Copia de Manual de Procesos-monitor

7/24/2019 Copia de Manual de Procesos-monitor

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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS

MANUAL DE PRCTICAS

PROCESOS BIOLOGICOSCdigo: 185!1"

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE # RECURSOS NATURALES

ADMINISTRACI$N AMBIENTAL

AGOSTO DE "15


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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. Entre al laboratorio con la bata puesta y permanezca con ella abotonada.

2. Debido a que los microorganismos con los cuales trabajar son potencialmentepatgenos, es necesario que su manipulacin se haga dentro de la mayor asepsiaposible, est atento a las recomendaciones.

. !impie la super"icie de la mesa de trabajo con una solucin germicida antes ydespus de la prctica.

#. $antenga la mesa libre de todo aquello que no sea esencial. %us objetos personalesy libros gurdelos en los gabinetes destinados para tal "in.

&. !a'e sus manos y desin"ctelas antes y despus de realizar cualquier siembra.

(. )o "ume ni coma dentro del laboratorio

*. $aneje correctamente el microscopio y tome las precauciones necesarias delimpieza y mantenimiento.

+. Durante el semestre le sern asignadas a cada curso de laboratorio un sitioespec"ico para incubacin y mantenimiento de materiales, que debe ser conser'adodurante todo el semestre. -s mismo los materiales asignados deben ser cuidadospara el adecuado desarrollo de las prcticas.

. Debe traer un equipo de trabajo compuesto por una asa de bacteriologa de puntarecta, una de punta redonda y una de micologa. /inta para enmascarar, lpiz decera y algunos elementos como tijeras o cortador, jabn, un limpin y "s"oros.


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PRCTICA%ACTIVIDAD FEC&A

0)3D4//03)5 )3$-060D-D7 803%E940D-D -gosto

$3:3!390- ; 0)/03)E% $0/380-)-% -gosto

$E3D3% DE %0E$8- -gosto

!ectura $todos de %iembra$E3D3% DE E/4E)3 0 %eptiembre

$E3D3% %0$

/3)3! $0/380-)3 %eptiembre

/3)3! $0/380-)3


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PRACTICA No' 1

MORFOLOGIA BACTERIANA # TECNICAS DE TINCION

INTRODUCCI$N

Morfologa bacteriana:

- pesar de la gran cantidad de bacterias que se desarrollan en una gran di'ersidad dehbitats, su "orma se reduce a tipos bsicos> !os cocos BredondosC, los bacilosBalargadosC y los espirilos Ben "orma de sacacorchosC. -dems en el caso de lasbacterias es"ricas se pueden distinguir agrupaciones como diplococos, sarcinas,tetradas, esta"ilococos y estreptococos.

Preparaciones para observar morfologa:

!a mor"ologa microbiana se puede eaminar de dos maneras.

Tincin simple:%e lle'a a cabo con colorantes bsicos como el azul de metileno y elcristal 'ioleta y colorantes cidos como la nigrosina.

Tincin diferencial: /omo la coloracin de 9ram y la coloracin de cido alcoholresistencia.

Tincin de estructuras: /omo la tincin de :eulgen para colorear material gentico, latincin de %chae""er :ulton para endosporas, la tincin de la pared celular, la tincin de"lagelos y la tincin de cpsulas.

Tincin de material de reserva:Ejemplos son la tincin de -lbert o de glucgeno y la

tincin de los lpidos.


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PROCEDIMIENTO

A' P()*+(+,io-). )- /().,o%on muy utilizadas para obser'ar muestras directas de protozoos, tienen poco uso en

bacteriologa a menos que se use un microscopio de contraste de "ase.1. En una lmina portaobjetos limpia y marcada colocar una gota de un caldo de

culti'o, sua'emente coloque una laminilla cubreobjetos y djela caer en ngulo de#&F.

2. /olocar la preparacin en la platina del microscopio, obser'ar con los objeti'os de1GH, #GH y 1GGH. 4tilizar la misma muestra y prepara "rotis "ijos, colorear con azulde metileno en la primera prctica y con la coloracin de 9ram en la siguiente,comparar los resultados en cada caso.

B' F(o0i. /io.

1. En una lmina portaobjetos limpia y marcada, colocar una gota de agua destilada,!as etensiones a partir de medios lquidos se hacen de la misma manera, eceptoque no se requiere adicin de agua.

2. %uspender en la gota el inoculo bacteriano, utilizar el asa bacteriolgica estril.

. Etender la gota de suspensin en un rea no superior a dos centmetroscuadrados. %eguir instrucciones del pro"esor.

#. Dejar que la preparacin se seque al aire. :ijar con calor, pasando tres 'ecesseguidas a tra's de la llama del mechero. /olorear.

C. Ti-,io-).

TINCI$N SIMPLE:

1. /olocar la preparacin sobre una rejilla encima del 'ertedero.2. /ubrir la preparacin con cualquiera de las soluciones colorantes que se indican a

continuacin.

a. /ristal 'ioleta Bsolucin al &I en aguaC> 1 minuto.b. -zul de metileno de !oe""ler > & minutosc. :ucsina "enicada diluida> G segundos

. Despus del tiempo indicado, eliminar el colorante y la'ar sua'emente con el chorrodel agua.

#. Dejar secar.


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#. /olocar la preparacin en la platina y obser'ar con el objeti'o de menor aumento.4na 'ez logre el en"oque en 1GH y #GH, desplace la lmina a uno de los etremos ycoloque una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 9irar el re'l'er paraque el objeti'o de inmersin quede en posicin de obser'acin, en"ocar. %i la

distancia "ocal es correcta el lente de 1GGH entrar en contacto con el aceite.$ientras est obser'ando el objeto a tra's del microscopio le'ante o acerque muylentamente el objeti'o con el tornillo micromtrico hasta lograr nitidez.

&. egistrar lo obser'ado. Elaborar el in"orme.

(. Despus de utilizar el microscopio, limpiar el aceite de inmersin de los lentesutilizando papel de arroz u otro papel "ino.

COLORACIONES COMPUESTAS

/3!3-/03) DE 9-$

1.


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!a resistencia de las micobacterias a la decoloracin por cidos se basa en el hecho deque poseen una capa serosa que pre'iene o impide a los colorantes absorbidos por lasclulas ser etrados por un tratamiento de la'ado con alcohol5cido.

1. Elaborar un "rotis a partir de tierra, "ijar con calor

2. /olocar las lminas "ijadas en la rejilla de coloracin y cubrir con "ucsina "enicada./alentar sua'emente sobre un mechero de alcohol hasta emisin de 'apores, e'itarque el colorante se seque o hier'a. Dejar en"riar luego de cada calentamiento.ealizar este procedimiento durante cinco minutos. etirar el colorante y la'ar conagua de chorro.

. Decolorar con alcohol 5 cido durante 2G segundos. !a'ar con agua.

#. /ontra colorear con azul de metileno por un minuto. !a'ar con agua y secar al aire.

!as micobacterias se 'en como bacilos rojos sobre un "ondo azul plido.

0)/0L) DE E%4/4-%.

$N3D3 DE %/@-E::E 5 :4!3)

1.


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1. Describa y eplique el "undamento de tinciones utilizadas en microbiologa,di"erentes a las realizadas en la prctica de laboratorio.

2. Eplique el "undamento y los usos potenciales de la microscopa de> /ontraste de "ase /ampo claro

/ampo oscuro $icroscopa electrnica de barrido$icroscopa electrnica de trans"erencia

.


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PRACTICA No' "

METODOS DE SIEMBRA

INTRODUCCI$N

4na manera sencilla para estudiar los microorganismos es hacerlos crecer en un mediode culti'o contenido en un tubo de ensayo, en una caja de

M)dio d) ,730io .3ido> /on un porcentaje de agar entre el 1 P 1.( I.M)dio d) ,730io .)i.3ido> ambin conocido como caldo, no contiene agar.

El tipo y modo de preparacin de los medios de culti'o son decisi'os para obtener unasolucin ptima y de alto rendimiento.

- Emplear agua destilada o desmineralizada "resca, de reaccin neutra y dentro de loposible pobre en grmenes.

- 4tilizar recipientes poco alcalinos como el 'idrio u ollas esmaltadas.

- - una cantidad de agua aproimadamente igual a la mitad de la necesaria a la quese 'aya a preparar, adicionar la cantidad prescrita en la etiqueta del "rasco del mediode culti'o deshidratado. @acer una suspensin homognea y luego agregar el aguarestante.

- !os medios que contienen agar se dejan en reposo durante 1G minutos para quepueda embeberse el agar por el agua, y se colocan en una estu"a o en el mecherohasta que hier'a y el lquido est brillante.


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cada lote del medio preparado una prueba de esterilidad y una prueba dee"ecti'idad.

El crecimiento puede mani"estarse de di"erentes "ormas como son el enturbiamiento yopacidad del medio, la "ormacin de un 'elo originado por una masa de organismos

que "lotan en la parte superior del culti'o o como un sedimento en la parte in"erior deltubo, pero que se pone en suspensin cuando se agita. En el medio slido elcrecimiento de los microorganismos se mani"iesta por "ormacin de colonias. !amanera tpica en la cual crece cada microorganismo en un medio de culti'o ya sealquido o slido, en condiciones ambientales constantes es muy Jtil para suidenti"icacin. /on este mtodo se busca lograr colonias aisladas en lasuper"icie del medio de culti'o, para as obtener culti'os puros. !as colonias aisladasson mor"olgica y "isiolgicamente iguales y son las que deben utilizarse para realizarpruebas bioqumicas.


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Espiral ejilla /ombinado:igura 2.1. $todos de siembra en medios de culti'o slido ser'ido en cajas de

El monitor entregara a cada grupo los medios de culti'o y las cepas bacterianas. %eguirlas siguientes instrucciones>

1. /alentar el asa al rojo, dejarla en"riar.

2. omar el tubo con el medio a inocular y el tubo de la muestra con la mano izquierda,remo'er con la mano derecha el algodn de ambos, "lamear sua'emente la boca deambos tubos e introducir el asa redonda sacar una gota de la muestra y depositarlaen el medio de culti'o estril, "lamear ambos tubos y algodones antes de taponar. Elasa debe calentarse al rojo antes de 'ol'erla a colocar en la mesa.

%istema de siembra en medio slido>

En cajas

1. ener en cuenta tcnicas aspticas. %embrar por agotamiento Bobser'ardemostracin del instructorC un agar nutriti'o.

En tubos de ensayo>

1. %eguir las mismas recomendaciones pero usar asa de bacteriologa de punta recta.%embrar un agar motilidad.


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2. En tubos con medios de culti'o con super"icie plana realizar una picadura o puncin.% el medio tiene super"icie inclinada al sacar el asa del medio hacer una espiral enla super"icie, utilizar el medio suministrado por el docente.

-mbientales>1. Elegir un sitio para conocer la densidad bacteriana del aire. omar una caja del agar

nutriti'o, destaparla y eponerla al aire durante 1& minutos.2. 0ncubar con todo el material sembrado en la prctica.. /ontar las colonias desarrolladas en el medio.#. eportar y elaborar in"orme.&. Estudiar mor"ologa de colonias con ayuda de la "igura .1.

0ncubacin>

odos los materiales inoculados en la prctica se colocan en canastilla marcada con elnJmero de grupo y "echa. odo el material en su interior debe estar marcado demanera similar. 0ncubar a &Q75G.&F/ durante 2#5#+ horas. /ada grupo debe 'eri"icar latemperatura.

!ectura de resultados>e'isar, anotar y describir los resultados obtenidos en cada caso> el crecimiento decolonias, la obtencin de colonias aisladas, mor"ologa de colonias Btabla 251C presenciay tipo de contaminacin etc.

SEGUIMIENTO

Elaborar un in"orme escrito de las obser'aciones y resultados obtenidos durante laprctica.


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FIGURA 2.1: CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS UTILES

PARA SU IDENTIFICACION*

TAMAO: En mm

FORMA: Puntiforme

Circular

Filamentosa

Ameboide

Rizoide

Fusiforme

COLOR: Pigmento extracelular: El medio de cultivo cambia de color

Pigmento intracelular: La colonia es coloreada

CONSISTENCIA O TEXTURA: Viscosa

Seca

Desmenuzable

Grasosa

ELEVACION: Plana Elevada

Cncava Pulvinada

Umbonada

BORDE: Entera (circular) Ondulada

Lobulada Crenada

Filamentosa Enrollada


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*Caractersticas uniformes para un medio de cultivo y un tiempo de incubacin dado


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TABLA DE RESULTADOS'

PRACTICA NO' "' MTODOS DE SIEMBRA

+' MTODOS DE SIEMBRA

No'

CEPA

AGAR TSIA AGAR SIM MORFOLOGAG37,o.

+

L+,%S+, &"S G+. MOTILIDAD &"S INDO3 GRAM

;' AMBIENTALES

E.07di+-0) F),)(o d) ,o3o-i+.1"!

No0+: E.0+( +0)-0o. + 3o. ().730+do. d) 3o. o0(o. g(7*o. 4 0)-)(3o. )- ,7)-0+ )-3+ di.,7.i-


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PRACTICA No' !

METODOS SIMPLIFICADOS PARA EL ESTUDIO DE LAS BACTERIAS

INTRODUCCI$N

-un cuando los mtodos tradicionales para estudiar las bacterias siguen siendoherramientas bastante utilizadas, muchos de ellos son engorrosos, consumen muchotiempo, requieren muchos operarios, algunas 'eces muy entrenados, para surealizacin, as como laboratorios con reas bien di"erenciadas y bastante equipo.Debido a lo anterior se han diseKado sistemas ms simpli"icados que generalmenteson simples, rpidos y no requieren mucho tiempo para su realizacin.

0denti"icacin bioqumica con sistemas rpidos>

En la actualidad por razones de comodidad se han diseKado bateras Bo TitsC dereacciones bioqumicas que 'ienen integradas en unidades que reciben di"erentesnombres segJn su utilizacin o la casa comercial que la produzca. - este Jltimo es un sistema cmodo y sobre todo rpido, a las cuatrohoras ya se obtienen resultados pero es ms usado para el diagnstico clnico. Elsistema -

Este mtodo se aplica actualmente para la deteccin de coli"ormes totales yEscericia colien aguas. 4tiliza substratos hidrolizables por enzimas espec"icas deesas bacterias. /uando se usa la tcnica cromognica los coli"ormes totales se de"inencomo todas aquellas bacterias que poseen la enzima 5D5galactosidasa la cual alromper el sustrato libera un compuesto coloreado. Escericia coli se de"ine como unabacteria perteneciente a los coli"ormes por lo tanto es 5D5galactosidasa positi'a, queadems posee la 5glucuronidasa la cual actJa sobre un sustrato "luorognicoliberando un compuesto "luorescente. 6arias casas comerciales han propuesto diseKosque permiten el recuento o la deteccin B


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PROCESO

1' P()*+(+,i-

- /ada grupo debe programar con el monitor la hora de asistencia al laboratorio paralectura de pruebas a las 2# y #+ horas.

"' E),7,i-

Identificacin bioqumica con API 20E

/ada grupo utilizar una bacteria coli"orme incluida Escericia coli.

1. %eguir las instrucciones del pro"esor.2. 0ncubar en cmara hJmeda y leer a las 2# y a las #+ horas.

Mtodo del sustrato Cromo!nico:

En la prctica 'a a identi"icar presencia de coli"ormes y Escericia colien muestras deagua potable, usar un sistema para monitoreo Bcuando desea tener respuestascualitati'as, positi'o7negati'oC de calidad. Es muy importante que un grupo prepare uncontrol negati'o Bagua destilada estrilC y otro un control positi'o Bagua destiladainoculada con Escericia coli.

1. -gregar el reacti'o B'iene en dosisC a 1GG ml de la muestra de agua2. 0ncubar a &Q G.&F / por 2# horas. !eer los resultados> 0ncoloro> negati'o para coli"ormes totales y E. coli. -marillo>

positi'o para coli"ormes. :luorescente Bcuando utiliza una lmpara ultra'ioleta conlongitud de onda de (& nmC> positi'o para E. coli.

SEGUIMIENTO

1.


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2. /ul es la di"erencia entre bacterias alctonas y autctonasO De ejemplos. Enqu grupo se encuentran los coli"ormesO

.


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PRACTICA No' ?

CONTROL MICROBIANO POR AGENTES FISICOS # @UIMICOS

INTRODUCCI$N

!os "actores "sicos y qumicos tienen un e"ecto notable sobre la 'ida de losmicroorganismos en su medio ambiente natural. -lgunos estimulan su desarrollo entanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del e"ecto de esos parmetrosmedio ambientales no solo permiti estudiar los microorganismos bajo condicionescontroladas de laboratorio para "a'orecer su crecimiento sino que posibilit aprender la"orma de controlarlos. Este Jltimo campo, el del control microbiano, constituye una delas reas ms importantes de la $icrobiologa -plicada principalmente en losrelacionados con sanidad y produccin industrial. %e reconoce que un agentemicrobiostatico impide el desarrollo de uno o 'arios microorganismos y uno microbicidacausa su muerte. -dems el uso de "iltros tanto en el laboratorio como en ambientesnaturales, como por ejemplo su paso por arena o por capas de la tierra, "a'orece sueliminacin mecnica.

En este laboratorio podr apreciar el e"ecto de la temperatura, agentes antimicrobianosy p@ sobre el desarrollo de algunos microorganismos.

PROCESO

1' P()*+(+,i-

- raer correctamente leda y preparada la prctica a realizar. El ito del trabajo en ellaboratorio depende de una buena organizacin y preparacin.

- Durante esta sesin realizar acti'idades que sern interpretadas en la primeraparte de la prctica de la semana entrante.

"' E),7,i-

)3-> Es muy importante sembrar de ultimo el Bacillus subtilis en un sitio apartado dellaboratorio.

+' E/),0o d) 3+ 0)*)(+07(+ .o;() )3 ,(),ii)-0o ;+,0)(i+-o

/ulti'o de Escericia coli /ulti'o de Bacillus subtilis /aldo rojo de "enol B:C glucosa

0nocular cada cepa en # de los caldos suministrados. $arcar muy bien


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%ometer parejas Buna "ormada por un caldo : glucosa inoculado con E. coliy otrocon B. subtilisC a uno de los siguientes tratamientos>

/alor hJmedo B121U/ durante 1& minutos, en autocla'eC


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En una caja de petri de -gar nutrit'o, inocular cada una de las cepas.

0mpregnar con sensidiscos estriles alcohol, yodo, hipoclorito y tego &1. !uegocolocarlos sobre cada caja con petri con cada microorganismo, dejando espacio

entre ellos. 0ncubar durante 2# horas a & Q5 G.& U/

3bser'ar el desarrollo de halos de inhibicin en cada caso.

3bser'e y anote los resultados.

V El pro"esor o el monitor repartirn a cada grupo una de las cepas seleccionadas.

SEGUIMIENTO

Elaborar un in"orme escrito de las obser'aciones y los resultados obtenidos durante

la prctica.

/4E%03)-03

1. Eplique a que se re"iere el tiempo de reduccin decimal en la temperatura. /moaplicara este concepto en la estandarizacin de un proceso de esterilizacin porcalorO

2. /mo podra demostrar si un microorganismo es term"ilo o termotoleranteO

.


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PRACTICA No' 5

METODOS PARA RECUENTO DE MICROORGANISMOS INDICADORES

EN AGUAS POTABLES # NATURALES

INTRODUCCI$N

@ay 'arios mtodos para determinar el nJmero de grmenes presentes en una muestrade agua. En esta prctica se entrenar en los principios bsicos para realizar los tresms utilizados, el mtodo de la placa 'ertida o recuento standard en placa, el nJmeroms probable B)$


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". El conteo en cajas que contengan entre G5GG colonias.

%e pesan aspticamente 2& gr o ml de la muestra segJn el caso y se diluyen en 22&ml de agua peptonada al G.1I estril. %i son materiales slidos se maceran antes dehacer la dilucin, con ayuda de una licuadora. !a suspensin as obtenida debe

homogenizarse per"ectamente por lo menos 2& a G 'eces antes de proseguir. !asmuestras lquidas se suspenden directamente en el diluyente. !a suspensin obtenidase denomina dilucin 1G51para todos los casos. -nlisis $icrobiolgico de -guas. $edios de culti'o. $E/SC

&ecipientes: %e utilizan "rascos de 'idrio de 2&G5&GG ml limpios y estriles.,escloracin:


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aKadir un "ormador de quelatos como etilendiamintetracetato en una concentracin de*2 mg7! solo o conjuntamente con tiosul"ato sdico antes de la esterilizacin de los"rascos. Toma de muestras: !a muestra debe ser representati'a del agua a in'estigar ydebe e'itarse estrictamente su contaminacin. !os "rascos de las muestras no sellenan completamente, para poder agitar el contenido antes de la preparacin de los

culti'os.


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*. /ontar las colonias. R)*o(0+( 3o. ().730+do.' I-.0(7,,io-). )- 3+ 0+;3+ '"E3+;o(+( )3 i-/o() *().)-0+( 3+. ,++. ,o- 3+. di37,io-). ,o(().*o-di)-0)..

&'mero M(s Probable )&MP* $ara co3i/o(). 0o0+3).>

1. $arcar tres series cada una de tres tubos que contienen un caldo de culti'o con latecnologa sustrato de"inido, 3)

/on este mtodo se har el conteo de coli"ormes totales o "ecales en muestras deagua potable.

1. -gitar la muestra, adicionar 1GG ml en el embudo de la parte superior del equipo,'eri"icar que el "iltro de membrana BG.#& mC de acetato de celulosa, estcorrectamente colocado. -plicar 'aco para que la muestra pase a tra's de lamembrana. Enjuagar con agua peptonada, usar al menos un 'olumen igual al de lamuestra "iltrada.

2. etirar la parte superior del embudo. /on ayuda de unas pinzas estriles tomar lamembrana y colocarla en la super"icie del agar E)D3 Bcaja de petri pequeKaC.

. 0ncubar a &Q G.&F / por 2# P #+ horas. %i 'a a contar coli"ormes "ecales hacerlos a##,&U /. /ontar solo las colonias rojas oscuras desarrolladas en la super"icie del"iltro.

#. Elegir para el recuento cajas con un rango de colonias entre 2G y 2GG. eportar elresultado.


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M+0)(i+3). 4 R)+,0io.:

Erlenmeyers &GG ml


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TABLA 5.1.MICROORGANISMOS A INVESTIGAR EN EL AGUA

INDICADORES PATOGENOS

$es"ilos -erobios !tap"lococcus aureus /oli"ormes otales Pseudomonas aeruginosa /oli"ormes :ecales !almonella $lostridium%ul"ito eductor !igella

-ibrio coleraey -. paraaemol"ticus

6irus intestinales, algunas especiesde leptospiras, hue'os de parsitosintestinales, etc.

PARAMETROS RECOMENDADOS

AGUAS: )aturales)egras INDICADORES


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TABLA 5.2: RECUENTO STANDARD EN PLACA

INTEPRETACION Y CALCULO

1. %eleccionar las cajas de la dilucin que contengan entre G5GG colonias.

/ontar las colonias de cada caja, tomar la media aritmtica y multiplicar por el in'erso del"actor de dilucin. En el recuento "inal se in"orman dos dgitos. %i el tercer dgito de laderecha es & o mayor, el 'alor hay que aproimarlo a la unidad superior siguiente y seaumenta en una unidad el "actor de dilucin. + H 1Gu"c7m! o g. En tanto que en +* H 1G2u"c7m! o greportar> H 1Gu"c7m! o g.

2. %i no hay cajas entre G5GG colonias BEstos casos se in"orman como Yecuento Estimado%tandardZ>

El nJmero es mayor que GG>

Po( , ,7+d(+do Esta norma se aplica el recuento contempla elnJmero de microorganismos con caractersticas macroscpicas importantes. Ej> ecuento dehongos y le'aduras.


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TABLA 5. 3. NUMERO DE GERMENES DE MAXIMA PROBABILIDAD.

NMP

CON 3 TUBOS DE 10, 1 Y 0.1 ml

No' d) 07;o. *o.i0io. L9i0). d) ,o-/i+-+ 5H

NMP%13

1G 1.G G.1 B+o A30oG G G [ 5 5G 1 G Q [1 1*1 G G # [1 211 G 1 *Q 2 2*1 1 G * 2 2+1 2 G 11Q # &

2 G G 2 +2 G 1 1#Q & #+2 1 G 1& & &G2 1 1 2GQ * (G2 2 G 21 + (2 G G 2 1G G 1 1G 1+G 1 G # 1G 21G 1 1 *& 2G 2+G 2 G G +G 2 1 1&G &G &GG

2 2 21GQ +G (#G G 2#G G 1#GG 1 #(G 1GG 2#GG 2 11GG GG #+GG \11GG 5 5

a- los resultados normales obtenidos en el &I de las pruebas no se les coloca el signo BQC. - los resultados que sepresentan con menor "recuencia, obtenidos en solo el #I de las pruebas se les adiciona el signo BQC. !ascombinaciones de tubos positi'os que no se muestran, ocurren en menos del 1I de las pruebas, si ocurren"recuentemente indican "allas en la metodologa. El )$< para esas combinaciones se pueden obtener poretrapolacin hacia la combinacin ms alta que si se muestra, por ejemplo, un resultado de 25G52 podratener un resultado aproimado de 2G, el cual es el )$< de un resultado de 25151.

omado de> :D-. 12. 8-/E03!390/-! -)-!;0/-! $-)4-!.*thedition.


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PRACTICA No'

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVOS: TEST ECOMETRICO

INTRODUCCI$N

M)dio. d) ,730io 4 ()+,0io.: la importancia que tiene la calidad en la "abricacin delos medios de culti'o deshidratados as como su preparacin, conser'acin y uso, es elpunto de partida para lograr que estudios microbiolgicos y sus resultados seancon"iables. !os laboratorios utilizan di'ersos medios de culti'o sin e"ectuar lacomprobacin de su e"iciencia, en la mayora de los estudios sobre calidad en loslaboratorios uno de los puntos crticos son los medios de culti'o reconstituidos.0nicialmente los "abricantes de medios de culti'o o"recen una buena calidad de losmismos en cuanto a su capacidad de recuperacin y7o selecti'idad, estado "sicoBgranulado, en pol'o, deshidratado, etc.C, pero su uso inadecuado, as como sualmacenamiento, preparacin y elementos que inter'ienen durante esta operacinpueden conducir a un deterioro de los mismos, y como consecuencia se e'aluaraninadecuadamente la contaminacin real de las muestras analizadas o alteracin de losdatos en una in'estigacin microbiolgica. !a e'aluacin con cepas control es un puntoimportante para determinar la calidad del medio.

Co-0(o3 d) ,+3id+d d) )dio. d) ,730io

En la mayora de los laboratorios no se presta mucha atencin al "uncionamiento de losmedios de culti'o y por ende se pueden emitir resultados que no sean del todocorrectos.


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E+37+,i- d) )dio. d) ,730io .3ido. )*3)+-do )3 0odo ),o0(i,o;+.+do )- )3 0odo d).,(i0o *o( Mo..)3 4 ,o3' 18!K 15'

$ossel y colaboradores describieron en 1+ un mtodo que permite e'aluar lasensibilidad de los medios de culti'o selecti'os al desarrollo de un microorganismo

deseado y la resistencia a la colonizacin por microorganismos indeseados y laselecti'idad de los medios no selecti'os, que se denomin mtodo ecomtrico.

MTODO ECOMTRICO'

Este mtodo utiliza un procedimiento normalizado de siembra en estras para obteneruna dilucin progresi'a de una suspensin de prueba de un microorganismo en unaplaca del medio que se est colocando a prueba. 4sando este procedimiento se obtieneun resultado semi5cuantitati'o.

En una placa de petri antes de 'erter el medio a e'aluar, es di'idida en cuatrocuadrantes sobre la base de la misma y en cada cuadrante se trazan cinco B&C lneasparalelas y una lnea en el centro de la misma tal y como se muestra en la :ig.1.


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Fig7(+ 1' epresentacin de las di'isiones de la placa de petri para la ejecucin del testEcomtrico.

2. Depositar el medio de culti'o a e'aluar en una capa cuyo grosor deber ser de unos# mm.. - partir de cada uno de los culti'os en "ase eponencial Bmantenidos en crecimientotoda la noche o 1+ horas de incubacinC, tome con una asa calibrada de 1 microlitro ytrace sobre la super"icie del medio & estras paralelas a las lneas dibujadas en cadacuadrante y una estra central, de "orma progresi'a y sin recargar, retorcer, repisar oesterilizar el asaB:ig. 2C. epresentacin de la secuencia de siembra del test Ecomtrico.

1


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#. 0ncubar las placas en posicin in'ertida por el tiempo necesario y a la temperaturaapropiada segJn el mtodo.

&.ranscurrido el tiempo, e"ectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que cadaestra tiene un 'alor de G.2 y la estra central de 1.G.

(. $ultiplicar por el nJmero de estras en las cuales se obser'a crecimiento, ydeterminar el ]ndice de crecimiento absoluto BICAC. %i hay crecimiento en las cincoestras de los cuatro cuadrantes y la estra central B1C, el 0/- es igual a &. El 0/- esigual al nJmero del cuadrante cuando todas las estras de este y de los cuadrantesanteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se obser'e crecimiento enninguna estra del cuadrante siguiente.

*. E"ectuar la misma operacin con el medio de re"erencia. 4na 'ez obtenida laslecturas en cada medio B0/-C, sacar el ]ndice de /recimiento elati'o BIC%C,comparando el 0/- del medio en e'aluacin y el medio de re"erencia.

IC% ICA Medio Evaluado ICA Medio %eferencia

OBSERVACIONES:

El 0/ deber estar cercano a 1.


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. /on que "recuencia debemos hacer pruebas ecometricas en el laboratorioO#. =ue son microorganismos inter"erentesO =u 'entajas tiene hacer pruebas

ecometricasO

M+0)(i+3 d) Vid(io E67i*o. 4 o0(o.:-sas de platino calibradas./ajas de petri.0ncubadora de &U/$echeroeglamarcador

M+0)(i+3 ;io3gi,o/epas bacterianas de 1+ horas de incubacin y repicadas por tres das consecuti'os>

!tap"lococcus aureus.

Escericia coli.

Bacillus cereus

!almonella

Pseudomona aeroginosa.

M)dio. d) C730io

E$8, /etrimide, H!D, %%, 8acillus cereus, 8aird -cademic


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FORMATO 1

VALORES DE REPRODUCTIVIDAD # SELECTIVIDAD MTODO ECOMTRICO

FEC&A:

C)*+ I-0)(/)()-0): C)*+ d).)+d+: I-.0(7,,io-).:

:rente a la lnea de cada cuadrante coloque un BQC si se presenta crecimiento y B5C si nohay crecimiento. %ume el nJmero de positi'os para cada cuadrante y multiplique porG.2. En la "ila correspondiente a suma coloque el resultado para cada cuadrante, y en lalnea & si hay crecimiento coloque un 'alor de 1.:inalmente sume los resultados y obtendr el 0/- para cada medio.

$edio de re"erencia> -gar ________________________.

1 2 # & %4$-

/uadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante # ____ ____ ____ ____ ____ ______!nea & ______

ICA:

$edio a 'alorar producti'idad> -gar ________________________.

1 2 # & %4$-/uadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante # ____ ____ ____ ____ ____ ______!nea & ______ICA:

$edio a 'alorar selecti'idad> -gar ________________________

1 2 # & %4$-/uadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante ____ ____ ____ ____ ____ ______/uadrante # ____ ____ ____ ____ ____ ______!nea & ______

ICA: V+3o( d) -di,) d) C(),ii)-0o R)3+0io ICR:


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PRCTICA No'

ELABORACI$N DE #OGURT

INTRODUCCI$NEl yogurt se puede obtener a partir de la leche de de todas las especies de animales yaunque la ms comJn es la 'aca, la cabra y la o'eja, tambin se han utilizado leches decamella y bJ"ala. Eisten distintos tipos de yogurt, pero los ms importantes son losyogures "irmes o consistentes y los yogures batidos.


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8ureta !minas /ulti'o iniciador B2G mlC-zJcar B1 lbC :ruta Bmora o "resa, limnC 8olsa de leche pasteurizada ecipiente de 'idrio para la conser'a ecipiente plstico para el yogurt /ulti'o iniciador


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3bser'e la consistencia a la hora 1, 2 y #, determine la acidez a la hora # y hagacoloracin de 9ram

-parte realice una determinacin del grado de acidez del culti'o iniciador anote losresultados.

4na 'ez terminada la "ermentacin adicione la conser'a y mezcle sua'emente parae'itar la sinresis.

En"re antes de tomar

RESULTADOS

P(od7,0o H A,id)!eche inicial0nculo inicial@ora #

/oloracin de 9ram del producto terminado>

_____________________________________

DISCUSI$N

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. )ombre algunas de las cepas probiticas ms utilizadas en la elaboracin deyogurtO

2. Di'ersas in'estigaciones se han realizado respecto al yogurt con probiticos y lapre'encin de en"ermedades como el cncer de clon, soportado con artculosrecientes cuente que otras en"ermedades pueden ser pre'enidas consumiendoestos productos regularmente.

. En que legislacin colombiana se basara para crear un producto nue'o queusted 'a a sacar al mercado como el yogurt YDoKa lecheZO

#. =u signi"ica sinresis, y porque se debe e'itar en la produccin de yogurtO

' BIBLIOGRAFIA CONSULTADA


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PRCTICA 8

INTERACCIONES MICROBIANAS I: V)(i/i,+,i- d)3 )/),0o d) 3+ .i;io.i. d)

%,i-obium .*.4 7-+ 3)g7i-o.+'Desde los orgenes de la microbiologa, "ue e'idente la importancia de lasinteracciones microbianas con animales y plantas, principalmente en lo relacionado conlas relaciones hospedero patgeno, durante los procesos in"ecciosos. !a in"inidad deen"ermedades in"ecciosas, causadas por 'irus, bacterias y protozoos, as como unagran cantidad de relaciones ben"icas para los organismos eucariotas, indican que losmicroorganismos son agentes acti'os dentro de los ecosistemas y que in"luyen y sonin"luenciados por otras poblaciones de organismos 'i'os.

Dentro de las posibilidades de interaccin, la simbiosis eistente entre algunas plantas y

microorganismos "ijadores de nitrgeno es ampliamente reconocida y de granimportancia desde el punto de 'ista agrcola.

%e sabe que la producti'idad de los ecosistemas, entendida como la cantidad debiomasa que un sistema puede producir por unidad de tiempo y rea, est controladaen gran medida por nutrientes limitantes. El nitrgeno asimilable escaso en el suelo yen el agua, se encuentra almacenado en "orma molecular y gaseosa en la atms"era,por lo que suele ser un elemento limitante de la producti'idad. -lgunosmicroorganismos, poseen la capacidad de con'ertir el nitrgeno atmos"rico ennitrgeno asimilable a tra's de un proceso conocido como "ijacin biolgica delnitrgeno muchos son de 'ida libre, no obstante, algunos han establecido relacionesmuy estrechas con plantas como en el caso de la bacteria hizobium y algunos hongosque "orman micorrizas.

El gnero &iobium, es uno de los ms importantes simbiontes "ijadores de nitrgenoen los miembros de la "amilia !eguminosae. Estas bacterias, establecen una relacincon las clulas de los pelos radiculares dando origen a la "ormacin de ndulos,consecuencia del desarrollo del microorganismo al interior de una pared sintetizada porla planta. !a simbiosis entre estos organismos, asegura la disponibilidad de sustratosorgnicos, necesarios para el desarrollo de la bacteria, y pro'ee a la planta denitrgeno asimilable necesario para su crecimiento.

En esta prctica se pretende aislar bacterias "ijadoras de nitrgeno del gnero&iobium a partir de ndulos radiculares de trbol y comprobar el e"ecto de suinoculacin sobre el crecimiento de plntulas.


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PROCEDIMIENTOAi.3+i)-0o d) %,i-obium

!le'e al !aboratorio una buena cantidad de trboles sil'estres que presenten

desarrollo claro de nodulacin radicular. En general, los ndulos radiculares acti'ostienden a presentar una coloracin rojiza, por lo que es deseable encontrar estascaractersticas en los ndulos utilizados para este propsito.

!a'e muy bien las plantas recogidas, procurando eliminar el eceso de tierra. etirela mayor parte de tallos y hojas que sern innecesarios. - partir de este punto utilicepinzas para e'itar la contaminacin de los ndulos.

Enjuague los "ragmentos de raz que contengan los ndulos con agua desionizadaestril. %umerja los ndulos en alcohol al +G I durante # minutos. :iltre a tra's deuna gasa los ndulos para recuperarlos. Enjuague con agua destilada estril durante

& minutos. %umerja los "ragmentos en solucin de hipoclorito durante & minutos.


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que la cantidad de eopolisacarido sea mayor en los de crecimiento rpido mientrasque puede ser escasa en los de crecimiento lento.

%iembre por agotamiento en cajas con agar ;$- y rojo congo # colonias que seaproimen a la descripcin mor"olgica planteada arriba.

0ncube a 2( U/ durante 1 semana.

I-o,73+,i- )- *3+-0+. d) 0(;o3

El objeti'o de este ensayo es comprobar el e"ecto de la inoculacin de las bacteriaselegidas como supuestos miembros del gnero &iobium, sobre el desarrollo deplntulas de trbol. siembre en cada uno de tres "rascos con tierra estril 1&

semillas sin tratamiento.o /ontrol de limitacin por nitrgeno> agregue en cada uno de tres "rascos

con tierra 2& ml de una solucin de )@#)3G,1 $ estril, luego siembrecada uno con 1& semillas sin tratamiento.


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Espere ( a * semanas para que las semillas germinen y obtenga plntulasdesarrolladas. E. ().*o-.+;i3id+d d) ,+d+ g(7*o d) ).07di+-0). +-0)-)( 3o.)=*)(i)-0o. )- ;7)-+. ,o-di,io-)..


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ubos de centr"uga plsticos 1G6asos plsticos 1+/ajas de he 77linT.springer5ny.com7linT7ser'ice7booTs71G12&7.

S+do.4 M'K G(+77linT.springer5ny.com7linT7ser'ice7booTs71G12&7.
http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/


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P%AC"ICA &o.

I/E&"I+ICACI& /E 1&3) Medio Ambiente4 3istemas de aires acondicionado # frutas en

descom$osicin*

Introduccin

El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edi"icios puede produciren sus habitantes determinadas patologas entre las que cabe destacar asma yal'eolitis alrgicas. !a contaminacin ambiental por hongos en el interior de edi"icios, esdebida bsicamente a hongos "ilamentosos y le'aduras.

De igual "orma es cierto que los alimentos pueden ser 'ehculo de transmisin dedi'ersos microorganismos y metablicos microbianos, algunos de los cuales sonpatgenos para el hombre, segJn su procedencia se agrupan en>

O(ig)- )-dg)-o> presentes en el alimento antes de su elaboracin alimentos deorigen animal productores de zoonosis, transmitida por 'a digesti'a al hombre pormedio de alimentos.

O(ig)- )=g)-o> llegan a los alimentos durante su obtencin, transporte,industrializacin, conser'acin, etc. !os que son patgenos para el hombre producenintoicacin alimentaria Bconsumir alimentos contaminados con periodo de incubacinde 251G horas y que presenten un sndrome gastroentericoC.

!a /3o(+ )=g)-ode los alimentos esta constituida principalmente por microorganismossapro"itos, que son la causa principal de alteracin de los di'ersos alimentos.

De todos los ms conocidos son los mohos que crecen en la super"icie de los alimentoscon su tpico aspecto aterciopelado o algodonoso, a 'eces pigmentado, y quegeneralmente todo alimento enmohecido o "lorecido se considera no apto para elconsumo. %i bien es cierto que los mohos inter'ienen en la alteracin de muchos tiposde alimentos, determinadas especies de los mismos son Jtiles en la elaboracin demuchos tipos de alimentos. -s, algunos tipos de quesos son madurados por mohos,como por ejemplo el queso azul, el de oque"ort, el de camembert, el de 8rie, el de9ammelost, etc., utilizndose tambin en la elaboracin de alimentos orientales, comoson la salsa de soja, etc.

El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos "ilamentososmulticelulares cuyo crecimiento en la super"icie de los alimentos se suele reconocer


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"cilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. !a parte principal de sucrecimiento suele tener aspecto blanco, aunque puede tener colores distintos, coloroscuro o color de humo. %on tipicas de los hongos adultos de algunas especies lasesporas de colores 'ariados, las cuales pueden comunicar su color a parte o a todo elcrecimiento, carece de races 'erdaderas, de tallos y de hojas.

$uchos hongos son bene"iciosos, algunos son comestibles, como es el caso de lassetas y de la protena unicelular de las le'aduras.. De las plantas se pueden aislarmuchos hongos, entre los cuales se encuentran especies de los gneros -lternaria,hizopus, :usarium, /ladosporium, @elminthosporium y /haetomium. !os dos gnerosde hongos que predominan en los alimentos almacenados probablemente sean


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hongos son di"sicos, es decir, unas 'eces se comportan como hongos "ilamentosos yotras pueden comportarse como le'aduras.!as condiciones necesarias para que un hongo crezca en una super"icie son> eistenciade esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre # y + o/.

En la prctica, los hongos "ilamentosos y las le'aduras tambin se di"erencian en ellaboratorio en dos grupos segJn el aspecto macroscpico de sus colonias> lasle'aduras "orman colonias hJmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos"ilamentosos producen colonias algodonosas, lanosas o pul'erulentas.

E.*),i). . ,o7-). )- +i() i-0)(io(

!as especies ms comunes que se encuentran en aire interior son las re"lejadas en latabla 1, a partir de los resultados obtenidos en dos estudios di"erentes B@ealth y^el"are, 1+* y :lanigan et al. 1C publicados en 8iocontaminants in 0ndoorEn'ironment. !os hongos ms comunes eistentes en el pol'o de origen domsticopueden "cilmente pasar al aire y si se dan las condiciones adecuadas para sudesarrollo en cuanto a temperatura y humedad relati'a, tambin pueden acantonarseen cualquier tipo de material Bcomo al"ombras, moquetas, empapelado de una pared,etc.C y crecer desmesuradamente, proyectando al ambiente un nJmero ele'ado deesporas con el consiguiente riesgo para la salud.

T+;3+ 1' &o-go. ,o7-). )- *o3o do.0i,o/ladosporium sp. B /. cladosporoides, /. herbarum, y7o /.sphaerospermumC


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E/),0o. .o;() 3+ .+37d!os hongos a tra's de sus esporas, micotoinas y por la emisin de 63/ Bcompuestos'oltiles orgnicosC, pueden causar di"erentes tipos de en"ermedades o alteraciones de

la salud> En"ermedad in"ecciosa o patognica> aspergilosis Bpor eposicin a -spergillus"umigatusC, histoplasmosis Bpor @istoplasmaC, criptococosis Bpor /rypto coccusC ycoccidiomicosis Bpor /occidioidesC

eacciones alrgicas, como rinitis y asma )eumonitis por hipersensibilidad /ncer debido a micotoinas carcinognicas Desrdenes inmunolgicos por micotoinas inmunosupresi'as eacciones ticas por micotoinas eacciones de in"lamacin debidas al 51,5glucano, compuesto de la pared

celular de los hongos %indrome Edi"icio En"ermo

P(i-,i*+3). 0odo. d) id)-0i/i,+,i- d) 2. %eleccionar una colonia aislada.. /alentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar de "orma que se

con'ierta en un objeto cortante.


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#. /on la ayuda del asa, etraer un "ragmento triangular de la colonia que contengaadems un poco de agar en la parte in"erior.

&. Depositar el "ragmento etrado sobre un portaobjetos en el cual, pre'iamente,se ha depositado una gota de azul de lacto"enol.

(. /ubrir con un portaobjetos y presionar sua'emente para dispersar la colonia y el

agar de esta "orma, la muestra est disponible para su obser'acin almicroscopio.

Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios, ya que lasmuestras se preparan con "acilidad y rapidez y adems permite identi"icar muchas delas especies de hongos ms habituales. El mayor incon'eniente de la obser'acin en"resco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas alpresionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es 'lido en los casosen que es necesario conocer la disposicin de las esporas.

Fig' 1: P()*+(+,i- )- /().,o

P()*+(+,i- ,o- ,i-0+ d) ,)3o/- +d


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4na de las des'entajas de este mtodo es que si la cinta transparente no se presionacon su"iciente "irmeza sobre la super"icie de la colonia, la muestra no es adecuada, yaque al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hi"as no se pueden identi"icar.

En los casos en que mediante este mtodo no se obser'en esporas deber realizarse

la preparacin en "resco.

Fig' ": P()*+(+,i- ,o- ,i-0+ d) ,)3o/- +d


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BIBLIOGRAFIA

$icrobiologia de los alimentos -utores> ^./. :racier7 D./. ^estho"", editorial -cribia %.-BAaragoza EspaKaC, 1 /uarta Edicin.

$icrobiologia de los alimentos B:undamentos ecolgicos para garantizar y comprobarla inmunidad y calidad de los alimentosC. -utores> D.-.-. $ossel7 8. $oreno 9arcia,Editorial -cribia, %.- BAaragoza EspaKaC, 1+&.


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PRACTICA No'1

LA COLUMNA DE INOGRADSQ#

!a columna de înogradsTy es un ecosistema en miniatura que permite hacer

obser'aciones relacionadas con los procesos de sucesin y la participacin de losmicroorganismos en la trans"ormacin de la materia en los ciclos biogeoqumicos. !acolumna, que consiste bsicamente de lodo enriquecido y una capa de agua, su"re unconjunto de cambios "sicos y qumicos en el tiempo, que "a'orecen el desarrollo dedi"erentes comunidades que dependen totalmente de otras porque generan lascondiciones necesarias para su crecimiento. - di"erencia de los mtodos clsicos deculti'o de microorganismos, la columna de înogradsTy es un culti'o mito BnoanicoC que permite mirar relaciones complejas entre las di"erentes poblaciones queinteractJan entre s y con los nutrientes del medio.

!a "igura 1, muestra uno de los gradientes que se dan como resultado de los procesosbiolgicos que se lle'an a cabo dentro de la columna. !a consecuencia del gradientede ogeno es que hay una distribucin 'ertical de las di"erentes comunidadesmicrobianas. Estas comunidades se establecen en la columna en di"erentes momentosa causa de las trans"ormaciones bioqumicas que su"ren los nutrientes dentro del micro5ecosistema y pueden ser "cilmente identi"icadas por la presencia de zonas condi"erente pigmentacin en la columna.

:igura1. 9radientes de 3geno en la columna de înogradsTy. omado de -tls y8arta, 2GG2.

El objeti'o de ste ejercicio, es lograr que los estudiantes identi"iquen los cambios"sicos que su"re la columna en el tiempo y los relacionen con la aparicin de losdi"erentes grupos mor"olgicos microbianos, las condiciones que "a'orecen su


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desarrollo y los cambios qumicos que se producen como consecuencia de lastrans"ormaciones bioqumicas del metabolismo, particularmente en lo relacionado alciclo del azu"re y del carbono.

PROCEDIMIENTO1. P()*+(+,i-:

- !as lecturas de esta prctica se realizar durante gran parte del semestre,aproimadamente en prcticas. Es necesario estar muy atento a la distribucinque aparece en el cronograma de acti'idades.

- raer a la clase una bolsa con una "uente de carbono que se utilizar en laelaboracin de la columna Bpasto, hojas, papel, etcC

PREPARACI$N DE LA COLUMNA DE INOGRADSQ#1. 3btenga su"iciente cantidad de lodo o "ango para llenar 7# partes del recipiente.

=uite las rocas u otros objetos que puedan "a'orecer la "ormacin de burbujas deaire.

2. -gregue los & g de /a/3y & g de /a%3#y 1G g de "uente de carbono y mezclebien con el lodo.

. /oloque la mezcla preparada en la columna procurando no dejar burbujas deaire.

#. -dicione sobre el lodo agua de lago su"iciente para cubrirlo al menos con unacapa de & cm. $ezcle sua'emente para eliminar burbujas.

&. /oloque de +51G lminas de 'idrio en posicin 'ertical sobre la super"icie dellodo.(. apar con una hoja de papel aluminio para reducir la e'aporacin. Es posible

que necesite reeemplazar el agua e'aporada*. 0ncube la columna a temperatura ambiente a la luz del sol entre # y + semanas.

OBSERVACIONES DE LA COLUMNA

1. En la primera semana, se deben hacer obser'aciones diarias en lo posibledespus del segundo da. Despus de la segunda semana es su"icientehacerlas semanalmente. ener en cuenta los siguientes parmetros u otros que

se consideren pertinentes.

-note los cambios en los patrones de color y crecimiento que hay tanto enel lodo como en la columna de agua.

egistre los cambios de olor que puede tener la columna. ome una de las lminas, realice una preparacin en "resco y haga las

obser'aciones pertinentes. 4na 'ez hechas las obser'aciones las lminas


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sern marcadas y puestas de 'uelta en la columna. Debe preocuparse porreabastecer las lminas durante el tiempo del estudio.

Despus del da y semanalmente realizar una coloracin de 9ram a unade las lminas y obser'ar los cambios en la mor"ologa y abundancia decada uno de los grupos mor"olgicos.

En las obser'aciones debe anotar los cambios en la abundancia y el tipo demicroorganismos presentes B8acterias, protozoos y algas principalmenteC

2. /ada grupo de laboratorio debe tomar nota de manera clara y ordenada de lasobser'aciones realizadas durante las semanas de trabajo. Es deseablepresentar datos comparati'os entre las di"erentes columnas preparadas en elgrupo, ya que cada columna es Jnica y puede presentar di"erentes cambios.

-lgunos de los "actores que inter'ienen en el desarrollo de di"erentescaractersticas son la "uente de carbono, la posicin de la columna con respectoal sol, el grado de anaerobiosis, entre otros.

SEGUIMIENTO

-l "inal, los estudiantes entregarn un in"orme en el cual describirn susobser'aciones y eplicarn las posibles causas de los cambios "sicos yqumicos que se registraron en la columna y sus consecuencias sobre eldesarrollo de las poblaciones microbianas.


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A-)=o

M+0)(i+3). 4 R)+,0io.:

ecipiente transparente Bprobeta de 1GGG mlC con super"icie lisa, con boca ancha

y aproimadamente 1 litro de capacidad. Debe tener un dimetro mnimo de &cm. y una altura de al menos 11 cm. %u"iciente lodo o suelo inundado, pro'eniente de un lago, ro o corriente, para

llenar 7# partes del recipiente elegido.


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PRACTICA No' 11

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE LA COLUMNA DEINOGRADSQ#

El aislamiento y culti'o de microorganismos es un requerimiento esencial en el estudio"isiolgico de los microorganismos de hecho, el gran a'ance en el estudiomicrobiolgico en los siglos H0H y HH se debi, entre otras cosas, a las metodologasque Soch propuso como parte del proceso de identi"icacin de agentes patgenos. %inembargo, los medios de culti'o enriquecidos y la tcnica del culti'o anico, que tienetanto ito en el mantenimiento de bacterias patgenas, no es muy Jtil para lamanipulacin de la mayora de microorganismos ambientales.

!as ideas de înogradsTy y 8eijerinT que dieron origen a los primeros trabajos en

microbiologa ambiental se basaron en el uso de nue'as tcnicas de culti'o quepermitieron aislar microorganismos en culti'os mitos y entender de una manera msclara las interacciones y el e"ecto que estos tienen sobre los ecosistemas el ejemploms claro de este tipo de sistemas de culti'o es la columna de înogradsTy.

!a columna de înogradsTy, no solamente es un ensayo que permite e'idenciar"cilmente interacciones entre las poblaciones microbianas y el e"ecto del metabolismomicrobiano sino que es una ecelente tcnica de culti'o mito. - partir de esta columnaes posible aislar di"erentes microorganismos utilizando las tcnicas tradicionales deagotamiento y mtodos de enriquecimiento selecti'o.

Este laboratorio tiene como objeti'os 1C aislar un microorganismo "otoauttro"o poragotamiento 2C -islar una bacteria "otohetertro"a por enriquecimiento selecti'o y"iltracin por membrana y C comprobar la capacidad de una cepa para crecer"acultati'amente mientras utiliza succinato de sodio como "uente de carbono.

PROCEDIMIENTO

Ai.3+i)-0o d) i,(oo(g+-i.o. /o0o+700(o/o.'

- partir de las paredes de la columna o directamente del agua, tome una muestracon un escobilln estril y realice una siembra por agotamiento en los medios de

culti'o enunciados a continuacin.o -gar 8ristolo -gar etracto de sueloo -gar :2 9uillard


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utilizando un rastrillo. -segJrese de distribuir bien la muestra para obtenercolonias aisladas.

0ncube hasta que obser'e crecimiento Busualmente el desarrollo de estosmicroorganismos puede tomar alrededor de dos semanasC a 2G U/. 4se la

incubadora con lmparas de tungsteno.

/uando obser'e colonias de color 'erde o pardas, realice una siembra poragotamiento en el mismo agar en el que detect el crecimiento.


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- partir de uno de los tubos que muestre crecimiento tome una alcuota de G,& ml ytrans"iralo nue'amente a un medio basal con succinato, pre'iamente reducido.ecuerde que pocos microorganismos pueden crecer bajo estas condicionesutilizando el succinato como "uente de carbono y por lo tanto se usa como el agentede enriquecimiento selecti'o.


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A-)=o

M+0)(i+3). 4 R)+,0io.

- cajas de agar 8ristol-

/ajas de agar etracto de suelo- cajas de agar :2 9uillard- + 'iales con medio mineral basal con succinato- & tubos con ml de solucin salina estril- %olucin de !5cisteina al I- $ezcla de )2>/32P +G>2G- & cajas de agar con medio mineral basal con succinato- 2 escobillones estriles- 2 pipetas 1 ml- 1 rastrillo estril- 1 esptula-

1G jeringas de tuberculina con puntas azules- papel aluminio

E@UIPOS

- 0ncubadora iluminada- ampa para intercambio de gases- 6orte

BIBLIOGRAFA

A03+. R'K B+(0


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PRACTICA No' 1"

INTERACCIONES MICROBIANAS II: Ai.3+i)-0o d) Mi,(oo(g+-i.o. ,o-A,0iid+d A-0ii,(o;i+-+'

!a acti'idad que tienen los microorganismos en su medio natural genera una gran'ariedad de interacciones que trae consecuencias a ni'el del desarrollo de laspoblaciones, de la estructura de las comunidades y por lo tanto sobre la di'ersidadmicrobiana y los "lujos de materia y energa dentro de los ecosistemas.

4no de los "actores que genera interacciones entre los microorganismos es lacompetencia por los sustratos disponibles. Esta competencia puede tomar dos

"ormas> 1C pasi'a, cuando los microorganismos in'olucrados luchan entre s demanera indirecta, compitiendo con sus tasas de crecimiento e incorporacin de lossustratos y 2C acti'a, cuando se producen sustancias que inhiben o retardan elcrecimiento de las poblaciones competidoras. En cualquier caso, de acuerdo con elprincipio de eclusin competiti'a, alguna de las poblaciones tiende a serdesplazada, ecepto cuando sus nichos ecolgicos no se traslapan totalmente.

!a produccin de sustancias antimicrobianas implica la sntesis de metabolitos quereducen las tasas de crecimiento de las poblaciones competidoras. Estos procesosparecen tener ms importancia en ambientes terrestres donde las sustancias no sediluyen con "acilidad y donde suele haber una intensa competencia por los recursoslimitantes para el crecimiento sin embargo, la intensa relacin eistente entre losmicroorganismos acuticos asociados a las partculas de materia orgnica ensuspensin ha generado una mayor adaptacin haca el amensalismo de lo que seesperaba.

!os microorganismos pueden desplazar a sus competidores a tra's de laproduccin de gran cantidad de compuestos qumicos como alcoholes, cidoscetonas, etc, sin embargo, estas sustancias pueden reducir el crecimiento de otraspoblaciones porque modi"ican las condiciones del medio o porque atacandirectamente la estructura y "uncin de las clulas. -lgunos microorganismos han

desarrollado sustancias microbianas conocidas como antibiticos y bacteriocinas,que son altamente espec"icas en su "uncin y que inhiben de manera directa eldesarrollo de los microorganismos competidores.

En esta prctica se busca aislar cepas de microorganismos productores desustancias antimicrobianas a partir de muestras de suelo, con el "in de comprobar suacti'idad y e"ecto "rente a di"erentes cepas de microorganismos patrn. De estamanera se espera que el estudiante compruebe que bacterias y hongos soncapaces de establecer relaciones amensales con otras poblaciones.


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PROCEDIMIENTO

Ai.3+i)-0o

ome G,& gramos de suelo y agrguelos a un erlenmeyer con 2&G ml de solucin

salina estril B%%EC. -gite durante 1G minutos con 'orte para liberar losmicroorganismos que se encuentran adheridos a las partculas de suelo.

1.


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:igura 1. $todo de siembra para identi"icar acti'idad antimicrobiana.%iembra de microorganismo problema

Despus del periodo de incubacin, trace con ayuda del asa de micologa, #lneas perpendiculares a la lnea de crecimiento bacteriano B"igura 2C. %obre

cada una de esas lneas siembre uno de los siguientes microorganismos>

Bacillus cereus Escericia coli

!tap"lococcus aureus

!treptom"ces sp.

-segJrese de acercarse lo ms posible pero sin tocar la lnea de crecimientode la bacteria a ensayar B"igura 2C.

0ncube durante # das a 2& U/

3bser'e presencia de halo de inhibicin. -note sus resultados.

:igura 2. $todo de siembra para identi"icar acti'idad antimicrobiana.%iembra de microorganismo de prueba.

2.


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/on un tubo de ensayo estril retire cuidadosamente un crculo de la zonacentral de cada una de las cajas pre'iamente sembradas. )o ol'ide utilizar untubo di"erente para cada culti'o bacteriano.

/on otro tubo de ensayo estril y tcnicas aspticas, saque # "ragmentos

circulares de cada uno de los culti'os con # das de incubacinBmicroorganismos con acti'idad antimicrobiana potencialC.

0ntroduzca los "ragmento que sac de los culti'os de # das en cada una de lascajas de agar %- inoculadas con Bacillus cereus, Escericia coli,!tap"lococcus aureusy !treptom"ces sp.

0ncube 2# horas a &U/.

3bser'e la "ormacin de un halo de inhibicin para aquellas bacterias que

produzcan sustancias anti5microbianas "rente a los microorganismos yamencionados. % es posible mida el dimetro de los halos de inhibicin.

CUESTIONARIO

1. =u di"erencia eiste entre los antibiticos y las bacteriocinas con respecto aotras sustancias antimicrobianasO

2. Eplique si la teora de la relacin de recursos de ilman eplica la competenciagenerada por la produccin de sustancias anti5microbianas.

. =u tan importantes puede ser la produccin de antibiticos en los mediosnaturales, desde el punto de 'ista de la competenciaO %on realmente e"ecti'osO

#. =u 'entaja tiene un microorganismo competidor que produce sustancias queinhiben el desarrollo de otras poblacionesO En qu casos sera positi'oproducirlasO

A-)=o

M+0)(i+3). 4 R)+,0io.

- 2&G ml de solucin salina estril- 1G tubos con & ml de solucin salina estril- G cajas con %- B1&52G ml de agarC- & tubos con * ml %8

E67i*o.

- 0ncubadora 2& U/- 8aKo $ara (G U/


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BIBLIOGRAFA

A03+. R'K B+(0


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PRACTICA No' 1!

ACTIVIDAD MICROBIANA II

A,0iid+d M)0+-og-i,+'

-unque la D83 es un parmetro de gran utilidad cuando se pretende e'aluar lacantidad de materia orgnica biodegradable de un sistema o la acti'idad microbianamediante la cual este material es oidado con ogeno como aceptor "inal deelectrones, hay situaciones en las cuales este elemento no se encuentra enconcentraciones su"icientes para ser utilizado en estos procesos. Estas condiciones,generadas por caractersticas "sicas y ambientales de los ecosistemas, como en elcaso de la estrati"icacin de lagos y ocanos, o por la misma acti'idad biolgica delos organismos aerobios que agotan el ogeno, estn relacionadas con bajos

potenciales de reduccin y con una estructura y procesos microbianos di"erentes.

4na de las caractersticas ms rele'antes de los sistemas anaerobios con respectoa los aerobios, es la baja e"iciencia energtica de los microorganismos que lle'an acabo el proceso anaerobio de oidacin. Esta di"erencia se debe a que losprocesos de oidacin anaerobia en general producen menor cantidad de energalibre B9UC debido a menores di"erencias entre los donadores y aceptores deelectrones, o a que el proceso de oidacin es lle'ado a cabo por di"erentescomunidades que realizan oidaciones parciales sucesi'as, lo que implica unamayor cantidad de eslabones en los cules hay disipacin de energa comoconsecuencia del metabolismo. Estas caractersticas son de gran utilidad en eltratamiento anaerobio de residuos solubles porque la cantidad de biomasamicrobiana producida es pequeKa reduciendo la cantidad de lodo que se produce.

El proceso de descomposicin anaerobia de la materia orgnica, puede di'idirse encuatro "ases interdependientes, lle'adas a cabo por di"erentes poblaciones demicroorganismos especializadas>

&id(3i.i.: produccin de eoenzimas, que hidrolizan los polmetros dedi"erentes orgenes para producir sustancias monomricas susceptibles a laoidacin.

F)()-0+,i-: oidacin parcial de los monmeros carbonados. !le'ado acabo por mJltiples poblaciones que median di"erentes tipos de "ermentacin.En estos procesos generalmente se producen molculas carbonadas de y #carbonos.

A,)0og-).i.:con'ersin de los cidos grasos de y # carbonos Bbutirato ypropionatoC en acetato por medio de una poblacin especializada debacterias se 'en limitadas por la produccin de los metabolitos que producen.

M)0+-og-).i.: con'ersin del acetato B /32C en metano, utilizando loselectrones del hidrgeno, producido por las bacterias acetognicas, parareducir los compuestos carbonados

!as poblaciones que inter'ienen en este proceso estn acopladas en espacio ytiempo y se relacionan a tra's de los sustratos que utilizan o de los productos del


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metabolismo. En algunos casos, como el de las bacterias sintr"icas del propionatoy butirato BacetognicasC, la relacin es tan estrecha que un desbalance en una delas poblaciones conlle'a a la inestabilidad de todo el proceso de descomposicin.

4na de las "ormas de aproimarse a la acti'idad microbiana anaerbica es medir la

acti'idad metanognica espec"ica. Esta metodologa permite estimar la cantidad demetano que se produce por la descomposicin de una cantidad conocida de cidosgrasos o de un e"luente complejo. eniendo en cuenta la estrecha relacin queeiste entre las poblaciones degradadoras, la acti'idad metanognica no es unamedida de acti'idad de las bacterias metanognicas Jnicamente, de hecho es unaestimacin de la capacidad degradadora del consorcio anaerobio, que generalmentese encuentra en un lodo. %i se quiere medir directamente la acti'idad de lasbacterias metanognicas, es necesario agregar al ensayo el acetato que necesitan yque de otra manera debera ser producido por la acti'idad de bacterias acetognicasa partir de cidos grasos como el butirato y propionato.

4n ensayo para medir esta 'ariable, permite estimar la acti'idad metanognicaespec"ica de los slidos suspendidos 'oltiles B%%6C de un lodo anaerbico. !asunidades de la acti'idad metanognica espec"ica B-$EC son g D=3/@#7g %%6. Eneste caso, los %%6 corresponden a la biomasa microbiana que est lle'ando a caboel proceso de degradacin. Es importante tener en cuenta que para el ensayo elsupuesto es 'lido porque en un lodo anaerobio casi toda la biomasa producida esde carcter microbiano y que esta biomasa se pierde cuando los slidos sonsometidos a calcinacin.

En los ensayos de acti'idad metanognica inter"ieren di"erentes "actores dentro delos cuales deben controlarse de manera importante los siguientes>

T)*)(+07(+:debe utilizarse la temperatura a la cual trabaja normalmente unlodo Bgeneralmente alrededor de GU/C.

Co-,)-0(+,i- d)3 .7.0(+0o 4 d)3 3odo: debe procurarse obtener unarelacin entre sustrato y lodo adecuadas, para "a'orecer la di"usin delsustrato a las clulas sin que las concentraciones de cidos grasos se'uel'an inhibitorias para el consorcio. En general, para un sistema agitado,se recomiendan de 2 a & g %%67! para el lodo y de 2 a # g D=37! de sustrato.Estas concentraciones garantizan el buen desarrollo del ensayo.

,ido. g(+.o. o30i3). d)3 .7.0(+0o:la mezcla del butirato y acetato tiene

incidencias importantes sobre la acti'idad del lodo medida. En la prctica,sera deseable utilizar una proporcin de cidos grasos similar a la dele"luente que se espera tratar. En este laboratorio se utilizar por "acilidadacetato como "uente de carbono.

*& d)3 )dio:todas las soluciones que se agregan al ensayo, inclusi'e lasde cidos grasos, deben estar neutralizadas a un p@ de *.G. !a acidi"icacina"ecta dramticamente la acti'idad de las bacterias metanognicas y por lotanto el resultado del ensayo.

P)(iodo d) +,0iid+d: el tiempo de ensayo puede in"luir dramticamentesobre la estimacin de la pendiente de cantidad de metano producida en eltiempo. En lo posible, el periodo deber cubrir, al menos, hasta que el &GIde los cidos grasos se hayan utilizado.


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En este laboratorio se espera que los estudiantes realicen el montaje de unrespirmetro para medir la acti'idad metanognica espec"ica de un lodo anaerobioalimentado con acetato, a partir de la produccin de metano.

PROCEDIMIENTO

P()*+(+,i-

/ada estudiante debe traer debidamente leido y preparado el procedimiento.

Estar atento a los datos del monitor que debe haber medido los slidos'oltiles de los lodos trados.

1' E),7,i-

E.0i+,i- d) 3o. SSV d)3 3odo:

:iltrar 2 ml de lodo en un "iltro de "ibra de 'idrio B^hatman 9:7:C de #* mmde dimetro, pre'iamente secado y pesado.

Dejar secar hasta peso constante Baproimadamente 2# horasC en un horno aG U/.

Estime los slidos suspendidos totales B%%C>

SST=Pf Pi

Donde>


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o " Bo0)33+. d) 7).0(+:tenga en cuenta que el 'olumen total de cadareactor debe ser de #&G ml, incluyendo las soluciones de 'itaminas,acetato, solucin reductora, el medio y el lodo. !as soluciones seagregan en las siguientes cantidades> 1G ml de solucin de acetato, #,&ml de solucin de 'itaminas, 22,& ml de solucin reductora, un 'olumen

de lodo que contenga 2 a & g %%67! de la solucin y su"iciente cantidadde medio estril para completar #&G ml.o Co-0(o3 d) +,0iid+d )-dg)-+:%e prepara igual que las botellas de

la muestra sin incluir la solucin de acetato, por lo tanto el 'olumen demedio estril es ligeramente mayor. Este control tiene el objeti'o deestimar la acti'idad endgena del lodo causada por la degradacin delos cidos grasos que 'engan en l.

OJO: -gregue todos los componentes en los reactores ecepto el lodo.pelas y permita que el agente reductor consuma el ogeno que haydisuelto en el los reactores.

%olamente cuando la rezasurina Bque es el indicador de anoiaC se pongatranslucida, adicione el lodo. Este proceso puede tardar alrededor de unahora

9asee gentilmente con una corriente de nitrgeno puro. %elle los "rascos.

Mo-0+) d)3 .i.0)+

%iga el siguiente procedimiento para la preparacin del sistema, sobser'e la "igura*.1 y est atento a las recomendaciones del pro"esor.


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:igura *.1. DiseKo esquemtico de un biorreactor metanognicoL),07(+ d) d+0o. 4 C3,73o.

-l menos cada 2# horas, registrar el aumento en el peso del sistema derecepcin, causado por el 'olumen de metano que desplaza la soda de latrampa de /32.

Estimar la densidad de la soda utilizada en el ensayo con ayuda de unpicnmetro.

/alcular el 'olumen de soda desplazado en cada una de las botellas de lamuestra y en el control de acti'idad endgena.

Estimar la cantidad de metano corregida a partir del 'olumen producido porunidad de tiempo en la muestra y en el control.

[CH4] =V

muestraV

control

9ra"icar en un eje coordenado la cantidad de metano acumulada en el

tiempo. - partir de un anlisis de regresin, calcular la pendiente de la gr"ica que

corresponde a la tasa de produccin de metano. /alcular la acti'idad metanognica espec"ica del lodo como sigue>

AME= R 24

FCV SSV

Donde>-$E W acti'idad metanognica espec"ica Bg D=3/@#7g de %%6 dC

W tasa de produccin de metano en ml de /@#7hora2# WnJmero de horas en un da

REACTORES

FLUJO DEL

METANO

TRAMPA

DE CO2

FLUJO DE LA

SODARECEPT

CULOPARA LA SODA

DESPLAZADA


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6 W 6olumen e"ecti'o del reactor:/ W "actor de con'ersin en ml de /@#7 g D=3 B&2(,*C%%6 W concentracin de slidos suspendidos 'oltiles en g %%67!

CUESTIONARIO

1. Eplique por qu las Ybacterias sintr"icas del butirato y del propionatoZ estnasociadas simbiticamente con las bacterias metanognicas.

2. En la prctica, qu hara para di"erenciar la acti'idad metanognica acetoclsticaBacetato Q @2C de la metanognica hidrogeno"lica B@2Q /32CO.

. /mo a"ecta la metanognesis el ciclo del carbono a escala globalO /ul es suimportanciaO =u tiene que 'er con el e"ecto in'ernaderoO

#. %on las bacterias metanognicas quimoorganotro"asO %on auttro"asO Epliquesu respuesta.

A-)=o

M+0)(i+3). 4 R)+,0io.

%olucin de acetato> a #,22 g cido actico adicione unos 1G ml de aguadesionizada. )eutralice la solucin utilizando perlas de )a3@ hasta p@ *.-"ore con agua desionizada hasta 2& ml.

%olucin de 'itaminas> 2,& de solucin de 'itaminas B(C en 2& ml de solucinde cloruro de calcio B8C. %oluciones 8 y ( "iltradas por "iltro de G,22 m.

%olucin reductora> a 2& ml de solucin de )a@/3 B#C agregue G,& ml desolucin de )a2% B*C.

"rascos %chott con #&G ml de medio de sales mineral estril B#&G mlC

!odo B'olumen conocido para obtener 25& %%67!C # "rascos sellados, con #&G ml de solucin de soda comercial al &I con

"eno"taleina Bpara trampa de /32C 2 probetas estriles 1G jeringas de tuberculina estriles 1G agujas azules # Equipos de 'enoclisis peditrica # agujas 'erdes # "rascos de &GG ml de capacidad con corchos y agra"es


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Bo43) M' 1. $icrobial Ecology o" seàge treatment. En> -quaticmicrobiology> an ecological aproach. 8alcTèll %cienti"ic. 4%-.

)g)(. F'K Fi)3d J' 1+*. $anual para -rranque y operacin de sistemas de"lujo ascendente con manto de lodo 54-%85. 4ni'ersidad del 6alle y

4ni'ersidad -grcola de âgeningen.


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PRACTICA No' 1?

PRODUCCI$N DE MACROM#CETOS

!os hongos se clasi"ican, segJn su tamaKo, en micromycetos y macromycetos. !os

hongos macroscpicos o macromycetos se caracterizan por tener largas hi"asrami"icadas que se reJnen en cordones rizomor"os y cuerpos de reproduccinBascomas, basidiomasC. %on organismos saprobios que absorben la materiaorgnica muerta de los residuos donde crecen. %u ciclo de 'ida es complejo y 'arasegJn las clases de hongos. !os hay 'enenosos y comestibles. El per"il generalalimenticio de un cuerpo "ruct"ero comestible presenta todos los aminocidosesenciales el contenido proteico "luctJa de 1& a #GI se encuentran 'itaminashidrosolubles y todos los minerales. Estos atributos son apro'echados por el hombrepara producir este tipo de hongos a partir de desechos agrcolas o poblaciones'egetales.

En este laboratorio se pretende que los estudiantes puedan>


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0ntroduzca la mezcla en la bolsa de polipropileno de modo que no ocupe latotalidad sino las 2 terceras partes de la capacidad de la bolsa.

/ierre la bolsa y colquele la banda elstica, asegurase que esta quede bienajustada.

-utocla'e el material por 1 hora a 121F/ 1& psi.

Deje en"riar el material.

En condiciones de esterilidad suelte la banda elstica y con la cuchara metlicaestril siembre la semilla del hongo a una relacin de *I con respecto al peso delsustrato o mezcla utilizado. /oloque el tubo de


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PRACTICA No' 15

METODOS PARA EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS DEL AIRE

INTRODUCCI$N

!a microbiologa del aire o aeromicrobiologa se de"ine como el estudio de laaerolizacin, transmisin o transporte y deposicin de materiales biolgicos entre laatms"era y litos"era. 9eneralmente, los microorganismos del aire se encuentran ensuspensin junto con partculas ms grandes como pol'o, polen etc., "ormandoestructuras conocidas como bioaerosoles que pueden tener un tamaKo entre G,G2hasta 1GG m, sin embargo, muchos de ellos pueden permanecer libres ensuspensin durante periodos de tiempo cortos.

%on muchos los "actores que inter'ienen en el proceso de transporte y deposicin delos materiales biolgicos, entre otros, su super'i'encia, la 'elocidad del aire, la

turbulencia, la humedad relati'a, la temperatura y el tipo de "uente Bpuntuales,lineales y de reaC. De acuerdo con la interaccin de todos estos "actores, eltransporte de bioaerosoles puede cubrir di"erentes escalas desde submicroescalaBmenos de 1G min. y hasta 1GG metrosC hasta macroescala B'arios das y cientos deTilmetrosC. !a mayora de microorganismos estn limitados a la submicroescala ymicroescala aunque muchos de ellos, especialmente 'irus pueden ser trasportadosa grandes distancias como sucede por ejemplo en algunas pandemias de in"luenza.

El estudio de los microorganismos de los bioaerosoles se justi"ica porque muchos deellos estn in'olucrados en procesos in"ecciosos en animales, plantas y el hombre.-dicionalmente, el uso de la bioaspersin como una herramienta para el controlbiolgico de plagas y la eistencia de zonas de manejo de microorganismosin"ecciosos, en los cuales el aire puede llegar a contener altas cantidades de clulasen suspensin genera la necesidad de introducir metodologas que permitan haceruna aproimacin hacia la modelacin de la aerolizacin, transporte y deposicin debioaerosoles con el "in de pre'enir, contener o "a'orecer la dispersin de losmicroorganismos del aire.

%e utilizan di'ersas metodologas que pueden di'idirse en pasi'as o acti'as deacuerdo con el tipo de dispositi'o usado para el muestreo. En las *+.i+., losdispositi'os ms empleados son cajas con medio de culti'o que se eponen durante

un periodo de tiempo de"inido y permiten hacer una aproimacin a la cantidad y tipode microorganismos suspendidos en el aire esta metodologa, que ser aplicada enel laboratorio, asume que todos los microorganismos sedimentan sobre las cajasepuestas, sin embargo, es posible que haya subestimacin de los recuentos,especialmente cuando se hacen estudios etramurales en los cuales la turbulenciapuede a"ectar de manera importante los resultados. En las )0odo3og9+. +,0i+., elaire es bombeado hacia algJn dispositi'o de "iltracin por lo que no depende de losprocesos de deposicin de partculas. Estos mtodos, que permiten la estimacin dela abundancia de bacterias en un 'olumen de aire espec"ico, dependen del uso dedispositi'os especializados para la recoleccin de bioaerosoles que 'aran deacuerdo con las necesidades particulares y las preguntas que se quieran resol'er.

-dems, en su diseKo y aplicacin deben tenerse en cuenta el tipo de aire a


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muestrear, la mo'ilidad y turbulencia, el 'olumen de la muestra a "iltrar y la relacinentre costo y bene"icio.

eniendo en cuenta que las condiciones di"ciles del medio areo pueden generar lainjuria de microorganismos y la induccin de clulas 'iables pero no culti'ables, en

la actualidad se han implementado tcnicas de recuento directo que en conjuntocon tcnicas moleculares "a'orecen una caracterizacin ms precisa de lascomunidades microbianas del aire. )o obstante, la implementacin de estasmetodologas es costosa y requiere un amplio entrenamiento de las personasin'olucradas en su 'alidacin y aplicacin.

PROCEDIMIENTO

Este ejercicio prctico tiene dos objeti'os> 1C /aracterizar la in"luencia espacial deuna "uente de microorganismos sobre la calidad del aire. 2C /omparar tres sitios conuna in"luencia di"erente en cuanto al tipo de "uente o el aporte la cantidad o

"recuencia del proceso de aerolizacin.

1' P()*+(+,i-:

!eer adecuadamente la gua y traer un plan de trabajo en "orma de diagramade "lujo del procedimiento a realizar.

/on anterioridad seleccione una "uente de produccin de bioaerosoles, o tressitios con una in"luencia contrastante en las "uentes de microorganismoshacia aire y que tengan "cil acceso desde la 4ni'ersidad.

/aracterizar los tipos de "uente y de"inir el objeti'o de su prctica.

9enerar un diseKo eperimental y seleccionar el mtodo estadstico medianteel cual 'a a comparar los resultados encontrados.


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&. @aga una caracterizacin preliminar de los tipos mor"olgicos Bmor"ologa decolonia y microscpicaC predominantes en cada uno de los tratamientos.

(. @aga un anlisis de los resultados obtenidos con la prueba estadstica

SEGUIMIENTO

0n"orme escrito de los resultados y obser'aciones obtenidas durante la prctica. R/ules son las di"erencias entre una "uente puntual instantnea, puntual

continua, lineal y de reaO R


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PRACTICA No' 1

METODOS PARA EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO

INTRODUCCI$N

!os ambientes terrestres son tal 'ez los medios ms complejos y con mayor'ariedad de "uentes nutriti'as para el crecimiento microbiano. Debido a lo anteriorlos suelos contienen mayor abundancia y biomasa de microorganismos cuando secomparan con los medios acuticos o areos.

En general cualquier cuerpo poroso, como el suelo, est compuesto por tres "ases>1C una "ase slida que comprende minerales asociados con materia orgnica. 2C 4na"ase lquida que permite la solubilizacin de compuestos ionizables. C una "asegaseosa. Estas "ases interactJan entre s cuando el suelo es disturbado hastalograr un equilibrio, por lo cual cada suelo tiene una composicin espec"ica y a

menos que su"ra un nue'o "enmeno de disturbio, las condiciones tienden apermanecer en equilibrio, "a'oreciendo el desarrollo de una comunidad demicroorganismos bien establecida.

eniendo en cuenta que tpicamente el &GI del suelo esta compuesto por una "aseslida, y que de esta el &5I corresponde a compuestos inorgnicos, uno de los"actores que regula el crecimiento microbiano en el suelo es el contenido de materiaorgnica. !os 'alores de composicin pueden 'ariar por supuesto, de acuerdo conel clima, la geologa y el origen de los materiales que con"orman un suelo enparticular.

En general, los suelos pueden "ormarse a partir de rocas sedimentarias B"ormadaspor procesos de deposicinC rocas gneas Bgeneradas por el en"riamiento delmagmaC y rocas metamr"icas Bproducidas por presiones y temperaturas etremas yla accin de materiales gneos y sedimentariosC. /on el tiempo las rocas sonsometidas a "actores ambientales como la llu'ia y los 'ientos, y a la accin de losmicroorganismos que liberan los minerales que las componen. Estos mineralessir'en como "uente de nutrientes a los microorganismos auttro"os que generanbiomasa cuando esta se descompone da origen a la materia orgnica BdetritoorgnicoC que pueden utilizar los microorganismos hetertro"os.

/omo consecuencia de los procesos mecnicos, ambientales y biolgicos de"ormacin del suelo, la composicin porcentual de iones, materia orgnica, agua yaire 'ara 'erticalmente, "ormando di"erentes estratos con caractersticas propiasque dan cabida al desarrollo de una microbiota asociada, muy 'ariada.

-dems los microorganismos en el suelo se encuentran generalmente "ormandomicrocolonias, puesto que los procesos microbianos generan la "ormacin deagregados "a'orecidos por la produccin de polisacridos mucilaginosos resultantesdel metabolismo de muchos de ellos. En las capas super"iciales, la distribucin delos microorganismos tiende a ser ms homognea pues hay mayor disponibilidad demateria orgnica, adems la porosidad del medio "a'orece la absorcin de agua y el

transporte de iones, y el mayor tamaKo de las partculas potencia la adhesin de losmicroorganismos.


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PROCEDIMIENTO

En esta prctica de laboratorio se espera que los estudiantes hagan unacaracterizacin preliminar de la 'ariacin espacial de las comunidades bacterianas

del suelo.

!' P()*+(+,i-:

!eer adecuadamente la gua y traer un plan de trabajo en "orma de diagramade "lujo del procedimiento a realizar.

0n'estigar sobre el tema los horizontes del suelo.


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ealice una coloracin de 9ram y compare sus obser'aciones con las de losotros grupos.


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+ tubos con ml de agua peptonada o solucin salina2 asas de DrigalsTy1 pipeta de 2& ml1G pipetas de 1 G 2 mleacti'os coloracin de 9ram

E67i*o.:

$icroscopio /mara cuentacolonias@orno -utocla'e0ncubadora 8alanza


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BIBLIOGRAFIA

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Documents

Copia de Manual de Procesos-monitor