Copia de Tesis completa 8-06

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS

Tesis presentada para optar por el grado académico de Master en Biotecnología Vegetal

EEmmpplleeoo ddee llaa mmuuttaaggéénneessiiss iinn vviittrroo ppaarraa llaa oobbtteenncciióónn ddee mmuuttaanntteess ddee ppoorrttee bbaajjoo eenn

MMuussaa sspppp.. ccuullttiivvaarr ‘‘ZZaannzzííbbaarr’’ ((AAAABB))

Autor: Ing. José de la Concepción Ventura Martín

Tutores: Dr.C. Rafael Gómez Kosky Dr.C. Jorge López Torres

Santa Clara, CUBA 2010

Resumen

Tesis de Maestría

RESUMEN

Los esfuerzos en el mejoramiento de Musa por métodos tradicionales, presentan

numerosos obstáculos. Existen pocos resultados prácticos en la aplicación de la

mutagénesis in vitro combinado con el cultivo de tejidos, en la obtención de mutantes de

porte bajo en plátanos, para evitar los daños ocasionados (30%) por las tormentas

tropicales. Es por esto que el objetivo de este trabajo fue obtener mutantes de porte bajo

en Musa spp. cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) mediante el empleo de la mutagénesis in vitro. La

investigación se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y áreas de campo del

INIVIT a partir del año 1996 hasta el 2009. Se tomaron ápices meristemáticos (2,0–3,0

mm) de las yemas múltiples formadas in vitro del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) y se utilizaron

diferentes dosis de radiaciones (0-60 Gy) para determinar la DL50 y GR50. Se seleccionó

la dosis de 45 Gy por ser la que permitió una disminución del porcentaje de supervivencia

de 52,0% y el coeficiente de multiplicación de 1,41. Se realizó una evaluación de las

plantas en condiciones de campo, durante tres ciclos vegetativos y como resultado se

seleccionaron tres posibles mutantes, los cuales presentaron porte bajo con una altura

entre 2,0 y 2,65 m, racimo en forma de cono truncado con 12-16 dedos por mano y 30–32

dedos por racimo, con un peso del racimo entre 20,10 y 26,60 kg por racimo en

dependencia de la densidad de plantación. Se generalizó un mutante, el ‘INIVIT PV 06 30’

(AAB), de una altura promedio de 2,65 m, con sabor astringente, el cual fue aprobado en

el Registro Nacional de Variedades de Cuba, como un nuevo cultivar comercial.

Introducción

Tesis de Maestría 1

1. INTRODUCCIÓN

Los plátanos y bananos (Musa spp.) son cultivos perennes, pueden cosecharse durante

todo el año y se encuentran entre los principales cultivos en los países tropicales y

subtropicales de alta presión demográfica (Valmayor, 2008). Constituyen el alimento

básico de cerca de 500 millones de personas de todo el mundo (Zambrano et al., 2007).

La producción mundial en el 2008 fue de 125 049 265 toneladas métricas, de las cuales el

27,46% fue de plátano vianda (FAOSTAT, 2010). Se cultivan alrededor de 10 millones de

hectáreas, de ellas el 21% corresponde a los plátanos vianda (AAB) (Rodríguez, 2003).

Lograr una base clonal relativamente amplia resulta sumamente importante (Ventura,

1993). En Cuba, el plátano vianda (AAB) constituye un cultivo de elevada prioridad dentro

del programa alimentario nacional, debido a su capacidad de producir todos los meses del

año, para lograr la estabilidad en el mercado, por los arraigados hábitos de consumo y por

su diversidad de usos (Rodríguez, 2000).

Las enfermedades Sigatoka negra y Mal de Panamá, así como, problemas virales,

nemátodos y otros factores adversos, limitan la obtención de altos rendimientos de este

cultivo (Sandoval et al., 1999).

Los esfuerzos en el mejoramiento de Musa sp. para la resistencia a enfermedades con el

empleo de métodos convencionales, presentan numerosos obstáculos tales como:

partenocarpia, esterilidad, poliploidía y propagación vegetativa (Persley et al., 1987;

Dheda, 1991; Vuylsteke y Swennen, 1991; May et al., 1995), por lo que la utilización del

mejoramiento por mutaciones desempeña un rol importante en este cultivo (Donini y

Sonnino, 1998; Nichterlein, 2000; García, 2000; Roux, 2004). Novak et al. (1990),

encontraron una considerable variación fenotípica en plantas de plátanos y bananos

regeneradas de brotes cultivados in vitro después del tratamiento mutagénico con 60Co.

Roux (2004) informó el registro de variedades obtenidas por el programa FAO/IAEA, como

Introducción


‘Novaria’ y ‘Klue Hom Thong KU1’, pero no son cultivares con impacto productivo y

económico.

En el Banco de Germoplasma del INIVIT se encuentra el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB),

introducido de Tanzania, de porte alto (3,68 metros), con el mayor rendimiento dentro de

los plátanos vianda (26,6 t.ha-1). Es del tipo Horn y tiene ahijamiento desordenado. Su

elevada altura lo hace vulnerable a la acción de los vientos. En Cuba, por ser una isla

larga y estrecha, la acción de los vientos tiene un efecto negativo en la producción

platanera. Vientos con una velocidad superior a los 50 kilómetros por hora pueden producir

volcamiento y doblamiento de la planta, causando pérdidas desde el 60 al 100% de la

plantación. A nivel mundial se estiman pérdidas en cosecha del 20 al 30% por efecto de

vientos (Álvarez, 2005).

Los sistemas de mejoramiento que han sido desarrollados hasta la fecha se han basado

en las técnicas in vitro para inducir mutaciones (Novak, 1987; Novak et al., 1990; Ventura,

1993 y 1996, García et al., 2000 y Roux, 2004), pero en el cultivar ‘Zanzíbar’ no se han

obtenido mutantes de porte bajo mediante está técnica.

Tomando en consideración los antecedentes descritos anteriormente, se planteó la

siguiente hipótesis de trabajo: “El uso combinado del cultivo de tejidos y la mutagénesis in

vitro en ápices meristemáticos del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) permitirá obtener mutantes de

plátano vianda de porte bajo con valor comercial”.

Para validar esta hipótesis de trabajo, se propusieron los objetivos siguientes:

1. Determinar la radiosensibilidad en ápices meristemáticos del cultivar de plátano vianda

‘Zanzíbar’ (AAB) para determinar la dosis letal media, inducir variabilidad genética y

seleccionar posibles mutantes.

2. Obtener mutantes de porte bajo y con valor comercial con el empleo de radiaciones

ionizantes (60Co) en Musa spp., cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB).

Introducción


3. Evaluar morfológica y agronómicamente en condiciones de campo, los mutantes

obtenidos durante tres ciclos de cultivo.

Revisión Bibliográfica


2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Generalidades del cultivo

2.1.1. Origen del género Musa

El plátano, banana, banano, cambur, topocho o guineo (Valmayor, 2008) es un cultivo

probablemente originario de la región indomalaya. Desde Indonesia se propagaron hacia

el sur y el oeste, Hawaii y la Polinesia. Los comerciantes europeos llevaron noticias del

árbol a Europa alrededor del siglo III antes de Cristo, pero no lo introdujeron hasta el siglo

X (Cheesman, 1948; Morton, 1987; Stover y Simmonds, 1987; Valmayor et al., 2008). A

partir de las plantaciones de África Occidental donde posiblemente ocurrieron mutaciones

que propiciaron un gran número de cultivares, los portugueses lo llevaron hasta las Islas

Canarias (Robinson, 1996). En cuanto a su introducción en América, el cronista Oviedo

sostiene que el plátano fue llevado desde la Gran Canaria a Santo Domingo por Fray de

Berlanga en 1516 y de ahí a Cuba (López, 1989).

2.1.2. Sistemática y botánica del género Musa

La primera clasificación de los bananos fue realizada por Carlos Linneo en 1753 (citado

por Robinson, 1996), hasta el presente la ubicación taxonómica del género Musa ha sido

tratada por varios autores. En la actualidad la más aceptada fue la propuesta por Cronquist

(1988), como sigue:

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Liliopsida

Sub-clase: Zingiberidae

Orden: Zingiberales (Scitamineae)

Familia: Musaceae



Género: Musa

Especie: Musa acuminata y Musa balbisiana

Los bananos y plátanos son plantas monocotiledóneas. La familia Musáceas está

constituida por los géneros Musa y Ensete. El género Musa (compuesto por entre 30 y 40

especies diploides) está formado por cuatro secciones: Australimusa, Callimusa,

Rhodochlamys y Eumusa. La sección Eumusa es la de mayor importancia económica y

distribución geográfica, ya que en ella se incluyen la mayor cantidad de los bananos y

plátanos comestibles (MusaDoc, 2000). No sería hasta la publicación en 1948 del

Classification of the bananas de Ernest Cheesman que se introdujo el orden taxonómico.

Cheesman et al. (1955) identificaron a los tipos linneanos como híbridos producidos por el

cruzamiento de dos especies descritas por Luigi Colla, M. acuminata y M. balbisiana. El

grupo procedente principalmente de M. acuminata comprendería a los bananos

comestibles más antiguos. A partir de éstos, y por restitución cromosómica, se

desarrollaron variedades triploides más robustas y productivas. Cheesman et al. (1955)

clasificaban a estas variedades junto con su ancestro silvestre como M. acuminata. Más al

norte, en regiones más secas, los cultivares procedentes de M. balbisiana resultaron más

útiles al ser más tolerantes.

En las Filipinas se obtuvieron los primeros ejemplares triploides, difundidos por

propagación vegetativa por su esterilidad, los cuales dieron origen al segundo grupo de

cultivares, a los que Cheesman et al. (1955) clasificaban paralelamente como M.

balbisiana. Finalmente, en algunas zonas ambos grupos genómicos entraron en contacto,

y al ser heterocompatibles dieron origen a híbridos naturales diploides, triploides y algunos

tetraploides, entre los cuales se contaban las dos variedades que identificó Linneo.

Simmonds y Weatherup (1990) propusieron la sustitución de los nombres linneanos por un

código ad hoc para expresar el genotipo de la variedad. Cada híbrido se identificó por una



clave de entre dos y cuatro letras, de acuerdo a su ploidía; cada letra respondería al origen

de la variedad, siendo A para designar una rama genética procedente de M. acuminata o B

para una procedente de M. balbisiana. Las investigaciones han revelado que los cultivares

de origen A son más numerosas que las de origen B; la mayoría de los cultivares son AAA

o AAB, varios plátanos son ABB, siendo AB, AABB y ABBB los menos comunes.

2.1.3. Anatomía y morfología

Los plátanos no son árboles, sino una megaforbia, como las demás especies de Musa

carece de verdadero tronco (Cheesman, 1948; Morton, 1987; Stover y Simmonds, 1987;

Valmayor et al., 2008). Son hierbas perennes de gran tamaño, amontonadas, con sistemas

radicales adventicios y tallos simpódicos subterráneos; los tallos aéreos son altos y están

sostenidos por las vainas foliares, unidas apretadamente, que forman el pseudotallo,

similares a fustes verticales de hasta 30,0 cm de diámetro basal que no son leñosos y

alcanzan los 7,0 m de altura. Las hojas se desarrollan en el corazón del pseudotallo y

surgen de él en un estado de arrollamiento sumamente apretado. El número de hojas

totales de la planta depende de la edad y el cultivar (Sandoval y Müller, 1999). Cada planta

tiene normalmente entre 5 y 15 hojas, siendo 10 el mínimo para considerarla madura; las

hojas viven no más de dos meses, y en los trópicos se renuevan a razón de una por

semana en la temporada de crecimiento (Cheesman, 1948; Morton, 1987; Stover y

Simmonds, 1987; Valmayor et al., 2008).

El cormo es un eje constituido por la raíz y el vástago que se diferencia en tallo y hojas; y

entre las bases foliares circundantes del cormo se encuentra en una depresión encerrada

el meristemo apical. Su sistema radical es adventicio, con raíces de primero, segundo y

tercer orden; su diámetro puede variar de 5 a 10 milímetros, y su longitud de 3 a 5 metros

dependiendo del cultivar (Sandoval y Müller, 1999). La inflorescencia emerge por el centro

del pseudotallo en posición vertical; semeja un enorme capullo púrpura o violáceo que se



afina hacia el extremo distal, con el pedúnculo y el raquis glabros. Los grupos de flores se

denominan manos y las flores dedos. Cada mano puede tener de 4 a 8 flores por hilera,

colocadas en posición alterna las de una fila con la siguiente. Después que el meristemo

ha producido flores femeninas, ocurre un cambio y aparecen grupos de flores masculinas.

Las piezas florales se desecan pronto y caen; las brácteas se levantan cada día y se

descubre una mano de flores masculinas (Champion, 1975).

El fruto es una falsa baya epígina de 7,0 a 30,0 cm de largo y hasta 5,0 de diámetro, que

forma un racimo compacto. La pulpa es de blanca a amarilla, rica en almidón y dulce; en

los plátanos puede resultar algo astringente o gomosa por su contenido de látex y harina

seca (Cheesman, 1948; Morton, 1987; Stover y Simmonds, 1987; Valmayor et al., 2008).

2.1.4. Importancia de los plátanos y bananos

Los usos de los bananos y plátanos han sido celebrados por las personas desde tiempos

remotos. En la India al plátano se lo denomina "kalpatharu", que significa "hierba con todos

los usos imaginables". Los plátanos y bananos están considerados dentro de los cultivos

de mayor producción mundial (Roux et al., 2008) y sus productos constituyen el cuarto

alimento más importante después del arroz, trigo y maíz en valores de toneladas

producidas (Afza et al., 1996). Sin embargo, los plátanos han alcanzado mayor

importancia como cultivo comercial y de subsistencia en regiones lejanas de su centro de

origen primario (Robinson, 1996); específicamente en los países del trópico y subtrópico

(Afza et al., 1996; Van Duren et al., 1996; Crouch et al., 1998).

En la alimentación, los bananos y plátanos son fuente importante de carbohidratos (35%),

proteínas (1,2%) y fibras (6-7%); adicionalmente aportan potasio, magnesio, fósforo, calcio

y vitamina A y C (Novak, 1992; Kodym y Zapata, 1999). Son utilizados para brindar

sombra a grupos de cultivos, incluyendo el cacao y el café (MusaDoc, 2004).



En Cuba, los bananos y plátanos constituyen un cultivo de elevada prioridad dentro del

programa alimentario nacional, debido a su capacidad de producir todos los meses del

año, su elevado potencial productivo, arraigado hábito de consumo y diversidad de usos.

La producción de plátanos y bananos posee gran significación dentro de la producción de

viandas en Cuba, pues representan más del 40% de este indicador anualmente.

Actualmente esta producción está basada en varios cultivares pertenecientes a los

subgrupos Cavendish (AAA), Plantain (AAB), Burros (ABB) y tetraploides (AAAA, AAAB,

AABB), introducidos de la Fundación Hondureña de Investigaciones Agrícolas (FHIA),

(MINAG, 2007).

2.1.5. Principales problemas que afectan la producción de plátanos y bananos

Pérez (1998) señala que dentro de las principales plagas que afectan los cultivos de

bananos y plátanos en Cuba, con pérdidas que oscilan entre el 40-50% de las cosechas,

se encuentran: Sigatoka negra y amarilla (Mycosphaerella fijiensis Morelet y

Mycosphaerella musicola Leach); Mancha por Cordana musae; Pudrición de la corona

(Fusarium pallidoros eum, Colletotrichum. musae y Fusarium spp); Mal de Panamá

(Fusarium oxysporum F. sp cubense (Foc)); Pudrición acuosa del cormo y necrosis del

rizoma (Erwinia chrysanthemi); Virus del rayado del banano (BSV, de sus siglas en inglés:

Banana Streak Virus) y virus del mosaico del pepino (CMV, de sus siglas en inglés:

Cucumis Mosaic Virus); nemátodos, Picudo negro (Cosmopolites sordidus); Acaro rojo

(Tetranychus tumidus) y chinches harinosas (Pseudococcus adonidum, Pseudococcus

comstocki).

Las técnicas del manejo integrado son el sistema de soporte de las decisiones para la

protección de los cultivos, que se centra en la prevención a largo plazo o supresión de los

problemas de plagas con mínimo impacto en la salud de los seres humanos, el medio

ambiente y otros organismos que no se desea eliminar. El control de malezas en este



cultivo, se basa en la integración de los elementos: preparación de suelo, labores de

cultivo, limpia y uso de herbicidas (Pérez, 2009).

Otro de los problemas que afectan la producción de estos cultivos es el efecto de los

vientos, lo cual a nivel mundial se estima que ocasiona pérdidas en cosecha del 20 al 30%

(Álvarez, 2005).

2.2. Clasificación de los plátanos (AAB)

Este grupo de híbridos triploides se originó en la India, a partir de cruzamientos

espontáneos y mutaciones somáticas, dando lugar a un gran número de cultivares

(Robinson, 1996). La característica de la inflorescencia es la diferencia morfológica más

marcada entre los cultivares del plátano, los cuales están clasificados en cuatro tipos

según el grado de degeneración de la inflorescencia: French, French-Horn, False Horn y

Horn (Simmonds, 1973). En términos de variación cuantitativa, la altura de la planta y

número de frutos son los caracteres más discriminantes para agrupar los cultivares del

plátano (Swennen y Vuylsteke, 1995).

El plátano Horn (AAB) es estéril, por lo que las actividades de mejoramiento del mismo en

el programa de la FHIA siempre han sido limitadas por esta razón (Rowe, 2000).

2.2.1. Características del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB)

• Origen: Tanzania.

• Tipo: Horn.

• Año de introducción en Cuba: 1987.

• Genoma/Ploidia: AAB.

• Características de la Planta:

Morfológicas



o Hábito foliar: Normal

o Apariencia del pseudotallo: Verde con manchas negras pequeñas

o Altura: 3,60–3,80 m

o Perímetro del pseudotallo: 52,0–60,0 cm

o Forma de Racimo: Asimétrico

o Posición del Racimo: Oblicuo a 45 grados

o Color de Frutos: Verde

o Color de la pulpa: Amarilla brillante

o Longitud de los dedos: 22,0–30,0 cm

o Grosor del dedo: 14,0–17,0 cm

o Relación pulpa-cáscara verde: 1,47

Fenológicas

o Duración primer ciclo vegetativo (siembra a floración): 220-270 días

o Duración primer ciclo productivo (floración a cosecha): 90-110 días

Producción

o Peso neto (con raquis) de racimo: 28,0–35,0 kg

o Número de dedos por racimo: 61±8

o Número de manos por racimo: 6–8

Reacción a enfermedades:

o “Sigatoka negra”: Susceptible

o “Mal de Panamá”: Resistente



o Nemátodos: Susceptible a Radopholus similis, moderadamente susceptible a

Pratylenchus coffeae

El cultivar ‘Zanzíbar’, pertenece al grupo AAB, subgrupo Plantain, denominado en Cuba

como plátano macho o vianda (López, 1989). La planta alcanza una altura aproximada de

3,68 m, con pseudotallo cónico y de color verde con manchas negras, con un elevado

rendimiento (26,6 t.ha-1). Es del tipo Horn y tiene además ahijamiento desordenado.

La principal limitante para su cultivo es la susceptibilidad a la enfermedad Sigatoka negra y

la altura de la planta; que causa entre un 40% y 60% de pérdidas económicas, lo cual ha

hecho que sus plantaciones estén restringidas a pequeñas áreas en el país (Álvarez,

2005).

2.3. Cultivo de tejidos

Desde hace más de 120 años se ha empleado la técnica del cultivo de tejidos. En 1902

Haberlandt postuló el principio de la totipotencia que es la base teórica sobre la que se

sustentan todas las técnicas del cultivo in vitro en plantas, ya que toda célula es capaz de

regenerar un individuo. El cultivo de tejidos puede definirse como un conjunto de técnicas

que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y

protoplastos, empleando medios nutritivos artificiales (Dixon, 1991; Roca y Mroginski,

1993; Jiménez, 1998a).

Para la expresión de la totipotencia celular en los cultivos vegetales in vitro existen dos

vías, la organogénesis y la embriogénesis. La regeneración de plantas por una u otra vía

depende de las características genéticas de las plantas y del manejo del cultivo in vitro,

que tiene en cuenta la manipulación, los medios de cultivo y otras condiciones ambientales

(Tisserat, 1991; Gómez, 1997). Los primeros trabajos sobre la multiplicación in vitro de

plátanos y bananos se realizaron en la década de 1970 en algunos genotipos AAA (Afza et

al., 1996).



2.3.1. Micropropagación

Originalmente la micropropagación se definió como “cualquier” procedimiento aséptico que

comprenda la manipulación en las plantas, de órganos, tejidos o células que produzcan

plántulas y que permitan el desvío tanto del proceso sexual normal como de la

propagación vegetativa no aséptica que se practica convencionalmente. La

micropropagación clonal implica que cada una de las plántulas que se produce puede

crecer y ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta original de la que se deriva

(Krikorian, 1991; Villalobos, 1991; Pérez, 1997).

Kitto (1997) señaló que la micropropagación constituye una industria joven con un

excelente futuro, pero su incremento dependerá del desarrollo de nuevas técnicas para la

automatización de los procesos y del mejoramiento de los sistemas de aclimatización de

las plantas.

2.3.1.1. Organogénesis. Aspectos generales

La organogénesis es un evento morfogenético que se caracteriza por su desarrollo

unipolar, en otras palabras, es la formación de un primordio unipolar a partir de una yema

con el subsecuente desarrollo de éste en un brote vegetativo, existiendo siempre una

conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno (Hu y Wang, 1983). Los brotes pueden

formarse directamente del explante (organogénesis directa) o indirectamente a partir de

callos. En contraste con la embriogénesis somática, en la vía organogénica, para lograr la

formación de una planta completa, ya sea por la vía directa o indirectamente, se requiere

de una secuencia de medios de cultivo, que favorecen el desarrollo de los brotes, la

formación de raíces y viceversa (Jiménez, 1998b).

La organogénesis ha sido la base fundamental de la multiplicación vegetativa y dentro de

ella pueden diferenciarse dos vías: la formación de yemas axilares y la formación de

yemas adventicias



o Formación de yemas axilares

Se basa en la formación de brotes a partir de las yemas que se encuentran en las axilas

de las hojas o primordios de hojas, los cuales son divididos y subcultivados

respectivamente (Hu y Wang, 1983). Este método ha sido el más utilizado para la

propagación comercial debido a la facilidad con que se ha establecido en la mayoría de

las especies y a la estabilidad genética de las plantas regeneradas, siendo el sistema de

regeneración en el cual se obtienen los menores índices de variación genética (Prakash,

1994; Kitto, 1997).

o Formación de yemas adventicias

Se basa en la formación de novo de yemas a partir de meristemos preexistentes o tejidos

no meristemáticos, los cuales se originan de una o un pequeño grupo de células, cuando

se cultivan los explantes en medios de cultivos con concentraciones elevadas de

citoquininas (Vulysteke y de Langhe, 1985). Con esta técnica es posible producir un mayor

número de plantas por unidad de tiempo en comparación con el método de yemas axilares

y a la vez presenta mayores posibilidades de mecanización-automatización, existiendo ya

varios ejemplos de utilización de biorreactores para su producción (Akita et al., 1994). Sin

embargo, al igual que el método de yemas axilares tiene la limitante de que el proceso

productivo es realizado en dos etapas: producción de brotes y crecimiento-enraizamiento,

adicionalmente tiene el inconveniente de que puede ser una fuente de variación genética

debido al propio origen unicelular de las yemas adventicias (Reuveni et al., 1985).

2.3.1.2. Fases de la propagación in vitro vía organogénesis

Los métodos de propagación in vitro vía organogénesis, están basados fundamentalmente

en la proliferación de brotes axilares a partir de la formación de una plántula, mediante el

cultivo aséptico de un ápice o meristemo (Vasil, 1994). Esta técnica constituye la base de



la propagación masiva de plátanos y bananos, con actual vigencia en muchos países para

propagar y distribuir de forma comercial y a gran escala, plantas libres de enfermedades

(Afza et al., 1996).

Los ápices meristemáticos de plátanos y bananos, en dependencia del genotipo o cultivar,

presentan diferentes respuestas en la formación de plantas durante el establecimiento in

vitro y posterior índice de multiplicación en la fase de multiplicación (García y Noa, 1998).

Esta fase, tiene como objetivo principal la producción del mayor número posible de

propágulos a partir de explantes introducidos in vitro (Pérez et al., 1998a).

La proliferación de explantes puede lograrse con la incorporación de citoquininas en el

medio de cultivo, la más empleada en la mayoría de las especies es la benzilaminopurina

(6-BAP), y es casi exclusiva en la micropropagación de plátanos y bananos (Orellana,

1998).

Pérez et al. (1998b) demostraron que la eficiencia del proceso está determinada por la

fase de multiplicación y su parámetro fundamental es el coeficiente de multiplicación; que

indica que por cada unidad de aumento en el mismo, disminuyen los costos en un 10%.

Razones por las cuales los medios de cultivo en estado líquido se han propuesto en

muchos casos para sustituir los medios de cultivos semisólidos en plátanos y bananos

(Orellana, 1998). Sus principales ventajas incluyen corto tiempo para manipular los

explantes, mayor rapidez de absorción de nutrientes, cambio de la composición del medio

de cultivo por simple transferencia y la esterilización puede realizarse por ultra filtración o

autoclave (Alvard et al., 1993).

Strosse et al. (2004), señalaron tres etapas fundamentales denominadas I, II y II que

consisten en la iniciación de explantes caulinares, multiplicación y regeneración de plantas

No obstante, a pesar de las limitaciones, esta técnica posee un gran número de ventajas;

motivo por el cual un notable número de investigadores consideran que es posible su

aplicación a escala comercial logrando hacerla más eficiente mediante la automatización,



cambios tecnológicos, medidas organizativas y de control (Vasil, 1994; Pérez et al.,

1998a). El aumento de la eficiencia en la micropropagación convencional está muy

relacionado con el perfeccionamiento de las técnicas in vitro (Orellana, 1998; Pérez et al.,

1998b).

2.4. Mejoramiento Genético de Musa

2.4.1. Mejoramiento genético tradicional por cruzamiento

La genética ha contribuido al desarrollo agrícola en nuestros tiempos, desde que

Gregorio Mendel formulara en el siglo XIX las leyes de la herencia (Ventura, 1996).

Los programas de mejoramiento genético de banano y plátano por hibridación en el

mundo están basados en cruzamientos entre triploides comerciales y diploides mejorados

cuyo objetivo es el desarrollo de bananos y plátanos más productivos, tolerantes a las

principales enfermedades (González, 2005). Por esta razón el potencial de la

biotecnología y su utilización en los programas de mejoramiento de esta especie ha sido

muy investigado (Novak, 1992; Ortiz y Vuylteke, 1996; García, 2000, Bermúdez et al.,

2000; Mack et al., 2004, Roux, 2008; Orellana, 2008).

Debido a que el éxito en estos cruzamientos a menudo se basa en una meiosis desviada,

es decir, producción de gametos no reducidos, pueden producirse híbridos con diferentes

niveles de ploidía (Ortiz y Vuylsteke, 1995; Vuylsteke et al., 1996). Por otra parte, algunos

programas de mejoramiento utilizan tetraploides obtenidos por poliploidización artificial a

partir de una fuente diploide (Dolêzel et al., 1997).

El trabajo de mejoramiento genético convencional que inició la United Fruit Company en

Jamaica con introducciones de cultivares de Filipinas, Java, Malasia, Bali, Papúa, Nueva

Guinea e Islas Salomón, fue recuperado por La Fundación Hondureña de Investigación



Agrícola (FHIA), en 1984 (Rowe y Rosales, 1994). De este programa han surgido un

grupo de bananos y plátanos tetraploides híbridos con resistencia a Sigatoka negra, Mal

de Panamá (Fusarium oxysporum) y a nemátodos (Rowe y Rosales, 1990 y 1994). Entre

estos se destacan los híbridos tetraploides ‘FHIA 01’ (AAAB), ‘FHIA 02’ (AAAA), ‘FHIA 18’

(AAAB), ‘FHIA 20’ (AAAB) y ‘FHIA 21’ (AAAB). Esta resistencia se expresa por un

alargamiento del ciclo de la enfermedad, la reducción del tamaño de las lesiones y de la

capacidad de producción de esporas (Pérez, 1996). En la actualidad lo clones antes

citados, no se comportan de la misma manera (Pérez, 2009).

Existen otros programas de mejoramiento en banano y plátano, entre ellos el desarrollado

en el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) en Nigeria, donde se han

registrado 14 cultivares híbridos tetraploides mejorados (TMPx) con resistencia a Sigatoka

negra (Ortiz y Vuylsteke, 1996) y en el INIVIT se trabaja en la obtención de cultivares

superiores de bananos y búsqueda de plátanos similares en sabor y calidad a los plátanos

AAB, con tolerancia a Sigatoka negra, Sigatoka amarilla, Mal de Panamá y nemátodos

(Ventura, 1993; Pino et al., 1998). En este sentido, se han obtenido un grupo de cultivares

tetraploides con resistencia o tolerancia a las principales plagas (Ramírez et al., 2005 y

Ramírez, 2010).

2.4.2. Mejoramiento asistido por Biotecnología

La biotecnología vegetal tiene tres objetivos básicos de interés para la mejora: el

incremento de la variabilidad genética sin intervención de la reproducción sexual, la

propagación de genotipos normalmente inestables en la reproducción sexual y la

disminución en el número o en la duración de los ciclos de selección necesarios para un

programa de mejora (Pérez, 1998c). Se pueden desarrollar técnicas para el rescate de

embriones, selección desde etapas muy tempranas a factores bióticos y abióticos,

inducción de mutaciones in vitro (con el consiguiente incremento de la eficiencia del



tratamiento mutagénico), desarrollo de técnicas de transformación genética con el empleo

de métodos directos o indirectos (biológicos) y la micropropagación de los cultivares

seleccionados para los estudios de extensión (Pérez, 1998c).

Algunos investigadores han hecho referencias que las mutaciones que se producen por la

variabilidad somaclonal son similares a las producidas espontáneamente o por los

métodos clásicos de mutagénesis (Pérez, 1998b; Bermúdez, 2000). La condición

fundamental para utilizar el cultivo de tejidos en los programas de mejoramiento por

biotecnología, es poder contar con un sistema de regeneración de plantas eficiente, para

que las células modificadas genéticamente puedan desarrollarse y regenerar plantas que

manifiesten las características deseadas (Pérez, 1998a).

Se han establecido técnicas para la propagación in vitro, como organogénesis y

embriogénesis somática (Cronauer y Krikorian, 1983; Escalant et al., 1994; Hernández,

1995; Okole y Schulz, 1997; Barranco, 2000; López et al., 2004) que se han utilizado en el

mejoramiento genético por inducción de mutaciones in vitro (Novak et al., 1990; Afza et al.,

1994; Cardona et al., 2000; García et al., 2000) y por transformación genética (Sági et al.,

1995; Sagi et al., 1998; Ganapathi et al., 1999; Becker et al., 2000; Bermúdez, 2000;

Daniell et al., 2001; Ganapathi et al., 2001; Ganapathi et al., 2008; López et al., 2008;

Roux et al., 2008; Sales et al., 2008).

Se ejecutan programas de mejoramiento genético en Cuba, con el empleo de estos

métodos para la obtención de plantas resistentes a enfermedades, reducción del porte y

mejora de los frutos, en el INIVIT (López et al., 2004), en el Instituto de Biotecnología de

las Plantas (Pérez, 1998a y Orellana, 2008) y en la Unidad de Mejoramiento Genético de

los Laboratorios de la Organización Internacional de la Energía Atómica en Austria.

Se ejecutan proyectos nacionales en Bélgica, Sri Lanka, Israel, Sudán, Pakistán, Filipinas,

Malaysia y Australia (Roux et al., 2008).



2.4.3. Empleo de la mutagénesis en el cultivo in vitro

La mutagénesis tiene correspondencia directa con la variación del genoma de la planta y

se puede dar en diferentes aspectos, ya sea alterando el juego básico o la estructura de

los cromosomas, ó causando modificaciones de las bases del ADN (Sandoval, 1998). Los

sistemas de mejoramiento por mutaciones inducidas, se fundamentan en el empleo de

agentes mutagénicos físicos o químicos que propician cambios similares a los que se

presentan en las mutaciones naturales, pero en un período de tiempo relativamente corto y

en mayor cantidad (Perea, 1998).

Las técnicas in vitro han creado nuevas oportunidades para la inducción de mutaciones en

los cultivos propagados vegetativamente (García et al., 2000). La capacidad de regenerar

plantas a partir de una o pocas células y la posibilidad de la descomposición de las

quimeras que es la desventaja fundamental de los métodos clásicos de mejoramiento por

mutación (Van Harten, 1997; Pérez, 1998a). La manipulación de los reguladores del

crecimiento y en particular un medio de cultivo enriquecido con citoquininas, puede

incrementar la recuperación de células mutadas y el desarrollo de células que han sufrido

daños por el efecto físico de las mutaciones (Morpurgo et al., 1997). Por estas razones

más del 60% de las variedades obtenidas, a través del mejoramiento por mutaciones, se

han liberado después de 1985, en la era del mejoramiento genético de plantas por

Biotecnología (Nichterlein, 2000).

El cultivo de brotes meristemáticos de plátanos y bananos ha sido utilizado para el

mejoramiento genético en combinación con la inducción de mutaciones (Novak et al.,

1990; Donini y Micke, 1994; López et al., 1998; Roux, 1998; García et al., 2000; Mack et

al., 2004; Roux, 2004; Ali et al., 2008; Ganapathi et al., 2008; López et al., 2008; Orellana,

2008; Roux et al., 2008; Sales et al., 2008).



Además, Hautea et al. (2004) señalaron que la inducción de mutaciones, ya sea química o

por irradiación combinado con el cultivo in vitro de Musa spp. genera un gran número de

variantes o mutantes vegetativos en plantas propagadas de manera asexual.

Para disociar estas quimeras en plátanos y bananos frecuentemente se sugiere la

propagación de los brotes irradiados por cuatro ciclos vegetativos (Novak et al., 1990). En

estudios de desagregación de mixoquimeras se concluyó que utilizando la regeneración de

plantas a través de yemas axilares no se pueden desagregar completamente (Roux, 1998;

Roux et al., 2001). Estos factores alteran las respuestas de las células a las radiaciones en

su efectividad (mutaciones/unidad de dosis) y eficiencia (relación mutantes útiles/mutantes

deseables) y son dependientes de las propiedades específicas y condiciones del

tratamiento, de los tipos de radiaciones y del sistema biológico (Pérez, 1998a).

Hirimburegama (2004), expresó que desde 1995 en el programa IAEA/TC han aplicado

radiaciones Gamma a meristemos de los cultivares ‘Embul’ y ‘Cavendish’ y obtuvieron

mutantes de porte bajo y floración temprana. García et al. (2000); Mack et al. (2004); Roux

(2004); Ganapathi et al. (2008); López et al. (2008); Orellana (2008); Roux et al. (2008);

Sales et al. (2008), también han empleado dichas radiaciones en yemas múltiples y

embriones somáticos para el mejoramiento genético a diferentes cultivares de bananos y

plátanos.

2.4.4. Radiosensibilidad de yemas adventicias y determinación de la dosis óptima

del agente mutagénico

Diferentes cultivares de Musa exhibieron diferencias significativas en la radiosensibilidad

cuando fueron irradiados brotes con radiaciones Gamma (60Co), (Roux, 1998). Los

cultivares diploides fueron más sensibles a las radiaciones mientras que los tetraploides

expresaron los niveles más bajos de daños por la irradiación (Novak et al., 1990; Roux,

1998).



En estudios de radiosensibilidad en yemas adventicias y brotes axilares, de cultivares de

plátanos y bananos, se refirió que las células de origen adventicio son más sensibles que

los brotes. El uso de células adyacentes durante el tratamiento mutagénico es

recomendado para evitar el exceso de daños y garantizar una mejor regeneración (Afza et

al., 1994). Las mutaciones en las células apicales del domo meristemático son

especialmente valiosas porque ellas pueden producir primordios con grandes sectores

mutados u homohistonas.

Como regla general la dosis del mutágeno debe permitir la supervivencia del 40-60% con

respecto al material vegetal no tratado en condiciones in vitro (Pérez, 1998a). Otros

investigadores plantean que una dosis adecuada debe reducir en la fase de plántula del

30-40% de la altura o la longitud de las raíces, y con una dosis alta el 50% de las plantas

debe sobrevivir en el campo (Rodríguez et al., 1995). En este sentido, Hirimburegama

(2004) señaló que una dosis de 45 Gy en cultivares Cavendish generan mutantes

importantes para la producción agrícola, sobre todo la disminución del porte de las plantas.

2.4.5. Evaluación de la variabilidad producida por la inducción de mutaciones

La detección y confirmación de mutantes es la parte más difícil del mejoramiento por

mutaciones en Musa. El desarrollo de ensayos bioquímicos puede ayudar a la selección

primaria y a establecer las bases genéticas de estos cambios fenotípicos (Novak y Micke,

1990).

Según Simmonds (1973) los mutantes somáticos en los plátanos pueden ser clasificados

por: la altura de la planta y hábito de crecimiento, los colores de la planta, la serosidad, la

variegación, los caracteres del racimo y del fruto. Después del tratamiento mutagénico se

han observado considerables variaciones morfológicas en las plantas regeneradas de

plátanos y bananos (Novak et al., 1990; Jamaluddin, 1994; Radha y Nayar, 1996 a, b).



La frecuencia de variaciones fenotípicas que incluyen: morfológicas (altura de la planta,

forma de la hoja, pigmentación), fisiológicas (crecimiento de los hijos y multiplicación,

tiempo de florecimiento, maduración del fruto) y caracteres agronómicos (calidad del

racimo), fueron de 3 a 40% de las plantas probadas, dependiendo del genotipo y las dosis

de radiación (Novak et al., 1990). En los últimos años se han obtenido mutantes con

florecimiento precoz, agradable sabor, textura suave de la pulpa y disminución en el porte

de la planta (Nichterlein, 2000), proveniente del cultivar ‘Gran enano’ en el programa de

mejoramiento en Musáceas que preside el Organismo Internacional de Energía Atómica

(Roux et al., 1994).

López et al. (2004) también realizaron la evaluación durante tres ciclos de cultivo en

campo de varios mutantes de porte bajo, provenientes de ápices meristemáticos del

cultivar ‘Parecido al Rey’ (AAA), a los que se le aplicó radiaciones Gamma y se evaluaron

en campo determinadas características.

El empleo de la mutagénesis in vitro constituye una alternativa viable para este cultivo por

la posibilidad de producir cambios discretos sin afectar el genoma completo de la planta,

que posibilite seleccionar cultivares con una mejor adaptación a las condiciones adversas

de la producción.

Materiales y Métodos


3. MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y áreas de campo del

INIVIT, ubicado en el municipio de Santo Domingo, provincia de Villa Clara; durante el

período comprendido entre enero de 1997 hasta enero de 2009.

Técnicas y procedimientos generales

Procedimientos generales

Los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121oC de temperatura y 1,2

kg.cm-2 de presión, el tiempo de esterilización varió en dependencia del volumen de medio

de cultivo a esterilizar, según información técnica de SIGMA (1991). El instrumental

(pinzas y bisturí) se desinfectó en un esterilizador eléctrico modelo DENT-EQ que

permaneció dentro de la cámara de flujo laminar horizontal fabricada por la industria

cubana de equipos médicos (ICEM).

El resto de los instrumentales utilizados para el manejo de los explantes fueron

esterilizados en estufa Memert a 180oC durante dos horas. Las condiciones de cultivo

fueron: temperatura 27 ± 2°C y régimen de 16 horas de luz (DFFF de 62-68 µmol m-2s-1) y

ocho horas de oscuridad. El manejo de los materiales biológicos (establecimiento,

subcultivos y cambios de medios de cultivo), se realizó en condiciones de esterilidad en

una cámara de flujo laminar horizontal.

Establecimiento y multiplicación in vitro del cultivar ‘Zanzíbar’

El establecimiento in vitro de los ápices se realizó a partir de plantas en floración,

previamente seleccionadas. Se seleccionaron hijuelos tipo “espada”, con una altura entre

50 y 100 cm procedentes del Banco de Germoplasma del INIVIT en buen estado

fitosanitario-nutricional, los cuales fueron llevados a condiciones semicontroladas en el

Centro de Reproducción Acelerada de Semillas (CRAS), según Filipia (1983), el cual

consiste en utilizar los cormos de diferentes calibres, yemas e hijos, los cuales fueron



desinfectados en una solución de formalina al 2% durante dos o tres minutos.

En dependencia del tamaño de los cormos estos fueron seccionados en fracciones de más

de 100 gramos, se eliminó la parte de la yema apical y se plantaron en un lecho de

enraizamiento con arena desinfectada. Transcurridos 60 días, al material vegetal se le

eliminaron las partes más externas del cormo y las vainas foliares, hasta obtener

secciones con el ápice caulinar de aproximadamente 5,0 cm de largo y 2,5 cm de diámetro

en la parte sucia del laboratorio de cultivo de tejidos.

La desinfección y reducción del tamaño de las secciones hasta obtener un ápice de

aproximadamente 0,50 cm2, se realizó por la metodología propuesta por Ventura et al.

(1993). El establecimiento de los mismos se realizó en el medio de cultivo propuesto por

Murashige y Skoog (1962), modificado por Ventura et al. (1999) (Tabla 1), para propiciar el

desarrollo de yemas múltiples en los explantes para su irradiación posterior.

Se utilizaron tubos de ensayo dosificados con 10 mL de medio de cultivo líquido y con

soporte de papel de filtro para el establecimiento in vitro. Para la multiplicación y

enraizamiento se añadió 30 mL de medio de cultivo (Tabla 1) en estado semisólido, se

utilizó Agar-Agar (SIGMA) como gelificante a una concentración de 5,0 g.L-1 en frascos de

cristal transparente de 250 mL de volumen. El pH del medio de cultivo se ajustó, con HCl

0,5 N o NaOH 0,5 N, a 5,8 previo a la esterilización.



Tabla 1. Composición de los medios de cultivo utilizados para la propagación in vitro del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB)

Componentes Medio de cultivo

establecimiento

Medio de cultivo

multiplicación

Medio de cultivo

enraizamiento

Sales MS (%)

Tiamina (mg.L-1)

N6-bencilaminopurina (mg.L-1)

Kinetina (mg.L-1)

Ácido indol butirico (mg.L-1)

Mio-inositol (mg.L-1)

Sacarosa (%)

100

1,0

1,0

-

--

100

3,0

100

1,0

3,5

1,5

--

100

3,0

100

1,0

--

-

0,23

100

2,0

La aclimatización de las plantas in vitro se desarrolló según la metodología propuesta por

Pérez et al. (1999) en un umbráculo cubierto por una malla plástica (zarán), que permitió el

paso de una densidad de luz de FFF de 600 μmol m-2s-1, que logra una reducción de la

intensidad luminosa del 70% durante esta etapa.

Se utilizaron bandejas de polieturano con 70 orificios (100 cm3 de volumen) que contenían

un sustrato de cachaza descompuesta, cuya composición química aparece en la Tabla 2 y

fueron plantadas a una profundidad de 1,0 cm, previa desinfección con formalina al 2,0%.

Tabla 2. Composición química del sustrato utilizado en la fase de aclimatización (expresado en %)

Sustrato N P2O5 K2O Ca Mg S MO

Cachaza 2,18 2,37 1,04 5,77 0,16 0,37 42,8



El riego se realizó por microaspersión mediante sistema Microjet con una frecuencia de

seis riegos al día y una duración de dos minutos cada uno. Se garantizó una humedad

relativa del 85–90%. Las plantas propagadas in vitro con una altura de 4,0 a 5,0 cm y de

dos a tres hojas, fueron plantadas a una profundidad de 1,0 cm. Se evaluó en esta fase la

supervivencia de las plantas in vitro a los 45 días y se separaron aquellas que presentaron

cambios morfológicos.

3.1. Determinación de la radiosensibilidad en ápices meristemáticos del cultivar

‘Zanzíbar’ (AAB)

Con el objetivo de determinar el efecto de diferentes dosis de radiaciones en ápices

meristemáticos del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB), se utilizó la metodología propuesta por

Novak, (1987), modificada por Ventura et al. (1996) (Figura 1), en el marco del proyecto de

Colaboración Técnica CUB 05 014 con el Organismo Internacional de la Energía Atómica

(IAEA).

De las yemas múltiples obtenidas en el medio de cultivo de multiplicación (Tabla 1) fueron

extraídos ápices meristemáticos de 2,0–3,0 mm y colocados en tubos plásticos de un

centímetro cúbico de volumen que contenían dos o tres gotas de agua destilada estéril

para evitar la deshidratación del tejido. Se utilizaron 200 explantes iniciales por

tratamiento, aplicando las dosis de radiación de 0; 25; 35; 45 y 60 Gy con una frecuencia

de 8 Gy/minuto en fuente de 60Cobalto ubicada en el Centro de Estudios Aplicados de la

Energía Nuclear (CEADEN), Ciudad de La Habana. Posterior a la irradiación, los explantes

se transfirieron a medio de cultivo fresco de multiplicación y se subcultivaron cada 30 días

(Tabla 1), (Figura 1).



Figura 1. Esquema utilizado en el INIVIT para el mejoramiento por mutagénesis in vitro en plátano ‘Zanzibar’ (AAB)

En la generación vegetativa M1V4 fueron enraizadas 6 039 plantas in vitro, las cuales se

llevaron a la fase de aclimatización. Adicionalmente, con la dosis de radiación

seleccionada se procedió a un tratamiento masivo y se obtuvieron 5 200 plantas in vitro,

que junto a las anteriores con igual dosis fueron evaluadas en campo.

Para determinar la reducción del 50% de la población (DL 50) y la reducción del 50% del

crecimiento (GR 50), se evaluó la mortalidad de los explantes a los 30 días y el coeficiente

de multiplicación (M1V3) para cada uno de los tratamientos. Para el procesamiento de los

datos, se utilizó el paquete estadístico CURVE EXPERT ver. 1,3 para Windows 2003.

La aclimatización de la vitroplantas obtenidas se desarrolló según la metodología

propuesta por Pérez et al. (1999) descrita anteriormente en procedimientos generales.

IN VIVO

IN VITRO

IN VIVO

Plantas PLUS del cultivar seleccionado

Propagación en CRAS

Establecimiento y formación de yemas múltiples

Tratamiento mutagénico

Aclimatización

Estudio comparativo de posibles mutantes (II y III ciclo)

Enraizamiento M1V4

Multiplicación y evaluación de posibles mutantes

Selección en campo (I ciclo)

Multiplicación de material irradiado M1V1 – M1V3

Extracción de ápices meristemáticos (2,0-3,0 mm)



Transcurridos 60 días, las plantas obtenidas del tratamiento control y todas las irradiadas a

45 Gy se llevaron a condiciones de campo.

3.2. Selección en campo de las plantas de porte bajo en el primer ciclo

Con el objetivo de seleccionar las plantas de bajo porte a partir de la variabilidad inducida

en las plantas irradiadas, se regeneraron 5 701 plantas, que incluyen las de irradiación

masiva y parte de las obtenidas para la determinación de la DL50, a igual dosis y 1 700

plantas del control sin irradiar.

La plantación se realizó en el INIVIT, en un suelo Pardo sialítico cálcico carbonatado

(Hernández et al., 1999) en 1997. La distancia de plantación utilizada fue de 3,00x1,00 m.

en hilera sencilla a una densidad de plantación de 3 333 plantas/ha (alta densidad) en un

diseño completamente aleatorizado. Se realizaron las labores agrotécnicas, incluyendo el

deshije, según el Instructivo Técnico del cultivo (MINAG, 1994). En el momento de la

cosecha, se evaluaron la frecuencia de variación fenotípica en cada uno de los

tratamientos y se seleccionaron los posibles mutantes, teniendo en cuenta los siguientes

criterios:

o Plantas con altura entre 2,15–3,55 m.

o Plantas con peso de del racimo con raquis entre 6,90–20,00 kg.

3.3. Evaluación morfológica y agronómica de los mutantes seleccionados, durante el

segundo ciclo de producción en campo

Con el objetivo de evaluar la respuesta morfológica y agronómica en campo de los

posibles mutantes seleccionados en el primer ciclo de cultivo (Acápite 3.2) se multiplicaron

en CRAS, hasta obtener 20 plantas por mutante seleccionado y plantas del cultivar

‘Zanzíbar’, las cuales fueron plantadas según el Instructivo Técnico del cultivo (MINAG,



1994), en el año 1998. Las evaluaciones se realizaron en el momento de la cosecha y se

tuvo en cuenta los siguientes criterios de selección:

Variables vegetativas en el momento de la cosecha

o Altura de la planta (2,0-3,33 m), medida desde la base del pseudotallo hasta la

inserción en forma de V de las últimas hojas emitidas (m)

o Perímetro del pseudotallo, medido a un metro de la base de la planta (cm)

Variables de producción en el momento de la cosecha

o Peso del racimo (6,90-27,00 Kg)

o Número de dedos por racimos (u)

Se utilizó un diseño completamente aleatorizado. Los datos se analizaron

estadísticamente mediante análisis de varianza de clasificación simple y la comparación

múltiple de medias según las dócima de Tukey y Dunnett´C (en el caso de las variables

discretas). Los niveles de significación establecidos fueron: significativo para p<0,05;

altamente significativo para p<0,01 y no significativo para p>0,05.

3.4. Evaluación morfológica y agronómica de los mutantes seleccionados y

caracterización fenotípica en el tercer ciclo

Con el objetivo de evaluar en campo los mutantes seleccionados en el Acápite anterior se

multiplicaron en CRAS, junto a las plantas del cultivar ‘Zanzíbar’ como control hasta

obtener 150 plantas de cada uno de ellos, estas fueron plantadas en bloques a una

distancia de 3,60 m de calle y 2,00 m entre plantas, en un área de 0,60 ha. Las

condiciones de suelo y agrotécnia del cultivo fueron ya descritas. Las evaluaciones se

realizaron en el momento de la cosecha, entre 11 y 12 meses y se evaluaron los

siguientes caracteres a todas las plantas:



Variables vegetativas en el momento de la cosecha

o Altura de la planta, medida desde la base del pseudotallo hasta la inserción en forma

de V de las últimas hojas emitidas (m)

o Perímetro del pseudotallo, medido a un metro de la base de la planta (cm)

o Número de hojas en el momento de la cosecha (u)

Variables de producción en el momento de la cosecha

o Peso del racimo (kg)

o Número de manos por racimo (u)

o Número de dedos por racimo (u)

o Largo del dedo central de la segunda mano verde (cm)

o Largo del dedo central de la segunda mano maduro (cm)

o Grosor del dedo central de la segunda mano verde (cm)

o Grosor del dedo central de la segunda mano maduro (cm)

o Relación pulpa/cáscara del fruto verde

o Relación pulpa/cáscara del fruto maduro

Para la caracterización fenotípica de los mutantes seleccionados se utilizaron los

caracteres morfoagronómicos utilizados por IPGRI/INIBAP/CIRAD (1996), entre ellos:

o Altura de la planta (m)

o Color del pseudotallo

o Número de hijos (u)

o Desarrollo de los hijos

o Manchas en la base del pecíolo

o Color de las manchas

o Color nervadura haz

o Canal peciolar hijo III



o Color cara dorsal de la hoja bandera

o Longitud de la lámina (m)

o Ancho de la lámina (m)

o Longitud del pedúnculo (m)

o Color del pedúnculo

o Pubescencia del pedúnculo

o Posición del racimo

o Forma del racimo

o Tipo de raquis

o Posición del raquis

o Tipo de yemas masculinas

o Comportamiento de las brácteas antes de caer

o Pigmentación del pétalo compuesto

o Color del estigma

o Color básico del ovario

o Pigmentación del ovario

o Número de frutos de la mano media (u)

o Longitud del fruto (cm)

o Forma de los frutos

o Ápice del fruto

o Color de la cáscara del fruto inmaduro

o Color de la cáscara del fruto maduro

o Color de la pulpa a la madurez

o Sabor predominante

o Presencia de semillas botánicas

Se utilizó un diseño de bloques al azar.

Resultados y discusión


4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Determinación de la radiosensibilidad en ápices meristemáticos del cultivar.

‘Zanzíbar’ (AAB)

A medida que se incrementó la dosis de radiación de 0 a 60 Gy, disminuyó el porcentaje

de supervivencia de los explantes irradiados. Se observó que la dosis más cercana que

redujo al 50% la supervivencia de los explantes irradiados fue la de 45 Gy (Figura 2).

S = 7.30980795r = 0.96368185

Dosis de radiación (Gy)

Supe

rviv

enci

a (%

)

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.030.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

Figura 2. Porcentaje de supervivencia de los ápices meristemáticos a diferentes dosis de radiación en el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB)

Según Donini y Sonnino (1998), cuando se realizan experimentos con radiaciones es

esencial determinar la DL50, a partir de una serie de dosis de radiaciones comparando la

supervivencia de los explantes cultivados con el control no irradiado para recuperar los

posibles mutantes útiles. Resultados similares en un cultivar de plátano vianda (AAB)

fueron obtenidos por Yeung (1995), respecto a las dosis de irradiación. En estudios de

y=100.8633 + (-1.0140394) x



radiosensibilidad en el cultivar ‘Williams’ (AAA), la dosis recomendada fue de 20 Gy con un

73% de supervivencia de las plantas (Smith et al., 1994).

Álvarez et al. (2000) al irradiar con rayos Gamma, yemas múltiples del cultivar ‘Dominico

Hartón’ (AAB) a una dosis de 25 Gy, obtuvieron diferencias en la altura de las plantas, las

cuales clasificó como plantas: altas (3,66 m) (24,2%), medianas (3,23 m) (54,5%) y bajas

(2,65 m) (21,2%). Orellana et al. (2008) obtuvieron cinco mutantes a partir del plátano

cultivar ‘FHIA 21’ (AAAB) al irradiar yemas múltiples cultivadas in vitro a una dosis de 25

Gy.

Roux (1998) expresó que la radiosensibilidad en brotes de varios cultivares de Musa,

depende del nivel de ploidía y la constitución genética de los mismos y encontró diferentes

dosis de radiaciones Gamma para cada cultivar: 10-20 Gy para los cultivares diploides

‘Calcuta 4’ (AA) y ‘Tani’ (BB), 30-40 Gy para los triploides ‘Gran enano’ (AAA) y ‘Williams’

(AAA) y 40-50 Gy para el triploide ‘Cachaco’ (ABB). Roux (2004) también informó que

existe la tendencia de usar dosis de radiaciones bajas para que provoquen pequeños

cambios en los cromosomas, sin embargo estos resultados producen bajas frecuencias de

mutaciones.

García et al. (2000) refirieron que al utilizar radiaciones con rayos Gamma en el cultivar

‘Gran enano’ (AAA) encontraron a una dosis de 25 Gy, un porcentaje de supervivencia de

23%, similarmente Epp (1987) al emplear el mismo cultivar obtuvo que solo el 22% de los

brotes tratados con 40 Gy sobrevivieron. Mack et al. (2004), al aplicarle radiaciones

Gamma al cultivar ‘Pisang Berangan’ (AAA) a una dosis de 45 Gy obtuvieron la mayor

frecuencia de variantes: cambio de color, deformación y textura de las hojas y disminución

de la altura de las plantas. De esta población seleccionaron mutantes con tolerancia a

Fusarium sp. que fueron certificados con el empleo de la técnica molecular de

Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico (RAPD, de sus siglas en inglés: Random



Amplification Polimorphic DNA). Ganapathi et al. (2008), al irradiar ápices meristemáticos

hasta 30 Gy del cultivar ‘Cavendish gigante’ (AAA) obtuvieron mutantes de porte bajo y

floración temprana. Sales et al. (2008), también irradiaron yemas múltiples del cultivar

‘Lakatán’ (AAA) a una dosis de 50 Gy y obtuvieron una gran variabilidad genética.

Al evaluar el coeficiente de multiplicación luego del tratamiento de irradiación se encontró

que a 45 Gy se redujo el coeficiente de multiplicación al 50% (1,41), con respecto al

control (Figura 3). A medida que aumentó la dosis de radiación, disminuyó el coeficiente

de multiplicación.

S = 0.08596024r = 0.99423455

Dosis de radiación (Gy)

Coe

ficie

nte

de m

ultip

licac

ión

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.00.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

Figura 3. Influencia de la dosis de irradiación en el coeficiente de multiplicación de ápices meristemáticos a diferentes dosis de radiación en el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB)

Mack et al. (2004) al irradiar yemas múltiples a una dosis de 0 a 60 Gy al cultivar ‘Pisang

Berangan’ (AAA), concluyeron que cuando aumenta la dosis de radiación disminuye el

coeficiente de multiplicación, que osciló en un rango de 4,35 a 0,65 cuando se aplica a 60

Gy. A medida que aumenta la dosis de radiación, la tasa de mutaciones tiende a ser

y=2.791133 + (-0.030640394) x



mayor, sin embargo a dosis elevadas pueden ocasionar el rompimiento de los

cromosomas y se obtiene mayor frecuencia de mutaciones cromosómicas y genómicas

(Pérez, 1998a).

El uso de bajas dosis de radiación ofrece mayor posibilidad de tener mutaciones puntuales

que son, en última instancia, las más favorables para el mejoramiento (Maluszynski et al.,

1995). Varios grupos de investigadores han señalado diferentes dosis de irradiación de

acuerdo al grupo y constitución genómica de los bananos y plátanos (Novak et al., 1990;

Roux, 2004).

La selección de la dosis a utilizar para la irradiación masiva de material vegetal parece

estar muy influenciada con el genotipo a utilizar y las condiciones de cultivo in vitro a que

serán sometido. Teniendo en cuenta que los plátanos vianda son inestables y que han

surgido en la mayoría de los casos por selección natural, fue seleccionada la GR50 de 45

Gy, dosis que redujo en un 50% el coeficiente de multiplicación (1,41), como la dosis para

la inducción de mutaciones en el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB), el cual tiene un alto potencial

productivo en el germoplasma cubano.

4.2. Selección en campo de las plantas de porte bajo en el primer ciclo

En los primeros estados de desarrollo de las plantas en campo la radiación afectó la

emergencia y la expansión de las hojas jóvenes y se observaron algunas aberraciones

morfológicas. Estas deformaciones fueron citadas también por De Guzmán et al. (1980);

Novak et al. (1990); Jamaluddin (1994); Daniells et al. (1999) y García (2000), en otros

cultivares.

Durante el primer ciclo en campo se observaron plantas con diferentes variaciones

fenotípicas y morfológicas, que representaron un 69,69% de variación total en el cultivar

‘Zanzíbar’ las cuales fueron estudiadas durante el siguiente ciclo (II ciclo) de cultivo en



campo a fin de determinar la estabilidad de los cambios observados (Tabla 3). Esto puede

estar ocasionado por que durante los procesos in vitro se producen cambios que pueden

ser transmitidos a las generaciones posteriores. Sin embargo, en ciertos casos la

variabilidad puede ser transitoria y las plantas retornan a su fenotipo original, por lo que

cualquier estimación de la variabilidad es más difícil para el caso de poblaciones obtenidas

por cruzamientos o tratamientos mutagénicos tradicionales (Sandoval et al. 1997) (Figura

4).

Las principales variaciones fenotípicas consistieron en una reversión de Horn a French del

41,3%, cambios en la altura de las plantas (21,17%), cambio de coloraciones en

pseudotallos y hojas (16,96%), deformación de racimos (12,62%), ordenamiento del

ahijamiento (5,65%) y floración temprana (2,30%), provocados probablemente por la

influencia de la dosis de irradiación empleada (45 Gy) (Tabla 3).

Tabla 3. Variaciones fenotípicas observadas durante el primer ciclo de cultivo en campo del cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’ (AAB)

Variaciones fenotípicas (%)

Reversión de tipo Horn a French 41,30

Cambios en la altura de la planta 21,17

Cambios en la coloración del pseudotallo y hojas 16,96

Deformación de los racimos 12,62

Cambios en la forma de ahijamiento 5,65

Floración temprana o precoz 2,30

Estas variaciones se han observado en otros cultivares de plátano vianda. Orellana (2008)

obtuvo mutantes de porte bajo por inducción de mutaciones en el cultivar de plátano

vianda ‘FHIA–21’ (AAAB), irradiado con una dosis de 25 Gy, un 6,6% de variabilidad

fenotípica total en las plantas de material vegetal tratado con radiaciones. La mayor

variación correspondió a los caracteres del racimo, tales como: apariencia, forma de la



pampana y el raquis. López et al. (2008) al irradiar suspensiones celulares embriogénicas

a la dosis de 80 Gy en el cultivar ‘CEMSA ¾’ (AAB), seleccionaron también plantas de

porte bajo y con reversión del tipo Pseudohorn a French en la pámpana.

Figura 4. Algunas variantes fenotípicas observadas en las plantas irradiadas a 45 Gy en el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB). A. Plátano tipo French. B. Plátano tipo Horn (‘Zanzíbar’) Control C. Altura del posible mutante ‘Z 30’. D. Ahijamiento del mutante ‘Z 30’

A

B

C

D



Teniendo en cuenta los principales componentes del rendimiento, altura de la planta,

ahijamiento ordenado y forma del racimo; fueron seleccionados 15 posibles mutantes

(Tabla 4). Al evaluar la altura de la planta y el peso del racimo como caracteres

discriminantes, se seleccionaron 15 posibles mutantes los cuales mostraron una altura

entre 2,15 y 3,53 m. Las plantas del control no irradiado mostraron una altura de 3,88 m.

El peso del racimo de las plantas seleccionadas estuvo entre 12,40 y 19,60 kg.

Se seleccionó una planta con un racimo que pesó 6,90 kg., por la estructura de éste,

manos separadas, ahijamiento ordenado y vertical respecto al pseudotallo, longitud de los

dedos superior al resto de todas las plantas seleccionadas y color de la pulpa amarillo

brillante.

Tabla 4. Caracteres evaluados en plantas seleccionadas del cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’ (AAB) irradiado en el primer ciclo

Código Altura de la planta (m)

Peso del racimo (kg)

‘Z 1’ 2,75 13,70

‘Z 2’ 2,77 6,90 ‘Z 3’ 2,60 13,80 ‘Z 4’ 2,85 14,10

‘Z 5’ 3,01 13,90

‘Z 6’ 2,90 14,70

‘Z 7’ 2,93 15,10

‘Z 8’ 2,91 13,30

‘Z 9’ 3,25 12,40

‘Z 10’ 2,87 14,10

‘Z 30’ 2,75 19,60

‘Z 30 A’ 2,15 13,10

‘Z 13’ 2,45 14,30

‘Z 14’ 3,53 15,10

‘Z 15’ 2,21 12,80

‘Zanzíbar’ (Control) 3,88 13,60



El tratamiento mutagénico empleado permitió obtener mutantes de porte bajo y

características del racimo similares al cultivar original, los cuales fueron multiplicados en el

Centro de Reproducción Acelerada de Semillas (Filipia, 1983), para el establecimiento de

familias clonales, que se evaluaron en campo en un segundo ciclo. Se evaluó también la

estabilidad de las variaciones observadas en un segundo ciclo.

4.3. Evaluación morfológica y agronómica de los posibles mutantes seleccionados,

durante el segundo ciclo de producción en campo

En el segundo ciclo en campo se pudo apreciar una baja estabilidad en la mayoría de las

variaciones observadas en el primer ciclo (Tabla 5) (cambio de altura de las plantas

(23,25%), reversión de Horn a French (21,45%), deformación de los racimos (71,55%),

coloración de pseudotallos y hojas (65,70%) siendo muy baja en estructura de ahijamiento

(11,28%) y en floración precoz o temprana (5,65%). Se obtuvo un 33,15% de estabilidad

total, lo cual demuestra que estas variaciones pudieran tener una base genética y no

epigenética.

Tabla 5. Variaciones fenotípicas encontradas durante el primer ciclo de cultivo en campo de los mutantes seleccionados del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) que se evaluaron en el segundo ciclo

Variaciones fenotípicas observadas Variantes estables

Reversión al estado normal

Estabilidad (%)

Reversión de tipo Horn a French 326 1 193 21,45

Cambios en la altura de la planta 180 595 23,25

Cambios en la coloración del pseudotallo y hojas 409 214 65,70

Deformación de los racimos 334 133 71,55

Cambios en la forma de ahijamiento 24 185 11,28

Floración temprana o precoz 6 79 5,65

Al respecto, Novak et al. (1990) encontraron cambios principalmente en relación con las

hojas (color, forma y distribución) y algunos mutantes enanos. También encontró una



frecuencia de variaciones fenotípicas del 3,0-40% en dependencia del genotipo y de la

dosis de radiación utilizada. Con la utilización de 25 Gy de radiaciones Gamma sobre

ápices meristemáticos se obtuvo mayor variabilidad fenotípica (16,55%) en comparación

con otros trabajos donde se irradiaron ápices meristemáticos de este mismo cultivar con

30 Gy y se obtuvo solamente 7,4% de variabilidad (Novak et al., 1990). Se ha planteado

que este tipo de variaciones sean genéticas y no estén relacionadas con cambios

epigenéticos (Daniells y Smith, 1991; Sandoval et al., 1997). Las plantas no irradiadas no

mostraron variación.

En este trabajo se observó que en el segundo ciclo de multiplicación de las plantas

provenientes del cultivo de tejidos la variabilidad se redujo, lo cual según Pérez (1998a) es

producto a la pérdida de la mayoría de los cambios epigenéticos y en esta fase de

multiplicación es que se puede hacer una estimación “confiable” de la variabilidad.

Reuveni e Israeli (1990) señalaron que estas diferencias fenotípicas observadas, pudieran

deberse a que las ápices meristemáticos, en el caso específico de Musa, incrementan de 4

a 10 veces la variabilidad con respecto a la regeneración por yemas axilares. Esto unido al

efecto de las radiaciones Gamma sobre estas estructuras pudo incrementar la frecuencia

de variabilidad. Además pudo haber influido el protocolo de regeneración de plantas

establecido, donde se precisan al menos dos multiplicaciones en los medios de cultivo

después del tratamiento mutagénico, esto condiciona menores pérdidas de mutaciones

producto de la selección diplóntica.

Es conocido que el incremento de divisiones celulares acelera las pérdidas de las

mutaciones (Marcotrigiano y Gradziel, 1997). Las plantas con manchas de varios colores

en los pecíolos, hojas y pseudotallos mantuvieron estas características en un alto

porcentaje en el segundo ciclo de multiplicación, mostrando su estabilidad. En algunos

casos se observaron estos cambios de coloración más reforzados. Resultados similares



obtuvieron Radha y Nayar (1996b) y García et al. (2000) en el cultivar ‘Gran enano’.

Cuando se estudió la estabilidad de la anomalía de la decoloración del verde heterogéneo

entre los plátanos Cavendish (Musa cultivar. AAA) en Taiwán se encontró que todas las

plantas anormales produjeron descendencias fuertemente afectadas por esta

característica deletérea (Tang, 1998).

Durante los procesos in vitro se producen cambios que pueden ser transmitidos a las

generaciones posteriores. En este trabajo, las plantas con manchas violáceas en las hojas

y en el nervio central, no mantuvieron sus características al ser multiplicadas en campo.

Probablemente, esta variación fue un caso de cambio epigenético el cual es producido por

genes estimulados durante el proceso del cultivo de tejidos, pero estos no representan

cambios en el material hereditario (Pérez, 1998b) y se pierden.

La frecuencia de adaptantes se expresa muy superior a la de mutantes, en el orden de 100

a 1 000 veces (Meins, 1983). De las variantes con florecimiento precoz (5,65%)

observadas no se pudo seleccionar un posible mutante pues estaban asociadas a plantas

con racimos deformados. En este sentido, Roux et al. (1994) informaron la obtención de un

mutante con esta característica en el cultivar ‘Gran enano’ irradiado con 60Co, el que

presentó además, disminución en el porte de la planta. Ventura et al. (1999) encontraron

un alto porcentaje de variaciones en los cultivares de banano ‘Parecido al Rey’ (AAA) y

plátano ‘Burro CEMSA’ (ABB), las más significativas fueron: disminución de la altura,

cambio de coloraciones, presencia de cera en los frutos y deformación de los racimos.

Se encontró estabilidad en la mayoría de las variaciones estudiadas, obteniéndose un

83,33% de estabilidad total de la población irradiada y seleccionadas, lo que puede indicar

que estas variaciones no sean epigenéticas.



Al evaluar los caracteres morfoagronómicos se encontraron diferencias significativas entre

las medias de la variable altura; la cifra más elevada correspondió al cultivar ‘Zanzíbar’

(3,68 m) y la más bajas a las variantes ‘Z 30 A’ (2,00 m) (Tabla 6). Otros mutantes de porte

bajo fueron el ‘Z 13’ (2,30 m) y el ‘Z 30’ (2,65 m), con diferencias significativas respecto al

cultivar ‘Zanzíbar’ (3,68 m). En cuanto al perimetro del pseudotallo a 1,0 m de altura desde

la base, se observó que la media más elevada, con diferencias significativas respecto al

resto, fue para el mutante ‘Z 9’ (52 cm) con el mejor comportamiento, la media más baja la

obtuvo el mutante ’Z 15’ (41 cm).

Para el número de dedos/racimos, el mutante ‘Z 2’ (110) fue el mejor con la media más

alta, y diferencias significativas respecto al resto, la media más baja la alcanzó el mutante

‘Z 30 A’ (26). Los primeros mutantes, a pesar de tener un gran número de dedos fueron

eliminados de la selección por ser cortos y delgados, característica del tipo French. En

cuanto al peso de los racimos se pudo inferir, que el mutante ‘Z 30’ (26,60 kg) fue superior

tanto numérica como estadísticamente (p < 0,01) al resto.



Tabla 6. Caracteres morfoagronómicos evaluados en los posibles mutantes seleccionados del cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’ (AAB) irradiado, en el segundo ciclo

Código Altura de la planta (m)

Perímetro del pseudotallo (cm)

No. de dedos/racimo

Peso del racimo (kg)

‘Z 1’ 2,55 bc 42 g 59 g 14,70 de

‘Z 2’ 2,67 bc 43 fg 110 a 6,90 f

‘Z 3’ 2,50 bc 43 fg 64 f 15,80 bc

‘Z 4’ 2,78 b 47 cd 60 g 15,10 cde

‘Z 5’ 2,97 b 46 d 70 d 15,90 bc

‘Z 6’ 2,78 bc 44 ef 64 ef 16,70 b

‘Z 7’ 2,83 b 48 c 68 de 16,10 bc

‘Z 8’ 2,86 b 47 cd 59 g 15,30 cde

‘Z 9’ 3,14 b 52 a 36 l 14,40 e

‘Z 10’ 2,77 b 46 d 69 d 15,10 cde

‘Z 30’ 2,65 bc 42 g 30 i 26,60 a

‘Z 30 A’ 2,00 d 44 ef 26 j 15,10 cde

‘Z 13’ 2,30 cd 44 ef 32 i 15,30 cde

‘Z 14’ 3,33 b 50 b 106 b 16,10 bc

‘Z 15’ 2,00 d 41 h 73 c 15,80 bc

‘Zanzíbar’ 3,68 a 50 b 69 d 14,60 e

ES ± 0,10* 0,24 * 0,67 * 0,21 *

CV (%) 7,43 1,07 2,16 2,81

Medias con letras desiguales difieren para p<0,05 según dócima de Tukey y Dunnett'C

Los resultados obtenidos demuestran la posibilidad del empleo de la inducción de

mutaciones para crear variabilidad genética para la selección en los programas de

mejoramiento genético utilizados en plátanos, de manera que estos se puedan

complementar.



Teniendo en cuenta los criterios de selección establecidos en este trabajo y otros

caracteres, fueron seleccionados tres mutantes:

o ‘Z 30’, por tener una altura media de 2,65 m, 42 cm del

diámetro del pseudotallo a un metro del suelo, 30 dedos

por racimos muy bien estructurados y un mejor

rendimiento respecto al resto (26,60 kg), todo lo cual

evidencia la uniformidad de todos los racimos.

o ‘Z 13’, tiene una altura menor que el ‘Z 30’ (2,30 cm),

mayor número de dedos (32) y mayor diámetro del

pseudotallo a un metro del suelo, su rendimiento fue

mucho menor (15,30 kg) y no son uniformes sus racimos.

Tiene una pulpa amarilla intensa

o ‘Z 30 A’, es el mutante de porte más bajo con una altura

de 2,00 m y es el de menor peso por racimo (15,10 kg).

Es muy estable en la altura de las plantas, pero no así en

el racimo.




caracterización fenotípica en el tercer ciclo

Después de dos ciclos de multiplicación en el campo los tres mutantes de porte bajo

seleccionados no modificaron su altura de porte bajo, lo cual indicó que fueron estables

(Tabla 7).

Tabla 7. Respuesta de los mutantes seleccionados del cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’ (AAB) irradiado en plantaciones de alta densidad, en el tercer ciclo de cultivo

Código Altura

(m)

Perímetro del

pseudotallo a

1,0m (cm)

No. de

manos

(U)

Total

dedos

(U)

Peso de los

racimos

(kg)

Hojas

activas en

cosecha (U)

‘Z 13’ 2,18 b 50,74 b 6 32 b 23,99 b 7 a

‘Z 30’ 2,26 b 51,63 b 6 30 c 20,10 d 6 a

Z 30 A’ 2,27 b 52,27 a 6 31 b 21,65 c 6 a

‘Zanzíbar’ 3,01 a 49,86 c 6 66 a 33,05 a 5 a

ES± 0,04* 0,28* 0,62* 0,17* 0,51ns

CV(%) 3,51 1,09 3,21 1,43 17,05

Medias con letras desiguales difieren para p<0,05 según dócima de Tukey

En cuanto a la altura de las plantas, el cultivar ‘Zanzíbar’ (3,01 m) difirió estadísticamente

del resto, el mutante ‘Z 13’, mostró la media más baja (2,18 m). En el diámetro a un metro

de altura de la base de la planta, se observó que el cultivar ‘Z 30 A’ (52,27 cm) fue el de

media más alta con diferencias significativas respecto al cultivar ‘Zanzíbar’ (49,86 cm) que

obtuvo el menor valor en esta evaluación.

El número de manos/racimo fue el mismo para todos los cultivares (6). El total de dedos

fue superior en el cultivar ‘Zanzíbar’ (66) con diferencias significativas respecto al resto, la

cifra más baja correspondió al mutante ‘Z 30’ (30 dedos).



El cultivar ‘Zanzíbar’ (33,05 kg) fue el de mejor respuesta en cuanto al peso de los

racimos, con diferencias significativas respecto al resto. El mutante ‘Z 30’ (20,10 kg) ocupó

el último lugar con la media más baja. Respecto al número de hojas en la cosecha o corte

del racimo, el mutante ‘Z 30’ (7) fue el de media más alta sin diferencias estadísticas

respecto a los demás. El cultivar ‘Zanzíbar’ (5) alcanzó la cifra más baja.

Estos resultados coinciden con lo referido por Smith y Drew (1990); Daniells y Smith

(1991); Novak (1992); Sandoval et al. (1997); Daniells et al. (1999); García et al. (2000) y

Orellana (2008) los cuales constataron que las variantes características del enanismo, se

mantuvieron después de dos ciclos de establecimiento en el campo. Las mutaciones que

afectan a la altura de la planta tienen lugar en los tipos AAA, AAB y ABB, por lo tanto, la

incidencia de estas mutaciones no parece tener relación con sus progenitores (Simmonds,

1973). Se ha planteado que el enanismo en cultivares de plátano es controlado por un

simple gen recesivo que provoca un bloqueo de la vía metabólica de la giberelina (Ortiz y

Vuylsteke, 1995).

Al evaluar la longitud de los dedos de frutos verdes, el mayor valor se observó en el

mutante ‘Z 30 A’ (33,5 cm) con diferencias significativas respecto a la media más baja para

el cultivar ‘Zanzíbar’ (25,0 cm). La longitud de los dedos de los frutos maduros fue superior

numéricamente para el mutante ‘Z 13’ (30,5 cm) y altamente significativo respecto a la

media más baja para el cultivar ‘Zanzíbar’ (24,5 cm). Para la variable grosor de los dedos

de frutos verdes, los mutantes ‘Z 13’ y ‘Z 30 A’ (5,0 cm) alcanzaron los mayores valores

con diferencias significativas respecto al resto. La media más baja la alcanzó el cultivar

‘Zanzíbar’ (4,0 cm). Para el grosor de los dedos de frutos maduros, el mejor

comportamiento, con la media más elevada, fue para el mutante ‘Z 13’ (5,5 cm), con

diferencias significativas respecto al resto. La media más baja correspondió al cultivar

‘Zanzíbar’ (3,0 cm) (Tabla 8).



Tabla 8. Respuesta de los frutos en los mutantes seleccionados del cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’ (AAB) en plantaciones de alta densidad durante el tercer ciclo en el momento de la cosecha

Cultivar

Long. dedos verdes (cm)

Long. dedos

maduros (cm)

Grosor dedos verdes (cm)

Grosor dedos

maduros (cm)

Relación Pulpa/cásc.

verde

Relación Pulpa/cásc.

madura

‘Z 13’ 30,0 b 30,5 a 5,0 a 5,5 a 1,50 a 1,89 b

‘Z 30’ 28,5 c 29,0 b 4,5 b 5,0 b 1,56 a 1,91 b

‘Z 30 A’ 33,5 a 28,5 b 5,0 a 4,5 b 0,80 b 1,89 b

‘Zanzíbar’ 25,0 d 24,5 c 4,0 c 3,0 c 1,47 a 3,18 a

ES ± 1,38 * 1,66 * 0,74 * 0,84 * 0,10 * 0,15 *

CV (%) 10,10 11,36 9,85 11,99 16,25 14,61

Medias con letras desiguales difieren para p<0,05 según dócima de Tukey

En la relación pulpa/cáscara de frutos verdes se detectaron diferencias significativas entre

las variantes, la media más alta fue para el mutante ‘Z 30 (1,56) y la más baja para el

cultivar ‘Z 30 A’ (0,80). En cuanto a la relación pulpa/cáscara de frutos maduros, el cultivar

‘Zanzíbar’ (3,18) fue el mejor y con diferencias significativas respecto a los mutantes ‘Z 13’

(1,89); ‘Z 30 A’ (1,89) y ‘Z 30’ (1,91). Von Loesecke (1950), afirma que durante el proceso

de maduración el contenido de humedad de la pulpa aumenta, debido a la hidrólisis del

almidón y al movimiento osmótico del agua de la cáscara hacia la pulpa y por la

concentración más rápida de azúcares en la pulpa, incrementando la relación del peso

pulpa/cáscara.

Los resultados de la caracterización morfológica de los mutantes, (Tabla 9) permitieron

determinar que los mutantes seleccionados difieren del cultivar ‘Zanzíbar en cuanto a

altura (2,18–2,27 m), color del pseudotallo (cambio de verde rojizo a verde medio),

ahijamiento (de 6 a 2-3 hijos), desarrollo de los hijos, disminución de las manchas en la



base del peciolo, color de la nervadura por el haz, color de la cara dorsal de la hoja

bandera, presentan raquis.

Se mantuvieron estables los caracteres color de las manchas, canal peciolar del hijo III,

color del pedúnculo.

Cuando Larkin y Scowcroft (1981) postularon el principio de la variabilidad somaclonal se

creó una gran expectativa, comenzando en muchos laboratorios programas de mejora

utilizando el cultivo de tejidos. No obstante, han pasado ya varios años y aún no se han

obtenido los resultados esperados por esta vía debido a la baja eficiencia en la mejora

para caracteres específicos. La mayoría de los mutantes obtenidos presentan variaciones

no útiles los cuales, según Ahloowalia (1998) están asociadas con aberraciones

cromosómicas y el comportamiento agronómico es generalmente inferior a los cultivares

originales (Daniells y Smith, 1993; Vuylsteke, 1998).

En general, la reducción en la altura de las plantas está asociada a falsos entrenudos y

pecíolos cortos, pseudotallos gruesos y disminución del área foliar (Sandoval et al., 1997).

Pereira et al. (2003), cuando estudiaron la variabilidad genética existente en 20 accesiones

del Banco de Germoplasma del INIVIT, que incluyeron los posibles mutantes promisorios

obtenidos en el presente trabajo, mostraron un agrupamiento que se corresponde con las

relaciones de parentesco existente entre las accesiones estudiadas, así como con las

características fenotípicas analizadas, en el estudio de PCR efectuado.



Tabla 9. Características morfológicas de los mutantes ‘Z 30-A’, ‘Z 13’ y ‘Z 30’ y el cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) en el tercer ciclo

Descriptores ‘Zanzíbar’ ‘Z 30 A’ ‘Z 13’ ‘Z 30’

Altura (m) 3,01 2,27 2,18 2,26 Color del pseudotallo Verde rojizo Verde medio Verde medio Verde medio Número de hijos 8 2 2 3 Desarrollo de los hijos Inhibido Entre ¼ y ¾ de altura de

la madre Entre ¾ de altura de la

madre Entre ¼ y ¾ de altura de

la madre Mancha en la base del peciolo Manchas grandes Manchas pequeñas Manchas pequeñas Manchas pequeñas Color de las manchas Marrón negruzco Marrón negruzco Marrón negruzco Marrón negruzco Color nervadura haz Verde medio Verde claro Verde claro Verde claro Color cara dorsal de la hoja bandera

Verde Verde rosado Verde rosado Verde

Canal peciolar hijo III Estrecho con márgenes erectos

Estrecho con márgenes erectos



Longitud de la lámina (m) 1,60 1,60 1,59 1,54 Ancho de la lámina (m) 0,65 0,77 0,73 0,74 Longitud del pedúnculo (m) 0,40 0,42 0,38 0,52 Color del pedúnculo Verde Verde Verde Verde Pubescencia del pedúnculo Poco pubescente Glabro Poco pubescente Poco pubescente Posición del racimo Ligeramente inclinado Oblicuo a 45º Ligeramente inclinado Ligeramente inclinado Forma del racimo Cono truncado Cono truncado Cono truncado Cono truncado Tipo de raquis Truncado Presente Presente Presente Tipo de yema masculina Ausente Degenerado antes de la madurez Comportamiento de las brácteas antes de caer

- Revoluta Revoluta Revoluta

Pigmentación del pétalo compuesto

- Salpicado de herrumbre Salpicado de herrumbre Salpicado de herrumbre

Color de estigma - Crema Crema Crema Color básico del ovario - Verde Verde Verde



Descriptores ‘Zanzíbar’ ‘Z 30 A’ ‘Z 13’ ‘Z 30’ Pigmentación del ovario - Muy poco o sin signos

visibles Muy poco o sin signos

visibles Muy poco o sin signos

visibles Número de frutos de la mano media

4 5 4 5

Longitud del fruto (cm) 15,2 14,8 16,5 17,0 Forma de los frutos Curvos Curvos Curvos Curvos Apice del fruto Largamente puntiagudos Largamente puntiagudos Largamente puntiagudos Largamente puntiagudos Color de la cáscara inmadura Verde Verde Verde Verde Color de la cáscara madura Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Color de la pulpa antes de la madurez

Marfil Marfil Marfil fuerte Marfil

Color de la pulpa a la madurez Amarillo Amarillo Amarillo brillante Amarillo Sabor predominante Astringente Astringente Astringente Astringente (como

banano cocido) Presencia de semillas No No No No Posición del raquis Inclinado Pendular verticalmente Pendular verticalmente Pendular verticalmente



El mutante seleccionado por sus características fue el ‘Z 30’, el cual en la actualidad se

denomina ‘INIVIT PV 06 30’ (AAB) y se generaliza a escala productiva en varias entidades

agrícolas del país de las provincias de Guantánamo, Santiago de Cuba, Granma, Holguín,

Ciego de Ávila, Sancti Spiritus, Villa Clara, Cienfuegos y La Habana.

Fue certificado como un cultivar comercial en el registro Nacional de Variedades de Cuba,

en el año 2010. Además es propagado en las Biofábricas de Santiago de Cuba, Granma,

Holguín, Ciego de Ávila, Villa Clara, Cienfuegos y La Habana por ápices meristemáticos y

plantas provenientes de embriogénesis somática, con una alta eficiencia y demanda de los

productores.

De una población de 5 200 plantas irradiadas a 45 Gy, se seleccionaron tres mutantes de

porte bajo con valor comercial, que representa un 0,05% de eficiencia.

Los resultados alcanzados en este trabajo, posibilitaron establecer una metodología para

el desarrollo de la mutagenesis in vitro en el cultivar ‘Zanzibar’ (AAB), la cual se muestra

en el esquema de trabajo realizado (Figura 5). A partir de la selección de plantas ¨Plus¨

del Banco de Germoplasma del INIVIT del cultivar ‘Zanzibar’ se propagaron en el Centro

de Reproducción Acelerada de Semillas (CRAS) en un tiempo de 60 días. De estas

plantas se establecieron los ápices meristemáticos en un medio de cultivo líquido con

soporte, en 30 días. Se multiplicaron los ápices meristemáticos para desarrollar yemas

múltiples en el medio de cultivo de multiplicación en un tiempo de 30 días. De estas,

fueron extraídos ápices meristemáticos de 2-3 mm de tamaño, los cuales fueron irradiados

con la dosis seleccionada (45 Gy). Estos ápices meristemáticos irradiados fueron

multiplicados por tres generaciones en el mismo medio de cultivo de multiplicación (M1V3).

Los sub cultivos fueron realizados cada 30 días. En el cuarto sub cultivo fueron enraizadas

(M1V4) en medio de cultivo líquido. Las plantas in vitro fueron aclimatizadas en un tiempo

de 45 días, momento en el cual fueron llevadas a campo por un año y se seleccionaron

quince posibles mutantes, los cuales fueron multiplicados en CRAS junto al control en un



tiempo de 60 días. Las familias clonales establecidas fueron evaluadas en campo durante

dos ciclos (24 meses).

Figura 5. Esquema del empleo de la mutagénesis in vitro en el cultivar ‘Zanzibar’ (AAB) para obtener mutantes de porte bajo. La metodología utilizada posibilitó obtener mutantes del cultivar ‘Zanzibar’ (AAB) con el

porte bajo deseado, así como un rendimiento similar al cultivar donante, lo cual aporta

nuevos conocimientos en la aplicación de la mutagénesis in vitro en ápices meristemáticos

provenientes de yemas múltiples del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) para la inducción de

características deseadas, que a la vez amplia la estructura clonal de los plátanos vianda

en Cuba.

Adicionalmente, por primera vez en la agricultura cubana se dispondrá de un mutante de

porte bajo de plátano vianda a partir del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB), que propiciará una

mayor resistencia al efecto de los vientos, aumentarán los niveles de producción, la

Establecimiento (MS + 1 mg.L-1 BAP)

Multiplicación de material irradiado M1V1 – M1V3 (MS + 3,5 mg.L-1 BAP +

1,5 mg.L-1 Kin)

Multiplicación en CRAS 60 días

Aclimatización

Selección de plantas "plus"

Evaluación en campo II y III Ciclos. 24 ‘INIVIT PV 06 30’Selección en campo (I

ciclo) 12 meses

Propagación en CRAS

60 días 30 días

Extracción de ápices meristemáticos

(2,0-3,0 mm) Enraizamiento M1V4(MS) 30 días

30 días

30 días

45 días

Formación de yemas múltiples (MS + 3,5 mg.L-1 BAP + 1,5 mg.L-1



satisfacción de las necesidades, así como las demandas de este cultivo de vital

importancia económica.

Conclusiones


5. CONCLUSIONES

1. Fue posible seleccionar la dosis letal media de 45 Gy con fuente de 60Co tomando

como base la curva dosis efecto.

2. El empleo de radiaciones ionizantes (60Co) en ápices meristemáticos del plátano

vianda cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) permitió seleccionar tres mutantes de porte bajo (‘Z

30’, ‘Z 30A’ y ’Z 13’) (2,26; 2,27 y 2,18 m de altura).

3. Las evaluaciones de campo durante tres ciclos permitieron seleccionar un mutante

‘INIVIT PV 06 30’ de bajo porte, ahijamiento ordenado y rendimiento agronómico

similar al cultivar de plátano vianda ‘Zanzíbar’.

Recomendaciones


6. RECOMENDACIONES

1. Evaluar los cultivares ‘INIVIT PV 06 30’,’INIVIT PV 06 13’ e ‘INIVIT PV 06 30A’ en

diferentes condiciones edafoclimáticas del país

2. Generalizar en la producción, el cultivar ‘INIVIT PV 06 30’ en diferentes áreas de

producción del país

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Tesis de Maestría

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Indice

Tesis de Maestría

1. INTRODUCCIÓN......................................................................................................................... 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...................................................................................................... 4

2.1. Generalidades del cultivo ..................................................................................................... 4

2.1.1. Origen del género Musa ................................................................................................ 4

2.1.2. Sistemática y botánica del género Musa ...................................................................... 4

2.1.3. Anatomía y morfología .................................................................................................. 6

2.1.4. Importancia de los plátanos y bananos ........................................................................ 7

2.1.5. Principales problemas que afectan la producción de plátanos y bananos .................. 8

2.2. Clasificación de los plátanos (AAB) ..................................................................................... 9

2.2.1. Características del cultivar ‘Zanzíbar’ (AAB) ................................................................ 9

2.3. Cultivo de tejidos ................................................................................................................ 11

2.3.1. Micropropagación ........................................................................................................ 12

2.3.1.1. Organogénesis. Aspectos generales ...................................................................... 12

2.4. Mejoramiento Genético de Musa ....................................................................................... 15

2.4.1. Mejoramiento genético tradicional por cruzamiento ................................................... 15

2.4.2. Mejoramiento asistido por Biotecnología .................................................................... 16

2.4.3. Empleo de la mutagénesis en el cultivo in vitro.......................................................... 18

2.4.4. Radiosensibilidad de yemas adventicias y determinación de la dosis óptima del

agente mutagénico ................................................................................................................ 19

2.4.5. Evaluación de la variabilidad producida por la inducción de mutaciones .................. 20

3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................... 22

3.1. Determinación de la radiosensibilidad en ápices meristemáticos del cultivar

‘Zanzíbar’ (AAB) ........................................................................................................................ 25

3.2. Selección en campo de las plantas de porte bajo en el primer ciclo ................................ 27

3.3. Evaluación morfológica y agronómica de los mutantes seleccionados, durante el

segundo ciclo de producción en campo.................................................................................... 27

Indice

Tesis de Maestría


caracterización fenotípica en el tercer ciclo .............................................................................. 28

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 31

4.1. Determinación de la radiosensibilidad en ápices meristemáticos del cultivar.

‘Zanzíbar’ (AAB) ........................................................................................................................ 31

4.2. Selección en campo de las plantas de porte bajo en el primer ciclo ................................ 34

4.3. Evaluación morfológica y agronómica de los posibles mutantes seleccionados,

durante el segundo ciclo de producción en campo .................................................................. 38


caracterización fenotípica en el tercer ciclo .............................................................................. 44

5. CONCLUSIONES...................................................................................................................... 53

6. RECOMENDACIONES ............................................................................................................. 54

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................................ 55

Documents

Copia de Tesis completa 8-06