paniculatum (G.)
se ha direccionado al análisis de la composición de sus volátiles y de algunos compuestos
fenólicos así como de la capacidad antiproliferativa de estos en el cáncer pancreático.
Aunque los estudios mencionados contribuyen al conocimiento de la planta hace falta
investigar a profundidad el fruto y todos sus metabolitos secundarios; del mismo modo es
importante ampliar los estudios sobre actividad biológica de sus extractos y compuestos
químicos específicos, de acuerdo con lo anterior surgen las siguientes preguntas: ¿Pueden
los extractos de Syzygium paniculatum (G.) tener actividad antioxidante considerable?
¿Qué metabolitos secundarios del fruto maduro de Syzygium paniculatum (G.) son los
principales responsables de su actividad antioxidante?
2.2. HIPÓTESIS
Los frutos maduros de Syzygium paniculatum (G.) presentan alta concentración de
compuestos fenólicos que pueden tener actividad antioxidante significativa y útil en el
desarrollo de medicamentos para el tratamiento de múltiples enfermedades.
13
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
El interés por conocer y utilizar los recursos naturales de América Latina es una tarea que
viene desarrollándose desde el descubrimiento del continente americano y que ha
permitido conocer la amplia biodiversidad que este alberga, especialmente en países
tropicales catalogados desde el año 2002 como megadiversos por poseer los índices de
biodiversidad más altos del mundo (5). En este escenario han tenido lugar múltiples
investigaciones científicas en disciplinas como la química y se han fortalecido algunas de
sus líneas de investigación como es el caso de productos naturales cuyo objetivo principal
es identificar, aislar, purificar y analizar compuestos orgánicos, originados en el
metabolismo secundario de organismos vivos, que poseen en su estructura química una o
varias funcionalidades con actividad biológica en animales y humanos y que pueden ser
aprovechados en beneficio del ser humano y del medio ambiente (2). Gracias al desarrollo
vertiginoso de las técnicas de análisis químico, ahora es posible no solo reconocer el
potencial biológico de extractos naturales sino que también cuantificarlo así como aislar e
identificar estructuralmente las moléculas responsables de esto. Es así como algunos
estudios reportan el potencial de los compuestos fenólicos de diversos extractos naturales
para combatir daño oxidativo presentándolos como alternativa a los antioxidantes
artificiales y naturales más ampliamente utilizados como la vitamina C y la E (3,4).
El continuo estudio de los polifenoles ha dado lugar entonces a la identificación de
muchos de ellos en diversas fuentes naturales y al perfeccionamiento de las condiciones
de extracción, purificación e identificación de los mismos como es el caso de Carazzone et
al. 2012 que proponen métodos de extracción y separación de polifenoles y suministran
una lista de 64 compuestos fenólicos encontrados en el extracto metanólico de la
ensalada de achicoria. Este tipo de estudios son un recurso importante para quienes
desean hacer investigaciones posteriores en el campo de los polifenoles además de
aportar al conocimiento de nuestra biodiversidad (6).
No obstante, aún se conoce poco de muchas especies vegetales del continente entre estas
la Syzygium paniculatum (G.) de la cual se ha estudiado ampliamente sobre su papel en el
ecosistema del que hace parte pero muy poco de su composición química y la actividad
biológica de sus compuestos.
La Syzygium paniculatum (G.), comúnmente conocida en la región andina como ciruelo
sabanera, cerezo australiano o cerezo magenta, es una planta ornamental de la familia
Myrtaceae nativa del trópico australiano y naturalizada en algunos países de América
Latina, presenta fruto globular magenta o púrpura que es consumido tradicionalmente en
preparación de jaleas, mermeladas y jarabes. Sobre este, Quijano-Célis et al. (2013),
analizaron la composición de sus volátiles y reportaron la presencia de pigmentos
polifenólicos cuya estructura química aún es desconocida mientras que Vuong et al.
(2013), muestran que el extracto etanólico presenta alta capacidad antiproliferativa de
14
células cancerígenas en páncreas y cuantifican 5 de los antioxidantes naturales más
abundantes en frutos (4,7).
Los antecedentes presentados permiten perfilar los frutos de Syzygium paniculatum (G.)
como una fuente potencial de compuestos polifenólicos con propiedades antioxidantes y
colorantes que abren la puerta a nuevos estudios sobre la estructura química de
polifenoles y otros metabolitos secundarios con gran potencial en múltiples campos. En
este sentido, el presente proyecto de investigación brinda la posibilidad de conocer los
principales metabolitos secundarios presentes en el extracto del fruto con mayor
capacidad antioxidante y permite reconocer su potencial en el tratamiento de afecciones
del ser humano, relacionadas con el estrés oxidativo.
15
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Contribuir al estudio fitoquímico del fruto maduro de la especie Syzygium
paniculatum (G.).
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener extractos de diferentes polaridades provenientes del fruto de la especie
Syzygium paniculatum (G.).
Evaluar la capacidad antioxidante de los extractos del fruto de Syzygium
paniculatum (G.) mediante ensayo de decoloración del catión radical ABTS+•.
Identificar en el extracto con mayor actividad antioxidante los metabolitos
secundarios mayoritarios haciendo uso de técnicas instrumentales como
espectroscopía UV-Vis y HPLC/MS-MS.
16
5. MARCO TEÓRICO
5.1. FAMILIA MYRTACEAE
5.1.1. Características generales de la familia Myrtaceae
Myrtaceae es una familia de angiospermas que agrupa aproximadamente 133 géneros y más de 3800 especies. Como se observa en la figura 1 su centro de diversidad está en Australia, sureste asiático y las regiones tropicales y subtropicales de América, teniendo una pequeña representación en África (8–10). Los dos grandes centros de dispersión geográfica están representados por la sub familia Leptospermoideae, distribuída principalmente en Australia y la Polinesia, y la subfamilia Myrtoideae, distribuida principalmente en las regiones tropicales y subtropicales americanas y zonas templadas (10).
Fig. 1 Distribución de la familia Myrtaceae. (Global Biodiversity Information Facility, s.f.)
*Las zonas amarillas, naranjas y rojas corresponden a la distribución de la familia Myrtaceae
En Colombia está ampliamente distribuida en todas las formaciones vegetales y el gradiente altitudinal, constituyendo entre un 0,7 y 0,8 % de la totalidad de las plantas de este tipo en el país hasta el año 2014. Se estima que en Colombia existen 24 géneros, 9 introducidos y 15 nativos, así como 165 especies pertenecientes a esta familia siendo Eugenia el género con mayor cantidad de especies reportadas en el país (24) (11).
5.1.2. Características morfológicas de la familia Myrtaceae
Las Myrtaceas son arbustos y árboles leñosos. Presentan hojas enteras, de disposición alternada, opuesta ó algunas veces opuesta cruzada, pecioladas, con estípulas muy
17
pequeñas, glándulas por lo general resinosas y aromáticas, ovario medio inferior a inferior, estambres generalmente numerosos y floema interno. Las flores son generalmente blancas y algunas veces rojas. Producen frutos carnosos en baya o drupa, por lo general con restos florales en el ápice(9,10,12).
Fig. 2 Características morfológicas de la familia Myrtaceae
Todos los géneros nativos colombianos de mirtáceas presentan frutos en baya. A
diferencia de las mirtáceas nativas, algunos géneros introducidos presentan frutos
capsulares (Corymbia, Eucalyptus, Leptospermum, Melaleuca y Metrosideros) y otros,
frutos en baya (Acca, Myrtus, Pimenta y Syzygium) (11).
5.1.3. Usos etnobotánicos de la familia Myrtaceae
Las especies de la familia Myrtacea han sido ampliamente usadas en múltiples campos.
Los tallos del género Eucalyptus por ejemplo son una fuente importante de pulpa y resina
de celulosa, usadas para la fabricación de papel, carbón vegetal y madera mientras que las
hojas presentan alto contenido de aceites esenciales utilizados con fines técnicos y
farmaceúticos como es el caso de las hojas de Eucalyptus citriodora que al ser hervidas en
agua liberan vapores usados para tratar enfermedades respiratorias, disentería, diabetes,
fiebre, gripe, malaria o tuberculosis. Además se emplean como compresas y cataplasmas
para aliviar dolores de gota, neuralgias y reumatismo (12,13).
18
Tradicionalmente, el órgano más empleado en Suramérica con fines medicinales es la hoja
de las especies pertenecientes a esta familia. Destaca entre estas el empleo de hojas secas
del arrayán o murta (Myrtus communis) por parte de algunas comunidades para la
cicatrización del cordón umbilical y en baños para el tratamiento de anemia, neurastenia,
enfermedades reumáticas y elefantiasis. Las infusiones de las hojas del
Ubajay (Hexachlamys edulis) son ampliamente usadas en Brasil para el tratamiento de
bronquitis, tos y tos ferina (13).
5.1.4. Actividades biológicas evaluadas en especies de la familia Myrtaceae
La actividad biológica de la familia de las Myrtaceas está dada principalmente por la
presencia de metabolitos secundarios como taninos y compuestos fenólicos; existen
varios estudios en los cuales se ha encontrado actividad antioxidante, antiproliferativa y
antimicrobiana significativa. A continuación se presentan algunas de las especies
estudiadas y la actividad biológica evaluada en cada una de ellas con resultados
interesantes para su posible aplicación en medicina e industria (4,14–18).
Tabla 1 Actividad biológica reportada en especies de la familia Myrtaceae
ESPECIE ÓRGANO FRACCIÓN
EVALUADA
ACTIVIDAD
BIOLÓGICA
EVALUADA
AUTOR
Syzygium paniculatum
(Gaertn)
Frutos Extracto hidroalcohólico Antiproliferativo (Vuong et al., 2014)
Psidium guayaba (L.)
Frutos Pulpa de fruta Antioxidante (Marquina et al., 2008)
Psidium guineense (Sw.)
Cáscara y
pulpa de
fruto verde
Extracto etanólico Antibacterial (Neira et al., 2005)
Eugenia arata
Hojas
secas Extracto hidroalcohólico Antiproliferativa (Elias et al., 2009)
Eugenia macrosperma
(DC)
Eugenia
Fluminensis (Berg.)
Cáscaras
de fruto
Extracto etanólico
Antioxidante (Do Nascimento et al., 2009)
Myrcianthes rhopaloides
(H.B.K.)
Hojas Extracto etanólico y
aceite esencial Antimicrobiano (Lizcano et al., 2008)
5.1.5. Quimiotaxonomía de la familia Myrtaceae
La familia Myrtaceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias bioactivas
de diversa naturaleza química en corteza, hojas y frutos. De esta familia se han
19
caracterizado compuestos como taninos, flavonoides y terpenoides. La tabla 2 presenta
estudios químicos de diferentes plantas en sus diferentes órganos así como las moléculas
encontradas en cada una de estas investigaciones (4,14–18).
Tabla 2 Estudios químicos realizados a la Familia Myrtaceae.
ESPECIE ÓRGANO
ESTUDIADO COMPUESTOS QUÍMICOS ENCONTRADOS AUTOR
Eugenia
copacabanensis
Hojas y tallos
Clovanediol (1)
Fridelina (2)
Taraxerol (3)
(Junior et al., 2012)
Mirabilis
rotundifolia Tallos
Friedelina (4)
Ácido arjunólico (5)
Ácido betulínico (6)
Lupeol (6)
Lupenona (6)
β- sitosterol (7)
Estigmasferol (8)
Esqualeno (9)
(De Cerqueira et al.,
2002)
Mirabilis
multiflora Hojas
Metoximatteucina (10)
Myriacetina (11)
Miricitrina (12)
1-desmantina (13)
Quercitrina (14)
Guaijaverina (14)
Mirciacitrina I (15)
Mirciacitrina II (15)
Mirciafenona A (16)
2’, 4’, 6’ – trihidroxiacetofenona (17)
Ácido ginkgóico (18)
(Yoshikawa et al., 1998)
[10]
Eugenia edulis Frutos
Quercetina libre y glicosilada (19)
Miricetina libre y glicosilada (20)
Canferol libre y glicosilado (21)
(Hussein et al., 2003)
Eugenia
javanica Frutos
Pinocembrina (22)
Quercetina libre y glicosilada (19)
Miricetina libre y glicosilada (20)
Gossipetina (23)
2,4-dihidroxi-3,5-dimetil-6-Metoxichalcona (24)
2,4-dihidroxi-3-metil-6-metoxichalcona (24)
2,4-dihidroxi-6-Metoxichalcona (24)
(Simirgiotis et al., 2008)
Syzygium
aromaticum Hojas
Syzyginina A (25)
Syzyginina B (26)
(Tanaka et al., 1996)
(1) (2) (3) (4)
20
(5) (6) (7)
(8) (9)
(10) (11) (12)
(13) (14) (15)
(16) (17) (18)
21
(19) (20) (21)
(22) (23) (24)
(25) (26)
5.2. GÉNERO SYZYGIUM
5.2.1. Características generales del género Syzygium
El género Syzygium (Myrtaceae), nativo de Asia, Malasia y Australia, es el género más
diverso en la familia de las Myrtáceas con aproximadamente 1200 especies. La mayor
densidad y diversidad de este género se encuentra en la región malasio-australiana
aunque también se reporta amplia distribución del mismo en el sur y centro de África,
Centroamérica y La Polinesia (10,19–22).
22
Fig. 3 Distribución del género Syzygium. (Global Biodiversity Information Facility, s.f.) *Las zonas amarillas, naranjas y rojas corresponden a la distribución del género Syzygium
Este género está representado en Colombia por 5 especies introducidas para uso
ornamental o, en el caso excepcional del Syzygium jambos (L.) conocido como pomarrosa,
para el consumo de su fruto. Es importante destacar que las especies de Syzygium aún no
crecen de forma espontánea en nuestro país por lo que no se consideran naturalizadas
(11).
5.2.2. Características morfológicas del género Syzygium
El género Syzygium abarca en su gran mayoría árboles además de algunos arbustos
ampliamente distribuidos en trópicos y subtrópicos. Aunque las especies de este género
son taxonómicamente muy diferentes, la mayoría se caracterizan por su abundante
follaje, flores generalmente grandes y vistosas con numerosos estambres largos, frutos
globosos o piriformes, carnosos, algunos comestibles, con una o dos semillas adheridas al
pericarpo y de radícula corta. Las especies de Syzygium que crecen en Colombia presentan
generalmente hojas opuestas, inflorescencias en racimos cortos o panículas, pétalos de
color blanco o rosado así como frutos globosos de color púrpura o rosado en la madurez
(10,11,19,23).
23
Fig. 4 Caraterísticas morfológicas del género Syzygium
5.2.3. Usos etnobotánicos del género Syzygium
Este género es comercialmente importante por sus árboles maderables (Syzygium
aqueum y Syzygium bracteatum) y productores de frutos comestibles, que generalmente
se comen frescos, en ensaladas, cocinados o son preservados para usos caseros. Muchas
especies son cultivadas como árboles ornamentales por el atractivo de las flores con
estambres de colores y frutos frecuentemente de color brillante (10,24–26).
Probablemente la Syzygium aromaticum sea la especie más conocida de este género ya
que los botones de las flores secas son los clavos de olor comerciales utilizados como
especia además, es una de las fuentes de aceites esenciales más conocidas. Es usado en
principalmente en infusiones como expectorante, antiflatulencia y para el tratamiento de
la dispepsia. También se utiliza en odontología como calmante y antiséptico (27).
El jambul, jambolán o pésjua extranjera (Syzygium cumini) es otra de las especies con
múltiples usos en países como India, Malasia, Australia, Brasil y Venezuela. En la India, el
vinagre del fruto verde es usado para tratar problemas estomacales y diuréticos y los
frutos maduros para preparar vinos, mermeladas, conservas y encurtidos así como agente
antidiabético en la medicina tradicional y tribal. El uso tópico del extracto de hojas evita
daños en el ADN inducidos por radiación y el extracto de semilla se utiliza
tradicionalmente en la diabetes (28–31).
Una decocción de la corteza de Syzygium cumini es usada para tratar hemorragias y
disentería. Adicionalmente es usada como enjuague bucal. Las raíces tienen propiedades
diuréticas (30,32).
24
5.2.4. Actividad biológica de especies del género Syzygium
La actividad biológica de los órganos de Syzygium cumini y Syzygium aromaticum ha sido
ampliamente estudiada, contrario a lo que ocurre con las demás especies del género
donde las investigaciones son escasas, destacan las altas actividades antibacterial,
antioxidante y antifúngica. Estos y otros tipos de bioactividad hallados en el género se
presentan a continuación:
Tabla 3 Actividad biológica reportada en especies del género Syzygium
ESPECIE ÓRGANO FRACCIÓN
EVALUADA
ACTIVIDAD
BIOLÓGICA
EVALUADA
AUTOR
Syzygium travancoricum
(G.)
Hojas Aceite esencial Antimicrobiana
Antifúngico (Radha et al., 2002)
Syzygium cumini (L.)
Frutos Cáscara de fruta Antioxidante (Banerjee et al., 2005)
Syzygium cumini (L.)
Frutos Extracto etanólico Antioxidante (Benherlal et al., 2007)
Syzygium cumini (L.)
Semillas Extracto hidroalcohólico
Anticonvulsiva
Sedante (De Lima et al.,1998)
Syzygium samarangense
(B.)
Hojas Extracto etanólico y
aceite esencial Antihiperglicémica (Hanshella et al., 2005)
Syzygium aromaticum Yema
floral Aceite esencial Antioxidante (Huang et al., 2013)
Los estudios presentados anteriormente sugieren que la mayoría de compuestos con
actividad antimicrobiana son mono y sesquiterpenos. Por otra parte, la actividad
antioxidante es atribuida a ácidos orgánicos pequeños y compuestos fenólicos; los taninos
muestran generalmente alta capacidad de captar radicales libres a diferencia de las
antocianidinas y antocianinas que exhiben valores discretos (25,28,30–33).
5.3. Especie Syzygium paniculatum
5.3.1. Características generales de la especie Syzygium paniculatum
La Syzygium paniculatum (G.) es una especie nativa de las costas tropicales de Australia
que se ha adaptado fácilmente al trópico americano, fue descubierta por el botánico
Gaertner en 1789, quien la denominó Eugenia panicula por lo cual se conoció durante
muchos años como Eugenia paniculatum G. sin embargo su nombre cambió hace pocos
años a Syzygium paniculatum (G.) debido a la actualización de los parámetros de
clasificación taxonómica del código de nomenclatura vegetal aceptado mundialmente (34)
25
5.3.2. Características morfológicas de la especie Syzygium paniculatum
Syzygium paniculatum (G.) es un árbol de talla media con alturas promedio de 18 metros y
diámetro de tallo a la altura del pecho de 40 cm, su tronco es ligeramente encorvado y su
corteza tiene un color marrón rojizo. Sus ramas, de color verde y marrón, presentan forma
ligeramente angular y dorsiventralmente aplanada en su etapa temprana mientras que las
mayores son redondeadas y ligeramente escamosas (20).
Las hojas son opuestas, simples, enteras y lanceoladas, crecen hasta 10 cm de largo y 3 cm
de ancho. Poseen prominentes bases en forma de cuña, superficies brillantes de color
verde oscuro con nervios centrales y su pecíolo mide de 2 a 10 mm de largo (20).
Sus inflorescencias se dan en racimos cortos o panículas, las flores de la especie son
blancas, se componen de cuatro pétalos redondeados, cada uno de los cuales es de 4 a 5
mm de ancho. Los estambres son numerosos y miden entre 6 y 16 mm de largo (20).
El fruto es una baya globosa u ovoide brillante de color magenta, blanca, rosa pálida o
púrpura cuyo diámetro promedio es de 18 mm. Cada fruto contiene una sola semilla que
mide entre 5 y 15 mm de diámetro, es de color marrón, forma globular y consta de 1 a 9
embriones apretados. Esta especie florece a finales de verano y principio de otoño y sus
frutos son evidentes en otoño, invierno y principios de primavera(11,20).
Fig. 5 Fruto maduro de Syzygium paniculatum (G.)
5.3.3. Usos etnobotánicos de la especie Syzygium paniculatum
Los frutos de Syzygium paniculatum (G.), al igual que la mayoría de frutos de este género
tradicionalmente se comen frescos y en los últimos años en preparaciones de
mermeladas, jarabes, tartas y pudines (35,36).
26
En América el consumo del fruto es escaso por tanto, carece de interés comercial y la
planta se usa principalmente con fines ornamentales en jardines y vallas verdes (36,37).
5.3.4. Actividad biológica de la especie Syzygium paniculatum
Hasta ahora solo ha sido reportado un estudio evaluativo de actividad biológica en esta
especie. Allí se evaluó la capacidad antioxidante del extracto etanólico total del fruto así
como su efecto inhibitorio en la proliferación de células cancerosas en páncreas
obteniendo que el extracto presenta baja capacidad antioxidante respecto a moléculas
como vitamina C, vitamina E y BHT (BHT es uno de los antioxidantes más utilizados en los
alimentos que contienen grasas y aceites gracias a su capacidad de captar los radicales
libres producidos en la oxidación lipídica autocatalítica, evitando la aparición de olor
rancio en estos productos) además, reducción significativa en la viabilidad de células de
cáncer pancreático tipo MiaPaCa-2 y ASPC-1. Este estudio sugiere que la capacidad
antioxidante puede aumentar significativamente mejorando los protocolos de extracción
usados (4,38).
5.3.5. Estudios fitoquímicos de la especie Syzygium paniculatum
Los estudios fitoquímicos hechos a esta especie son muy escasos. Actualmente se reporta
en Latinoamérica el estudio de Quijano-Célis et al., (2013) sobre la determinación de la
composición de volátiles del fruto mediante la extracción-destilación simultánea con
disolvente orgánico (SPME) e identificación mediante cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas. En otro estudio realizado en Australia, Vuong et al., (2013)
hicieron la extracción etanólica de los compuestos fenólicos totales e identificaron y
cuantificaron ácido gálico, ácido clorogénico, catequina, y epicatequina mediante la
comparación de los tiempos de retención de estándares de referencia con los del análisis
HPLC del extracto bajo las mismas condiciones cromatográficas. (4,7)
5.4. Actividad antioxidante
La actividad antioxidante de extractos y/o metabolitos secundarios de origen vegetal es
una de las determinaciones que se vienen realizando de forma generalizada en nuevos
productos naturales con la finalidad de encontrar compuestos alternativos a los
convencionalmente usados que presenten menos contraindicaciones y mayor eficiencia
frente a los agentes oxidantes.
Dos de los ensayos in vitro más usados para medir la captación y disminución de radicales
libres estables usan los cationes radicales DPPH* y ABTS+• en solución, cada uno con una
banda de absorción característica en la región visible del espectro electromagnético, y
miden la disminución de la absorción de la solución después de la adición del antioxidante
e incubación de la mezcla (39).
27
5.4.1. Ensayo de decoloración del catión radical ABTS+•
El ensayo ABTS+• es un método espectrofotométrico diseñado para la medición de la
actividad antioxidante total de sustancias puras o mezclas a través de la disminución de la
absorbancia de una solución con el catión radical ácido 2,2'–azino–bis–[3–
etillbenzotiazolin–6–sulfonico] (ABTS+•) cuando la misma entra en contacto con la
muestra. La decoloración del ABTS+• depende de la concentración del agente reductor y
del tiempo de contacto entre el agente reductor y el oxidante además, suele expresarse
como porcentaje de inhibición del ABTS+• o como inhibición relativa a la inhibición que
generaría el Trolox (Antioxidante estándar análogo de la vitamina E desarrollado por
Hoffmann-La Roche) en la misma solución de ABTS+• bajo las mismas condiciones (40).
La formación del catión radical ABTS+• suele generarse por la reducción del ABTS con
persulfato de potasio, el catión radical resultante presenta varios longitudes de onda
donde se producen picos de absorbancia pero para el ensayo ABTS+• suele considerarse
734 nm como la longitud de onda de máxima absorbancia.
Fig. 6 Formación del radical ABTS+• en presencia de agente oxidante (41)
Fig. 7 Fórmula estructural del Trolox (Upert et al, 2009)
28
6. METODOLOGÍA
6.1. Generalidades
El estudio fitoquímico del fruto de Syzygium paniculoatum (G.) fue llevado a cabo
haciendo uso de métodos cromatográficos, espectrométricos y espectroscópicos
ampliamente utilizados en la separación, elucidación estructural y determinación de
actividad biológica de metabolitos secundarios.
El análisis HPLC-PDA-ESI-MS/MS se realizó usando un dispositivo Thermo Scientific Dionex
UltiMate 3000 equipado con desgasificador de muestras, bomba binaria,
automuestreador y detector de arreglo de diodos UV-Vis (PDA) acoplado a un
espectrómetro de masas con analizador de trampa iónica y fuente de ionización
electrospray (ESI).
6.2. Métodos de separación cromatográfica
Se establecieron condiciones cromatográficas similares a las empleadas por Carazzone et
al. ( 2012) a excepción de la temperatura de columna (6).
La separación se hizo en una columna analítica Atlantis T3® (150 x 2.1 mm i.d., 3 µm). La
fase móvil fue una mezcla de A (ácido fórmico en agua 0.1%) y B (metanol) a un flujo de
0,3 mL/min y volumen de inyección de 10 µL. El gradiente de elución empleado inició con
2% B aumentando hasta 5% B en 10 minutos, posteriormente a 40% B durante 50 minutos
más, a 60% B en 10 minutos más y a 100% B 10 minutos después manteniéndose en este
último porcentaje durante otros 10 minutos. El tiempo total del protocolo fue de 90
minutos, seguido por un reacondicionamiento de columna. La temperatura del
automuestreador fue de 4 °C mientras que la de columna fue de 20°C.
6.3. Técnicas para la elucidación estructural
6.3.1. Espectrometría UV-Vis
El detector múltiple de longitud de onda empleado fue el Thermo Scientific™ Dionex™
UltiMate™ MWD-3000RS equipado con una lámpara de tungteno y una de deuterio con
rango de detección de longitud de onda entre 280 y 320 nanómetros respectivamente.
6.3.2. Espectrometría de masas
El espectrómetro de masas Thermo Scientific™ LCQ Fleet™ equipado con trampa de iones
se operó en modos data-dependent, full scan y MS/MS usando energía de colisión del 35%
y ancho de aislamiento de 3 m/z.
29
Los parámetros negativo y positivo de la fuente de ionización fueron optimizados
efectuando análisis por inyección de flujo de quercetina (5 ppm en ácido fórmico 0,1% -
metanol (50:50 v/v) ) con 3,5 kV de voltaje de ionización y 260 °C como temperatura del
capilar.
Se empleó el software Thermo Fisher Scientific Excalibur para la adquisición y el
procesamiento de datos.
6.4. Estudio fitoquímico de frutos de Syzygium paniculatum
6.4.1. Productos químicos y reactivos
Los solventes de grado analítico usados se compraron a Chemí a excepción del metanol que se
compró a Panreac.
El metanol grado HPLC se compró a Panreac y el ácido fórmico grado HPLC a Sigma-Aldrich. El agua
grado HPLC (18,2 MΩ.cm a 25 ºC) usada para la preparación de las muestras fue obtenida con un
sistema de purificación de agua Direct-Q® (Millipore, Billerica, MA). Las membranas de filtración
(0,22 µm) fueron compradas a Millipore.
La tabla 4 muestra los solventes usados en la preparación de extractos y separación
cromatográfica de los mismos así como los reactivos empleados en la determinación de la
actividad antioxidante de cada extracto y del patrón de Trolox de referencia
Tabla 4 Información de reactivos
REACTIVO LOTE
Ácido fórmico grado HPLC Sigma-Aldrich
Metanol grado HPLC Panreac
Metanol Chemí
Etanol Chemí
Acetato de etilo Chemí
Diclorometano Chemí
Hexano Chemí
ABTS Sigma-Aldrich
K2S2O8 Sigma-Aldrich
Trolox Sigma-Aldrich
6.4.2. Recolección, identificación y caracterización del material vegetal
El fruto fue recolectado en el restaurante El Pórtico ubicado en el Kilómetro 17 de la
Autopista Norte en Bogotá, Colombia. Se seleccionaron frutos con los siguientes
parámetros de madurez establecidos por Quijano-Célis et al., (2013): color magenta a
morado, diámetro axial de 1.5 a 2.0 cm y ecuatorial de 0.9 a 1.3 cm, pH 4.2 a 4.5, °Brix 7.7
a 8.0, 0.330 a 0.410 kg/cm2 de dureza y una humedad de 80.5. Los frutos sin semilla
30
fueron liofilizados (Labconco, FreeZone 4.5), pulverizados y almacenados a -21°C en
recipientes sellados (7).
El Jardín Botánico de Bogotá realizó la clasificación taxonómica de las plantas usadas en
esta investigación.
6.4.3. Extracción con metanol, acetato de etilo, cloroformo y hexano
Se suspendieron 15 g de fruto tratado en 70 mL de C6H14, se llevaron a ultrasonido
(Branson, 1510) durante una hora, finalmente se separó el extracto del residuo sólido.
Este procedimiento se repitió 3 veces usando en cada una de estas diclorometano
(CH2Cl2), acetato de etilo (AcOEt) y metanol acidificado (MeOH-HCOOH (99:1, v/v)) en este
orden. El siguiente diagrama resume las condiciones de extracción descritas.
Fig. 8 Extracción con solventes de polaridad creciente
Los cuatro extractos obtenidos fueron concentrados en presión reducida a 40°C (Buchi
Switzerland, R-215).
6.4.4. Evaluación de la actividad antioxidante
Cada extracto fue disuelto en mezcla etanol-disolvente extracto (1:1, v/v) para obtener
soluciones de 50, 100, 200, 400 y 500 µg/mL, se determinó su actividad antioxidante
mediante el ensayo de decoloración del catión radical ácido 2,2'–azino–bis–[3–
etillbenzotiazolin–6–sulfonico] (ABTS+•) como lo describe Re (1980) y haciendo uso de un
31
espectrofotómetro Uv-Vis (Thermo Scientific- Genesys 5) (40). La reacción se realizó
directamente en las celdas del espectrofotómetro adicionando en cada prueba 1,5 mL de
solución de ABTS+• a 15 μL de extracto diluido y dejando reaccionar por al menos un
minuto.
Se construyó una curva de calibración usando Trolox como reactivo de referencia con
soluciones de 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 300 ppm, 350 ppm, 400
ppm, 450 ppm y 500 ppm.
Las medidas espectrofotométricas fueron hechas por triplicado a cada solución preparada,
todos los resultados experimentales fueron expresados como valores medios ± desviación
estándar (DE). El análisis de varianza fue realizado usando ANOVA. Valores de p < 0,05 se
consideraron estadísticamente significativos.
6.4.5. Identificación de grupos de metabolitos secundarios
Se preparó un extracto etanólico por extracción sólido-líquido usando 100 ml de etanol
(EtOH) y 10 g de fruto liofilizado. Éstos se sometieron a pruebas químicas de precipitación
y coloración para identificar posibles grupos de metabolitos secundarios. El análisis está
basado en la guía de análisis fitoquímico preliminar propuesta por Sanabria (1999).
6.4.6. Extracción y caracterización química de metabolitos secundarios de alta
polaridad
Se suspendieron 200 µL de extracto metanólico en 980µL de metanol-ácido fórmico (99:1,
v/v), la mezcla se filtró en membrana de 0,22 µm e inyectó en el HPLC-PDA-ESI-MS/MS.
Los componentes mayoritarios en el extracto metanólico fueron identificados haciendo
uso conjunto de los espectros de masas, que revelan masa molecular y principales
fragmentaciones de los compuestos presentes, y la detección UV-Vis para postular
estructuras tentativas que posteriormente se elucidaron y confirmaron a través del
análisis de las fragmentaciones de la espectrometría de masas en tándem.
32
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS
7.1. Análisis fitoquímico preliminar
La tabla 5 presenta los resultados obtenidos en las pruebas químicas realizadas al extracto
etanólico de frutos de la especie Syzygium paniculatum (G.)
Tabla 5 Análisis fitoquímico preliminar
GRUPO DE METABOLITOS SECUNDARIOS
PRUEBA QUÍMICA
RESULTADO
Taninos
Cloruro férrico +
Acetato de Plomo +
Gelatina-sal +
Flavonoides Shinoda +
Antocianidinas Rosenhein +
Leucoantocianidinas Leucoantocianidinas +
Quinonas
Borträger-Kraus -
Comportamiento H+ y OH- -
Rodamina y Amoniaco -
Cumarinas
Hidroxamato férrico -
Erlich -
Fluorescencia -
Saponinas Formación de espuma -
Rosenthal -
Sesquiterpenlactonas Hidroxamato férrico -
Carbohidratos
Baljet +
Tollens +
Antrona +
Molish +
Carotenoides Salkowski -
Triterpenos Libermann - Burchard -
Esteroides Anhídrido acético -
Alcaloides
Valser -
Mayer -
Dragendorff -
Schleiber -
Wagner -
El análisis fitoquímico preliminar indicó la presencia de taninos, flavonoides,
antocianidinas, leucoantocianidinas y carbohidratos evidenciándose que este fruto
presenta los mismos tipos de metabolitos secundarios reportados en otros frutos de la
familia Myrtaceae por Hussein (2003), Simirgiotis (2008), Tanaka (1996) en los cuales los
33
flavonoides, taninos y antocianidinas se encontraron mayoritariamente enlazados a
azúcares por enlaces glucosídicos. Los posibles grupos de metabolitos identificados en
este análisis preliminar presentan alta polaridad y son conocidos por presentar actividad
antioxidante, antiinflamatoria y algunas veces antiproliferativa de células cancerígenas
(4,13,42,43).
7.2. Evaluación de la actividad antioxidante
En este estudio se empleó el ensayo de decoloración del catión ABTS+• para determinar la
actividad antioxidante de los cuatro extractos del fruto y compararla con Trolox, un
antioxidante análogo de la vitamina E desarrollado por Hoffmann-La Roche ampliamente
usado como referencia en este tipo de pruebas debido a su alta capacidad reductora de
radicales libres.
El ensayo consiste en medir la disminución de la absorbancia del ión ABTS+• después de
ser reducido por los antioxidantes presentes en la muestra biológica. La tabla 6 presenta
las absorbancias determinadas para las soluciones de ABTS+• en contacto con el patrón de
Trolox y cada uno de los extractos de Syzygium paniculatum (G.)
Tabla 6 Absorbancia soluciones de extractos SP y patrón de Trolox a diferentes
ABSORBANCIA ± DE*
Trolox MeOH AcOEt CH2Cl2 C6H14
CO
NC
ENTR
AC
IÓN
(p
pm
)
50 0,564 ± 0,010 0,674 ± 0,009 0,631 ± 0,002 0,575 ± 0,009 0,701 ± 0,009
100 0,492 ± 0,012 0,653 ± 0,007 0,627 ± 0,004 0,574 ± 0,008 0,699 ± 0,009
150 0,442 ± 0,007 NA NA NA NA
200 0,390 ± 0,008 0,626 ± 0,009 0,619 ± 0,002 0,573 ± 0,008 0,698 ± 0,009
250 0,337 ± 0,016 NA NA NA NA
300 0,289 ± 0,002 NA NA NA NA
350 0,242 ± 0,006 NA NA NA NA
400 0,178 ± 0,010 0,561 ± 0,008 0,604| ± 0,006 0,573 ± 0,008 0,696 ± 0,009
450 0,128 ± 0,008 NA NA NA NA
500 0,083 ± 0,002 0,537 ± 0,012 0,596 ± 0,002 0,568 ± 0,006 0,692 ± 0,009
1000 NA 0,370 ± 0,008 0,556 ± 0,001 0,560 ± 0,006 0,685 ± 0,009
1479 NA NA NA NA 0,675 ± 0,010
1675 NA NA 0,512 ± 0,011 NA NA
2958 NA NA NA NA 0,651 ± 0,010
3350 NA NA 0,374 ± 0,002 NA NA
3750 NA NA NA 0,541 ± 0,010 NA
6250 NA NA NA 0,518 ± 0,005 NA
6700 NA NA 0,127 ± 0,002 NA NA
12500 NA NA NA 0,465 ± 0,008 NA * Datos expresados como la media ± Desviación estándar; n=3 (ANOVA post-test Tukey: p ˂ 0,05). Not Avalaible
Con el fin de comparar la actividad antioxidante del patrón de Trolox y de los extractos del
fruto, se determinó el porcentaje de inhibición en las soluciones de concentración 400
ppm, 200 ppm, 100 ppm y 50 ppm usando la siguiente ecuación:
34
𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =100 − (AbsABTS+M − AbsB)
𝐴𝑏𝑠𝐴𝐵𝑇𝑆 𝑑𝑖𝑙 × 100
Donde AbsABTS+M corresponde a la absorbancia de la solución de ABTS+• después de ser
parcialmente reducido por los antioxidantes presentes en el extracto o el patrón de
Trolox, AbsB a la absorbancia de la solución blanco (Solvente + extracto ó Trolox) y Abs ABTS
dil a la absorbancia de la solución de ABTS+• y solvente.
Tabla 7 Inhibición del radical ABTS+• por acción de soluciones de extractos y Trolox
MUESTRA PORCENTAJE DE INHIBICIÓN ± DE* IC50 (ppm) TEAC
Trolox
50 22,95 ± 0,779
233,96 1,00
100 30,64 ± 1,366
200 45,00 ± 0,721
400 75,08 ± 1,196
500 88,48 ± 0,125
MeOH
50 7,90 ± 0,443
985,94
0,31
100 10,90 ± 0,321
200 14,90 ± 0,544
400 23,97 ± 0,462
500 27,40 ± 1,170
AcOEt
50 11,85 ± 0,043
3630,19
0,07
100 12,45 ± 0,316
200 13,52 ± 0,541
400 15,67 ± 0,631
500 16,79 ± 0,557
CH2Cl2
50 18,99 ± 0,871
25772,50 0,01
100 19,09 ± 0,816
200 19,18 ± 0,201
400 19,23 ± 0,210
500 19,93 ± 0,230
C6H14
50 1,13 ± 0,014
20390,42
0,02
100 1,42 ± 0,018
200 1,56 ± 0,020
400 1,84 ± 0,133
500 2,17 ± 0,164 * Datos expresados como la media ± Desviación estándar; n=3 (ANOVA post-test Tukey: p ˂ 0,05)
La tabla 7 presenta la capacidad antioxidante de cada uno de los extractos en términos de
porcentaje de inhibición, IC50 (concentración en la cual la solución inhibe en un 50% los
agentes oxidantes del medio) y unidades TEAC (concentración milimolar de una solución
de Trolox que tiene capacidad antioxidante equivalente a una solución 1 mM de la matriz
evaluada) (40,42).
35
Los resultados obtenidos evidencian que el extracto metanólico contiene los compuestos
con mayor capacidad de reducir el radical ABTS+• en el fruto seguido del extracto AcOEt,
aunque con una disminución alta de actividad antioxidante, mientras que los extractos
CH2Cl2 y C6H14 presentan inhibiciones muy bajas. Teniendo en cuenta los resultados del
análisis fitoquímico preliminar se puede suponer que todos los grupos de metabolitos
secundarios posiblemente encontrados en el fruto hacen parte de estas dos fracciones
debido a la alta polaridad que tienen los taninos, flavonoides y antocianidinas gracias a su
estructura y que se incrementa por la formación de glucósidos con carbohidratos del
medio.
Fig. 9 Porcentaje de inhibición de agentes oxidantes en extractos de Syzygium paniculatum (G.)
*Resultados expresados como valor ± desviación estándar, DE (n=3)
La figura 9 evidencia que la capacidad antioxidante del extracto MeOH es dependiente de
su concentración e incrementa significativamente cuando la concentración incrementa
desde 50 ppm a 500 ppm a diferencia de la bioactividad de los extractos AcOEt y C6H14 que
aumenta levemente con la concentración y la del extracto CH2Cl2 que permanece
prácticamente constante a diferentes concentraciones. Aunque ninguno de los extractos
obtenidos logró captación de radicales libres equivalente al Trolox, el extracto metanólico
mostró valores de inhibición importantes a bajas concentraciones (IC50= 985,94 ppm) que
además pueden considerarse significativos teniendo en cuenta que el compuesto de
referencia es análogo sintético del antioxidante natural con mayor actividad antioxidante
conocido hasta ahora, la vitamina E.
7.3 Caracterización de metabolitos secundarios en extracto metanólico de SP
Se analizaron 6 compuestos que podrían agruparse en dos categorías; ácidos orgánicos
pequeños y derivados de ácido hidroxicinámico. La figura 10 presenta el cromatograma de
iones totales (TIC) del extracto MeOH. Teniendo en cuenta que los polifenoles contienen
uno o más grupos hidroxilo y/o carboxilos, los datos de MS fueron adquiridos en modo de
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
500 400 200 100 50
Po
rce
nta
je d
e In
hib
ició
n (
%)
Concentración Extracto (ppm)
TroloxExtracto MeOHExtracto AcOEtExtracto CH2Cl2Extracto C6H14
36
ionización negativo. La identificación de los compuestos fenólicos se efectuó a partir de la
medición precisa de iones seudomoleculares [M-H]- y de los iones producidos por
fragmentación además, se hizo uso de los datos reportados por Carazzone et al. (2012) (6).
Fig. 10. Cromatograma de iones totales (TIC) de extracto MeOH de Syzygium paniculatum (G.)
El cromatograma podría dividirse en 3 zonas de acuerdo al tipo de compuestos que allí
aparecen. En los primeros 5 minutos del análisis se encuentran derivados del ácido
hidroxicinámico como el ácido caféico. Además fueron identificados en este segmento el
resveratrol, el ácido málico y el ácido quínico. En la zona intermedia se presentan
polímeros del 4-etilbenceno-1,2 diol que alcanzan m/z de hasta 787. Los últimos diez
minutos de análisis presentan un patrón de fragmentación similar al de la zona intermedia
aunque se alcanzan m/z de hasta 1474
Tabla 8. Datos MS y MSn de metabolitos en extracto MeOH de SP
Señal m/z MSn (Intensidad) m/z Identificación
1 155 155 (100) Compuesto desconocido
2 133 115 (100), 89 (3) Ácido málico
3 179 135 (100) Ácido caféico
4 191 173 (50), 127 (30), 111 Ácido quínico
5 227 227 (100) Resveratrol
6 515 379(100), 285(62), 191(19) Derivado de ácido quínico
7.3.1. Ácidos orgánicos pequeños
La señal 1 correspondiente a un [M-H]- con m/z 133 y que en MS2 genera un pico base a
(m/z) 115 de intensidad 100, este patrón de fragmentación sugiere una deshidratación
del ion molecular y corresponde en intensidades y m/z con las fragmentaciones
reportadas por Carazzone et al. (2012) para el ácido málico.
37
Fig. 11 Espectro MS2 del ácido málico
En los mecanismos de reacción que se presentaran a continuación, los cambios
conformacionales representados con un mismo color de trazo generarán el producto que
se encuentra frente a la flecha de reacción del mismo color.
La siguiente figura representa el mecanismo de las dos fragmentaciones obtenidas para el
ácido málico, en la fragmentación más abundante (m/z 115) el grupo hidróxilo sufre
ruptura heterolítica y el carbono α al carbocatión libera un hidrogenión para estabilizar
internamente la molécula, como resultado se produce la formación de un enlace pi entre
los carbonos 2 y 3 así como la formación de agua con carga neutra.
O- OH
O
OHO
O- OH
O
O
O-
OHO
-H2O
-COOH
m/z 133
m/z 89
m/z 115
Fig. 12 Principales fragmentaciones del ácido málico
38
La señal 3 corresponde a un [M-H]- con m/z 191 y sus fragmentaciones MS2 generan iones
de m/z 111, 127 y 173. Los mecanismos propuestos en la figura 14 contemplan tres
cambios conformacionales, la pérdida de grupos hidroxilo, la deshidratación del
ciclohexano y la descarboxilación del mismo (44).
Fig. 13 Espectro MS2 del ácido quínico
OH
OH OH
O-
O
O-
OH
OH
H
OH
OH OH
OH
O-
O
H H
CH-
OH
OH
m/z 173 m/z 191 m/z 127 m/z 111
Fig. 14 Principales fragmentaciones del ácido quínico
Aunque las intensidades observadas en el MS2 difieren de las presentadas por Carazzone
et al. (2012) los iones fragmentos más abundantes muestran m/z iguales y por tanto se
puede asumir que el pico m/z 191 de nuestra investigación corresponde al ácido quínico.
La señal 5 se presenta durante todo el análisis cromatográfico con muy baja intensidad,
aunque no fue posible obtener los iones fragmento en el análisis MS2 una revisión
bibliográfica de los compuestos fenólicos que se encuentran con frecuencia en frutos del
género Syzygium perfila al resveratrol como el posible precursor del [M-H]- con m/z 227
39
(Peso molecular: 228,25 g/mol). Este estilbeno que además se encuentra en la piel de
uvas, frambuesas, arándanos y moras es producido por el fruto como respuesta a lesiones
y ataque de patógenos (45).
Fig. 15 Fórmula estructural del resveratrol
7.3.2 Derivados de ácidos hidroxicinámicos
La señal 2 muestra un ion precursor con m/z 179 y en MS2 un único ion de fragmentación
con m/z 135 el cuál es característico de la pérdida del grupo carboxilo del ácido caféico.
Este fue identificado como ácido caféico de acuerdo con lo reportado por Carazzone et al
(2012).
Fig. 16. Espectro MS2 del ácido caféico
40
O-
O
OH
OH
CH-OH
OH
m/z 179 m/z 135
- COOH
Fig. 17 Descarboxilación del ácido caféico
La señal 6 correspondiente a un [M-H]- con m/z 515 generó en MS2 un pico base de m/z
379 y otros dos iones fragmentos m/z 285 y 191 como se muestra en la figura 18. La
primera pérdida del ion precursor supone la salida de un ión de m/z 136, probablemente
el residuo neutro descarboxilado del ácido caféico (4-etilbenceno-1,2 diol), mientras que
la segunda y tercera pérdida tienen m/z 94, característico de pérdidas de fenol.
Finalmente, el fragmento m/z 191 corresponde como se indicó anteriormente al ácido
quínico. La estructura propuesta para el ion precursor así como sus fragmentaciones se
presentan en la figura 19 (44,46).
Fig. 18 Espectro MS2 de derivado del ácido quínico
41
OH
OO-
OH
OOOH OH
H
OH
OO-
OH
OHOOH
H
OH
OO-
OH
OHOH
OH
OO-
O
OOOH OH
OH
OH
H
C8H9O2
m/z 515
m/z 379
m/z 285
m/z 191
-PhOH
-PhOH
Fig. 19 Fragmentación del derivado de ácido quínico
Aproximadamente desde el minuto 5 hasta el minuto 80 del análisis, el TIC presentó los
mismos picos con intensidades similares. En la figura 20 se evidencia que desde la señal
con m/z 1195 hay una diferencia entre los picos más intensos de m/z 136 que
probablemente corresponde a la pérdida del 4-etilbenceno-1,2 diol (residuo neutro
descarboxilado del ácido caféico). De lo anterior se puede deducir que después de los
primeros 5 minutos y aproximadamente hasta el minuto 80 de análisis, el o los
compuestos detectados son polímeros del monómero con m/z 136 enlazados finalmente a
un compuesto de m/z 155 que no se identificó.
Fig. 20 Patrón de fragmentación desde t=5 min hasta t=80 min
42
Durante los últimos diez minutos de análisis se presentaron de forma contínua en el TIC
las señales que se observan en la figura 21. Las pérdida sucesivas entre los picos de mayor
intensidad fueron nuevamente de m/z 136 empezando desde la señal en m/z 1609 hasta
la señal en m/z 249, en esta última se presenta una pérdida de m/z 94 característica de
pérdida de fenol y se llega finalmente a la señal del compuesto desconocido con m/z 155.
(46)
Lo anterior permite suponer que cuando la fase móvil de separación cromatográfica es
100 % metanol, el compuesto eluido es un polímero de cadena larga del 4-etilbenceno-1,2
diol enlazado a una unidad de un compuesto desconocido con m/z 155.
Fig. 21 Patrón de fragmentación desde t=80 min hasta t=90 min
43
8. CONCLUSIONES
El análisis fitoquímico preliminar indicó presencia de flavonoides, carbohidratos y taninos
en el extracto etanólico sin embargo, en la caracterización del extracto con mayor
actividad antioxidante (Extracto MeOH) no se detectó ninguno de estos grupos de
metabolitos.
El extracto MeOH del fruto de SP presentó la mayor capacidad antioxidante entre los
cuatro extractos evaluados mediante el ensayo de decoloración del catión ABTS+• seguido
por el extracto AcOET. Aunque ninguno de los extractos tuvo TEAC cercano a 1, el extracto
metanólico tiene un IC50 de apenas 985,94 ppm lo cual indica que con bajas
concentraciones del extracto se pueden lograr inhibición considerable de agentes
oxidantes.
La corriente iónica total (TIC) revela que la mayoría de compuestos presentes en el
extracto metanólico del fruto tienen alta afinidad con la fase polar ácida del eluente
(Ácido fórmica 0,1% en agua) y solo un par de compuestos presentan mayor afinidad por
la fase polar básica (Metanol).
Se identificaron ácidos orgánicos pequeños y derivados de ácido hidroxicinámico.
Es conveniente aumentar con menor velocidad el porcentaje de metanol en la fase móvil
durante la cromatografía para optimizar la separación de los metabolitos secundarios
presentes en el extracto metanólico de frutos de SP, especialmente aquellos que eluyeron
hacia el detector antes de los primeros cinco minutos de análisis.
44
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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48
10. ANEXOS
Tabla 9 Prueba ANOVA de un factor para extractos del SP y Trolox
Actividad antioxidante
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos 7151,464441 4 1787,86611 10,18257116 0,000115643 2,866081402
Dentro de los grupos
3511,620162 20 175,5810081
Total 10663,0846 24
Ho= El promedio del porcentaje de inhibición en los tres grupos es igual, con 95% de confiabilidad Ha= En al menos un grupo el promedio del porcentaje de inhibición es diferente, con 95 % de confiabilidad
