Crecimiento de la línea celular del cáncer del seno humano MDA

Crecimiento de la línea celular del cáncer del seno humano MDA-MB-231 en matrices sólidos de óxido de silicio (sol-gel)

Rubén Díaz Vázquez* y Dra. Lymari Fuentes Claudio*

*Departamento de Ciencias y Tecnología, Universidad Metropolitana

Las matrices sólidos de óxido de silicio (sol-gel) son utilizadas para diversas aplicaciones biológicas, desde encapsulación de proteínas hasta como un medio para desarrollar cultivos celulares debido a sus propiedades y características que la hacen un material estable, simple, versátil y perfecta para soporte para un crecimiento celular. La línea celular MDA-MB-231 es utilizada en diversas investigaciones por su característica de ser una célula invasora y adherente en estudios in vitro. En el laboratorio, se utilizará el sol-gel como un medio de soporte sólido tridimensional para la célula MDA-MB-231. Se espera que la célula crezca en el medio sol-gel, si hay crecimiento se determinará si el crecimiento es superficial o si crece internamente en el material. Se harán varias réplicas de cultivo para estudiar y analizar en diferentes periodos de tiempo (2, 24, 48 y 72 horas). Los datos muestran que en 24 horas y 48 horas se pueden ver microscópicamente crecimiento celular sobre el sol-gel.

Introducción

Las matrices sólidos de óxido de silicio (sol-gel) han sido tema de investigación para varios grupos tanto por sus propiedades inorgánicas como por su funcionalidad. Es un material que ha ayudado a evolucionar la química orgánica e inorgánica y se considera un campo que ha tenido mucho crecimiento en la química contemporánea.[1] Los materiales más comunes para el proceso son tetrametoxilano (TMOS) y tetraetoxilano (TEOS) porque son los que pueden llevar a cabo el proceso en condiciones moderadas. La línea celular del cáncer del seno humano MDA-MB-231 contiene unas propiedades invasoras y adherentes que la hacen una candidata perfecta para estudios in vitro. Se preparará el medio de cultivo y la matriz solida de óxido de silicio (sol-gel). El sol-gel debe estar un periodo de 10 días para que tenga las propiedades mecánicas adecuadas y excelente condiciones para llevar a cabo el experimento. Se añade las células al monolito ya preparado y se ponen en la incubadora con unas condiciones específicas para que el crecimiento se lleve a cabo, por periodos de 1 a 3 días. De cada periodo se

estudiará si el medio es adecuado para crecimiento, si lo es, se comparará el crecimiento entre periodos y se determinará si el crecimiento es superficial o si es interno.

Materiales y Métodos

Preparación de sol-gel

Para preparar el sol-gel se iniciará hidrólisis de TEOS añadiendo una solución acida acuosa, donde se formará dos fases. La mezcla resultante se pondrá en una sonificadora por una hora para obtener un sol monofásico. Luego se almacenará por 7 días a -20℃ . Para la formación de los monolitos, volúmenes iguales de sol y buffer de fosfato a pH 7.2 se mezclarán y se transferirán a unos pozos de un plato de cultivo no esteril , la solución se solidifica dentro de 2 minutos. Se enjuaga con agua deionizada, se añade buffer de fosfato y se almacena por 24 horas a 4℃ . Luego de ese periodo, se vuelve a enjuagar con agua y se añade más buffer de fosfato y se almacena por 10 días más a 4℃. Una vez el monolito este preparado, el mismo se colocará en el

plato de cultivo donde se añadirán las células. Y se colocan en la incubadora.

Fig 1. Reacción de TEOS para formar el monolito de sol-gel.

Imagen 1. Sol-gel ya formados para comenzar experimento.

Procedimientos Experimentales

Los sol-gels se colocaron en un plato de cultivo de 24 pozos. Se colocó un sol-gel por pozo, se añadió las células que se habían puesto a crecer días antes del comenzar el experimento. Las células fueron cultivados utilizando un medio de cultivo que se componía de alpha-MEM, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), antibiótico:antimiotico y NEAA (Non Essential Amino Acids); el

medio de cultivo es preparado a un pH de 7.4 y a 37℃ . En los pozos se prepararon con los periodos a analizarse que eran 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 horas, a cada tiempo se le añadió un grupo control para comparaciones.

Imagen 2. Plato de cultivo con sol-gel a diferentes tiempos y con los grupos control.

Imagen 3. Plato de cultivo con sol-gel (fondo del plato)

Los platos de cultivo se colocaron en la incubadora con unas condiciones de 37℃ y 5% de CO2. Cuando era el tiempo de analizar los sol-gels se miraron los pozos utilizando un microscopio invertido (Imagen 4.) y luego se contó cuantas células vivas o muertas se encontraban en los pozos con el sol-gel y los pozo de control que correspondía al tiempo que se analizaba utilizando un contador de células (Imagen 5.).

© Biophysical Chemistry laboratory (2011)

Imagen 4. Microscopio Invertido

Imagen 5. Contador de células.

Resultados y Discusión

Se miró bajo el microscopio los pozos que correspondían al tiempo de dos horas. Donde en la Imagen 6. podemos ver como a dos horas aun no se puede notar ningún tipo de crecimiento celular en el sol-gel, al igual que al ver la Imagen 7. en el pozo de control tampoco se puede ver un crecimiento celular a dos horas.

Imagen 6. Foto de sol-gel a dos horas bajo el microscopio.

Imagen 7. Pozo de control a dos horas bajo el microscopio.

Se decidió esperar 24 horas para volver a tomar imágenes del sol-gel para ver si había algún crecimiento celular. A las 24 horas se pudo notar un crecimiento celular en el sol-gel. La imagen tomada (Imagen 8.) muestra una célula fibroelástica sobre el sol-gel. El pozo control mostraba un número de células creciendo en el medio de cultivo. (Imagen 9.)

Imagen 8. Célula vista sobre el sol-gel a 24 horas.

Imagen 9. Células creciendo en el pozo control a 24 horas.

© Biophysical Chemistry Research Laboratory, SUAGM-UMET (2011)

Luego de haber mirado los pozos que correspondían al tiempo de 24 horas, se estudió los pozos de 48 horas, tanto los que contenían el sol-gel y los pozos control. Los pozos se miraron con el microscopio. En la imagen tomada (Imagen 10.) se puedo ver otra célula pegada al sol-gel. Lo que sí se puede notar es que hay un cambio morfológico en la célula comparando a la célula que se había visto a las 24 horas. El pozo control a 48 horas (Imagen11.) se notó más crecimiento celular al compararlo con el pozo control a 24 horas.

Imagen 10. Célula vista en el sol-gel a las 48 horas.

Imagen 11. Células en crecimiento en pozo control a 48 horas.

El último periodo para analizarse era el de 72 horas. Cuando se miraron los pozos que contenían los sol-gels, se notó que el medio de cultivo se había puesto de un color turbio comparando al color rosa que debe de tener. Al tomar la imagen del sol-gel en el

microscopio no se pudo ver ningún tipo de célula y el sol-gel no se podía distinguir. (Imagen 12.) Sin embargo, cuando se miró el pozo control en el microscopio se pudo ver un crecimiento de células mayor comparando con los periodos anteriores.

Imagen 12. Pozo del sol-gel a 72 horas.

Imagen 13. Pozo control a 72 horas.



Imagen 14. Comparación de resultados en diferentes tiempos.

Una vez se analizó cada uno de los pozos tanto los que contenían los sol-gel y los que eran de control, se contó cuantas células habían muertas y vivas en cada uno de los pozos para así comparar los números a diferentes periodos de tiempo. Primero, se contaron las células de los pozos con sol-gel a 2 horas (Gráfica 1.). En la gráfica podemos ver como en cada pozo el número de células viva es menor al número de células muertas. Esto se debe a que a dos horas aun las células no se han pegada tanto al plato como al sol-gel para uno poder determinar correctamente el número de células. La gráfica del grupo control no se muestra debido al porciento de viabilidad era demasiado de bajo.

1 2 3 41.00E+041.10E+052.10E+053.10E+054.10E+055.10E+056.10E+057.10E+05

Conteo de células a 2 horas (sol-gel)

Total

Vivas

Muertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 1. Conteo de células a dos horas (sol-gel)

El mismo procedimiento se realizó con los grupos sol-gel y control que correspondían a 24 horas. Al ver los resultados de la Gráfica 2. vemos como el número de células vivas aumentó en 24 horas al compararlas con la Gráfica 1. Pero, el número de células muertas también es mayor al compararlas con el número de células muertas a dos horas. Esto sucede también con la gráfica de conteo de células a 48 horas, donde vemos que el número de células vivas aumentó al compararlas con los demás tiempos estudiados anteriormente.(Gráfica 3.)

Cuando se analizó cuantas células habían en los pozos de 72 horas con el sol-gel, vemos en la grafica que el número de células vivas disminuyó al compararse con los demás tiempos, esto se debe a que el medio de cultivo se encontraba turbio, algo pasó durante el tiempo de 48 a 72 horas en la incubación que cambió el medio de cultivo a ese color. También hay que considerar un error introducido a la hora de contar la células y fue que cuando se intentaba sacar los sol-gel de los pozos con una espátula, accidentalmente se pudo haber raspado el fondo del plato provocando a que la células se murieron, es por eso que se ve un numero alto de muertas células en los pozos de todos los tiempos.



Control

Sol-Gel

2 hrs

48hrs

24 hrs

72 hrs

1 2 3 40.00E+00

5.00E+05

1.00E+06

1.50E+06


TotalVivasMuertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 2. Conteo de células a 24 horas

1 2 3 40.00E+00

1.00E+05

2.00E+05

3.00E+05


TotalVivasMuertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 3. Conteo de células a 48 horas

1 2 3 40.00E+001.00E+052.00E+053.00E+054.00E+055.00E+056.00E+05


Total

Vivas

Muertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 4. Conteo de células a 72 horas.

A continuación se presentan las graficas de los grupos control de los tiempos de 24, 48 y 72 horas. En los grupos control se pude ver como al pasar el tiempo, por lo menos de 24 a 48 horas como el número de células vivas aumentaba, a las 72 horas se encontró con el problema del medio cultivo color turbio el cual mató las células vivas en algunos de los pozos. (Gráficas 5-7)

1 2 3 40.00E+002.00E+054.00E+056.00E+058.00E+051.00E+061.20E+06

Conteo de células a 24 horas (control)

Total

Vivas

Muertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 5. Conteo de células (control) a 24 horas

1 2 3 40.00E+001.00E+042.00E+043.00E+044.00E+045.00E+046.00E+047.00E+048.00E+04


Total

Vivas

Muertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 6. Conteo de células (control) a 48 horas

1 2 3 40.00E+005.00E+041.00E+051.50E+052.00E+052.50E+05


Total

Vivas

Muertas

Pozos

Núm

ero

de cé

lula

s

Gráfica 7. Conteo de células (control) a 72 horas.

Notas

Este experimento se empezó un mes después de la fecha que se había establecido para comenzar, debido al corto tiempo que quedaba del semestre no se pudo repetir el experimento para mejorar los fallos o rediseñar el experimento. El uso de la espátula para remover los sol-gel de los pozos afectó en la parte experimental del conteo de células. De los resultados obtenidos, los mejores resultados los presentaron los tiempos de 24 a 48 horas donde se pudo apreciar un crecimiento de la célula en el sol-gel. Se desconoce la razón porque el medio de cultivo se encontró turbio en el periodo de 72 horas. Algo ocurrido durante la incubación de 48 a 72 horas es la única conclusión a la que podemos llegar.

Referencias

1. Tally Cohen, Jeanna Starosvetsky, Uta Cheruti and Robert Armon. 2010. Whole Cell Imprinting in Sol-Gel Thin Films for Bacterial Recognition in Liquids: Macromolecular Fingerprinting. Int.J.Mol.Sci.11,1236-1252

2. Lymari Fuentes, Jessica Oyola, Monica Fernandez and Edwin Quiñones.2004. Conformational Changes in Azurin from

Pseudomona aeruginosa Induced through Chemical and Physical Protocols. Biophysical Journal.Volume 87, 1873-1880

3. Kumiko Sakai-Kato and Keiko Ishikura. 2009. Integration of Biomolecules into Analytical Systems by Means of Silica Sol-Gel Technology. Analytical Sciences, Volume 25, 969-978

4. David Avnir, Thibaud Coradin, Ovadia Lev and Jacques Livage. 2005. Recent bio-applications of sol-gel materials. J. Mater. Chem., 2006, 16, 1013-1030

5. Product Data Sheet, MDA-MB-231/GFP Cell Line. 2009. Cell BioLabs, Inc.

6. Yew Hoong Cheah, Fariza Juliana Nordin, Rozie Sarip, Thiam Tsui Tee, Hawariah Lope Pihie Azimahtol, Hasnah M Sirat, Badrul Amini Abd Rashid, Noor Rain Abdullah and Zakiah Ismail. 2009. Combined xanthorrhizol-curcumin exhibits synergistic growth inhibitory activity via apoptosis induction in human breast cancer cells MDA-MB-231. http://www.cancerci.com/content/9/1/1

7. Yaqin Zhang, Leslie A. Rivera Rosado, Sun Young Moon, and Baolin Zhang. 2009. Silencing of D4-GDI Inhibits Growth and Invasive Behavior in MDA-MB-231 Cells by Activation of Rac-dependent p38 and JNK Signaling. The Journal Of Biological Chemistry. Vol 284, NO. 19, pp. 12956-12965.

8. Tim Eiseler, Heike Doppler, Irene K Yan, Steve Goodison and Peter Storz. 2008. Protein kinase D1 regulates matrix metalloproteinase expression and inhibits breast cancer cell invasion. http://breast-cancer-research.com/content/11/1/R13

9. Bouzid Menaa, Carlos Torres, Mar Herrero, Vicente Rives, Aaron R. W. Gilbert, and Daryl K. Eggers. 2008. Protein Adsorption onto Organically Modified Silica Glass Leads to a Different Structure tan Sol-Gel Encapsulation. Biophysical Journal:Biophysical Letters, L5-L53

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