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Correlación entre el sistema vasotonérgico y comportamientos agonistas
de Betta splendens
Juan Alejandro Cano Moreno
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de Biólogo
Directora: Veronica Akle Álvarez, PhD.
Facultad de Medicina. Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia.
Codirector: Adolfo Amézquita Torres, PhD.
Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia
Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias. Departamento de Ciencias Biológicas
Bogotá, Colombia
2019
Correlación entre el sistema vasotonérgico y comportamientos agonistas
de Betta splendens
Juan Alejandro Cano Moreno
RESUMEN
La especie Betta splendens, o pez luchador, se caracteriza por ser territorial y
presentar comportamientos agonistas intensos y elaborados. Estas conductas son el reflejo de
una red cerebral compleja en las que intervienen moléculas neuromoduladoras, como la
arginina-vasotocina (AVT). Este neuropéptido homólogo a la oxitocina y vasopresina se ha
asociado con agresión y conductas de dominancia en los vertebrados no-mamíferos. En este
estudio se presenta la evaluación de una posible relación entre el comportamiento agonista
de B. splendens con la cantidad y distribución de neuronas del sistema vasotonérgico. Se
correlacionó el desempeño de los individuos en la prueba del espejo con la cantidad de
neuronas productoras de AVT, principalmente en la región hipotalámica. Se encontró que
existe una correlación moderada (60%) entre la cantidad de células que producen vasotocina
con la magnitud del despliegue de agresión en B. splendens. Se encontraron somas neuronales
inmuno positivas para AVT en el área preóptica del hipotálamo y fibras ampliamente
distribuidas por todo el tejido cerebral. Este trabajo presenta evidencia preliminar de la
relación entre el comportamiento del pez luchador y el sistema vasotonérgico.
Palabras clave: inmunohistoquímica, neuroanatomía, vasotocina, prueba de espejo.
INTRODUCCIÓN
La especie Betta splendens es un pez de agua nativo del sudeste asiático de la familia
Osphronemidae. En estado silvestre tienen un tiempo de vida de 1 año, aunque en cautiverio
pueden vivir hasta 5 años (Simpson, 1968). Gracias a la cría selectiva esta especie ha
desarrollado colores brillantes y es comercializada alrededor del mundo como pez
ornamental. Tienen la capacidad de respirar oxígeno del aire debido a su condición como
semipulmonado, entre otras adaptaciones propias del ambiente hostil en el que evolucionó la
especie (Hogan, 1967; Simpson, 1968).
El pez Betta es también llamado pez luchador por su bien documentado
comportamiento agonístico intenso y elaborado que usa para defender los territorios y
competir con sus conespecíficos por las hembras (Wallen, 1985; Galizio, 1985, Baenninger,
1984). Los machos muestran un dimorfismo sexual notorio con respecto a las hembras, son
ligeramente de mayor tamaño y poseen extensas y coloridas aletas que despliegan en
presencia de otro macho o para cortejar a una hembra en celo (Simpson, 1968). Las
competencias contienen determinados despliegues agonísticos en los cuáles se determina una
jerarquía social en el que los machos de mayor estatus copulan con las hembras y dominan
el territorio (Lyne, 2007; Simpson, 1968). Los machos, al percatarse de la presencia de su
conespecífico, despliegan el opérculo y las aletas, como se observa en la Figura 1. Los
estados de relajación equivalen a las aletas dorsal, caudal y anal (1A), y al opérculo (1B) en
posición regular. En posición agonística se destacan las aletas dorsal, caudal y anal
desplegadas en mayor área (1C) y el opérculo abierto perpendicular al cuerpo (1D). En
adición, los machos realizan ataques físicos, coletazos y mordiscos.
Figura 1. Fotografías del despliegue agresivo de B. splendens.
Estas conductas, su iniciación, mantenimiento y deserción esta codificada en una red
cerebral compleja en el que interviene una gran cantidad de moléculas neuromoduladoras
como la serotonina (Blanchard, 1991, Matter, 1998, Winberg 1993), dopamina (De Almeida,
2005) y, la del presente estudio, arginina-vasotocina (AVT).
El neuropéptido arginina-vasotocina (AVT) de los vertebrados no-mamíferos, así
como su homólogo arginina-vasopresina (AVP) de los mamíferos, se ha reportado como una
molécula involucrada en la agresión relacionada a territorialidad y comportamientos de
dominancia (Ferris & Potegal, 1988; 1989; Ferris et al., 1997; Hattori & Wilczynski, 2009).
Se ha reportado cómo la manipulación intracerebral de los niveles de AVT en campo median
comportamientos sociales en vertebrados. En peces se reportan diferentes efectos de AVT
sobre su conducta social. Inyecciones de AVT generan un incremento de su actividad
territorial y agresión (Salek et al. 2002; Carneiro et al. 2003; Santangelo & Bass 2006; Semsar
et al., 2001; Dewan & Tricas, 2011), o inhibe comportamientos sociales (Goodson & Bass
2000; Bastian et al. 2001; Lema & Nevitt 2004). En ranas de distintas familias se reporta que
AVT causa un incremento en la frecuencia de su canto agresivo, mecanismo principal de
delimitación y protección de su territorio (Ten, 2005; Ten & ul Han, 2012; Marler et al.,
1995; Boyd, 1995). Igualmente, se han hallado diferencias en los niveles de expresión de
AVT/AVP en un escenario de dominancia y subordinación para vertebrados (Greenwood et
al., 2008; Backström & Winberg, 2009; Hattori & Wilczynski, 2009).
Observaciones preliminares realizadas en el Grupo de Ecofisiología,
Comportamiento y Herpetología, y en el Laboratorio de Neurociencia y Ritmos Circadianos
de la Universidad de los Andes, la expresión de AVT en el cerebro, tanto para peces como
para anfibios, se ubica en el hipotálamo anterior (AH) y en el área preóptica (POA), aunque
se ha observado en otras regiones cerebrales como el tálamo y el epitálamo (Greenwood et
al., 2008; Hattori & Wilczynski, 2009). Estas áreas se conservan parcialmente entre el resto
de vertebrados (Maney et al., 1997; Eaton & Glasglow, 2008).
Este estudio describe la anatomía del sistema vasotonérgico en el cerebro de B.
splendens, así como una indagación preliminar de su relación con comportamientos
agonistas. Los objetivos principales son 1) describir la distribución del sistema vasotonérgico
en el cerebro de B. splendens y 2) identificar una relación entre el número de neuronas
inmuno-positivas para AVT y el característico comportamiento de agresión en B. splendens.
Se propone la hipótesis de que existe una correlación de tal manera que individuos que
muestren un mayor despliegue agresivo tendrán mayor cantidad de neuronas productoras de
AVT, principalmente con somas en la región hipotalámica, y con fibras esparcidas por toda
la matriz cerebral.
METODOLOGÍA
Animales
Se utilizaron 12 adultos macho de pez Betta provenientes de una misma tienda de
mascotas regular. Se trasladaron al invernadero de la Universidad de los Andes donde se
alojaron en peceras individuales y aisladas de 15cm x 15cm x 20cm (Alto, Ancho y Largo)
a temperatura de 23°C (±3°C) gracias a un calentador con termostato, pH 6.5-8, 2-4ppmDO2
sin oxigenación adicional y 100-200μS/cm de conductividad, basado en las necesidades de
la especie. Tuvieron un fotoperiodo de luz natural 12:12 durante los meses de septiembre y
octubre de Bogotá, Colombia (salida del sol a las 5:50am, y puesta del sol a las 5:45pm).
Fueron alimentados con 6 a 12 granos diarios de TetraBetta MiniPellets entre las 5:00pm y
8:00pm. El manejo de los animales fue avalado por el Comité de Uso y Cuidado Animal
(CICUAL) de la Universidad de los Andes por medio del FUA 19-024 de 2019.
Pruebas de comportamiento
Después de 15 días de aclimatación, se realizó la prueba del espejo. El montaje
consistía en una cámara que grababa desde una vista superior al individuo. Todo estaba
cubierto por un velo blanco, y el costado más próximo de la pecera con una lámina blanca
que evitaba cualquier contacto visual con el experimentador. El diseño experimental se
esquematiza en la Figura 2. El individuo se dejaba sin estímulo durante 10 minutos de
aclimatación (2A). Luego se iniciaba a grabar durante 10 minutos de los cuales 5 minutos
eran de control (sin estímulo, 2B) y 5 minutos de tratamiento (con estímulo, 2C). El espejo
permanecía tapado con un papel blanco hasta el momento de los 5 minutos de tratamiento,
cuando con una cuerda se destapaba para que el individuo pudiera ver su reflejo. Las variables
correspondientes fueron grabadas y cuantificadas: 1) tiempo con el opérculo abierto, 2)
cantidad de veces que el individuo abre el opérculo, 3) tiempo con las aletas desplegadas, 4)
cantidad de veces que el individuo despliega sus aletas, 5) cantidad de coletazos, 6) tiempo
dentro y fuera de la zona del espejo (mitad de la pecera más próxima y más alejada del espejo)
y 7) tiempo de inmovilidad. También se anotó la latencia de los primeros despliegues.
Figura 2. Diseño experimental.
Se grabó cada individuo 3 veces con intervalos de 5 días para un total de 3
repeticiones. Todas las grabaciones se hicieron entre las 9:00am y 12:00m. Se tomaron las
medidas multiparamétricas del agua de las peceras todos los días durante toda la
experimentación.
Preparación de la muestra
Los individuos fueron anestesiados con tricaína hasta que no se detectó respuesta a
estímulos mecánicos. Luego, se registró su peso y se les tomó fotografías para una posterior
eutanasia por decapitación. La cabeza se fijó en paraformaldehído (PFA 4% en PBS 1X)
durante por lo menos 48 horas hasta la disección de cerebro sobre PBS 1X. El tejido se
almacenó en una solución de 50% PFA (4%) y 50% sacarosa (30%) durante 24 horas, y en
solo sacarosa durante las 24 horas siguientes. Pasado este tiempo, el tejido fue embebido en
O.C.T (Sakura) y llevado a congelar a -80°C hasta el momento del corte.
Cortes.
Mediante un criostato (Tissue Tek-Cryo3 Sakura) se realizaron cortes coronales en
serie de todos los cerebros (10μm de grosor). Los cortes fueron ubicados en láminas
gelatinizadas en tres series con diferentes propósitos: 1) inmunohistoquímica con AVT, 2)
tinción de Nissl y 3) de reserva. De esta manera las secciones de cerebros en cada lámina
corresponden a 10um cada 30um. Los cortes fueron almacenados a -20°C hasta su respectiva
tinción.
Tinciones
Inmunohistoquímica con AVT. Las láminas fueron sumergidas en metanol (100%)
durante 2 minutos, y se dejaron secar durante 20 minutos. Se realizaron 4 lavados sobre un
un rocker con KPBS 0.05M por 10 minutos cada uno. Luego, las láminas se sumergieron en
Citrato de Sodio (SSC 10X), se llevaron a incubar a 55°C-65°C durante 2 horas y, pasado
este tiempo, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se realizaron 3 lavados
con KPBS 0.05M. Las láminas se sumergieron en anticuerpo primario (anti-AVT, 1:10.000)
donado por el profesor David Gray de la Universidad de Witwatersrand y se incubaron en
cuarto frío a 4°C durante 66 horas. Se realizaron 2 lavados con KPBS 0.05M. Luego, fueron
sumergidas en el anticuerpo secundario (donkey anti-rabbit ab6801, 1:1000) conjugado con
biotina, en incubación a oscuras sobre un rocker por 90 minutos. Se realizaron 2 lavados con
KPBS 0.05M. Luego, las láminas fueron incubadas en ABC solution (Kit ABC) durante 1
hora, en Acetato de Sodio (0.1M) durante 5 minutos, y en NiDAB durante 25 minutos. Por
último, 1 lavado de KPBS 0.05M y se dejó secar.
Tinción de Nissl. Se inició con lavados por inmersión con PBS y agua destilada.
Luego, se realizó la deshidratación con inmersiones en etapas con diferentes concentraciones
de etanol (50%, 75%, 95%, absoluto) y xileno absoluto al finalizar. Posteriormente, se
rehidrata retomando las mismas etapas de inmersión, pero en sentido contrario. Todas las
etapas se realizaron durante 2 minutos. Las láminas se sumergieron en Cresyl Violet (0,25%)
por 15 minutos. Para remover el exceso, se realizaron los mismos pasos de la deshidratación.
Por último, se aplicó una gota de Permount y se ubicaron laminillas.
Conteo y análisis estadísticos
Los cortes teñidos fueron observados en un microscopio óptico. Se hizo registro
fotográfico y se realizó anatomía comparada para determinar la distribución del sistema
vasotonérgico de B. splendens. Las neuronas discretas se contaron y se correlacionaron con
las variables extraídas de las pruebas de comportamiento. a partir de un análisis de
componentes principales se obtuvo un Aggression Score, el cual también fue correlacionado
con la cantidad de neuronas, y se evaluó la influencia de cada variable sobre el mismo.
RESULTADOS
Distribución del sistema vasotonérgico de B. splendens
El protocolo de inmunotinción y el anticuerpo primario anti-AVT donado por David
Gray de la Universidad de Witwatersrand, diseñado en el Herrerillo Común (Cyanistes
caeroleus), lograron una reacción exitosa con el neuropéptido producido por el cerebro de B.
splendens. De igual manera, Nissl tiñó correctamente todos los cuerpos celulares presentes
en la matriz cerebral. Las neuronas del sistema vasotonérgico están distribuidas desde el
telencéfalo (Figura 3A) hasta regiones posteriores del hipotálamo en el diencéfalo (Figura
3D). Mediante la comparación de los cuerpos celulares teñidos con Nissl y con anti-AVT
(Figura 4) fue posible la identificación de los núcleos vasotonérgicos principales en el cerebro
de B. splendens, diagramados en la Figura 3. Se encontró una cantidad reducida de cuerpos
neuronales AVT+ en los núcleos ventrales telencefálicos, los cuales son los más inferiores y
posteriores del telencéfalo, e indican el inicio del diencéfalo (Figura 3A). La conglomeración
neuronal AVT+ de mayor cantidad y relevancia se encontró en el área preóptica,
específicamente en el núcleo preóptico parvocelular y en el núcleo preóptico magnocelular
(Figura 3A). Estas se caracterizaron por su gran tamaño y prominencia en el tejido (Figura
4C), comparado con las que se encontraron en regiones anteriores (Figura 4A-B). Hubo
presencia, también, de algunas neuronas AVT+ en núcleos talámicos. (Figura 3C). La
presencia de estas neuronas AVT+ continúa a lo largo de todo el diencéfalo hasta una ínfima
cantidad en regiones cercanas al cerebelo (Figura 3D). Todos los cuerpos celulares AVT+ se
encontraron en regiones mediales del cerebro. Por otro lado, las fibras AVT+ predominaron
en regiones periféricas, especialmente en la zona de tractos (Figura 3B-C), aunque estuvieron
distribuidas por toda la matriz cerebral. Las fibras provenientes de las neuronas AVT+ de los
diferentes núcleos del área preóptica son conducidas a la zona periférica de tractos, como se
puede observar en la Figura 4C. Por último, la hipófisis se reconoce como contenedor
relevante de AVT+. (Figura 4D).
Asociación entre el comportamiento de B. splendens con la expresión de AVT
De los 12 individuos iniciales solo se obtuvo información confiable de 5, por lo tanto,
el n de este estudio es 5. Para todas las correlaciones se obtuvo una tendencia positiva en el
que individuos que tuvieron mayor cantidad de neuronas AVT+ mostraron un despliegue
más agresivo en la prueba del espejo. Los individuos con mayor cantidad de neuronas AVT+
contadas (54 y 32) fueron los que tuvieron una calificación más alta en todas las variables de
agresión. Por otro lado, individuos con menor cantidad de neuronas AVT+ (0, 23, 25)
tuvieron una calificación más baja en todas las variables de agresión. El individuo al que no
se le logró observar ninguna neurona AVT+ fue el que menos despliegue agresivo demostró
en la prueba del espejo. El mayor R2 se obtuvo en la variable de tiempo de actividad agresiva
(Figura 5B), que consistió en el inverso del tiempo en el que no realizaban comportamiento
amenazante frente al espejo. Por otro lado, el menor R2 se obtuvo con la variable de coletazos
(Figura 5C). Se obtuvo resultados similares para las variables de tiempo de apertura del
Abreviaciones. BO: Bulbo olfatorio; CE:
Cerebelo; H: Hipotálamo; Hab: Habénula; HT:
Hipotálamo; I/Vm/Vl: Núcleos talámicos; IL:
Lóbulo inferior; MO: Médula oblongada; OL:
Lóbulo óptico; PGZ: Zona gris periventricular
del tectum óptico; PM: Núcleo preóptico
magnocelular; POA: Área preóptica; PPa/PPp:
Núcleo preóptico parvocelular; Tel:
Telencéfalo; Teo: Tectum óptico; Vs/Vp:
Núcleos ventrales telencefálicos.
Figura 3A-D. Ilustraciones de la distribución de vasotocina de B. splendens. En paralelo y a la derecha de
cada diagrama se identifica el nombre de las respectivas regiones cerebrales. Puntos gruesos indican presencia
de neuronas AVT+. EL esquema indica la altura de cada uno de los cortes. Con respecto a la región POA, el
diagrama 3A representa la zona más anterior, y el diagrama 3C representa la región más posterior. De igual
manera, el diagrama 3B y 3D indican la región más anterior y posterior del hipotálamo, respectivamente.
A B
C D
Figura 4A-D. Fotografías de los cortes de cerebro de B. splendens. Imagen principal 10X y aumentos 40X.
Tinción de Nissl (izquierda) y Anti-AVT (derecha). Cada fotografía fue tomada a la misma altura que la de su
pareja. El esquema indica la altura de cada uno de los cortes. EL brillo y contraste de las imágenes fue ajustada
mediante Adobe Photoshop Software (USA). Escala 10X = 200μm. Escala 40X = 30μm.
Figura 5A-E. Resultados de las correlaciones entre la
cantidad de neuronas AVT+ con el comportamiento
agonista. Relación entre la cantidad de neuronas AVT+
de cada individuo (n = 5) con su Aggression Score obtenido
en cada día de experimentación (5A). Igualmente, el
tiempo en el que los individuos realizaron actividad
agresiva (5B), abrieron el opérculo (5D) y desplegaron las
aletas (5E) en un total de 5 minutos, así como la cantidad
de coletazos ejecutados (5C). Puntos amarillos indican Día
1, verdes indica Día 2, naranjas indica Día 3; color
combinado indica sobrelapamiento de días. Cada conjunto
vertical de tres puntos representa los resultados obtenidos
para un solo individuo en los tres días de experimentación. La cantidad de neuronas discretas AVT+ que se contaron
en cada individuo fueron, a su orden: 0, 23, 25, 32 y 54. La
línea de tendencia y el R2 obtenido para cada variable
correlacionada con las neuronas AVT+ se muestra en cada
gráfica. P-Value < 0.05 para todas las correlaciones.
opérculo (Figura 5D) y despliegue de las aletas (Figura 5E), en lo que, nuevamente,
individuos con mayor cantidad de neuronas tuvieron mayor calificación de agresión. La
unificación de todas las variables a un solo Aggression Score no diverge de los resultados
anteriores y logra resumir los resultados de esta asociación (Figura 5A). Gracias al análisis
de componentes principales se definió la variable Tail beats como la que tenía menor
influencia en el Aggression Score, sin embargo, no tuvo la suficiente divergencia estadística
como para ser descartada.
n = 5
DISCUSIÓN
En este estudio se logró describir una correlación moderada entre la cantidad de
células que producen vasotocina con la magnitud del despliegue agresivo de B. splendens.
Con un R2 de 0.6 aproximadamente se puede decir que hay una correlación presente, pero
baja. Sin embargo, la tendencia es positiva de tal modo que los individuos que tuvieron un
despliegue de agresión alto en la prueba del espejo fueron también los que tienen más
neuronas AVT+. Por otro lado, individuos que se caracterizaron por tener bajo despliegue de
agresión en la prueba del espejo fueron, a su vez, individuos con poca o ninguna neurona
AVT+. Esto permite tener evidencia preliminar de que la arginina-vasotocina podría
constituir un correlato neurofisiológico del comportamiento agonista característico de esta
especie. No se encontraron diferencias interespecíficas en cuanto a la distribución de las
neuronas AVT+, por lo que se podría sugerir que el posible correlato neurofisiológico con el
comportamiento agonista estaría dado por la cantidad de neuronas AVT+, y no por su
ubicación.
Dentro de las variables utilizadas en la prueba de comportamiento, la variable Tiempo
de actividad agresiva fue la que mejor se correlacionaba con la cantidad de neuronas AVT+.
Esta variable era equivalente al inverso del tiempo en el que no se encontraba agresivo y no
realizaba ningún tipo de despliegue. Por otro lado, la variable Tail beats fue la que menos
correlación obtuvo con la cantidad de neuronas AVT+, así como la variable de menor
influencia en el análisis de componentes primarios. Se hipotetiza, basado en observaciones,
que este tipo de comportamientos son ejecutados solo cuando el individuo alcanza niveles
muy altos de agresión. Los coletazos han demostrados ser fieles indicadores de la calidad del
macho, más no necesariamente como buenos predictores de la conducta de dominancia
(McGregor, 2001). De igual manera, a diferencia de los otros comportamientos, los coletazos
aumentan en frecuencia cuando hay presencia de una hembra que intensifique la conducta
agresiva (Doutrelant, 2001). Las variables de tiempo de apertura del opérculo y tiempo de
despliegue de las aletas son utilizadas muy frecuentemente para estudios de agresión en B.
splendens (Lynn, 2007; Wallen, 1985; Galizio, 1985, Baenninger, 1984), y brindaron
información significativa en nuestro estudio. Las variables de tiempo dentro y fuera de la
zona del espejo describían el tiempo que el individuo pasaba en un tercio del área más
próxima al espejo y en los dos tercios más lejanos restantes. Esta información no fue
significativa como indicador de agresión debido a que no hubo diferencias entre ningún
individuo, por lo que no se tuvo en cuenta.
Este estudio consiste en el primer reporte de la distribución del sistema vasotonérgico
en B. splendens. Como se esperaba, se da soporte a la noción de que este sistema es
ampliamente conservado en los vertebrados (Wilczynski, 2017; Goossens, 1977; Cumming,
1982). La gran mayoría de neuronas AVT+ se encontraron en el hipotálamo, especialmente
en el área preóptica. Esto probablemente debido a la relevancia de la vasotocina como
modulador del sistema hipotálamo-hipofisiario. Algunas pocas neuronas AVT+ fueron
encontradas en zonas anteriores telencefálicas. No hubo presencia de neuronas AVT+ en
zonas posteriores en ningún individuo. Las neuronas AVT+ de mayor prominencia y tamaño
fueron las encontradas en el área preóptica del hipotálamo. En regiones aledañas
hipotalámicas su tamaño era inferior. Las fibras AVT+ se distribuyen por gran parte del
cerebro, fueron encontradas desde el telencéfalo hasta la médula, y se observó una ligera
tendencia a que estuvieran ubicadas en las zonas periféricas de la matriz cerebral. Aquellas
de mayor relevancia fueron las que provenían de las neuronas AVT+ de gran tamaño
ubicadas en el área preóptica, como se observa en la figura 4B y 4C. Estas fibras se dirigían
hacia la región inferior periférica de la matriz cerebral, la cual, a esta altura del cerebro, se
caracteriza por ser una zona con alta presencia de tractos y axones que se distribuyen a lo
largo de todo el axis antero-posterior del cerebro. Por último, en la hipófisis hubo una gran
cantidad de AVT+, como se observa en la parte inferior de la figura 4D. Esto tiene mucho
sentido en tanto la hipófisis es una bolsa de almacenamiento de vasotocina (Van den Dungen,
1982).
Estudios previos en el cerebro de la trucha arcoíris (Salmo gairdneri) se reconoce
una alta concentración de cuerpos celulares AVT+ en el área preóptica del hipotálamo, con
algunos pocos en zonas telencefálicas y otras zonas del diencéfalo (Van den Dungen, 1982).
Esto demuestra cierta similitud con la distribución del sistema vasotonérgico de B. splendens.
Resultados similares fueron encontrados en tres especies de dendrobátidos donde la mayor
parte de cuerpos celulares AVT+ se encontraron en el área preóptica del hipotálamo y otras
áreas del diencéfalo (Pulido, 2018). En el pez dorado (Carassius auratus) se encontraron
cuerpos celulares AVT+ exclusivamente en el área preóptica, especialmente en el núcleo
parvocelular y magnocelular (Cumming, 1982), lo que muestra una diferencia con B.
splendens y S. gairdneri, cuyos cuerpos celulares fueron encontrados en otras regiones. A
pesar de esto, en las tres especies se identifica la presencia de fibras AVT+ por toda la matriz
cerebral.
El anticuerpo primario anti-AVT donado por el profesor David Gray de la
Universidad de Witwatersrand fue inicialmente diseñado en un ave (Cyanistes caeroleus).
De igual manera, estudios del Laboratorio de Neurociencia y Ritmos Circadianos de la
Universidad de los Andes demostraron su reacción con el neuropéptido producido por tres
especies de ranas de la familia Dendrobatidae: Ameerega trivittata, Allobates femoralis y
Allobates trilineatus (Pulido, 2018). Nuevamente, esto podría sugerir que el neuropéptido y
su receptor se encuentran altamente conservados a través de los vertebrados.
Por último, de los 12 individuos iniciales solo se logró extraer información relevante
y confiable de 5 de ellos por pérdida mecánica del tejido durante los procesos de corte e
inmunotinción. Por tanto, el n de este estudio fue de 5. Es necesario aumentar el tamaño
muestral con el fin de evaluar las consistencias de la posible correlación que en este estudio
se plantea, indagar en posibles diferencias entre individuos y dar mayor poder a los
estadísticos. Sin embargo, la especie B. splendens, a pesar de ser un modelo para estudios de
comportamientos agonistas por la fácil observación y cuantificación del comportamiento
agresivo, se propone también como una especie ideal para investigación dirigida a indagar
correlatos neurofisiológicos de la agresión, incluyendo la arginina-vasotocina.
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