CONTROL BIOLÓGICO biológico.… · Cuadro 1. Tratamientos en el control biológico de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. con el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae

CONTROL

BIOLÓGICO

201

CONTROL BIOLÓGICO DE LA BROCA DEL CAFÉ Hypothenemus hampei FERR.

(COLEOPTERA:CUCURLIONIDAE) CON EL HONGO ENTOMOPATÓGENO

Metarhizium anisopliae (METCH.) SOROKIN (MONILIALES:MONILIACEAE) EN

HUIXTLA, CHIAPAS

Víctor Manuel Díaz-Vicente, José Nelson Pérez-Quintanilla, Ricardo Magallanes-Cedeño, Erika Patricia Pinson-

Rincón, Martha Elena de Coss-Flores y Mario Ernesto Cabrera-Alvarado. Universidad Autónoma de Chiapas

Facultad de Ciencias Agrícolas. Carretera Costera Entronque Estación Huehuetán, Huehuetán, Chiapas.

[email protected]

RESUMEN. Se evaluó el efecto de diferentes dosis del hongo Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin para el control de

Hypothenemus hampei Ferr. en el Ejido Barrio Brasil, municipio de Huixtla, Chiapas. Se utilizó un diseño experimental en una

distribución en bloques al azar con seis tratamientos y cinco repeticiones. Se midieron cuatro variables: porcentaje de infestación,

mortalidad y abandono de la broca y el porcentaje de incidencia del hongo M. anisopliae. La mayor infestación, menor mortalidad

y menor abandono de la broca fue para el tratamiento testigo sin aplicación con 8.30%, 0.00% y 9.28%, respectivamente. Y la

menor infestación, mayor mortalidad y abandono fue para el tratamiento de mayor dosis (1.00 kg ha-1 a una concentración de

2.3X10 conidios por ml) de M. anisopliae con 1.86%, 22.66% y 34.40% respectivamente. La incidencia de M. anisopliae fue

mayor en el tratamiento de mayor dosis con 28.10% y el testigo sin aplicación fue de 0.00%.

Palabras clave: Coleoptera, concentración, dosis, mortalidad, incidencia.

ABSTRACT. It was evaluated the effect of different doses of the fungus Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin for control of

Hypothenemus hampei Ferr. in Ejido Barrio Brasil, Huixtla, Chiapas. Experimental design in a distribution in random blocks with

six treatments and five repetitions was used. Four variables were measured: percentage of infestation, mortality and abandonment

of the coffee berry borer and the percentage of incidence of the fungus M. anisopliae. The largest infestation, lower mortality and

lower abandonment of the borer were for the control without application with 8.30%, 0.00% and 9.28% respectively. And the

lower infestation, largest mortality and abandonment was for the higher dose treatment (1.00 kg ha-1 at a concentration of 2.3X10

conidia per ml) of M. anisopliae with 1.86%, 22.66% and 34.40% respectively. The incidence of M. anisopliae was higher in the

higher dose treatment with 28.10% and the control without the application was 0.00%.

Key Word: Coleoptera, concentration, dose, mortality, incidence.

Introducción

El cultivo del café se ubica entre los Trópicos de Cáncer y Capricornio, se cultiva en todo

el mundo a excepción de Europa. Las mayores producciones de café provienen de Brasil,

Colombia, Centro América, México. Puerto Rico, Jamaica, Camerún, Costa de Marfil, Vietnam,

Indonesia, Java, India, Sumatra, Australia y Hawai, entre otros (Álvarez, 2006). La broca del

grano de café Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera:Curculionidae Scolytinae) es la

principal plaga en todos los países productores de café, la hembra perfora los frutos y oviposita

en el endospermo, los cuales eclosionan y dan origen a las larvas que se alimentan del grano y

causan grandes pérdidas económicas (Mathieu et al., 1999; y Damon, 2000). La reproducción de

H. hampei presenta una alta endogamia, en la que la broca colonizadora da lugar a una progenie

de muchas hembras, y pocos machos. Los machos no vuelan y permanecen en el fruto y las

hembras copulan con sus hermanos lo cual ocurre antes de salir de los frutos para ir a colonizar

nuevos frutos de café. Este aspecto es acentuado por el mecanismo de la haplodiploidía funcional

en el cual tanto las hembras como los machos son diploides, pero estos últimos fallan en expresar

y transmitir los cromosomas paternos (Brun et al. 1995). Recientemente, se ha propuesto un

mecanismo para explicar el comportamiento reproductivo de la broca que tiene que ver con la

determinación sexual, en el que predominan las hembras sobre los machos. Ninguno de los siete

cromosomas presentes en su forma haploide en la broca han sido ligados a la determinación

mailto:[email protected]

202

sexual, se sugiere que probacterias del género Wolbachia, encontrada recientemente como un

endosimbionte en la broca, es la causante de la determinación sexual (Vega et al., 2002), de la

misma forma como ha sido descrita en otras especies de insectos (Benavides, 2005).

Materiales y Método

El presente trabajo se realizó en el Ejido Barrio Brasil, ubicado en el municipio de Huixtla

Chiapas a 940 metros sobre el nivel del mar. El clima AC m, semicálido con lluvias en verano

(García 1981).

Se utilizó un diseño experimental con una distribución en bloque al azar, con seis

tratamientos y cinco repeticiones, los tratamientos evaluados fueron diferentes dosis del hongo

M. anisopliae a una concentración de 2.3X10

conidios por ml (Cuaro1)

Cuadro 1. Tratamientos en el control biológico de la broca del

café Hypothenemus hampei Ferr. con el hongo

entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.)

Sorokin en Huixtla, Chiapas.

Tratamiento Dosis

A 0.2 kg ha-1

B 0.4 kg ha-1

C 0.6 kg ha-1

D 0.8 kg ha-1

E 1.0 kg ha-1

F Testigo Sin Aplicación.

Se midieron cuatro variables: porcentaje de infestación, se contaron los frutos sanos e

infestados por la broca, porcentaje de mortalidad, se disectaron los frutos brocados para observar

si el insecto estaba vivo o muerto, porcentaje de abandono, se disectaron los frutos con la

finalidad de observar presencia o ausencia de la broca y el porcentaje de incidencia del hongo M.

anisopliae, donde se observó la emergencia del micelio del hongo sobre el cuerpo de la plaga.

Los datos de las variables a medir fueron transformados a arc sen √porcentaje antes de realizar el

análisis de varianza, donde se observaron diferencias significativas entre tratamientos, se utilizó

la prueba de Tukey con un α = a 0.0 (Reyes, 1980).

Resultados y Discusión

En el cuadro 2 se observa que existe una diferencia altamente significativa entre los

tratamientos. Posteriormente se realizó la comparación de medias (Cuadro 3), en donde el

tratamiento que presentó mayor infestación por broca fue el testigo sin aplicación (8.30%),

seguido del tratamiento de menor dosis (0.2 kg ha-1

) con 6.56%. Estos dos tratamientos son

estadísticamente iguales. Tratamiento B, C, D y E a dosis de 0.4, 0.6 0.8 y 1.0 kg ha-1

con una

infestación de 3.20%, 2.80% 2.02% y 1.86%, respectivamente, fueron estadísticamente iguales y

todos por abajo del umbral económico para esta plaga que es de 5.00%. Lo que puede presentar

otra alternativa de control de la broca.

203

Cuadro 2. Análisis de varianza del porcentaje de infestación de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. con el

hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.

Fuentes de

Variación GL SC CM F cal.

F tablas

0.05 0.01

Tratamientos 5 314.215820 63.843163 18.3100** 2.71 4.10

Bloques 4 34.958984 8.739746 2.5476 2.87 4.43

Error 20 68.610596 3.430553

Total 29 417.785400

** Altamente significativa

Cuadro 3. Comparación de medias del porcentaje de infestación de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. con

el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.

Tratamientos Porcentaje Observado*

Campo Transformado

F Testigo Sin Aplicación 8.30 16.27 a

A 0.2 kg ha-1

6.56 14.81 a

B .0.4 kg ha-1

3.20 10.24 b

C 0.6 kg ha-1

2.80 9.60 b

D 0.8 kg ha-1

2.02 8.15 b

E 1.0 kg ha-1

1.86 7.83 b

* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad.

Porcentaje de mortalidad. En los cuadros 4 y 5 se observan el análisis de varianza

(diferencia altamente significativa entre los tratamientos) y la comparación de medias se puede

notar que el tratamiento de la dosis más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1

) fue el que presentó mayor

mortalidad de la broca de café (22.66%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1

causó

10.46% de mortalidad y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 00.00% de mortalidad.

Cuadro 4. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.on el

hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sororokin en Huixtla, Chiapas.

Fuentes de


F tablas

0.05 0.01

Tratamientos 5 2,484.805664 496.961121 394.7165** 2.71 4.10

Bloques 4 4.839844 1.209961 0.9610 2.87 4.43

Error 20 25.180664 1.259033

Total 29 2,514.826172


Cuadro 5. Comparación de medias del porcentaje de mortalidad de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con



Campo Transformado

E 1.0 kg ha-1

22.66 28.39 a

D 0.8 kg ha-1

17.06 24.37 b

C 0.6 kg ha-1

14.68 22.52 bc

B .0.4 kg ha-1

13.60 21.63 c

A 0.2 kg ha-1 10.46 10.85 d

F Testigo Sin Aplicación 0.00 00.00 e

* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de

probabilidad

204

Porcentaje de abandono. En los Cuadros 6 y 7 se observan el análisis de varianza

(diferencia altamente significativa entre los tratamientos) y la comparación de medias se puede

notar que el tratamiento de la dosis más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1

) fue el que presentó mayor

abandono de la broca de café (34.30%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1

causó

18.86% de mortalidad y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 9.28% de abandono, esto

concuerda con lo reportado por Díaz et al., (2009) quienes señalan que cuando se aplicó el hongo

Beauveria bassiana para el control de Hypothenemus hampei observaron un abandono de la

broca en forma natural menor de 10.00%.

Cuadro 6. Análisis de varianza del porcentaje de abandono de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con el

hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.

Fuentes de


F tablas

0.05 0.01

Tratamientos 5 835.625000 167.125000 39.2892** 2.71 4.10

Bloques 4 12.878906 3.219727 0.7569 2.87 4.43

Error 20 85.074219 4.253711

Total 29 933.578125


Cuadro 7. Comparación de medias del porcentaje de abandono de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr.con



Campo Transformado

E 1.0 kg ha-1

34.30 35.84 a

D 0.8 kg ha-1

24.58 27.92 b

C 0.6 kg ha-1

21.36 27.52 b

B .0.4 kg ha-1

20.36 26.80 b

A 0.2 kg ha-1 18.86 25.72 b

F Testigo Sin Aplicación 9.28 17.71 c

* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad

En los cuadros 8 y 9 se observan el análisis de varianza (diferencia altamente significativa

entre los tratamientos) y la comparación de medias y se puede notar que el tratamiento de la dosis

más alta (tratamiento E 1.0 kg ha-1

) fue el que presentó mayor incidencia del hongo M. anisopliae

(28.10%) y la dosis más baja, tratamiento A 0.2 Kg ha-1

causó 17.58% de incidencia del hongo

entomopatógeno y el tratamiento F testigo sin aplicación presentó 00.00% de incidencia.

Cuadro 8.Análisis de varianza del porcentaje de incidencia del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae

(Metch.) Sorokin en en Huixtla, Chiapas.


Fuentes de


F tablas

0.05 0.01

Tratamientos 5 2,503.624023 500.724792 706.9381** 2.71 4.10

Bloques 4 10.149414 2.537354 3.5821 2.87 4.43

Error 20 14.166016 0.708301

Total 29 2,527.939453

205

Cuadro 9. Comparación de medias del porcentaje de incidencia del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae

(Metch.) Sorokin en Huixtla, Chiapas.


Campo Transformado

E 1.0 kg ha-1

22.22 28.10 a

D 0.8 kg ha-1

18.00 25.10 b

C 0.6 kg ha-1

14.86 22.86 c

B .0.4 kg ha-1

11.24 19.56 d

A 0.2 kg ha-1 9.16 17.58 e

F Testigo Sin Aplicación 00.00 00.00 f

* Promedio con la misma letra son estadísticamente iguales según prueba de Tukey a un α = 0.0 de probabilidad

Conclusiones

El menor porcentaje de infestación de la broca se observó en el tratamiento de mayor

dosis 1.0 kg ha-1

con 1.86% y el que presentó mayor infestación fue el tratamiento testigo sin

aplicación con 8.30%.

La mayor mortalidad de la broca se presentó en el tratamiento de mayor dosis 1.0 kg ha-1

con 22.66% y el que de menor mortalidad fue el tratamiento testigo sin aplicación con 0.00%.

El mayor porcentaje de abandono de la broca se presentó en el tratamiento de mayor dosis

1.0 kg ha-1

con 34.30% y el menor abandono en el tratamiento testigo sin aplicación con 9.28%.

El mayor porcentaje del hongo M. anisopliae se observó en el tratamiento de mayor dosis 1.0 kg

ha-1

con 28.10%.

Literatura Citada

Álvarez, C. 2006. Distribución geográficas zonas. http://www.federacioncafe.com/Público/El

Cafe/Zonas. asp#>. Revisado el 11 de abril de 2007.

Benavides, P. 2005. Distribución global de la broca del café: la versión molecular. En: Memorias

XXXII Congreso de la Sociedad Colombiana de Entomología (Socolen). Ibagué, 27-29 de

julio. p. 7-11

Brun, L. O.; Stuart, J.; Gaudichon, V.; Aronstein, K.; Ffrench-Constant, R. H. 1995. Functional

haplodiploidy: a mechanism for the spread of insecticide resistance in an important

international insect pest. Proceedings National Academy of Sciences, U. S. A. 92: 9861-

9865.

Damon, A. 2000. A review of the biology and control of the coffee berry borer, Hypothenemus

hampei (Coleoptera:Scolytidae). Bulletin of Entomological Research 90: 453-465.

Díaz, V.V.V.M., J. N. Pérez Q. E.P. Pinson R. R. Magallanes C. M.E. De Coss F. y M.E. Cabrera

A. 2009. Mezcla de un tensoactivo aniónico con Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. para el

control de la broca del café Hypothenemus hampei Ferr. en Cacahoatán, Chiapas, México.

Entomología Mexicana Vol. 8 pp. 477-481.

García, de M. E. 1981. Modificaciones al Sistema de Clasificación de Koppen. Edit. UNAM.

México. p. 9, 47, 90.

http://www.federacioncafe.com/Público/El

206

Mathieu, F., O. Brun, B. Frerot, D. Duckling and C. Framton. 1999. Progression in field

infestation is linked with tramping of coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Col.

Scolytidae). J. Appl. Ent. 123: 535-540.

Reyes, C.P. 1980. Diseños de Experimentos Aplicados. 2ª. Edición Editorial Trillas, México,

D.F. 348 p.

Vega, F.; Benavides, P.; Stuart, J. J.; O neil, S. 2002. Wolbachia infection in the coffee berry

borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:Scolytidae). Annals Entomological

Society of America 95 (3): 374-378.

207

ASPECTOS DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA DE Anticarsia gemmatalis

(HÜBNER) (LEPIDÓPTERA: NOCTUIDAE), RELACIONADOS CON EL CONTROL

BIOLÓGICO DEL NUCLEOPOLIEDROVIRUS DE Anticarsia gemmatalis (AgNPV)

Joel Ávila-Valdez. INIFAP, Campo Experimental Las Huastecas, Apartado Postal 31, 89610, Altamira, Tam.

[email protected] RESUMEN. Anticarsia gemmatalis (Hübner), es la principal especie defoliadora del cultivo de soya en México y se controla

biológicamente con el nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis (AgNPV), el cual es utilizado en 15000 hectáreas en

promedio en México. Debido a la importancia de este caso de control biológico en México, esta revisión tiene como objetivo

abordar los principales aspectos de la biología y los mecanismos de defensa del insecto relacionados con el control de AgNPV.

Palabras Claves: Soya, Anticarsia gemmatalis, control biológico, nucleopoliedrovirus.

ABSTRACT. The veltbean Caterpillar Anticarsia gemmatalis (Hubner), is the main soybean crop pest in Mexico and has a

biological control with A. gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgNPV), used in 15,000 hectareas in Mexico. Considering the

importance of this case of biological control in Mexico, this review was aimed to address the main aspects of the biology and

defense mechanisms of this insect, as well as its biocontrol by AgNPV.

Key words: Soybean, Anticarsia gemmatalis, biological control, nucleopolyhedrosis.

Introducción Anticarsia gemmatalis (Hübner), es la especie defoliadora más importante del cultivo de

la soya en México (Maldonado et al 1991) y sus poblaciones han sido reguladas biológicamente

con el nucleopoliedrovirus de A. gemmatalis (AgNPV), desde el año 2000 en la región del sur de

Tamaulipas, en una superficie que actualmente fluctúa alrededor de 15 mil hectáreas (Ávila y

Rodríguez del Bosque, 2011). Este virus es muy específico y tiene la capacidad de burlar los

mecanismos de defensa en sus poblaciones (Moscardi, 1998). Considerando la importancia de

este caso de control biológico en México, el objetivo del trabajo fue realizar una revisión

bibliográfica sobre los mecanismos de defensa de A. gemmatalis (Hübner), relacionados con el

control biológico que se aplica con el nucleopoliedrovirus de A. gemmatalis.

Materiales y Método Se realizó una revisión bibliográfica sobre el tema y se elaboró una síntesis del

conocimiento recopilado, poniendo énfasis en la información de los riesgos de posible resistencia

de A. gemmatalis al uso continuo y masivo de AgNPV en condiciones de campo.

Resultados

La familia Baculoviridae está conformada por dos géneros de nucleopoliedrovirus (NPV),

que producen estructuras poliédricas (0.5-15 micrómetros) formadas por la proteína poliedrina y

los granulovirus (GV) que presentan cuerpos de oclusión menores (0.5 micrómetros) formados

por granulina. Los baculovirus producen dos tipos de virus fenotípicamente distintos, los virus

extracelulares y los virus derivados de los cuerpos de inclusión (Souza et al., 2002). Los virus

extracelulares se producen en la fase inicial de infección y se diseminan célula a célula dentro del

insecto. La otra forma de virus se produce en la fase tardía de la infección y resulta de la oclusión

de viriones en cuerpos proteínicos de inclusión (CPI); esta forma es llamada de cuerpo de


208

inclusión del poliedro y es responsable de la diseminación del virus entre los insectos en el

ambiente (Ribeiro y Pinedo, 2001; Souza et. al., 2002).

La infección de A. gemmatalis se produce al alimentarse del follaje contaminado con CPI.

El pH alcalino del intestino medio solubiliza los CPI liberando los viriones que son formados por

un nucleocapsideo envuelto, cuyas membranas se funden con las membranas de las

microbellosidades de las células epiteliales del intestino. Los nucleocapsideos migran al

citoplasma de la célula y penetran a través de los poros nucleares; en el núcleo liberan DNA viral

y ocurre la transcripción de los genes del virus y la replicación de su genoma. En esta fase son

sintetizados nucleocapsideos en el núcleo de la célula (Funk et. al., 1997; Castro et. al., 1999).

Los nucleocapsideos salen del núcleo y migran a la base de la célula, atraviesan la

membrana basal y se distribuyen en la hemolinfa y el sistema traqueal del insecto, provocando

infecciones secundarias en otros tejidos. En las células infectadas se forman más virus que son

diseminados célula a célula. En estados avanzados de infección es cuando ocurre la oclusión de

los viriones, los cuales revientan las membranas celulares y liberan gran cantidad de CPI en la

hemolinfa del insecto, (Funk et. al., 1997; Castro et. al., 1999). Durante el proceso de infección,

la larva de A. gemmatalis se debilita y pierde su capacidad motora de alimentación y busca la

parte superior de la planta donde muere en un periodo de cinco a ocho días; después de dos días

de muerta, el cuerpo se revienta y libera gran cantidad de virus en el follaje, sirviendo de inóculo

de la enfermedad (Moscardi y Souza, 2002).

Mecanismos de defensa. La cutícula y el exoesqueleto de los insectos presentan

componentes antimicrobianos que impiden la penetración de microorganismos a la hemocele y

constituyen la primera línea de defensa a los patógenos (Bulet et. al., 1999), internamente la

membrana peritrófica que recubre las células epiteliales del tubo digestivo, también son un

mecanismo de defensa a los patógenos que penetran por vía oral (Silva, 2002).

En el hemocele del insecto se desencadena una defensa hemocitaria, que es la respuesta

inmunológica del insecto a la invasión de patógenos (Bulet et. al., 1999). La defensa

inmunológica puede ser subdividida en dos componentes: un componente humoral y otro celular,

representado por los hemocitos (Niere et. al., 1999). La defensa humoral se realiza

principalmente por la acción de péptidos antimicrobianos en un complejo enzimático que regula

la coagulación y la melanización de la hemolinfa (Lavine y Strand, 2002). Los insectos no

presentan inmunoglobulinas específicas pues no tienen memoria inmunológica, no existen

evidencias de especificidad molecular de anticuerpos en el sistema inmunológico de los insectos,

ya que una respuesta inmunológica adquirida requiere de varios días y semanas para

desarrollarse, lo que sería desventajoso para el insecto que tiene un ciclo de vida relativamente

corto, comparado con los vertebrados (Niere et. al., 1999; Silva, 2002).

La respuesta celular de los insectos se debe a la actividad de los hemocitos en la

hemolinfa, los cuales reaccionan para eliminar al invasor o limitar su desarrollo (Alves y Pereira

1998). Los hemocitos se mueven pasivamente en el hemocele y al contacto con partículas

extrañas, reconocen y eventualmente destruyen a los patógenos. Los procesos celulares de

defensa comprenden fagocitosis, formación de nódulos, encapsulamiento, coagulación de la

hemolinfa y cicatrización (Meyer-Fernández et. al., 2000). La fagocitosis es considerada la

respuesta celular primaria de defensa de muchos insectos y consiste en el proceso por el cual los

hemocitos actuando individualmente forman pseudópodos y engloban las partículas extrañas

contenida en la hemolinfa (Lavine y Strand, 2002). Si la concentración de patógenos en la

hemolinfa es muy grande, los hemocitos se agregan y forman nódulos a fin de inmovilizar a los

209

invasores o sacarlos de circulación (Silva, 2002). Cuando el cuerpo extraño es muy grande para

ser fagocitado, ocurre el fenómeno de encapsulamiento, que es la aglomeración de un conjunto de

células que forman una cápsula alrededor del invasor (Pech y Strand, 1995).

La coagulación de la hemolinfa es un fenómeno frecuente observado después de una

herida en el exoesqueleto del insecto, para prevenir la pérdida de hemolinfa. También es una

barrera mecánica que impide la penetración de patógenos oportunistas. Desempeña un papel

complejo en las reacciones de defensa de los insectos y se le ha observado participando en el

proceso de encapsulamiento (Rowley y Ratcliffe, 1981). En un cuadro infeccioso, existe

variación en el número y proporción de los diversos tipos de hemocitos presentes en la

hemolinfa. En respuesta a la presencia de patógenos, estas variaciones se manifiestan en una

producción elevada de algunos tipos celulares y en la inmovilización de hemocitos en nódulos y

cápsulas alrededor del patógeno. Estas reacciones de defensa celular, son influenciadas por

parámetros genéticos y fisiológicos del hospedante y el patógeno; el número de respuestas

inmunológicas depende del número y los tipos de hemocitos involucrados en el mecanismo

(Russo et. al., 2001).

Los tipos de hemocitos pueden ser caracterizados morfológicamente por las diferencias

del tamaño y forma de la célula; por el tipo, tamaño y número de sus inclusiones, así como por su

apariencia general y coloración del citoplasma. También pueden ser clasificados por sus

diferencias en comportamiento, su capacidad de dividirse, rapidez de vacuolización de sus

inclusiones, su fragilidad, su abundancia relativa en periodos específicos en la vida del insecto y

su participación en los procesos de defensa (Jones, 1979). Se reconocen cinco tipos de hemocitos

que están presentes en la mayoría de los insectos: prohemocitos, plasmatocitos, granulocitos,

esferulocitos y oenocitoides (Gupta, 1979; Clark et. al, 1997). Los plasmatocitos son células

polimórficas, generalmente presentan pseudópodos y participan en los procesos de fagocitosis y

encapsulamiento. Los granulocitos son variables en tamaño y forma, pero generalmente son

células redondas u ovales y su función es de reconocimiento de cuerpos extraños y comprenden

más del 50% de los hemocitos (Silva 2002; Lavine y Strand, 2002).

Los prohemocitos son pequeños, redondos o elípticos con un pequeña cantidad de

citoplasma periférico y son considerados células formadoras de hemocitos; no participan

directamente en los procesos de defensa y son responsables de la multiplicación post embrionaria

de los hemocitos representan alrededor del 10% de los hemocitos (Lavine y Strand, 2002;

Yamashita e Iwabuchi, 2001). Los esferulocitos son esférulas grandes ovales o redondas con

núcleo pequeño y participan en la histólisis, que ocurre en ocasión de la muda, transportando

determinadas substancias como las hormonas, o participando en la síntesis de proteínas en la

hemolinfa que ayudan a la destrucción de bacterias; representan el 20% de los hemocitos (Gupta,

1979; Ratclife et. al., 1985; Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).

Los oenocitoides son los mayores hemocitos encontrados y tienen citoplasma abundante,

denso y homogéneo, núcleo pequeño y participan en la producción de fenoloxidasa, una enzima

multifuncional que participa en la defensa inmunológica, como en la cicatrización de lesiones y

esclerotización de la cutícula (Lavine y Strand 2002; Silva 2002).

El lepidoptero A. gemmatalis, tiene cinco tipos de hemocitos los cuales son:

plasmatocitos, granulocitos, prohemocitos, esferulocitos y oenocitoides, además de células

vermiformes y células esfoliativas (Andrade et. al., 2003). Las células vermiformes son de

aspecto fusiforme y no emiten pseudópodos (Andrade et. al., 2003). Las células esfoliativas, son

células grandes y son más bien un tipo de hemocito distinto a los demás, aunque existe escasa

210

información sobre ellas, sin embargo, constan evidencias que ambos tipos participan en los

procesos inmunológicos del insecto junto con los hemocitos plenamente reconocidos (Faraldo,

2000).

Discusión y Conclusiones

A. gemmatalis, ha sido controlada en Brasil desde la década de los ochenta con el virus

AgNPV y la superficie actual rebasa los 2.5 millones de hectáreas aplicadas (Sosa-Gómez, 2010,

comunicación personal). En todo este periodo, no se ha encontrado ninguna evidencia de

resistencia del insecto al virus. En México, Ávila y Rodríguez del Bosque (2011), consignan los

mismos resultados, aunque con solo diez años de aplicación, corroborando lo que registraron

Fuxa y Ritcher (1993), quienes consignan que en condiciones de campo no se han encontrado

indicios de resistencia de A. gemmatalis al virus AgNPV, sólo en condiciones de labotatorio y

bajo una fuerte presión de selección. La presencia de siete tipos de hemocitos en A. gemmatalis,

presupone una férrea actividad inmunológica del insecto para evitar la acción del AgNPV,

después de varios años de estar sometidos a presión de selección. La ausencia o retardo de la

resistencia puede deberse a la migración de adultos de las áreas no expuestas a las áreas tratadas

con el virus (Moscardi y Sosa-Gómez, 1992). También se debe a la gran especificidad del

AgNPV (Moscardi, 1998), que es una característica deseable en la mayoría de los

entomopatógenos utilizados en el control biológico de plagas (Ribeiro y Pinedo, 2001). Esto

permite concluir que se puede seguir utilizando el AgNPV por mucho tiempo e incrementar la

superficie aplicada actualmente en México, con todo el beneficio económico y ecológico que

resulta de su uso en el cultivo de soya.

Literatura Citada

Andrade, F., M. CC. Negreiro, E.A. Gregorio, F. Moscardi y A.M. Falleiros. 2003. Hemocytes of

Anticarsia gemmatalis (Hubner) (Lepidóptera: Noctuidae) Larvae: Morphological and

quantitative studies. Acta microsc V.12 (1): 59-64.

Alves, S.B. y R.M. Pereira. 1998. Disturbios fiológicos provocados por entomopatógenos, In:

Alves S.B. (Ed) Controle Microbiano de Insetos. 2 Ed. Piracicaba. FEALQ. p. 21-37.

Ávila, V.J. y L. A. Rodríguez del Bosque. 2011. Impacto económico y ecológico del uso

comercial del nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis, (AgNPV) en soya en las

huastecas, México. Memorias del XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico.

Bulet, P.C. Hetru, J. Dimarco y D. Hoffman. 1999. Antimicrobial peptides in insect structure and

function. Dev. Comp. Inmunol. Vol. 23:329-344.

Castro, M.E., M.L. Souza, W. Sihler, S.C. Rodriguez y B.M. Ribeiro. 1999. Biologia molecular

de baculovírus e seu uso no controle biológico de pragas no Brasil. Pesq. Agrop. Bras. Vol.

34:1733-1761.

Chapman, R.F. 1998. The insects 4° Ed. Cambridge University Press. 770 p.

Clark, K.D., L.L. Pech and M.R. Strand. 1997. Isolation and Identification of a plasmatocyte-

espreading peptide from hemolymph of the lepidopteran insect Pseudoplusia incluedens J.

Biol. Chem. Vol. 272 (37): 23440-23447.

Faraldo, A.C. 2000. Hemocitos de Diptera económicamente importantes; análise qualitativa,

quantitativa e funcional. Dissertacao (Maestrado). Instituto de Biociencias. Universidade

Estadual Paulista. 90 p.

211

Funk, C.J., S.C. Brunage and G.F. Rorhmann, 1997. Baculovirus structure in: Miller, L.K. (E.D.)

The baculoviruses, New York: Plenum Press. p. 7-32.

Fuxa, J.R. and A.R. Ritcher. 1993. Lack of vertical tramission in Anticarsia gemmatalis

(Lepidoptera: Noctuidae) of a nuclear polyhedrosis virus, a pathogen no indigenous to

Louisiana. Environ. Entolmol. 22:425-431.

Gupta, A.P. 1979. Insect hemocytes.Cambridge University press. P. 85-127.

Jones, J.C. 1979. Pathways and pitfalls in the classification and study of insect hemocytes. In:

Gupta, A.P. Insect hemocytes. Cambridge University Press. p. 279-300.

Lavine, M.D. and M.E. Strand . 2002. Insect hemocytes and their role in inmunity. Insect

Biochem. Mol. Vol. 32:1295-1309.

Maldonado, M.N., J.G. Garza y A.P. Terán. 1991. Guía técnica para cultivar soya en las

Huastecas. Folleto para productores No. 1. INIFAP. Campo Experimental Sur de

Tamaulipas.

Meyer-Fernández, J.R., H. Lanz-Mendoza and K.C. Gondim. 2000. Ectonucleotic

diphosphohydrolase activities in hemocytes of larval Manduca sexta. Arch. Biochem.

Biophys. Vol. 328 (1): 152-159.

Moscardi, F. and D.R. Sosa-Gómez. 1992. Use of viruses against soybean caterpillar in Brazil,

In: L.G. Lopping, M.B. Greem and R.T. Ress (Eds.): Pest Management in Soybean.

Elsevier, London/New York P. 98-109.

Moscardi, F. 1998. Utilizacao de virus entomopatogenicos em campo. Alves S.B. (ED). Controle

microbiano de insetos. 29 Ed. Piracicaba. FEALQ. p. 509-539.

Moscardi, F. y M.L. Souza. 2002. Baculovirus para o controle de pragas. Biotec. Cienc. Desenv.

Vol. 24: 22-29.

Niere, M., M. Meiblitzer, C. Weise, M. Ziegler and A. Wiesner. 1999. Insect inmuny activation

by recombinant Galleria melonella a polipophorin III. Biochim. Biophys. Acta. Vol.

1433:16-26.

Pech, L.L. and M.R. Strand 1995. Encapsulation of foreign targets by hemocytes of the month

Pseudoplusia includes (Lepidoptera: Noctuidae) involves in RGB dependent cell adhesion

mechanism. J. Insect Physiol. Vo. 41(6):481-488.

Ratcliffe, N.A., A.F. Rowley, S.W. Fitzgerard and C.P. Rhodes. 1985. Invertebrate inmunity:

basic concepts and recent advances. Int. Rev. Cytol. Vol. 97:183-279.

Ribeiro, B.M. y F.J. Pinedo. 2001. Baculovirus recombinante para controle de praga. Biotec.

Cienc. Desenv. Vol. 22:50-58.

Rowley, A.F. and N.A. Ratcliffe. 1981. Invertebrate blood cells. Academic Press. New York.

Vol. 2:421-490.

Russo, J., M. Brehélin and Y. Carton. 2001. Hemocyte changes in resistant and susceptible

strains of D. melanogaster caused by virulent and avirulent strains of the parasitic wasp

Leptopilina boulardi J. Insect Physiol. Vol. 47:167-172.

Silva, C.C. 2002. Aspectos do sistema inmunologico dos insetos. Biotec. Cienc. Desenv. Vol.

24:68-72.

Souza, M.L., M.E. Castro, W. Silher, Z.M. Ribeiro y F. Moscardi. 2002. Caracterizacao de

baculovirus utilizados no controle de pragas. Biotec. Cienc. Desenv. Vol. 24:18-20.

Tanada Y. and H.K. Kaya 1993. Insect pathology. Academic Press, San Diego. 666.

Yamashita, M. and K. Iwabuchi. 2001. Bombyx mori prohemocity division and differenciation

individual microcultures. J. Insect physiol. Vol. 47:325-331.

IM:L.G

212

TOXICIDAD DE TRES CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE

Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE)

Juan Reyes Delgado-Gamboa

1, Rafael Pérez-Pacheco

1, Jaime Ruíz-Vega

1, Carlos Alejandro Granados-Echegoyén

1,

Jorge Eugenio Ibarra-Rendón2, Verónica González-Negrete

3.

1Centro Interdisciplinario de Investigación para el

Desarrollo Integral Regional Unidad Oaxaca. IPN. Calle Hornos 1003. Santa Cruz Xoxocotlán. C.P. 71230. Oaxaca.

México. [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]. 2Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Centro de Investigación y Estudios Avanzados, Unidad Irapuato,

36500, Irapuato, Guanajuato, México. [email protected]. 3Universidad de Guanajuato, Campus Irapuato-

Salamanca División de Ciencias de la Vida. Ex Hacienda El Copal km. 9 carretera Irapuato-León; C.P. 36500;

Irapuato, Guanajuato. [email protected].

RESUMEN. Los mosquitos son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo y dengue. Una alternativa al uso

de insecticidas químicos es el empleo de agentes biológicos, principalmente insecticidas microbianos. En el presente trabajo se

evaluó la toxicidad de tres cepas de B. thuringiensis endémicas de Oaxaca, México, contra Aedes aegypti. Su efecto se cuantificó

mediante bioensayos. Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos plásticos con 100

ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano A. aegypti. Se utilizó el complejo espora-cristal, evaluando de 6 a 8

dosis., se realizaron 5 repeticiones con un testigo cada una. La mortalidad se determinó a las 24 h bajo condiciones de 70% de

humedad relativa y temperatura media de 28±2°C. Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL50 fueron

10.82 y 13.2 ng/ml, respectivamente, similares a la Bti control (CL50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar.

Palabras clave: Bacillus thuringiensis, toxicidad, bioensayo, resistencia, espora-cristal.

ABSTRACT. Mosquitoes are vectors of causal agents of diseases such as malaria and dengue. An alternative to chemical

insecticides is the use of biological agents, mainly microbial insecticides. In the present study was designed the toxicity of three

native B. thuringiensis strains of Oaxaca, Mexico, against Aedes aegypti. The effect was quantified by bioassay. Performed a

randomized design, using as an experimental unit with 100 ml plastic cups dechlorinated water and 20 early in fourth instar Aedes

aegypti. Using the spore-crystal complex, six to eight doses were evaluated, five replicates were performed and each with one

included one blank treatment. Mortality was determined after 24 hours under conditions of 70% relative humidity and mean

temperature of 28±2°C. Two highly toxic strains against of Aedes aegypti, were obtained which presented an LC50 of 10.82 and

13.20 ng/ml respectively, similar to the blank Bti (9.43 ng/ml).

Keys words: Bacillus thuringiensis, toxicity, bioassay, isolates, spore-crystal.

Introducción

Los mosquitos constituyen un grupo de insectos de gran importancia desde el punto de

vista médico epidemiológico, debido a que muchas de sus especies además de provocar molestias

al hombre y a los animales, son vectores de agentes causales de enfermedades como paludismo

(malaria) y dengue (Samanidou-Voyadjoglou et al., 2007).

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos en las áreas

tropicales y subtropicales del mundo, donde vive una tercera parte de la población humana

(Guzman y Kouri, 2002).

El uso de insecticidas químicos de alta acción residual y toxicidad a amplio espectro de

organismos han ocasionado serios problemas de contaminación y resistencia de los organismos

plaga (Van Frankenhuyzen, 1993).

Como una alternativa al uso de insecticidas químicos para el control de mosquitos es

necesario el empleo de diversos agentes biológicos (Rodríguez et al., 2001) incluyendo

principalmente insecticidas microbianos (Wirth et al., 2005).

Bacillus thuringiensis Berliner es la bacteria entomopatógena más conocida, estudiada y

utilizada como agente de control microbiano. Más del 90% del mercado de bioinsecticidas

mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]

213

incluye productos a base de esta bacteria (Glare y O Callaghan 2000). Los principales productos

están basados en los serovares kurstaki, israelensis, aizawai, morrisoni, alesti, galleriae,

darmstadiensis, dendrolimus y sotto (Glare y O‟Callaghan, 2000).

Desde el descubrimiento e identificación de B. thuringiensis, el interés en esta bacteria ha

sido cada vez mayor, en el intento de encontrar nuevas toxinas con actividad biológica diferente

(Khyami-Horani et al., 2003). Se estima que actualmente existen más de 100,000 aislados

distribuidos en colecciones de todo el mundo (Hammond, 2007).

Hasta 1976 se conocía que B. thuringiensis sólo era tóxico contra larvas de lepidópteros,

sin embargo, Goldberg y Margalit (1977), aislaron una cepa en el desierto del Negev (Israel).

Este aislado representaba un nuevo serotipo (H-14) y se le denominó B. thuringiensis svar.

israelensis (de Barjac, 1978).

Bti muestra una elevada actividad insecticida sobre larvas de dípteros, en particular de

mosquitos (Culicidae) y jejenes (Simuliidae); entre los mosquitos, es activo sobre los tres géneros

más importantes: Aedes, Anopheles y Culex, en orden de susceptibilidad (Ibarra et al., 2003).

Los productos-Bt basados en esta subespecie han logrado un gran éxito y son el principal

insecticida microbiano utilizado en el control de vectores de enfermedades, especialmente en

países en desarrollo. Existen diversos formulados comerciales, los más utilizados son

VectoBac®, Bactimos® y Teknac® (Federici et al., 2005). Aunque el espectro insecticida de Bti

abarca principalmente especies de dípteros, algunos insectos de otros órdenes, como lepidópteros

y coleópteros, también han mostrado cierto grado de susceptibilidad.

El éxito experimentado con la cepa Bti estimuló en todo el mundo el desarrollo de

programas de búsqueda de nuevas bacterias y cepas de B. thuringiensis con propiedades

mosquitocidas. Hasta la fecha, se han descubierto numerosos aislados activos, aunque su

efectividad nunca ha superado la de Bti (Federici et al., 2005).

El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad de tres cepas nativas de Oaxaca de B.

thuringiensis contra Aedes aegypti (L.).


Aislamiento de cepas. Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) forman parte del

aislamiento, selección y caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis, en el que se

procesaron 71 muestras de suelo, estiércoles y telarañas. Las muestras fueron tamizadas en malla

#40. Posteriormente se incorporó 1 g de muestra en tubos de ensayo con 10 ml de agua destilada

estéril. Los tubos fueron sometidos a pasteurización mediante baño María a 65°C durante 30 min

y enfriados inmediatamente después en hielo. De la suspensión se extrajeron alícuotas de 10 µl,

con el que serían plaqueadas cajas Petri con agar nutritivo. Estas se incubaron a 28°C durante 24

h, lo cual permitió el desarrollo de colonias aisladas, que fueron seleccionadas por la apariencia

propia de B. thuringiensis: forma irregular y aplanada, márgenes recortados irregularmente,

aspecto farinoso y opaco. Estas colonias se inocularon en pequeñas gotas de agar nutritivo (a

manera de microcultivos), las cuales fueron incubadas a 28°C durante 48 h en bolsas de plástico

(para evitar desecación), hasta obtener la esporulación de la cepa. Las telarañas se colocaron

directamente en tubos Eppendorf, se les adicionó 1 ml de agua destilada estéril con sol. Tween 80

al 0.02 %. Posteriormente se procedió de la misma manera que con las muestras de suelo.

La identificación de las colonias cristalíferas se efectuó al miscroscopio óptico de

contraste de fases (1000 X). Aquellas cepas que mostraron la formación de cristales (cuerpos

parasporales típicos de B. thuringiensis) fueron resembradas y cultivadas bajo las mismas

214

condiciones durante 4-5 días, hasta obtener autolisis. Posteriormente, cada cepa completamente

autolizada fue suspendida en 1000 µl de agua destilada estéril dentro de pequeños viales, donde

se introdujeron tiras estériles de papel filtro para absorver la suspensión bacteriana y se

sometieron a congelación y liofilización para después almacenarse a -20°C.

Bioensayo Preparación del Complejo Espora-Cristal. Para la selección toxicológica de las cepas

aisladas, se realizó una serie de bioensayos con larvas de A. aegypti, díptero de susceptibilidad

conocida a B. thuringiensis svar. israelensis. Se obtuvieron polvos liofilizados del complejo

espora-cristal, con la finalidad de contar con un peso seco constante para cada bioensayo de cada

una de las cepas. Las cepas cristalíferas se sembraron en matraces de 500 ml con leche

peptonizada y se incubaron a 28°C a 250 rpm (Revoluciones por minuto). Después de la autolisis

(5 días), se suspendió el cultivo de los matraces en 10 ml de agua destilada estéril y se sometió a

tres centrifugaciones sucesivas con la finalidad de eliminar las posibles exotoxinas excretadas, así

como los desechos celulares. El precipitado obtenido se congeló y liofilizó. El polvo seco

obtenido se utilizó para los bioensayos.

Pruebas de Toxicidad. La metodología del bioensayo fue diseñada con la finalidad de

determinar la concentración que provoca un 50% de mortalidad en la población (CL50), y así

determinar el grado de actividad del agente microbiano. Dichas pruebas toxicológicas se llevaron

a cabo sobre larvas del cuarto instar temprano de A. aegypti, alimentadas con levadura en polvo,

bajo condiciones de insectario (28± 2ºC, 70 ± 5% de humedad relativa y fotoperiodo de 16:8 h

luz: oscuridad). El bioensayo se preparó utilizando vasos plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20

larvas.

En un primer nivel de selección se probaron todas las cepas, poniendo una cantidad

indeterminada del complejo espora-cristal. Sólo las cepas que provocaron una mortalidad de

100% se sometieron a una segunda etapa de selección, partiendo de una solución madre de 10

mg del complejo espora cristal por ml, donde se probaron niveles de concentración entre 5.04 y

61.25 ng/ml.

Se realizó un diseño completamente al azar, utilizando como unidad experimental vasos

plásticos con 100 ml de agua desclorada y 20 larvas del cuarto instar temprano. Se realizaron 5

repeticiones con un control positivo empleando Bti.

Las cepas S4(17), S18(60) y S19(65) mostraron gran actividad insecticida, por lo que se

les probó en diversos bioensayos de 6 y 8 niveles de concentración. El nivel de toxicidad fue

comparado con la CL50 obtenida para la cepa estándar de B. thuringiensis israelensis (de Barjac,

1978), producida y probada bajo las condiciones antes mencionadas.

La mortalidad se determinó a las 24 h, considerando larva muerta a aquélla que al ser

hundida en el agua, no regresa a la superficie con sus movimientos normales característicos o

bien no presentan movimiento alguno. Posteriormente se realizó un análisis Próbit para

determinar la concentración letal media (CL50).


En el cuadro 1 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa control Bti, en el cual se

observa que con una concentración de 30 y 21 ng/ml se registraron los más altos niveles de

215

mortalidad que fueron de 100 y 80% respectivamente, el cálculo de la CL50 con un valor de

9.426 ng/ml, así como la CL95 con un valor de 27.806 ng/ml.

Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa control Bti en larvas del

cuarto instar de A. aegypti.

En el cuadro 2 se presenta el efecto tóxico causado por la cepa S4(17), en el cual se

observa que con una concentración de 61.25 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de

92.5%, una CL50 con un valor de 26.91 ng/ml y una CL95 de 131.641 ng/ml.

Cuadro 2. Porcentaje de mortalidad, CL50 y CL95 del complejo espora-cristal de la cepa S4(17) en larvas del cuarto

instar de A. aegypti.


observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de

95.92%, una CL50 con un valor de 13.196 ng/ml y una CL95 de 35.466 641 ng/ml.



Tratamiento Concentración

(ng/ml)

Mortalidad

%

CL50

(ng/m)

CL95

(ng/m)

1 30 95.92

2 21 69.7

3 14.7 59 13.19 35.466

4 10.29 35.71

5 7.20 14.58

6 5.04 14.58

Control 0 0


(ng/ml)

Mortalidad

% CL50 (ng/ml) CL95 (ng/ml)

1 30 100

2 21 80

3 14.7 74.58

4 10.29 62.07 9.426 27.80

5 7.20 37.5

6 5.04 13.33

Control 0 0


(ng/ml)

Mortalidad

%

CL50

(ng/ml)

CL95

(ng/ml)

1 61.25 92.5

2 42.875 70

3 30.0125 46.84

4 21.0087 30 26.91 131.641

5 14.7061 18.75

6 10.2942 12.82

7 7.2060 13.75

8 5.0442 11.67

Control 0 0

216


observa que con una concentración de 30 ng/ml se registró la mortalidad más alta que fue de

97.5%, una CL50 con un valor de 10.823 ng/ml y una CL95 de 29.324 ng/ml.



Se observa que las CL50 de las cepas S18(60) y S19(65) con un valor de 13.2 y 10.82

ng/ml respectivamente, son similares a la CL50 de la cepa Bti (control) con un valor de 9.43

ng/ml. En las mismas cepas las CL95 tuvieron el mismo comportamiento, por lo tanto estos

resultados nos indican que las cepas S18(60) y S19(65) tienen alto potencial mosquitocida,

siendo similar a la cepa Bti (control) usada como estándar y con mejor potencial a la cepa Bti

analizada por Wirth et al., (2004), quienes reportan una CL50 de 22.3 ng/ml para el complejo

espora cristal. De igual manera Federici et al., (2003), reporta un rango de concentración letal 50

(CL50) de 10-13 ng/ml sobre larvas de cuarto estadio de muchas especies de mosquitos.

Conclusiones Se obtuvieron dos cepas altamente tóxicas a A. aegypti, cuyas CL50 fueron 10.82 y 13.2

ng/ml respectivamente similares a la Bti control (CL50 de 9.43 ng/ml) usada como estándar. Este

trabajo abre una nueva vía para el control biológico de A. aegypti, el cual es un vector de

importancia médica-veterinaria, para el cual se está implementando una estrategia de control que

combina diversos métodos, entre los cuales se podría integrar la vía que explora esta

investigación, ya que B. thuringiensis por su elevada actividad larvicida, especificidad e

inocuidad sobre organismos no blanco, complejo de tóxinas, la hace una alternativa de gran

potencial en el control de insectos vectores de enfermedades.

El contar con cepas nativas permite conservar o alterar lo menos posible la biodiversidad

existente, en lugar de usar especies exóticas aisladas de nichos ecológicos diferentes. Más aún, el

uso de especies nativas es frecuentemente más eficaz que el correspondiente a especies exóticas,

cuando los especímenes han sido aplicados en igualdad de circunstancias.

Es importante continuar con la caracterización biológica de cepas nativas de B.

thuringiensis para disponer de mayores alternativas de control biológico de insectos plaga y

vectores de agentes causales de enfermedades.


(ng/ml)

Mortalidad

%

CL50

(ng/ml)

CL95

(ng/m)

1 30 97.5

2 21 87.5

3 14.7 65

4 10.29 44.3 10.823 29.324

5 7.20 23.08

6 5.04 14.29

Control 0 0

217

Literatura citada

De Barjac, H., 1978. nouvelle variété de Bacillus thuringiensis très toxique pour les moustiques:

B. thuringiensis var. israelensis sérotype H-14. Comptes Rendus Académie Sciences 286,

297–314

Federici, B.A., 2005. Insecticidal bacteria: an overwhelming success for invertebrate pathology.

J. Invertebr. Pathol. 89, 30-38.

Glare, TR; O Callaghan, M. 2000. Bacillus thuringiensis. Biology, ecology and safety. Reino

Unido, Wiley and sons. 350 p.

Goldberg, L. J., Margalit, J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity

against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti,

and Culex pipiens. Mosquito News 37:355-358.

Guzman, G., Kouri, G., 2002. Dengue: an update. Lancet Infect. Dis. 2, 33–42.

Hammond, B. 2007. Food safety of proteins in agricultural biotechnology. CRC Press, Boca

Raton (EEUU). pp. 51.

Ibarra, J.E., Del Rincón, M.C., Orduz, S., Noriega, D., Benintende, G., Monnerat, R., Regis, L.,

de Oliveira, C.M., Lanz, H., Rodríguez, M.H., Sánchez, J., Peña, G., Bravo, A., 2003.

Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity

against different mosquito species. Appl. Environ. Microbiol. 69, 5269-5274.

Khyami-Horani, H., Hajaij, M. y Charles, J. F. 2003. Characterization of Bacillus thuringiensis

ser. jordanica (serotype H71), a novel serovariety isolated in Jordan. Curr Microbiol

47(1): 26-31.

Rodríguez M. M., Bisset J., de Fernández DM., Lauzan L., Soca A. (2001).Detection of

insecticide resistence I Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Cuba y Venezuela.

Journal of Medical Entomology 38. 623-628.

Samanidou-Voyadjoglou A., Roussis V., Petrakis P. V. (2007). Control biológico de poblaciones

de mosquitos: aspectos aplicados de control de plagas mediante enemigos naturales.

Van Frankenhuyzen K (1993) The challenge of Bacillus thuringiensis. In: Entwistle PF, Cory JS,

Bailey MJ, Higgs SR (eds) Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory

and practice. Wiley, Chichester, pp 1–35.

Wirth M. C., Jiannino JA., Federici B. A., Walton W. E. (2005). Evolution of resistence toward

Bacillus sphaericus or a mixture of B. sphaericus+Cry 1A from Bacillus thurigensis, in

the mosquito, Culex quinquiefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate

Pathology 88. 154-162.

218

PRODUCCIÓN DE PROTEASAS EXTRACELULARES DE Gliocladium virens Y SU

RELACIÓN CON LA ACTIVIDAD ENTOMOPATÓGENA CONTRA Anopheles

albimanus

Guillermo Carrión-Vázquez

1, Germán Pérez-García

2 y María Guadalupe Vázquez-Martínez

1.

1Centro Regional de

Investigación en Salud Pública (CRISP). Instituto Nacional de Salud Pública. 4ª Norte y 19 Poniente s/n, Colonia

Centro C.P. 30700. Tapachula, Chiapas, México. 2Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de

Chiapas. Tapachula, Chiapas, México. [email protected]

RESUMEN. La cepa nativa del sureste de Chiapas Gliocladium virens demostró su potencial entomopatógeno sobre larvas de

mosquitos Anopheles albimanus en bioensayos de laboratorio. Con el propósito de estimar el potencial de esta cepa nativa para su

uso en campo para el control de los mosquitos vectores de paludismo, en este estudio se evaluó el efecto de la temperatura sobre

la producción de proteasas en G. virens y su relación con la actividad entomopatógena. Se encontró que el hongo G. virens

presenta una relación directa entre la producción de enzimas proteolíticas y su patogenicidad. Gliocladium virens produjo la

mayor cantidad de enzimas a 29ºC, que es la temperatura que caracteriza a los hábitats larvales de An. albimanus. La producción

de proteasas extracelulares y la alta entomopatogenicidad de G. virens, convierten a este hongo en un excelente candidato para

usarlo en estrategias de control del mosquito Anopheles albimanus.

Palabras Clave: hongos entomopatógenos, mosquitos, enzimas, control biológico.

ABSTRACT. The native strain of the South-East of Chiapas Gliocladium virens showed its entomopathogenic potential on

mosquito larvae Anopheles albimanus in laboratory bioassays. In order to estimate the potential of this native strain for use on the

field for the mosquito control, this study evaluated the effect of temperature on the production of proteases in G. virens and its

relationship to the entomopathogenic activity. We found that the fungus G. virens presents a direct relationship between the

production of proteolytic enzymes and their pathogenicity. Gliocladium virens produced the major amount of enzymes at 29°C,

which is the temperature that characterizes the larval habitats of Anopheles albimanus. The production of extracellular proteases

and the high entomopathogenicity of G. virens, make this fungus an excellent candidate to use it in the Anopheles albimanus

mosquito control strategies.

Key words: entomopathogenic fungi, mosquitoes, enzymes, biological control.

Introducción

El control del paludismo en México se lleva a cabo mediante el uso de insecticidas

químicos contra el mosquito vector y de medicamentos antipalúdicos contra el parásito (WHO,

2008). Recientemente han aumentado los casos de resistencia a insecticidas (Penilla et al., 2007;

Dzul et al., 2007) que complican el control de esta enfermedad, por lo que es necesario buscar

alternativas al control químico. Una buena alternativa es el control biológico mediante el uso de

hongos entomopatógenos, los cuales son patógenos naturales de varios insectos, actúan por

contacto, tienen capacidad de autodiseminación, y por lo tanto, gran potencial para ser empleados

como biocontroladores (Cañedo y Ames, 2004; Vázquez-Martínez et al. 2008a).

Tanada y Kaya (1993) describieron que los hongos presentan distintos mecanismos para

atacar a los mosquitos y pueden ser separados en tres fases: a) Adhesión y germinación de la

espora en la cutícula del insecto, b) Penetración dentro del hemocele, y c) Desarrollo del hongo

que resulta en la muerte del insecto.

Los hongos entomopatógenos penetran el exoesqueleto de los insectos mediante un

proceso mecánico acompañado de la acción enzimática, de proteasas, quitinasas y lipasas. En el

proceso de infección del insecto participan principalmente las proteasas extracelulares (Cañedo y

Ames, 2004).


219

La cepa nativa del sureste de Chiapas Gliocladium virens demostró su potencial

entomopatógeno sobre mosquitos Anopheles albimanus (Vázquez-Martínez et al. 2008b) en

bioensayos de laboratorio, causando mortalidades del 100% a las 96 hs de exposición a 4.6x107

conidias/ml. Con el propósito de estimar el potencial de esta cepa nativa para su uso en campo

para el control de los mosquitos vectores de paludismo, en este estudio se evaluó el efecto de la

temperatura sobre la producción de proteasas en G. virens y su relación con la actividad

entomopatógena.


Material biológico. La cepa de G. virens pertenece al cepario del Laboratorio de

Patógenos y Vectores del CRISP, a cargo de la Dra. Guadalupe Vázquez Martínez y las cepas de

referencia M. anisopliae cepa 33, fue donada por el Dr. Jorge E. Ibarra Rendón del

CINVESTAV, Irapuato y la otra cepa de M. anisopliae fue donada por la UNAM.

Cultivo. De un cultivo madre (stock) se resembraron los hongos en cajas petri con Agar

Dextrosa Sabouraud (ADS) usando la técnica del papel celofán (Dennis y Webster, 1971). Los

conidios se cosecharon en agua tridestilada estéril y se hicieron diluciones hasta una

concentración final de 104 conidias/ml. Este inóculo se resembró en matraces Erlenmeyer con

medio de cultivo líquido de soya.

Tratamientos. Los hongos se crecieron en medio líquido de soya, a diferentes

temperaturas: 20, 23, 26, 29 y 32°C, y fueron expuestos a un fotoperiodo de 12:12 horas

luz:oscuridad. La producción de enzimas proteolíticas de cada tratamiento se evaluó a las 24, 48,

72, 96 y 120 horas, por medio de las técnicas de la azocaseína y de la elastina cromogénica.

Todos los tratamientos fueron realizados en una cámara ambiental y se manejaron tres

repeticiones para cada tratamiento.

Evaluación enzimática. Para evaluar la producción de enzimas se tomaron muestras de

1.5 ml de los diferentes cultivos, por triplicado, a las 24, 48, 72, 96 y 120 h y se depositaron en

tubos Eppendorff de 2 ml. Los tubos se centrifugaron a 10 000 rpm durante 15 min y los

sobrenadantes (enzimas) fueron colectados. La actividad proteolítica fue evaluada a través de dos

técnicas.

Método de la azocaseína (Castellanos-Moguel 2002). En un tubo Eppendorff de 1.5 ml,

se colocaron 250 μl de sustrato y 150 μl de enzima y se incubaron a 25ºC por 1 h. Posteriormente

se agregó 1.1 ml de ácido Tricloroacético (TCA) al 10%, se mezcló y dejó en reposo durante 15

min para luego centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. En tubos de vidrio de 12 x 75 mm se

recuperó 1.2 ml de sobrenadante y se adicionaron 1.4 ml de hidróxido de sodio 1.0 M; se mezcló

para el desarrollo del color y después se realizó la lectura a la absorbancia de 440 nm. Se preparó

para cada muestra un tubo testigo de la misma manera pero al sustrato se le agregó el TCA al

10% antes que la enzima. Se usó como blanco el buffer de fosfatos. La actividad proteolítica se

expresó en unidades de proteasa (UP), siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un

cambio en la absorbancia de 0.01 a 440 nm, bajo las condiciones experimentales usadas.

Método de la elastina cromogénica. De una suspensión de elastina rojo congo (1.5

mg/ml) en buffer Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0, se tomaron 4 ml y se mezclaron con 1 ml de enzima

agitando vigorosamente por 10 seg. Se incubó a 30ºC durante 30 min sin agitación y luego se

centrifugó a 10 000 rpm durante 15 min. Se filtró el sobrenadante y se leyó a una absorbancia de

450 nm. Se preparó de la misma forma para cada muestra un tubo testigo con 4 ml del buffer sin

el sustrato y 1 ml de enzima, incubando a 30ºC por 30 min sin agitación. Se usó como blanco el

220

buffer Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0 sin el sustrato. La actividad enzimática sobre la elastina fue

determinada en unidades de enzima (UE), siendo una unidad la cantidad de enzima necesaria para

originar un cambio en la absorbancia de 0.01 a 450 nm, bajo las condiciones experimentales

usadas.

Bioensayos. Los hongos G. virens y M. anisopliae se cultivaron bajo las condiciones de

temperatura que obtuvieron la mayor y la menor producción de enzimas proteolíticas. Se

obtuvieron las conidias y se suspendieron en Tween 80 al 0.0001% a una concentración de 108

conidias/ml del hongo. Los bioensayos se realizaron en una cámara ambiental, colocando 100 ml

de la suspensión de conidias con 25 larvas de A. albimanus de 3er estadio en recipientes

desechables de plástico. Las observaciones se hicieron cada 24 h durante 5 días. En todos los

bioensayos se incluyó un grupo testigo de larvas, colocadas en una solución de Tween al

0.0001% pero sin conidias. Los bioensayos tanto para los tratamientos como para los grupos

testigos se realizaron por triplicado.


Determinación de la producción de proteasas: Técnica de la azocaseína.

El hongo G. virens mostró la mayor producción de proteasas a 29ºC a partir de las 48 h de

incubación (39.2 UP/ml), con un pico máximo a las 72 h (47.36 UP/ml). Con el tratamiento a

32ºC, G. virens no produjo proteasas (Cuadro 1). Por lo que, la temperatura de incubación afectó

la producción de proteasas de este hongo.

Cuadro 1. Producción de proteasas (UP/ml) de G. virens a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.

Temperatura

(ºC)

Tiempo de incubación ( h )

24

(UP/ml)

48

(UP/ml)

72

(UP/ml)

96

(UP/ml)

120

(UP/ml)

20 0 3.93 4.43 2.53 0.86

23 0.1 6.16 25.75 2.36 11.93

26 0.1 1.7 4.36 2.13 8.18

29 0.23 39.2 47.36 29.1 19.13

32 0 0 0 0 0

El hongo M. anisopliae produjo gran cantidad de proteasas a dos diferentes temperaturas

de incubación: 23 y 29ºC (Cuadro 2). La mayor cantidad de proteasas a 23ºC fue a partir de las

48 h de incubación (37.03 UP/ml), alcanzando la producción máxima a las 72 h (56.56 UP/ml). A

la temperatura de 32ºC, M. anisopliae no produjo proteasas.

Cuadro 2. Producción de proteasas (UP/ml) de M. anisopliae a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.

Temperatura

( ºC)


24

(UP/ml)

48

(UP/ml)

72

(UP/ml)

96

(UP/ml)

120

(UP/ml)

20 0 2.43 8.53 3.03 2.83

23 0.3 37.03 56.56 44.8 19.56

26 0.16 8.3 2.03 8.36 5.13

29 0.23 53.9 32.03 1.73 18.7

32 0 0 0 0 0

221

Determinación de la producción de Elastasa: Técnica de la elastina rojo congo.

Se demostró que G. virens tuvo la mayor producción de enzima a 29ºC, logrando la mayor

cantidad (3.96 UE/ml) a las 48 h (Cuadro 3). La menor producción de elastasa se observó a la

temperatura de 23ºC.

Cuadro 3. Producción de elastasa (UE/ml) de G. virens a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.

Temperatura

( ºC)


24

(UE/ml)

48

(UE/ml)

72

(UE/ml)

96

(UE/ml)

120

(UE/ml)

20 0 2.53 3.63 0.5 0.06

23 0.1 1.63 0.66 0.73 0.13

26 0.06 2.4 0.10 0.43 0.16

29 0.26 3.96 0.83 2.1 0.10

32 0.33 2.83 0.37 0.36 0.16

Cuando se cultivó M. anisopliae, se observó la mayor producción de elastasa a 23ºC

alcanzando un máximo a las 72 h (3.90 UE/ml). También hubo una producción considerable a 20

y 29ºC a las 48 h de incubación y la menor producción de elastasa fue a 32ºC (Cuadro 4).

Cuadro 4. Producción de elastasa (UE/ml) de M. anisopliae a diferentes temperaturas y tiempos de incubación.

Temperatura

( ºC)


24

(UE/ml)

48

(UE/ml)

72

(UE/ml)

96

(UE/ml)

120

(UE/ml)

20 1.9 2.63 1.03 1.4 0.23

23 0.3 1.63 3.90 1.36 0.06

26 0.16 4.16 0.03 1.26 0.02

29 0.23 3.7 1 1.53 0.04

32 0 2.76 0.53 3.45 0.06

En la producción de elastasa G. virens produjo mayor cantidad que M. anisopliae. La

temperatura de 29ºC y el tiempo de incubación de 48 h en la producción de elastasa de G. virens

coinciden con las condiciones para la producción de proteasas.

Bioensayos. Los resultados mostraron que en la cepa nativa de G. virens sí existe una

relación entre la producción enzimática y la patogenicidad, ya que las mortalidades larvarias

causadas por este hongo, con los cultivos crecidos a la temperatura de mayor producción de

enzimas (29°C), fueron del 100% a las 72 h del bioensayo (Cuadro 5). Esta relación no se

observó en la cepa de M. anisopliae, la cual mostró un porcentaje de mortalidad de 44% a las 120

h con los cultivos de mayor y menor producción de proteasas. Esto podría indicar que la

patogenicidad de este hongo depende más del proceso mecánico que del enzimático.

La temperatura es el principal factor de variabilidad en la producción de enzimas en un

hongo (Nirula, 1957) seguida de la exposición a la luz (Quesada y Vey, 2004), lo cual fue

constatado en este estudio. La cepa nativa de G. virens fue aislada en la planicie costera de

Chiapas, donde las temperaturas oscilan de 22ºC por la noche hasta 36ºC en el día, con una

temperatura promedio de 29ºC (Vázquez-Martínez et al. 2002).

222

Cuadro 5. Mortalidad larvaria (%) de Anopheles albimanus expuestas a G. virens y M. anisopliae cultivados bajo las

temperaturas en que produjeron la mayor y menor cantidad de enzimas.

Hongos Temperatura

Producción de

enzimas

Mortalidad diaria Mortalidad

(%)

Proteasas Elastasas 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h

M.

anisopliae

20°C --- Mayor 0 2 4 6 9 36

23°C Mayor --- 0 2 5 8 11 44

32°C Menor Menor 1 3 5 8 11 44

G. virens

23°C --- Menor 0 3 5 7 10 40

29°C Mayor Mayor 5 16 25 100

32°C Menor --- 1 3 5 8 13 52

Al comparar la producción de proteasas se observa que G. virens produjo la mayor

cantidad de proteasas a 29ºC desde las 48 h de incubación, mientras que M. anisopliae logró la

mayor producción de proteasas desde las 48 h de incubación, pero a 23ºC. La cepa de M.

anisopliae, donada por el CINVESTAV Irapuato, fue aislada de cultivos en el estado de

Guanajuato, con temperaturas promedio inferiores a las presentes en el estado de Chiapas. Por lo

anterior, M. anisopliae no es una buena opción para usarse en estrategias de control de larvas de

A. albimanus ya que tendría la desventaja de que su mayor producción de proteasas es a una

temperatura diferente a la presente en los criaderos de mosquitos, mientras que G. virens logró su

mayor producción a la temperatura promedio de 29ºC, que es la que caracteriza a los hábitats

larvales de este mosquito.

La producción de proteasas extracelulares y la gran patogenicidad de G. virens, convierten

a este hongo en un excelente candidato para el control del mosquito vector del paludismo A.

albimanus.

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, que financió este estudio a través del

Proyecto No. 87102. A la Q.F.B. Olga R. Gálvez Coutiño por su asistencia en laboratorio y a la

Téc. Octavia Pérez Medina por su apoyo en insectario.

Literatura Citada

Cañedo, V. y T. Ames. 2004. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos.

Centro Internacional de la Papa (CIP). Lima, Perú. 62 pp.

Castellanos-Moguel, M. J. 2002. Relación entre los niveles de proteasa y quitinasa en aislados de

Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith y su patogenicidad hacia la mosquita

blanca. Tesis de Maestría en Ciencias Químico-biológicas. Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas. Instituto Politécnico Nacional. México, D.F.

Dennis, C., and J. Webster. 1971. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. I:

Production of non-volatile antibiotics. Trans Br Mycol Soc, 57: 25-39.

Dzul, A. F., Penilla, R. P., y A. D. Rodríguez. 2007. Susceptibilidad y mecanismos de resistencia

a insecticidas en Anopheles albimanus del sur de la Península de Yucatán, México.

Revista Salud Pública de México, 4: 302-311.

Nirula, K. K. 1957. Observations on the green muscardine fungus in populations of Oryctes

rhinoceros L. Journal of Economic Entomology, 50: 767-770.

223

Penilla, R.P., Rodríguez A. D., Hemingway J., Trejo A., and A. D. López. 2007. Cytochrome

P450-based resistance mechanism and pyrethroid resistance in the field Anopheles

albimanus resistance management trial. Pest Biochem Physio, 89: 111-117.

Quesada, M. and A. Vey. 2004. Bassiacridin, a protein toxic for locust secrected by the

entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Journal Mycology, 108:451-452.

Tanada, Y. and H. K. Kaya. 1993. Insect pathology. Academic Press, New York, N. Y.

Vázquez-Martínez, M. G., Rodríguez M. H., Arredondo J. I., Méndez J. D., Bond J. G. and M.

Gold. 2002. Cyanobacteria associated with Anopheles albimanus (Diptera:Culicidae)

larval habitats in southern México. Journal of Medical Entomology, 39:825-832.

Vázquez-Martínez, M. G., Bond C. G., Torres E. J., Juárez S. J., Marina F. C., y T. López. 2008a.

Estrategias de control biológico. En: Rodríguez, M. H., Ulloa G. A., y J. Ramsey. Manual

para la vigilancia y el control del paludismo en Mesoamérica. Instituto Nacional de Salud

Pública. Cuernavaca, Morelos, México. 208pp.

Vázquez-Martínez, M. G., Rodríguez-Meneses A. y M. H. Rodríguez-López. 2008b.

Patogenicidad de diferentes cepas de hongos sobre el mosquito Anopheles albimanus

Wiedemann (Diptera:Culicidae), vector de paludismo. Entomología Mexicana, 7:760-763.

WHO. 2008. Malaria: informe sobre la situación actual: 142.a Sesión del comité ejecutivo.

Washington, D.C, EUA. 23 al 27 de junio del 2008.

224

EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA CAPACIDAD INFECTIVA DEL NEMATODO

PARÁSITO Romanomermis iyengari WELCH (NEMATODA:MERMITHIDAE) EN

LARVAS DE MOSQUITOS Culex quinquefasciatus SAY (DÍPTERA: CULICIDAE)

Ninfa Ruiz-Santiago y Rafael Pérez-Pacheco.

Instituto Politécnico Nacional (CIIDIR-IPN-Oaxaca), Calle Hornos N

o

1003, Col. Indeco Xoxocotlán, Oaxaca, México. C.P. 68000. [email protected] ,

[email protected].

RESUMEN. Las especies de nematodos parásitos del género Romanomermis (Mermithidae) son una alternativa efectiva,

específica y sostenible para el control biológico de mosquitos. Sin embargo el uso práctico y extensivo de los nemátodo está

limitado y requieren especial cuidado en la capacidad reproductiva, viabilidad e infectividad de los preparasíticos ya que estos son

la etapa parasítica del nematodo y es limitada por factores ambientales como la Temperatura, Salinidad y pH. Es por ello que se

evaluó el efecto de la salinidad en la capacidad parasítica del nematodo Romanomermis iyengari. Los niveles de parasitismo e

infestación se vieron disminuidos respecto a las concentraciones altas de salinidad. La salinidad es un factor de estrés de los

estados infectivos del nematodo R. iyengari afectando su capacidad infectiva y disminuyendo su potencial de control biológico de

larvas de mosquitos.

Palabras clave: nematodos, Romanomermis iyengari, salinidad.

ABSTRACT. The species of parasitic nematodes of the genus Romanomermis (Mermithidae) are an effective alternative,

targeted and sustainable alternative for biological control of mosquitoes. However the practical and extensive use of the nematode

is limited and they require special care in reproductive capacity, viability and infectivity of the preparasíticos these are the

parasitic nematode stage and is limited by environmental factors such as temperature, salinity and pH. For this reason that

assessed the effect of salinity on the parasitic ability of nematode R. iyengari. Levels of parasitism and infestation were

diminished to high concentrations of salinity. Salinity is a factor of stress of infective state of the nematode R. iyengari affecting

their infective ability and decreasing the potential for biological control of mosquito larvae.

Key words: Romanomermis iyengari, salinity, nematode.

Introducción

Los mosquitos son importantes en el sector salud por ser vectores de enfermedades como

la malaria y dengue, además de los problemas de molestia que ocasionan por sus picaduras,

principalmente por los criaderos naturales que están cerca a establecimientos humanos. La

utilización de insecticidas químicos ha sido el principal recurso en campañas para el control de

mosquitos. Sin embargo, el uso excesivo de estos productos químicos ha ocasionado serios

efectos nocivos sobre el ambiente, fauna y personas expuestas, tales como: contaminación del

suelo, aire y agua, muerte de organismos no nocivos, alteración de ecosistemas, resistencia a

insecticidas, intoxicación de personas y además alto costos económicos (Pérez-Pacheco et al.,

2005).

El uso de nematodos parásitos es una alternativa de alto potencial para el control

biológico de larvas de mosquitos (Paily y Balaraman, 2000). Estos organismos son parásitos

obligados, los cuales deben cumplir parte de su ciclo vital en el interior de una larva de mosquito,

las ventajas principales que presentan estos organismos es su capacidad de sobrevivencia en los

cuerpos de agua después de su emergencia del hospedero (reciclar biológicamente),especificidad

de parasitismo en larvas de mosquitos, provocan parasitismo letal para el hospedero y son

completamente inocuos para la fauna acompañante. Romanomermis iyengari Welch 1964 es uno

de los que presenta mayor potencial para reducir las densidades larvarias de mosquitos en

reservorios naturales (Pérez-Pacheco et al., 2005). Su ciclo de vida consta de cinco fases: huevo,

preparasítico, parásito y postparasítico. La fase preparasítica producto de la eclosión de los

225

huevos es corta, de 48 a 72 horas y de gran actividad en búsqueda del hospedero. La presencia de

condiciones ambientales extremas como la salinidad, temperatura y pH de los cuerpos de agua en

donde se aplican afecta su uso práctico y extensivo de control (Pérez et al., 1999) impidiendo

que logren su máximo potencial como agentes de control biológico. En la presente investigación

los estados infectivos de R iyengari fueron sometieron a diferentes concentraciones de salinidad

con el objetivo de determinar su efecto en el porcentaje de parasitismo e infestación del

nematodo.


Para evaluar el efecto de la salinidad en la capacidad infectiva de R. iyengari se utilizaron

nematodos preparasíticos de R. iyengari y larvas de II ínstar de Culex quinquefasciatus ambas

especies producidas en la “Planta de producción masiva de nematodos parásitos de larvas de

mosquitos” ubicada en el CIIDIR-IPN-Oaxaca.

Se diseño un experimento completamente al azar con once tratamientos de las siguientes

concentraciones de NaCl: 0.00M testigo (agua desionizada que no contiene sales), 0.2M

(200mg/L), 0.4M (400mg/L), 0.6M (600mg/L), 0.8M (800mg/L), 1M (1000mg/L), 1.2M

(1200mg/L), 1.4M (1400mg/L), 1.6M (1600mg/L), 1.8M (1800mg/L) y 2M (2000mg/L) con

cuatro repeticiones cada tratamiento. Cada unidad experimental consistió en una bandeja de

polietileno de 21x13.5x5.5 cm en la cual se depositaron 200 mL de solución salina de cada una

de las diferentes concentraciones evaluadas, posteriormente se colocaron 100 larvas de mosquito

C. quinquefasciatus en II ínstar y se contabilizaron para aplicar 1000 nematodos preparasíticos

(dosis=10:1 diez nematodos por larva de mosquito) de R. iyengari a través del método de

dilución volumétrica propuesto por Petersen y Willis (1972).

Después de 24 hrs de cada una de las unidades experimentales de los diferentes

tratamientos se tomó una muestra de 20 larvas que fueron depositadas de forma individual en

platos de cultivo de tejidos de 24 pocillos en los cuales previamente se agregaron 6 mL de agua

desionizada. Cuando las larvas colocadas en los pocillos alcanzaron el IV ínstar y comenzaron a

emerger los nematodos (juveniles 4), con ayuda de agujas entomológicas y un microscopio

estereoscópico se cuantifico el número de larvas o pupas con y sin nematodos, así como el

número de nematodos en las larvas parasitadas y su sexo, para posteriormente determinar el

Porcentaje de Parasitismo (PP) y Medias de Infestación (MI, número promedio de nematodos

parasitando una larva).

A los datos de porcentaje de parasitismo y medias de infestación, se les aplicó un análisis

de varianza con Statistical Analysis System (SAS, 2004) y se compararon las medias mediante

una prueba de Tukey (α =0.0 ) para determinar el efecto de la salinidad NaCl en la capacidad

parasítica del nematodo R. iyengari sobre larvas de mosquito C. quinquefasciatus.

Resultados

En el cuadro 1, se muestra el efecto de las diferentes salinidades evaluadas sobre el

porcentaje de parasitismo y media de infestación del nematodo R. iyengari en larvas de mosquito

C. quinquefasciatus.

La salinidad influyó negativamente en el PP (P

226

Tukey P

227

en el cuerpo de los nematodos en altas concentraciones de sal probablemente disminuye su

motilidad y en consecuencia, la infectividad. El desequilibrio de iones en los nematodos

infectivos y en consecuencia los trastornos metabólicos interfirieren con la capacidad infectiva de

los preparasíticos (Brown y Platzer, 1978).

Conclusión

Fue considerable la acción de salinidades altas sobre la acción infectiva del nematodo R.

iyengari, observándose una reducción drástica en el PP. Esto sugiere que los nematodos

preparasíticos se vio afectada por salinidades altas de NaCl reduciendo su capacidad de

parasitismo.

El rango óptimo de infectividad de R. iyengari fue entre 200 mg L-1

a 1 000 mg L-1

en

donde registró promedios de parasitismo de 100 a 62.6% y en promedio de 7.2 a 2.0 nematodos

por larva parasitada de C. quinquefasciatus.

La tolerancia e infectividad de los preparasíticos de R. iyengari a estas salinidades,

representa una ventaja importante que les permitió una ventaja importante respecto al resto.

Literatura Citada

Bheema, U. W. A. Gajanana and P. K. Rajagopalan. 1979. A note on the tolerance of the

mermithid nematode, Romanomermis sp., to different pH and salinity. Indian Journal of

Medical Research, 69, 423-7.

Brows, B.J. and E. G. Platzer. 1978. Salts and the Infectivity of Romanomermis culicivorax.

Journal of Nematology, 10: 53-61

Paily, K. P. and K. Balaraman. 2000. Susceptibility of ten species of mosquito larvae to the

parasitic nematode Romanomermis iyengari and its development. Medical and Veterinary

Entomology, 14:426-429

Pérez, P. R. G. Montesino y H. C. Rodríguez. 1999. Salinidad y pH , factores que afectan el

parasitismo de Romanomermis iyengari en larvas de mosquitos Culex quinquefasciatus .

Avances en la investigación. Instituto de Fitosanidad. Montecillo, Texcoco, Edo. de

México. pp 21-2.

Pérez-Pacheco, R. C. Rodríguez-Hernández. J. Lara-Reyna. R. Montes-Belmont. and J. Ruiz-

Vega. 2005, Control of the mosquito Anopheles pseudopunctipennis (Diptera: Culicidae)

with Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermithidae) in Oaxaca, Mexico. Biological

Control, 32:137-142

Petersen, J. J. and O. R. Willis. 1972. Procedures for the mass rearing of mermithid parasite of

mosquitoes. Mosquito News, 2:226-30

SAS Institute Inc. 2004. SAS OnlineDoc® 9.1.3. Cary, NC:SAS Institute Inc.

Von Brand, T. 1943. Physiological observations upon a larval Eustrongylides. IV. Influence of

temperature, pH and inorganicions upon the oxygen consumption. Biological Bulletin,

84:148-156

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EL CONSUMO DE LARVAS DE Galleria mellonella (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)

FUENTE DE NUTRIENTES EN DOS ESTADOS DE SU METAMORFOSIS OPCIÓN AL

COMBATE DE ESTA PLAGA

Virginia Melo Ruiz, Héctor Daniel Jiménez Aguirre, Nidia Vargas Martínez, Tomas Quirino Barreda. Universidad

Autonomía Metropolitana Unidad Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villaquietud, Delegación Coyoacán,

C.P. 04960. D.F. México. [email protected].

RESUMEN. Galleria mellonella insecto considerado como plaga para las colmenas, provoca perdidas económicas significativas

en la apicultura mexicana y de otras naciones. El objeto de esta investigación fue analizar el contenido de macronutrientes y

minerales a larvas y pupas del organismo, para difundir los beneficios de su consumo a la población y contrarrestar la plaga. En

Tenancingo, Estado de México se colectaron en 2011 larvas y pupas en un apiario, para realizar análisis proximal de nutrientes.

Los resultados obtenidos para 1) larvas y 2) pupas: proteínas 1) 42.54%, 2) 40.50%; lípidos 1) 44.70%, 2) 10.86%; minerales 1)

2.93%, 2) 4.39%; carbohidratos solubles 1) 9.83%, 2) 44.25%. Ambos estados contienen cantidades considerables de proteína, las

larvas poseen alto contenido de lípidos pero en las pupas disminuye, son una buena fuente de macronutrientes y calorías por tanto

pueden considerarse como un alimento más para consumo humano y así como combate de esta plaga.

Palabras clave: apicultura, plaga, macronutrientes, nutrición.

ABSTRACT. Galleria mellonella insect consider as a plague reduce worldwide incomes of Mexican apiaries due to low down

the wax production. The aim of this study was to assess the macronutrients and minerals of the larvae and pupae metamorphosis

stage of wax moth and inform population the benefits of their consumption to human health as well as to void apiary damage of

the moth. Convenience sampling at 2011 was performed at an apiary of Tenancingo, Mexico State, to assess larvae and pupae

macronutrients and minerals of larvae s and pupas. Data from 1) larvae and 2) pupae were: proteins 1) 2. , 2) 0. 0 ; lipids

1) 44.70%, 2) 10.86%; minerals 1) 2.93%, 2) 4.39%; soluble carbohydrates 1) 9.83%, 2) 44.25%. Proteins are high in both

metamorphosis stages, however lipids were higher in larvae than pupae, nevertheless insects are a good source of nutrients

therefore they can become a part of daily diet to improve human health and at the same time low down damage of the grub

plague.

Key words: apiculture, plague, macronutrient, nutrition.

Introducción

La apicultura en México es de importancia económica desde tiempo de la civilización

Maya, la cual practicaba esta actividad, y en época de la colon

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