COORDINADORA: DRA SILVINA KUPERMAN

PROGRAMA CONSULTA AL EXPERTO

COORDINADORA: DRA GRACIELA LEÓN DE GONZÁLEZ

SITUACIÓN ACTUAL DE LA INMUNOHEMATOLOGÍA EN AMÉRICA LATINA

PROFEROR INVITADO: DR CÉSAR CERDAS-QUESADA. Servicio de Inmunohematología y Banco de Sangre. Hospital La Católica de San José, Costa Rica. cesar.cerdas@hotmail.com

Situación actual de la Inmunohematología en América Latina.

Dr. César Cerdas-Quesada

Introducción:

Los pacientes expuestos a los aloantígenos de sistemas de grupos sanguíneos por transfusión, embarazo o transplante pueden producir anticuerpos contra dichos antígenos expresados en la superficie eritrocitaria. Esto puede causar reacciones hemolíticas agudas y tardías, eventos potencialmente serios en cuanto a morbilidad y mortalidad.1

Es conocida la prevalencia de aloanticuerpos dirigidos contra los antígenos de grupos sanguíneos en varias poblaciones estudiadas, tanto en pacientes hospitalizados, enfermos hematológicos que requieren terapia transfusional crónica, gestantes como en donantes de sangre. 2 La aloinmunización es una complicación común en pacientes transfundidos, y el riesgo aumenta con el número de eventos transfusionales, aunque en la mayoría de los politransfundidos la síntesis de anticuerpos podría ser más rápida en el curso del tratamiento.3

Esta aloinmunización mediada por transfusión podría, en teoría, ser prevenida realizando una compatibilidad exacta de fenotipos entre el donante de sangre y el receptor pero, la implementación de esta estrategia es laboriosa y costosa.1

Para algunas poblaciones específicas de pacientes, como talasémicos y drepanocíticos, la compatibilidad para los antígenos de Rh y K reduce la elevada incidencia de la aloinmunización en esta población de pacientes.4

La frecuencia de aloinmunización puede variar considerablemente del 2 al 21%. Además, el número exacto de transfusiones recibidas antes de la formación de aloanticuerpos es desconocido o no está bien documentada en muchos estudios publicados.1

La resolución de los estudios para identificación de anticuerpos involucra, además del conocimiento de cómo se realizan los procedimientos y los mecanismos de las pruebas básicas de hemoclasificación ABO/D, las pruebas de antiglobulina directa e indirecta, los métodos de elución y adsorción. Una vez que se conocen los principios de las pruebas anteriores, es importante la comprensión de cómo y cuándo usar estas técnicas para resolver las reactividades inesperadas en una muestra.

Identificación de anticuerpos anti-eritrocitarios:

Existen más de 300 antígenos que pertenecen a alguno de los 36 sistemas de grupos sanguíneos existentes. Todos ellos tienen capacidad inmunogénica, aunque es importante reconocer que sólo algunos de los anticuerpos que se forman tienen

importancia clínica en transfusión sanguínea y en la Enfermedad Hemolítica Feto-neonatal (EHFN).

Los estudios para identificar anticuerpos incluyen desde aquellos que son relativamente simples por su complejidad hasta los que necesitan de técnicas complementarias para reconocer la especificidad de los mismos (elución, absorción, neutralización, etc). Se ha estimado que aproximadamente un 1 a 2% de los pacientes que requieren una transfusión de sangre poseen aloanticuerpos clínicamente significativos dirigidos contra grupos sanguíneos diferentes del Sistema ABO. Pero en poblaciones específicas, tales como pacientes con drepanocitosis o talasémicos, se estima que la aloinmunización puede aumentar a valores de 20-50%.

La detección e identificación de anticuerpos es parte del proceso para seleccionar hemocomponentes compatibles o también para reconocer aquellos que puedan tener un impacto clínico en el feto o neonato. La meta de las pruebas de identificación de anticuerpos es determinar, en un período de tiempo apropiado, la causa de pruebas positivas para anticuerpos y conocer la posibilidad de conseguir sangre compatible ya que al conocer la especificidad se puede proyectar su posible comportamiento clínico. Además, estos estudios pueden brindar información de otras causas de resultados positivos como por ejemplo un anti-D adquirido pasivamente o un autoanticuerpos frío.5-6

Se debe asignar un significado clínico a los estudios inmunohematológicos, dado que los anticuerpos encontrados pueden tener la potencialidad de producir una hemólisis postransfusional, intraútero o postnatal.

Algunos conceptos sobre las metodologías para investigación de anticuerpos:7

Los métodos comúnmente ensayados para la búsqueda de anticuerpos anti-eritrocitarios son la aglutinación en tubo, en columnas de gel y/o adherencia de glóbulos rojos en fase sólida.8-9 Se han publicado muchos estudios que comparan los diferentes métodos en busca de la mejor técnica para el rastreo de anticuerpos durante las pruebas pretransfusionales.

Algunos de ellos demostraron que la aglutinación en tubo es la mejor opción para la identificación de anticuerpos porque es capaz de detectar a la mayoría de los aloanticuerpos clínicamente significativos, si se lo compara con los otros dos métodos.9

Es importante recordar que los anticuerpos considerados clínicamente significativos son aquellos que causan una disminución de sobrevida de los eritrocitos o EHFN. Al contrario, carecen de significancia clínica los que no están asociados con los dos puntos anteriormente expuestos.10

La selección de la metodología más conveniente está directamente relacionada con disminución de la ocurrencia de reacciones hemolíticas postransfusionales, consideradas como la primera causa de los principales eventos prevenibles de

morbilidad y mortalidad asociadas a la transfusión.11Según informes de la Food and Drug Administration (FDA por sus siglas en inglés), los anticuerpos no-ABO están frecuentemente implicados en reacciones hemolíticas transfusionales.12

Técnica de Polibrene versus aglutinación en gel:

El polibrene (bromuro de hexadimetrina) es un polímero cuaternario del amonio y otros policationes que facilita la detección de anticuerpos irregulares, y para este propósito se ha diseñado un sistema trifásico. Los glóbulos rojos son expuestos a una solución de baja fuerza iónica en la fase de sensibilización. La fase de aglutinación no específica inducida por el polibrene causa una aproximación de los eritrocitos y consecuentemente permite un puente de unión de los anticuerpos con sus moléculas blanco. Es una prueba simple y rápida en la que, inclusive se han publicado estudios sobre pruebas rápidas en lámina o portaobjetos sin necesidad de centrifugar, demostrando así una buena sensibilidad para la detección de anticuerpos.13

Según un estudio, el anti-K y anti-Jka pueden ser no detectados por la técnica de aglutinación en gel pero si por la técnica de polibrene, mientras que los anti-D, -C, -E, -c, -K, -Jka, -Fya, -Lea y -s pueden ser no detectados por polibrene pero si por la técnica de aglutinación en gel. En una muestra con anti-E, identificado por aglutinación en gel reaccionó con todas las células en la prueba de polibrene. Las crioaglutininas identificadas en gel no fueron detectadas con polibrene. El método en gel fue el único que demostró hemólisis evidente en el pocillo de reacción en tres muestras de suero con anticuerpos anti-D y anti-c.

En cuanto a las muestras con más de una especificidad de anticuerpo (mezclas), las pruebas de polibrene detectaron menos anticuerpos por muestra que la aglutinación en gel. Las pruebas de polibrene no detectaron anti-K, -c y –Lea en muestras con varios anticuerpos.

Ninguno de los dos métodos fue capaz de hallar a todos los anticuerpos clínicamente significativos y el gel aportó la mayoría de resultados sin patrón para identificación. En muchos de estos casos el polibrene aportó resultados negativos. Sin embargo, el polibrene fue más sensible que el gel para detectar el anti-E dando reacciones de mayor intensidad. Además, el polibrene mostró reacciones más intensas en las muestras que tenían especificidad Anti-M.7

Polietilenglicol versus aglutinación en gel:

El Polietilenglicol (PEG) es un polímero soluble en agua muy utilizado en la industria y desde lo publicado en 1987 es considerado como un potenciador de las reacciones antígeno-anticuerpo.14 Este reactivo ha sido usado para la detección e identificación de anticuerpos irregulares y en las pruebas de compatibilidad.

Algunos anticuerpos no fueron detectados por la técnica en gel (anti-Cw, anti-M y Anti-N), mientras que el PEG no detectó otros de significado clínico (anti-C, -E, -c, -K,

-Jka, -Fya, -Kpa). Algunos anti-E no detectados por el PEG tenían títulos muy bajos (2 a 4).

En cuanto a las muestras con más de una especificidad de anticuerpo (mezclas), el PEG detectó menos anticuerpos por muestra que el gel. En este tipo de muestras, el PEG no detectó anti-K, -c, -Fya y –Lea. La técnica en gel tampoco detectó un anti-Cw en una muestra con doble especificidad.15

Polietilenglicol versus polibrene:

Cuando se comparan las técnicas manuales de polibrene y PEG en pacientes politransfundidos, en el 18,5% de las muestras se detectó la presencia de anticuerpos; de estos, 85,7% en PEG y 21,4% en polibrene. La comparación demostró que el PEG fue de mayor sensibilidad en la detección de anticuerpos aunque detectó autoanticuerpos sin relevancia transfusional en el 22% de los casos.16

Automatización:17

Es importante recalcar que la automatización fue introducida en los países desarrollados en la década de los 1960s. La automatización provee las siguientes ventajas:

- Disminuye el error humano en el estudio de muestras, lo que representa una causa significativa de errores y reacciones transfusionales debido a incompatibilidad sanguínea.

- Reduce los errores en el desarrollo de las pruebas y de las variaciones subjetivas durante la interpretación de los resultados

- Previene los errores de transcripción de datos durante la documentación de resultados.

- Agrega objetividad, reproducibilidad y almacenaje de los resultados de las pruebas inmunohematológicas.

- Favorece la trazabilidad de todas las variables durante el análisis que puede incluir muestras, reactivos y staff operativo.

Métodos moleculares en Inmunohematología:18

Los antígenos de grupos sanguíneos son analizados clásicamente por técnicas de hemaglutinación, que han sido consideradas el estándar de oro por más de un siglo. Sin embargo, este método tiene varias limitaciones como por ejemplo a la hora de realizar determinaciones en pacientes recientemente transfundidos donde coexisten glóbulos rojos del paciente y del donante. Otras aplicaciones abarcan el grupo sanguíneo en pacientes con una prueba de antiglobulina directa positiva,

predicción del grupo sanguíneo en pacientes y donantes cuando el antisuero no esta disponible, detección de antígenos expresados débilmente, diferenciación entre auto y aloanticuerpos, investigación de discrepancias ABO, etc.18

Algunas innovaciones en Inmunohematología y sus soluciones a problemas concretos se muestran a continuación:

- Reconocimiento de nuevos sistemas de grupo sanguíneos.

- Beneficio directo para el paciente como por ejemplo poco después de la identificación del gen RHD, se realizó la predicción genética del riesgo fetal para la EHFN.

- Compatibilidad de genotipo para donante/paciente en las anemias hemolíticas autoinmunes con una prueba de antiglobulina positiva y luego de transfusiones recientes.

- La relevancia clínica de algunos grupos sanguíneos como Dombrock y Scianna luego de que sus bases moleculares fueran establecidas. En los paneles celulares comerciales son infrecuentemente designados por lo que incluye un beneficio para los pacientes la posibilidad de identificar estos anticuerpos clínicamente significativos durante las pruebas pretransfusionales.

En conclusión, la aloinmunización tiene un significativo impacto negativo en los recursos del laboratorio y de las instituciones porque esta complicación implica la necesidad de incrementar las pruebas de laboratorio para la identificación de unidades compatibles para transfusión, el manejo obstétrico y para la evaluación y manejos de las reacciones transfusionales. Es clara la importancia de este tipo de estudios en la población a transfundir y se pone en evidencia la gran utilidad de definir la mejor batería de técnicas según las posibilidades del centro. A pesar de que han sido implicadas más de 50 diferentes especificidades en la patogénesis de EHFN, aquellos dirigidos contra antígenos de los grupos sanguíneos Rh y Kell son los más comúnmente asociados con una mayor probabilidad de anemia fetal severa. En estos casos es notable la importancia de realizar estudios de titulación para estimar su fuerza y concentración.19

Anticuerpos anti-eritrocitarios clínicamente significativos y clínicamente no significativos: Un concepto estricto?

Un anticuerpo es clínicamente significativo cuando es capaz de destruir los glóbulos rojos portadores del correspondiente antígeno, o contribuir a la destrucción de los mismos. En la EHFN se le exige, además, que el feto o el recién nacido haya

requerido transfusión. El posible significado clínico del anticuerpo es deducible a partir de ciertas características manifestadas en el curso de las pruebas serológicas realizadas: intensidad de la reacción, reactividad en la fase de antiglobulina, rango térmico, especificidad, clase de inmunoglobulina, subclase de IgG, y afinidad y habilidad para fijar el complemento.5

No es conveniente tener un concepto estricto de clínicamente significativo y no significativo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Lewis son usualmente anticuerpos clínicamente no significativos y comúnmente encontrados en los sueros de embarazadas o individuos Le(a-b-). Tanto el anti-Lea como el anti-Leb ocurren naturalmente y son de clase IgM aunque se ha informado sobre un anti-Lea de clase IgG. Infrecuentemente causarían hemólisis in vivo pero no han sido implicados en la EHFN. Las reacciones hemolíticas son raras con anti-Leb.20

En el caso publicado, hubo fuerte evidencia que sugiere que la reacción hemolítica transfusional del paciente fue causada por un anti-Leb:

- El anticuerpo fue hemolítico in vitro.

- Las unidades que recibió en el momento del primer evento transfusional fueron positivas para Leb así como la unidad implicada en la reacción transfusional hemolítica.

- El fenotipo del paciente fue Le(a-b-), el fenotipo más común que produce anticuerpos anti-Lewis.

- Se excluyó anticuerpos inducidos por fármacos a un antibiótico (cefepime) que estaba recibiendo concomitantemente.

Es posible que haya estado sensibilizado en el momento de la primera transfusión y después desarrolló una respuesta anamnésica a la unidad implicada. Este tipo de reacción transfusional hemolítica por anti-Leb es extremadamente rara y solamente hay publicados tres casos más en la literatura.20

La tarjeta para identificación de anticuerpos:

Se ha descrito que la tarjeta para identificación de anticuerpos puede prevenir una posible reacción transfusional hemolítica tardía ya que en muchos países no hay una base de datos nacional con los resultados de los estudios inmunohematológicos. Es necesario tener mejores métodos para compartir información importante entre los bancos de sangre.21

Encuesta sobre el estado actual de la Inmunohematología en América Latina:

América Latina es una región de aproximadamente 20 millones de km2 que se extiende desde México hasta Chile y Argentina. Está conformada por 18 países de habla hispana y uno de habla portuguesa.22

Con el objetivo de describir la actual situación de la Inmunohematología en América Latina, se envió una encuesta vía correo electrónico a miembros del Grupo Cooperativo Iberoamérica de Medicina Transfusional (GCIAMT) usando un enlace realizado por medio del programa SurveyMonkey.com (https://es.surveymonkey.com/r/RPV5TZT ), obteniéndose respuesta de centros de Argentina, Bolivia, Chile, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, España, Estados Unidos, Guatemala, Honduras, México, Nicaragua, Panamá, Perú, Uruguay y Venezuela.

De manera paralela, y en el marco del 9º Ciclo Internacional de Conferencias de la Calidad, realizado en la Ciudad de México los días 24 y 25 de noviembre de 2015, se envió una encuesta a los participantes utilizando un enlace de SurveyMonkey.com (https://es.surveymonkey.com/r/RPFBCTW ). Se obtuvieron 23 respuestas que se analizaron durante el evento y que se fusionaron con la encuesta del GCIAMT alcanzándose un total de 101 respuestas.

Las encuestas utilizaron un cuestionario de 8 preguntas de selección, dos cerradas y seis abiertas con espacio para “otro”. Se utilizó como base la encuesta internacional realizada para la ISBT en el 2014. 23

Se obtuvieron 91 respuestas que se muestran a continuación:

1. En su servicio se realizan estudios sobre anticuerpos irregulares en

a) Pacientes y donantes 69 b) Sólo pacientes 17 c) Sólo donantes 5

2. ¿Qué técnicas utiliza para la detección de anticuerpos irregulares? a) Gel 68 b) LISS 30 c) Salina 34 d) PEG 11

e) Albúmina 23 f) Pruebas enzimáticas 23 g) Polibrene 2 h) Métodos de aglutinación en columna de vidrio 18 i) Microplacas magnetizadas 0 j) Microplacas en fase sólida 11 k) Microplacas capture 11 l) No se realizan 3

Observaciones realizadas:

- En algunos casos no es utilizada la técnica en columnas de gel por problemas de presupuesto y se continúa realizando las técnicas en tubo.

3. ¿Si el estudio de anticuerpos irregulares es negativo, que técnica de prueba cruzada utiliza en su servicio?

a) Gel 68 b) LISS 23 c) Salina 21 d) Polibrene 0 e) Métodos enzimáticos 2 f) Prueba cruzada electrónica 2 g) No se realizan pruebas cruzadas en el servicio 3 Observaciones: - En pacientes transfundidos crónicamente se utiliza gel, caso contrario se

realiza sólo la prueba salina como se indicó previamente. - En 6 encuestados además lo realizan en aglutinación en columnas de

microesferas de vidrio

4. ¿Qué prueba es utilizada en su servicio para proveer unidades destinadas a pacientes con autoanticuerpos calientes?

a) Prueba cruzada con suero auto o alo adsorbido 51 b) Adsorción a las muestras de pacientes sin historial conocido 10 c) Fenotipo compatible 52 d) Genotipificación 1 e) No se estudian los autoanticuerpos y se transfunde la unidad menos

incompatible 21 Observaciones:

- En 5 encuestados las pruebas son realizadas por un banco emisor, el banco proveedor o son remitidas a un banco de sangre o laboratorio de referencia.

- En Nicaragua, el Servicio Nacional de Sangre de la Cruz Roja Nicaragüense les realiza los estudios inmunohematológicos a los servicios de transfusión del país solamente cuando se han presentado reacciones adversas o pruebas cruzadas incompatibles o si ocurre alguna discrepancia.

- En relación con la administración de fenotipo compatible, un participante informó que por lo general sólo respeta el fenotipo Rh.

5. ¿Qué técnicas principales y accesorias realiza en su servicio para la identificación de anticuerpos séricos?

a) Gel 69 b) Salina 42 c) LISS 27 d) PEG 12 e) Albúmina 25 f) Técnicas enzimáticas 31 g) Fase sólida 8 h) DDT 5 i) Prueba con precalentamiento 23 j) Incubación en frío 26 k) Neutralización 9 l) Elución 38 m) Métodos moleculares 2

Observaciones:

- Cuatro participantes informaron que las pruebas para identificación son remitidas a un laboratorio de referencia.

- Cuatro participantes las realizan empleando la técnica de aglutinación en columnas con microesferas de vidrio.

- Un participante manifestó que solicita apoyo a otra institución para métodos moleculares en casos necesarios.

- Un participante utiliza también la técnica con ficina.

6. ¿Qué suero antiglobulina humano utiliza de rutina para la identificación de anticuerpos?

a) Poliespecífico 74 b) Monoespecífico anti-IgG solamente 17 c) Anti-IgA 0 Observaciones:

- Cuando el resultado es positivo se realiza la investigación para buscar la presencia de complemento

- En dos participantes las muestras son remitidas a un laboratorio de referencia para continuar con el estudio.

- Cuatro participantes respondieron que si es necesario utilizan sueros monoespecíficos anti-IgG y anti-C3.

7. ¿Cuál es la técnica que ha resultado más compleja para el entrenamiento de sus colaboradores?

a) Adsorciones diferenciales alogénicas 17 b) Interpretación PEG en tubo 1 c) Técnicas de adsorción 11 d) Dilución correcta de los glóbulos rojos para las pruebas en gel 2 e) Adsorciones diferenciales con ZZAP 4 f) Eluciones 12 g) Pruebas en tubo 11 h) Pruebas en fase sólida 1 i) Confirmación e interpretación de subgrupos 6 j) Discrepancias de grupo ABO 9 k) Estandarización de los métodos manuales por todo el personal. 13 l) Métodos moleculares 4 m) Otros: - Importante énfasis en las identificaciones de mezclas de aloanticuerpos y/o

autoanticuerpos. - Un participante informó que no cuenta con los reactivos necesarios para

efectuar los estudios mencionados. - Un participante comentó que la resolución de discrepancias ABO y los

estudios para D débil son realizados por diferentes personas en varios turnos porque el laboratorio funciona durante las 24 horas.

Comentarios:

Uno de los aspectos más importantes de la práctica inmunohematológica es la detección e identificación de anticuerpos, ya que la respuesta de aloanticuerpos contra aloantígenos eritrocitarios es una complicación frecuente de la transfusión. 16

Los profesionales encuestados comentan que buscan la mejor compatibilidad de las unidades de glóbulos rojos para la transfusión, especialmente para aquellos pacientes con protocolos de transfusión crónica.

En la mayoría de los casos, la compatibilidad se lleva a cabo por pre-selección:

- Luego de los resultados de la investigación de anticuerpos anti-eritrocitarios.

- Con unidades antígeno negativos o compatibles basado en la identificación de anticuerpos.

Comúnmente la detección e identificación de anticuerpos se efectúan con métodos manuales: salina, albúmina, LISS, fase sólida, polietilenglicol o aglutinación en columnas de gel. Otras técnicas conocidas para detectar algunos anticuerpos clínicamente importantes no son tan apropiadas como métodos de tamizaje, tal es el caso de las enzimas y el polibrene. Algunos encuestados, informaron que utilizan enzimas para identificar anticuerpos anti-eritrocitarios.

Es importante destacar que no se incluyó en la encuesta cuál es el número de células utilizadas para la investigación de anticuerpos. La literatura actual considera que es recomendable utilizar paneles celulares compuesto por 3 viales de células.24

En cuanto a los protocolos de estudios descritos en las respuestas, como es esperar, no hay coincidencia en los algoritmos empleados. De todos modos sería deseable que en cada país, se unifiquen los métodos de estudios y los procedimientos para que a nivel nacional, los pacientes reciban resultados de informes con características lo más homogéneas posible. Hay varias publicaciones sobre la comparación de métodos para la investigación de anticuerpos en las que se analizó el efecto en las reacciones hemolíticas transfusionales tardías y serológicas. Cuando se comparó el comportamiento del PEG versus el gel, se demostró una igual sensibilidad para detectar anticuerpos, pero la aglutinación en gel tenía una menor capacidad para detectar anticuerpos clínicamente no significativos y también en la incidencia de reacciones postransfusionales. 25

En una publicación de 2010 sobre las técnicas usadas en Japón se notó también la heterogeneidad en las metodologías y además, como el uso de pruebas en tubo se documentan en el menor número de instituciones. 26

Agradecimientos:

A los profesionales e instituciones que completaron la encuesta o brindaron alguna información.

Argentina: Oscar Torres, Jorgelina Blejer, Oscar López, Anabel Buceta, Andrea Torresi, Mónica Puppo, Flavia Cimillo, María Virginia Nicolorich. Bolivia: Edith Colque Ninaja. Colombia: Armando Cortés, Ángela María Balaguera G, Ángela Patricia Estrada N, Gloria Eugenia Barco A, Clínica Vascular Navarra, Myriam Guzmán Cote, Pilar Cárdenas González, Andrea Villamil, Rosa Duarte, Marisol Barrero, Fundación Hospital de la Misericordia, Norma Montoya García, Verónica

Ángel, Ángela María Trujillo Alvarado, Hospital Bosall nivel E.S.E., Sociedad de Cirugía de Bogotá, Hospital San José. Costa Rica: Adrián Soto Alpizar, Mario Barrantes, Jonathan Alfaro, Eduardo Alberto Zúñiga Delgado, Patricia Contreras. Ecuador: María Calahorrano Chamba, Marco Herdoiza Holguin, María Eugenia Zúñiga. El Salvador: Claudia Villatoro de Sorto. España: Roberto Roig Oltra. Estados Unidos: Carmen Valqui. Guatemala: Paula Castellanos, Myriam Juárez Vielman, Gladys Murga. Honduras: Martha Alemán, Keydi Juárez. México: Héctor Baptista González, Araceli Malagón Martínez, Elizabeth Guzmán Vásquez, María Margarita Carrera Hernández, Javier Bautista, Mario Alberto González Santos, Omar Juárez Castrejon, Alfredo González Rodríguez, María Morales, Sergio Arturo Sánchez Guerrero, Magalí Rodríguez, Hospital Materno Infantil Iseemym Toluca, María Concepción Pérez Robles, Rosa María Macias Medrano, Susana Lomeli Espinosa, María de los Angeles Soster Contreras, Hospital Regional de Puebla, Banco Regional Issste Culiacán Banco de Sangre Sanalona, María de Lourdes Zavala Trejo, Claudia Espinosa, Clínica Médica Sur, Juan Germán Portela Vázquez, Vicente Tovar Tovar, Lilia Rodríguez, Banco de Sangre Centro Médico Nacional Siglo XXI, Hospital Aranda de la Parra, CETS Jalisco, José Ramón Rivas Llamas. Nicaragua: Dalila Hernández Brenes. Panamá: Maura Ballesteros, Esmeralda Tuy de Lam, Itzka K Batista J. Perú: Ina Pérez, Carlos Penalillo, Estela Aliano Palomino, Alejandro Bustamante, Víctor Vargas Mendoza, Hospital Nacional Docente Madre Niño San Bartolomé, Oscar Pérez. Uruguay: Hemocentro Regional de Maldonado, Maximiliano Berro. Venezuela: Graciela León, Marinela Falcone, Rossana Cortez.

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