Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos

5/7/2018 Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos - slidepdf.com

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Influencia del ritmo circadiano en la sustantividad in vivo de la clorhexidina

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RESUMEN

Se evaluó la sustantividad in vivo de la clorhexidina al 0,2% sobre la saliva

y la placa bacteriana, diferenciando entre 2 momentos de aplicación (diurna vs

nocturna), mediante microscopía de epifluorescencia y de láser confocal.

Nuestros resultados corroboran el mayor dinamismo fisiológico de la flora

salival y la posible función reservorio asociada a la estructura de la placa " de

novo ".




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INTRODUCCIÓN

El estudio de la actividad antibacteriana in vivo de un antiséptico implica el

análisis de su efecto inmediato y de su sustantividad. La sustantividad se define

como la adherencia prolongada del antiséptico a las superficies orales (dientes

y mucosas) y su liberación lenta a dosis eficaces que garanticen la persistencia

de su actividad antimicrobiana (Manau y Guasch, 2003 ). Numerosos autores

demostraron que la Clorhexidina (CHX) provoca el mayor efecto antibacteriano

inmediato y presenta la mayor sustantividad in vivo en comparación a otros

antisépticos empleados en la cavidad oral (Moran et al, 1992; Jenkins et al,

1994; Elworthy et al, 1996; Balbuena et al, 1998 ). Por ello, en la mayoría de los

estudios microbiológicos más recientes, la CHX al 0,12% o al 0,2% se aplica

como control positivo, para analizar los resultados obtenidos con otros

principios activos sobre diferentes ecosistemas orales (Fernandes-Naglik et al,

2001; Rosin et al, 2002; van der Mei et al, 2006 ).

Sin embargo, actualmente existen aspectos asociados a la actividad

antibacteriana de la CHX que no están suficientemente investigados. Se ha

demostrado que la retención de la CHX en la cavidad oral depende no sólo de

la naturaleza del producto, sino también de factores intrínsecos asociados al

antiséptico (como la concentración, el tiempo y la temperatura) y de factores

extrínsecos (como la presencia de dientes, prótesis dentarias o materia

orgánica, el pH salival, así como la ingesta de comida o bebida) (Bonesvoll et

al, 1974; Bonesvoll y Olsen, 1974; Tsuchiya et al, 1999), lo que podría

condicionar su actividad antibacteriana. Hasta el momento, pocos autores han

estudiado la actividad antibacteriana in vivo de una única aplicación de CHX




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sobre el ecosistema oral, analizando la influencia de factores intrínsecos y

extrínsecos al enjuague (König et al, 2002; Caballero et al, 2009).

Desde hace varias décadas, la determinación de los recuentos

bacterianos salivales representa una prueba aceptada por la comunidad

científica para investigar el efecto antibacteriano in vivo de la CHX (Addy y

Moran, 1997; Sekino et al 2003 ), siendo considerada predictora de su

sustantividad (Roberts y Addy, 1981; Addy et al, 1989; Jenkins et al, 1994) y de

su actividad antiplaca (Jenkins et al, 1990 ). A partir de los primeros resultados

aportados por Schiött et al en 1970 (Schiött et al, 1970 ), existen numerosos

estudios en la literatura en los que se evaluó la sustantividad de la CHX sobre

la flora salival (Moran et al, 1992; Jenkins et al, 1994; Elworthy et al, 1996;

Balbuena et al, 1998 ).

Se demostrado en investigaciones in vitro que el biofilm dental presenta

una mayor resistencia a los agentes antibacterianos como consecuencia de un

ritmo lento de crecimiento, de la dificultad para penetrar su estructura y de la

posible inactivación del agente en su interior (Wood et al, 2000 ). Por

consiguiente, el otro nicho ecológico oral sobre el que se ha estudiado

ampliamente la actividad antibacteriana in vivo de la CHX es la placa

bacteriana (König et al, 2002; Arweiler et al, 2002; van der Mei et al, 2006;

García-Caballero et al, 2008 ).

En la mayoría de las series publicadas, la determinación de la actividad

antimicrobiana in vivo de la CHX en saliva se efectuó con técnicas

microbiológicas de cultivo en placa (Moran et al, 1992; Jenkins et al, 1994;

Elworthy et al, 1996; Balbuena et al, 1998; Tomás et al, 2008 ). Sin embargo,

hay autores que cuestionaron la fiabilidad de estas técnicas y propusieron




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como alternativa los métodos de fluorescencia que emplean fluorocromos

específicos para el marcaje de bacterias viables y no-viables (Weiger et al,

1998; Caballero et al, 2009; Tomás et al, 2009 ).

Existen estudios recogidos en la literatura en los que la determinación de

la actividad antimicrobiana in vivo de la CHX sobre la placa dental se efectuó

con técnicas microbiológicas de cultivo en placa (Rosin et al, 2001; Rosin et al

2002 ). Sin embargo, desde que Netuschil en 1983 (Netuschil, 1983 ) aplicó por

primera vez las técnicas de fluorescencia para la investigación del biofilm

dental, numerosos autores utilizaron estos métodos para evaluar el efecto

antibacteriano in vivo de la CHX sobre la placa (König et al, 2002; Arweiler et

al, 2002; van der Mei et al, 2006; Arweiler et al 2006). Un aspecto metodológico

común en todas estas series es que la placa bacteriana evaluada es

previamente removida de la superficie dentaria (König et al, 2002; Arweiler et

al, 2002; van der Mei et al, 2006; Arweiler et al 2006), lo que implica un análisis

inadecuado de la acción in vivo de la CHX sobre la estructura del biofilm dental

(Arweiler et al, 2002; Arweiler et al, 2004; Watson et al, 2005 ). Por

consiguiente, con el propósito de mejorar la metodología de este tipo de

trabajos, algunos autores diseñaron aparatos removibles especiales que

incorporaban diferentes discos sobre los que se producía el crecimiento del

biofilm dental (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001; Arweiler et al, 2004;

Auschill et al 2005; García-Caballero el al, 2008 ). Posteriormente, estas placas

bacterianas “no desestructuradas” se analizaban mediante técnicas de

microscopía de láser confocal y soluciones de fluorescencia que permiten el

estudio simultáneo de la estructura tridimensional del biofilm y la evaluación de




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la viabilidad bacteriana (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001; Arweiler et al,

2004; Auschill et al 2005; García-Caballero et al, 2008 )

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sustantividad in vivo de un

único enjuague de digluconato de CHX al 0,2% sobre la flora salival y la placa

bacteriana “no desestructurada”, diferenciando entre 2 momentos de aplicación

(enjuague diurno vs enjuague nocturno). La metodología implicó la aplicación

de técnicas de microscopía de epifluorescencia, de microscopía de láser

confocal y la solución de tinción dual LIVE/DEAD® BacLight™.

MATERIAL Y MÉTODOS

Selección del grupo de estudio

El grupo de estudio lo conformaron 5 voluntarios adultos con edades

comprendidas entre los 20 y 45 años que presentaban un buen estado de salud

oral: mínimo de 24 dientes permanentes, sin evidencia de gingivitis ni

periodontitis (Community Periodontal Index score= 0) (World Health

Organisation, 1997 ), y ausencia de caries. Los criterios de exclusión aplicados

fueron: fumar, ser portador de prótesis dentales o aparatos ortodóncicos, haber

recibido antibióticos o utilizar de forma rutinaria antisépticos orales durante los

últimos 3 meses, y padecer alguna enfermedad sistémica que provoque una

alteración en la producción y/o la composición de la saliva. Previamente al

inicio del estudio, a todos los voluntarios se les efectuó una tartrectomía.

Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de

Medicina y Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela. En

todos los casos se obtuvo por escrito el consentimiento informado de los

participantes en el estudio.




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Confección de la férula porta-discos

Considerando diversos modelos in vivo previamente descritos (Auschill et

al, 2004; Arweiler et al, 2004 ), a cada voluntario se le confeccionó una férula

individualizada de la arcada inferior para albergar 6 discos de cristal (5 mm de

diámetro, 1 mm de grosor) y pulidos a 4000 grid. Esta férula consta de 2

planchas de vinilo; la interna tiene 1 mm de grosor y es la que proporciona

retención y soporta los discos, mientras que la externa es de 0,5 mm de grosor

y está fenestrada para permitir el contacto de la superficie vestibular de los

discos con la saliva, a la vez que éstos se encuentran protegidos de la acción

de las mejillas y la lengua (Figura 1a). Se colocaron 3 discos en una

hemiarcada y los 3 restantes en la contralateral. El disco 1 o anterior se colocó

entre la porción distal del canino y la mesial del primer premolar; el disco 2 o

medio entre la distal del segundo premolar y la mesial del primer molar; el

disco 3 o posterior entre la distal del primer molar y la mesial del segundo molar

(Figura 1b).

Durante 48 horas, el voluntario portó la férula con los discos de cristal

para favorecer el crecimiento del biofilm bacteriano, retirándola de la cavidad

oral únicamente durante las comidas y para efectuar maniobras de higiene oral

(basadas exclusivamente en la remoción mecánica de la placa bacteriana sin el

empleo de ninguna pasta dentífrica o colutorio).

Aplicación del protocolo de clorhexidina

De cada voluntario, se recogieron muestras de saliva no estimulada (1 ml)

y se retiraron 2 discos de cristal de la férula (derecho e izquierdo; en dirección

mesio-distal) a las 8, 10 y 12 horas después de realizar bajo supervisión:




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1) Un único Enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%

(Oraldine Perio®, Pfizer, Barcelona, España) a las 7 a.m. (ENJ-CHX-diurno).

2) Un único Enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%

(Oraldine Perio®) a las 1 a.m. (ENJ-CHX-nocturno).

El día del experimento, a los voluntarios se les prohibió ingerir alimentos o

bebidas durante su transcurso. La recogida de las diferentes muestras salivales

y de placa bacteriana se realizaron: después del ENJ-CHX-diurno, desde las

4:00 p.m. (muestra de las 8 horas post-enjuague) hasta las 8 p.m. (muestra de

las 12 horas post-enjuague); después del ENJ-CHX-nocturno, desde las 9:00

a.m. (muestra de las 8 horas post-enjuague) hasta las 1 p.m. (muestra de las

12 horas post-enjuague). Aplicando un sistema de aleatorización equilibrada,

todos los voluntarios efectuaron los 2 enjuagues, estableciéndose un “período

de descanso” de 2 semanas entre las diferentes aplicaciones. Las muestras de

saliva no estimulada se recogieron aplicando métodos previamente descritos

(“spitting method”) (Navazesh y Christensen, 1982 ).

Preparación de la solución de fluorescencia

La solución de fluorescencia LIVE/DEAD® BacLight™ (Molecular Probes,

Leiden, The Netherlands) la componen 2 fluorocromos, SYTO-9 y yoduro de

propidio (YP), que al ser aplicados simultáneamente permiten diferenciar entre

bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) y bacterias con

membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) (Figuras 2a y 2b).

La solución de fluorescencia LIVE/DEAD® BacLight™ se preparó

siguiendo las recomendaciones del fabricante en 5 ml de agua estéril y filtrada

mediante un filtro de membrana Millipore (Millipore Ibérica S.A., Madrid,




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España), alcanzando una proporción 1:1 de ambos fluorocromos y se conservó

a -20 ºC. Las longitudes de onda de excitación (rango de emisión) para el

SYTO 9 y el YP son 488 nm (492-550 nm) y 561 nm (588-655 nm)

respectivamente.

Procesamiento de las muestras salivales

Las muestras de saliva se centrifugaron a 2000 rpm durante 6 minutos. El

sobrenadante se desechó y el pellet obtenido fue resuspendido en 100 l de

agua estéril. Después de agitar la suspensión bacteriana para homogeneizarla,

se mezcló con 100 l de la solución de fluorescencia y se almacenó en la

oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. La observación

microscópica la realizaron 2 investigadores que desconocían el diseño del

estudio, empleando un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japón)

equipado con un set de filtros para fluoresceína y Texas Red. El contaje debacterias viables y no-viables se realizó a gran aumento (100x) en 20 campos

microscópicos (10 campos por portaobjetos) que presentaban un mínimo de

100-150 bacterias, y se excluyeron los agregados bacterianos. Se calculó el

porcentaje medio de viabilidad bacteriana de cada muestra salival.

Procesamiento de las muestras de placa bacteriana

Los discos de cristal se retiraron de la férula e inmediatamente fueron

sumergidos en 100 l de la solución de fluorescencia y almacenados en la

oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. La observación

microscópica la realizó 1 investigador que desconocía el diseño del estudio,

empleando un microscopio Láser Confocal Espectral Leica TCS SP2 (Leica




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Microsystems HeidelberGmbH, Mannheim, Alemania) y el objetivo HCX APO L

63x/0,9 de inmersión en agua.

En la parte central de cada disco se evaluaron 4 campos o series xyz

seleccionados aleatoriamente. La emisión de fluorescencia se determinó en

series de imágenes xy, en las que cada imagen se correspondió con cada una

de las posiciones en z (en profundidad). Las secciones ópticas son escaneadas

en secciones de 1 µ desde la superficie del biofilm hasta la base del mismo,

determinándose el grosor máximo del campo y posteriormente el grosor

máximo del biofilm de la correspondiente muestra.

La cuantificación de la viabilidad bacteriana en series de imágenes xy se

determinó mediante el análisis del citofluorograma (Leica Confocal Software).

En este análisis las imágenes de cada fluorocromo se describen como

“canales” (SYTO 9 ocupa el “canal verde” y YP el “canal rojo”), obteniéndose

valores de área (µm2) ocupada por cada canal, el área total ocupada por biofilm

y el correspondiente porcentaje de viabilidad. Para el cálculo del porcentaje

medio de viabilidad bacteriana de cada campo se incluyeron las secciones con

un área mínima de biofilm de 250 µm2 y posteriormente se determinó el

porcentaje medio de viabilidad bacteriana del biofilm de la correspondiente

muestra.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron con el programa estadístico SPSS versión

15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Para el análisis intra- e inter-

observador, en la técnica de microscopía de epifluorescencia se determinó el

coeficiente de correlación intraclase (modelo de 2 factores, efectos aleatorios) y




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el grado de homogeneidad de los elementos mediante la perspectiva “acuerdo

absoluto”.

Los valores de las variables cuantitativas analizadas (“porcentaje de

viabilidad bacteriana”) mostraron una distribución normal; que se determinó

aplicando el test Kolmogorov-Smirnov. Se aplicó el test de ANOVA (modelo de

2 factores, ambos con medidas repetidas) y se efectuaron comparaciones por

pares (con el ajuste de Bonferroni) para el análisis intra- e inter-enjuague de la

viabilidad bacteriana en la flora salival y placa bacteriana, así como el análisis

de la viabilidad en cada tipo de enjuague (ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-

nocturno) entre ambos ecosistemas orales.

Se consideró estadísticamente significativo un valor de p< 0.05.

RESULTADOS

En la técnica de microscopía de epifluorescencia, en el análisis intra-

observador, los coeficientes de correlación intraclase fueron 0,937 (para el

observador 1) y 0,928 (para el observador 2); en el análisis inter-observador, el

valor de este coeficiente fue 0,916.

Tras la aplicación del ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-nocturno, los grosores

medios de biofilm detectados a las 8, 10 y 12 horas después de las

aplicaciones oscilaron entre 9-26 µm y 6-26 µm respectivamente.

En la tabla 1 se muestran los porcentajes de viabilidad bacteriana en la

flora salival y el biofilm detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar

una única aplicación de CHX al 0,2%, diferenciando entre el ENJ-CHX-diurno y

el ENJ-CHX-nocturno.




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En la flora salival, se detectaron diferencias estadísticamente significativas

en la viabilidad bacteriana en el análisis intra-enjuague (entre los diferentes

tiempos de recogida de las muestras) y el análisis inter-enjuague (entre el ENJ-

CHX-diurno y el ENJ-CHX-nocturno) (p= 0,025) (Tabla 2). En las

comparaciones por pares intra-enjuague, las frecuencias de bacterias viables

aumentaron con el transcurso del tiempo (8 horas vs 10 horas vs 12 horas),

tanto en el ENJ-CHX-diurno (las diferencias de medias oscilaron entre -9,00% y

-23,40%) como en el ENJ-CHX-nocturno (las diferencias de medias oscilaron

entre -15,60% y -32,60%), alcanzándose la significación estadística en la

mayoría de los contrastes (p= 0,001-0,020). En las comparaciones por pares

inter-enjuague, los porcentajes de bacterias viables obtenidos con el ENJ-CHX-

diurno fueron significativamente superiores a los detectados con el ENJ-CHX-

nocturno (las diferencias de medias oscilaron entre 24,80% y 34,00%; p=

0,000-0,005)

En el biofilm, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas

en la viabilidad bacteriana en el análisis intra-enjuague (entre los diferentes

tiempos de recogida de las muestras) ni en el análisis inter-enjuague (entre el

ENJ-CHX-diurno y el ENJ-CHX-nocturno) (Tabla 2).

En las figuras 3 y 4 se contrastan las prevalencias de viabilidad bacteriana

en la flora salival y biofilm detectadas a las 8, 10 y 12 horas después de

efectuar un ENJ-CHX-diurno y un ENJ-CHX-nocturno. En el ENJ-CHX-diurno,

la frecuencia de bacterias viables presente en la flora salival fue

significativamente superior a la observada en la placa bacteriana a las 8 horas

(56,40 vs 35,30%; p< 0,001) 10 horas (70,80 vs 34,39%; p= 0,001) y 12 horas

post-enjuague (79,80 vs 30,72%; p= 0,001). En el ENJ-CHX-nocturno, la




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frecuencia de bacterias viables presente en la flora salival fue

significativamente superior a la observada en la placa bacteriana a las 10 horas

(38,00 vs 28,57%; p= 0,044) y 12 horas post-enjuague (55,00 vs 28,95%; p=

0,008).

DISCUSIÓN

A partir del trabajo publicado por Schiött et al en 1970 (Schiött et al, 1970 ),

la comunidad científica asumió que: "La sustantividad de la CHX persiste hasta

las 12-14 horas después de su aplicación ". Sin embargo, son escasas lasseries en las que se realizaron determinaciones de la sustantividad in vivo de la

CHX sobre la flora salival o placa bacteriana posteriores a las 7 horas post-

aplicación de este antiséptico, en la mayoría de éstas se analizaron muestras

recogidas a las 24 horas post-aplicación (Addy y Wright, 1978; Dahlen, 1984;

Netuschil el 1989 ). Con la finalidad de aportar resultados a este respecto, en el

presente estudio se determinó la sustantividad in vivo de la CHX al 0,2% sobre

ambos ecosistemas (flora salival y placa bacteriana) a las 8, 10 y 12 horas

después de realizar un único enjuague con este antiséptico.

La solución de fluorescencia SYTO 9/YP detecta viabilidad bacteriana en

base a la integridad de la membrana citoplasmática, por lo que se ha

considerado especialmente útil para analizar la actividad antimicrobiana de la

CHX (Hope y Wilson, 2004; Filoche et al, 2007 ). Hasta el momento, la solución

SYTO 9/YP se ha aplicado sólo para estudiar la acción antibacteriana de la

CHX sobre el biofilm (Hope y Wilson, 2004; van Der Mei et al, 2006; Filoche et

al, 2007 ). Recientemente, nuestro grupo demostró que la microscopía de

epifluorescencia empleando la solución de tinción dual SYTO 9/YP es una

técnica eficaz para cuantificar la actividad antibacteriana de la CHX sobre la




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flora salival en “tiempo real” (Tomás et al, 2009 ). Al ser considerada una

técnica observador-dependiente (Tomas et al, 2009 ), resulta importante la

determinación de las correlaciones intra- e interobservador, cuyos valores en la

presente serie fueron >0,9.

Aunque algunos autores emplearon técnicas de epifluorescencia para el

análisis de la flora salival (Weiger et al, 1997; Weiger et al 1998; Ihalin et al,

2003 ), no hemos encontrado ningún trabajo en el que se aplicara la

microscopía de epifluorescencia y la solución SYTO 9/YP para evaluar la

actividad antimicrobiana in vivo de la CHX sobre la flora salival, por lo que la

comparación de nuestros resultados con los obtenidos por otros autores que

aplicaron técnicas de cultivo en placa debe ser interpretada con cautela.

Aplicando la microscopía de epifluorescencia y una solución de diacetato

de fluoresceína y bromuro de etidio, Weiger et al (Weiger et al, 1998 )

encontraron que aproximadamente el 85% de la flora salival es viable en

condiciones basales. Aunque en el presente estudio no se recogió una muestra

de saliva en condiciones basales, en estudios previos realizados por nuestro

grupo, observamos que el porcentaje de viabilidad bacteriana basal de la flora

salival es aproximadamente 90% (Tomás et al, 2009 ).

Los resultados obtenidos en diferentes estudios in vivo constataron que la

aplicación de un enjuague de CHX 0,2% (10 ml/1 minuto) se asociaba a un

efecto antibacteriano inmediato con una reducción de ≥90% (≥1 log10 UFC/ml)

en la concentración bacteriana salival con respecto a los valores basales

(Jenkins et al, 1991; Reynolds et al, 1991; Simonsson et al, 1991; Moran et al,

1992; Moran et al, 1995) y su sustantividad persistía como mínimo hasta las 7

horas post-aplicación, con una reducción ≥90% (≥1 log10 UFC/ml) (Jenkins et




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al, 1991; Reynolds et al, 1991; Moran et al, 1992; Moran et al, 1995) .

Resultados previos obtenidos por nuestro grupo con el empleo de la

microscopía de epifluorescencia y la solución SYTO 9/YP, revelaron que un

enjuague de CHX al 0,2% ocasionaba un descenso inmediato en el porcentaje

de bacterias salivales viables (≥90%) y que la actividad antimicrobiana aún era

detectable a las 7 horas post-aplicación (Cousido et al, 2006 ). En la presente

serie, la CHX al 0,2% ejerció una mayor actividad antimicrobiana, ya que en

comparación con los valores basales previamente descritos (Tomás et al,

2009 ), esta actividad persistió hasta las 12 horas post-aplicación con una

reducción de la viabilidad del 13% para el ENJ-CHX-diurno y del 38% para el

ENJ-CHX-nocturno. Probablemente estos resultados estén condicionados por

las férulas porta-discos que llevaban los participantes, ya que éstas pueden

favorecer la retención de la CHX como se ha demostrado en los pacientes con

prótesis removibles (Bonesvoll y Olsen, 1974 ) y por consiguiente potenciar su

efecto antibacteriano. A diferencia de los resultados obtenidos en estudios

previos basados en técnicas de cultivo en placa (Jenkins et al, 1991; Reynolds

et al, 1991; Moran et al, 1992; Moran et al, 1995), y coincidiendo con

investigaciones previas realizadas por nuestro grupo (Cousido et al, 2006;

Tomás et al, 2009 ), en la presente serie se detectó una recuperación

progresiva de la viabilidad bacteriana en las tomas salivales conforme se

incrementaba el número de horas transcurridas desde la realización del

enjuague con CHX (8 horas vs 10 horas vs 12 horas) estadísticamente

significativa en la mayoría de las comparaciones.

Se ha demostrado que la retención de la CHX en la cavidad oral esta

condicionada por factores extrínsecos asociados al enjuague (Bonesvoll y




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Olsen, 1974). Sin embargo, no hemos encontrado ninguno trabajo en la

literatura sobre la influencia del momento de aplicación del enjuague (día vs

noche) en la sustantividad in vivo de la CHX sobre la flora salival. En la

presente serie, el ENJ-CHX-diurno se asoció a una duración de la actividad

antimicrobiana sobre la flora salival significativamente inferior a la originada por

el ENJ-CHX-nocturno (las diferencias en los porcentajes de viabilidad

bacteriana oscilaron entre 34% a las 8 horas post-aplicación y 25% a las 12

horas post-aplicación). En nuestra opinión, la mayor sustantividad asociada al

ENJ-CHX-nocturno sobre la flora salival podría atribuirse al ritmo circadiano de

secreción salival, ya que está demostrado que durante el sueño se produce

una reducción significativa del flujo salival y su composición (Dawes, 1972;

Dawes, 2008 ). Como consecuencia, existe una disminución de los efectos

protectores de la saliva sobre la cavidad oral y simultáneamente un descenso

en el aporte de nutrientes, lo que condiciona directamente el crecimiento

bacteriano (Craig y Stitzel, 2003 ; Dawes, 2008).

Actualmente, la comunidad científica considera que la metodología más

adecuada para el estudio in vivo de la arquitectura y fisiología del biofilm dental

y del efecto antibacteriano de los antisépticos sobre esta estructura microbiana,

es la aplicación de la microscopía confocal junto con soluciones de

fluorescencia (Wood et al, 2000; Arweiler et al, 2004 ). Esta metodología precisa

que el biofilm a evaluar crezca previamente sobre determinados sustratos

incorporados a aparatos removibles de diferentes diseños (Wood et al, 2000;

Arweiler et al, 2004; Sreenivasan et al, 2004; Watson et al, 2005 ). En las series

publicadas, se utilizaron sustratos de distinta naturaleza como: discos de

esmalte humano (Netuschil et al, 1998; Wood et al, 2000; Auschill et al, 2001),




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de dentina bovina (Zaura-Arite et al, 2001) o de cristal (Netuschil et al, 1998;

Auschill et al, 2004; Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005 ). Dependiendo del

tipo de biofilm que se pretende analizar, el tiempo de permanencia en la

cavidad oral de los aparatos removibles es heterogéneo, oscilando entre las 6

horas (Zaura-Arite et al, 2001) y las 168 horas (Watson et al, 2005 ). Auchill et al

(Auchill et al, 2004 ) demostraron que el espesor medio del biofilm de 48 horas

no estaba condicionado por la localización del aparato removible en la cavidad

oral (maxilar superior vs mandíbula) ni por la del disco (distal vs mesial;

derecha vs izquierda). Aunque la rugosidad de la superficie y su energía libre

son considerados factores importantes para el crecimiento in vivo del biofilm

(Auschill et al, 2004 ), Netuschil et al (Netuschill, 1998 ) no detectaron grandes

diferencias en el espesor del biofilm de 48 horas al utilizar discos de esmalte y

de cristal. Igualmente, Arweiler et al (Arweiler et al, 2004 ) observaron que el

patrón de viabilidad bacteriana no estaba condicionado por la localización del

disco en la cavidad oral. En la presente serie, los aparatos removibles se

colocaron en la arcada inferior durante 48 horas; como soporte del biofilm se

utilizaron discos de cristal y en cada momento de recogida se procedió al

análisis de 2 discos (derecho e izquierdo; extraídos en dirección mesio-distal).

Centrándonos en las características de los biofilms de 48 horas, Auschill

et al (Auschill et al, 2004 ) y Arweiler et al (Arweiler et al, 2004 ) señalaron la

elevada heterogeneidad interindividual existente en los valores de espesor

máximo y viabilidad bacteriana, que oscilaron entre 14-150 µm y 64-77%

respectivamente. Diferentes autores coinciden en atribuirle a este tipo de

biofilm un modelo de “arquitectura abierta” caracterizado por la presencia de un

complejo sistema de canales (Zaura-Arite et al, 2001; Auschill et al, 2004;




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Arweiler et al, 2004 ). Aunque estos parámetros no han sido evaluados en la

presente serie, los resultados obtenidos previamente por nuestro grupo en un

modelo in vivo de biofilm de 48 horas revelaron un espesor máximo de 20-51

µm y un porcentaje medio de viabilidad bacteriana del 80% (García-Caballero

et al, 2008 ).

Hasta el momento, no hemos encontrado ningún estudio en la literatura

que haya evaluado el efecto antibacteriano in vivo de la CHX al 0,2% sobre la

placa bacteriana “no desestructurada”. Recientemente, nuestro grupo evaluó el

efecto inmediato y la sustantividad in vivo hasta 7 horas después de la

aplicación de un único enjuague de CHX al 0,2% (10 ml/30 segundos) sobre el

biofilm intacto de 48 horas (García-Caballero et al, 2008 ). En contraste con la

viabilidad basal (80%), las frecuencias detectadas en las posteriores

determinaciones post-enjuague resultaron significativamente inferiores (a los 30

segundos= 4%, a la hora= 16%, a las 3 horas= 35%; a las 5 horas= 23% y a las

7 horas= 30%). En consonancia con estos resultados, en la presente serie, a

las 8 horas post-enjuague se detectó un porcentaje de viabilidad en torno al

30%, persistiendo este efecto antibacteriano constante hasta 12 horas después

de la aplicación de la CHX. A diferencia de lo que acontece en la flora salival,

en el biofilm no se detectó una recuperación progresiva del ecosistema ni

diferencias en la viabilidad entre los 2 tipos de enjuagues de CHX aplicados

(ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno). En contraste con el grosor medio del

biofim de 48 horas previamente descrito por nuestro grupo (García-Caballero et

al, 2008 ), en la presente serie estos valores fueron inferiores, lo que podría

sugerir un cierto “efecto anti-placa” después de un practicar un único enjuague

de CHX.




18

Aunque se ha afirmado que la actividad antibacteriana de la CHX sobre la

flora salival no es extrapolable a su acción sobre las bacterias presentes en la

placa bacteriana (Netuschil et al, 1989 ), la saliva representa un “medio de

diseminación” de los microorganismos orales de un nicho ecológico a otro

(Collaert et al, 1992 ). Sekino et al (Sekino et al, 2003 ) demostraron que la

concentración de bacterias salivales presentes después de la aplicación de

diferentes protocolos de CHX puede condicionar los niveles de placa

bacteriana durante las primeras fases de su formación. A pesar de la

interconexión existente entre ambos ecosistemas y la importancia de su

estudio, muy pocos autores han investigado simultáneamente la actividad

antibacteriana ejercida después de una única aplicación de CHX al 0,2% sobre

la saliva y otras biopelículas orales (Sreenivasan y Gittins, 2004; García-

Caballero et al, 2008 ). En consonancia con los resultados previos descritos por

nuestro grupo (García-Caballero et al, 2008 ), en la presente serie los

porcentajes de viabilidad bacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después

del ENJ-CHX-diurno y del ENJ-CHX-nocturno fueron significativamente

superiores en la flora salival que en la placa bacteriana.

CONCLUSIONES

La aplicación de un único enjuague de CHX al 0,2% ejerció una menor

sustantividad entre las 8-12 horas post-aplicación sobre la flora salival con

respecto a la observada en la placa bacteriana “no desestructurada” de 48

horas. En la flora salival, la viabilidad bacteriana se recuperó progresivamente y

estuvo condicionada por el momento de aplicación del enjuague, siendo más

eficaz la práctica de un enjuague nocturno. En la placa, la viabilidad bacteriana




19

se mantuvo constante hasta las 12 horas post-aplicación y no estuvo

condicionada por el momento de aplicación del enjuague. Estos resultados

corroboran el mayor dinamismo fisiológico de la flora salival y la posible función

reservorio asociada a la estructura de la placa bacteriana "de novo ".




20

FIGURA 1a. Diseño de la férula doble porta-discos de cristal.

1- Férula interna en contacto con la arcada dentaria inferior.2- Disco de cristal.3- Férula externa fenestrada en el área de los discos.

FIGURA 1b. Imagen clínica de la férula doble porta-discos de cristal.

D1 (Disco 1): Colocado entre la porción distal del canino y la mesial del primer premolar.D2 (Disco 2): Colocado entre la porción distal del segundo premolar y la mesial del primer molar.D3 (Disco 3): Colocado entre la porción distal del primer molar y la mesial del segundo molar.

D1

D2

D3

1

2

3




21

FIGURA 2a. Bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) ybacterias con membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) en la florasalival.

FIGURA 2b. Bacterias con membranas intactas (emiten fluorescencia verde) ybacterias con membranas dañadas (emiten fluorescencia roja) en la placabacteriana “de novo ”.




22

TABLA 1. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar una únicaaplicación de clorhexidina al 0,2%, diferenciando entre ENJ-CHX-diurno y ENJ-CHX-nocturno.

VIABILIDAD BACTERIANA EN SALIVA (%)

ENJ-CHX-diurno

(media ± d.t.)

ENJ-CHX-nocturno

(media ± d.t.)

8 horas post-aplicación



56,40 ± 10,26

70,80 ± 7,52

79,80 ± 6,22

22,40 ± 10,83

38,00 ± 11,64

55,00 ± 9,13

VIABILIDAD BACTERIANA EN PLACA BACTERIANA (%)

ENJ-CHX-diurno

(media ± d.t.)

ENJ-CHX-nocturno

(media ± d.t.)




35,30 ± 10,60

34,39 ± 8,46

30,72 ± 11,89

30,06 ± 7,34

28,57 ± 6,49

28,95 ± 8,17

ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 7 a.m.; ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundoscon CHX al 0,2% efectuado a las 1 a.m; d.t.= desviación típica.




23

TABLA 2. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar una únicaaplicación de clorhexidina al 0,2% (comparaciones por pares intra-enjuague einter-enjuague)

VIABILIDAD BACTERIANA EN SALIVA (%)

Diferencias entremedias

p

COMPARACIONES INTRA-ENJUAGUE CHX

ENJ-CHX-diurno: 8 horas vs 10 horas



ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 10 horas

ENJ-CHX-nocturno: 8 horas vs 12 horasENJ-CHX-nocturno: 10 horas vs 12 horas

-14,40

-23,40

-9,00

-15,60

-32,60-17,00

0,020

0,001

0,069

0,063

0,0050,008

COMPARACIONES INTER-ENJUAGUE CHX

8 horas: ENJ-CHX-diurno vs ENJ-CHX-nocturno



34,00

32,80

24,80

<0,001

0,005

0,003

VIABILIDAD BACTERIANA EN PLACA BACTERIANA (%)

Diferencias entremedias p

COMPARACIONES INTRA-ENJUAGUE CHX



ENJ-CHX-diurno 10 horas vs 12 horas




0,90

4,58

3,67

1,48

1,10

-0,37

1,000

1,000

1,000

1,000

1,000

1,000

COMPARACIONES INTER-ENJUAGUE CHX




5,24

5,82

1,77

0,191

0,396

0,780

ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2% efectuadoa las 7 a.m.; ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al0,2% efectuado a las 1 a.m.




24

FIGURA 3. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar un ENJ-CHX-diurno al 0,2%.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

8 HORAS 10 HORAS 12 HORAS

SALIVA

PLACA

ENJ-CHX-diurno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 7 a.m.

FIGURA 4. Porcentajes de viabilidad bacteriana en la flora salival y la placabacteriana detectados a las 8, 10 y 12 horas después de efectuar un ENJ-CHX-nocturno al 0,2%.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

8 HORAS 10 HORAS 12 HORAS

SALIVA

PLACA

ENJ-CHX-nocturno= Un único enjuague de 10 ml durante 30 segundos con CHX al 0,2%efectuado a las 1 a.m.

p< 0,001

p= 0,001 p= 0,001

p= 0,090p= 0,044

p= 0,008




25

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Crecimiento de Biofilm de Placa Dental en Fedula Con Discos