Criopreservación. Dra Claudia Jimenez

Revisin__________________________________________________ Med._Vet._Zoot._58(II),_mayo__agosto_2011:_107-119

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1_Instituto_de_Reproduccin_Animal_de_Crdoba_(Argentina)._2_Clnica_ de_Reproduccin_Animal,_ Facultad_ de_Medicina_Veterinaria_ y_ de_Zootecnia,_Universidad_Nacional_de_Colombia,_sede_Bogot._Carrera_30_nro._45-03,_Bogot_(Colombia).

*Autor_para_correspondencia:[email protected].

CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VITRO

P. Rodrguez,1* C. Jimnez 2

Artculo recibido: 8 de octubre de 2010; aprobado: 9 de diciembre de 2010

RESUMENLa_criopreservacin_de_embriones_se_ha_venido_desarrollando_en_los_ltimos_aos_con_el_propsito_de_conservar_embriones_obtenidos_de_vacas_superovuladas._Las_investigacio-nes_han_continuado_su_desarrollo_y_se_han_dirigido_hacia_la_criopreservacin_de_oocitos_y_embriones_in vitro,_los_cuales_necesitan_diferentes_metodologas_para_lograr_una_su-pervivencia_aceptable._Por_consiguiente,_los_mtodos_tradicionales_de_criopreservacin_se_han_tenido_que_modificar_para_obtener_mejores_tasas_de_supervivencia_poscriopreser-vacin_que_sern_discutidas_en_esta_revisin.Palabras clave:_embriones,_biotecnologa,_criopreservacin,_embriones_producidos_in vitro.

CRYOPRESERVATION OF IN VITRO DERIVED EMBRYOS

ABSTRACTEmbryo_cryopreservation_techniques_have_developed_in_order_to_preserve_embryos_ob-tained_from_superovulated_cows._Research_has_followed_trying_to_cryopreserve_embr-yos_and_oocytes_manipulated_under_in vitro_conditions_due_to_the_low_survival_rates_obtained_with_traditional_cryopreservation_methods._The_different_methodologies_are_discussed_in_the_present_review.Key words:_embryos,_biotechnology,_cryopreservation,_in vitro_produced_embryos.

INTRODUCCIN

Durante_ los_ ltimos_ veinte_ aos,_ se_ ha_observado_ que_ la_ produccin_ de_ em-briones_ bovinos_ ha_ crecido_ de_ forma_progresiva,_ en_ especial_ en_ el_ rea_ de_ la_produccin_in vitro_(PIV),_lo_que_ha_he-cho_que_esta_se_convierta_en_una_tcnica_importante_ no_ solo_ en_ el_ mbito_ cien-tfico,_ acadmico,_ sino_ tambin_ en_ el_comercial._ Consecuentemente,_ esto_ ha_generado_ la_ necesidad_ de_ criopreservar_

los_ excedentes_ de_ embriones_ de_ dicha_produccin._Sin_embargo,_la_criopreser-vacin_de_embriones_producidos_in vitro_a_travs_de_los_mtodos_convencionales,_no_ ha_ alcanzado_ tasas_ de_ supervivencia_satisfactorias_(Vajta_2000)._Debido_a_sus_caractersticas_fsicas,_principalmente_en_la_membrana_donde_el_embrin_in vitro_presenta_una_mayor_cantidad_de_lpidos_que_ impiden_su_ fcil_ congelamiento,_ se_ha_ optado_ por_ el_ empleo_ de_ mtodos_

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alternativos_ como_ la_ vitrificacin._ Este_mtodo,_con_curvas_de_enfriamiento_su-periores_a_las_de_la_congelacin_conven-cional,_permite_la_reduccin_del_tiempo_de_exposicin_del_embrin_en_los_puntos_crticos_ de_ temperatura,_ con_ lo_ cual_ se_disminuyen_ los_ daos_ trmicos_ y_ me-cnicos_ causados_ durante_ la_ formacin_de_hielo,_ y_ se_ aumenta_ la_ viabilidad_de_los_ embriones_ posteriormente_ a_ su_ vi-trificacin_ (Lazar_ et_ l._ 2000;_ Vajta_ y_Kuwayama_ 2006;_ Mucci_ et_ l._ 2006)._No_obstante,_es_importante_resaltar_que_a_ pesar_ del_ alcance_ conseguido_ con_ es-tas_ tcnicas_hasta_hoy,_ an_ es_necesario_el_ desarrollo_ de_ nuevos_ mtodos_ y_ la_bsqueda_ de_ nuevas_ perspectivas_ que_optimicen_ la_vitrificacin_de_embriones_producidos_ in vitro._ La_ presente_ revi-sin_pretende_mostrar_ los_avances_en_el_rea_de_la_criobiologa,_en_especial_en_el_mtodo_de_vitrificacin,_que_constituye_hoy_en_da_la_principal_alternativa_para_la_criopreservacin_tanto_de_oocitos_como_de_embriones_producidos_.

Criopreservacin de embrionesCon_ el_ nacimiento_ del_ primer_ bovino_producido_ in vitro_ por_ Brackett_ et_ l._(1982),_la_tcnica_de_fertilizacin_in vitro_comenz_a_ser_reconocida_mundialmen-te;_sin_embargo,_su_estado_del_arte_haca_que_fuera_una_metodologa_an_restrin-gida_ al_ mbito_ experimental,_ adems_de_ que_ las_ condiciones_ de_mercado_ en_la_dcada_de_los_ochenta_y_noventa_res-tringan_su_aplicacin_comercial_ (Viana_y_Camargo_2007)._As_mismo,_la_intro-duccin_de_la_transferencia_de_embriones_in vitro_estimul_el_aumento_no_solo_de_la_produccin,_sino_tambin_de_la_distri-bucin_ de_ este_ tipo_ de_ embriones._ Sin_embargo,_en_algunos_pases_se_ha_incre-mentado_de_forma_cuantiosa_el_nmero_

de_embriones_producidos,_superando_el_nmero_de_receptoras,_creando_as_la_ne-cesidad_ de_ criopreservar_ los_ embriones_excedentes_ para_ su_ posterior_ comercia-lizacin_ alrededor_ del_mundo_ (Viana_ y_Camargo_2007;_Cutaia_y_B_2007).

Uno_de_los_principios_ms_importan-tes_de_ la_criopreservacin_de_embriones_es_ lograr_ su_ almacenamiento_ en_ condi-ciones_ de_ bajas_ temperaturas_ (-196C),_intentando_ mantener_ su_ integridad_ a_travs_de_la_remocin_del_mximo_volu-men_posible_de_agua_antes_de_su_congela-miento,_con_lo_cual_se_evita_la_formacin_de_ hielo_ (Seidel_ 1986)._ Dentro_ de_ los_mtodos_ms_ importantes_ para_ la_ crio-preservacin_se_encuentran_el_mtodo_de_congelacin_convencional_y_el_de_vitrifi-cacin._El_mtodo_de_congelamiento_fue_el_primero_en_ser_ introducido,_y_hoy_es_el_ms_ utilizado_ comercialmente_ (Vajta_2000)._ Su_ curva_ de_ congelacin_ lenta_permite_mantener_el_equilibrio_entre_los_factores_que_pueden_causar_dao_celular,_como_la_formacin_de_cristales_de_hielo,_la_ fractura_del_ embrin,_ el_ dao_ txico_y_ osmtico,_ as_ como_ las_ alteraciones_de_ las_ organelas_ intracelulares_ y_ del_ ci-toesqueleto_ (Vajta_ y_ Kuwayama_ 2006;_Dobrinsky_ 1996;_ Vanderzwalmen_ et_l._2002)._Durante_ este_procedimiento,_los_ embriones_ normalmente_ van_ a_ ser_equilibrados_ dentro_ de_ bajas_ concen-traciones_ de_ crioprotectores,_ en_ pajillas_de_ inseminacin_ de_ 0,25_ml,_ con_ tasas_de_ enfriamiento_ entre_ 0,3_ y_ 1C/min,_hasta_alcanzar_los_-30_a_-35C,_para_pos-teriormente_poder_ser_ sumergidos_en_el_nitrgeno_ lquido._ Por_ su_ parte,_ la_ vi-trificacin_ es_una_metodologa_definida_como_la_gelificacin_de_un_lquido,_pro-ducida_no_por_la_cristalizacin,_sino_por_una_ extrema_ elevacin_ de_ la_ viscosidad_durante_el_enfriamiento,_por_lo_cual_esta_


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es_ la_ nica_ tcnica_ de_ criopreservacin_que_ permite_ la_ eliminacin_ total_ de_ la_formacin_ de_ hielo,_ tanto_ en_ la_ clula,_como_en_el_medio_que_la_rodea_(Fahy_et_l._1984)._En_la_vitrificacin,_la_curva_de_enfriamiento_ es_ ms_ rpida_ (2500C/min)_y_necesita_de_la_presencia_de_crio-protectores_ms_concentrados,_que_per-mitan_la_formacin_del_llamado_estado_vtreo,_ que_ disminuye_ los_ daos_ qu-micos_y_mecnicos_causados_por_el_paso_entre_los_puntos_crticos_de_congelacin_(Dobrinsky_1996;_Martino_et_l._1996)._La_formacin_del_estado_vtreo_evita_tales_daos,_al_promover_la_distribucin_ini-ca_del_lquido_e_impedir_la_formacin_de_cristales_de_hielo_(Rall_y_Fahy_1985;_Arav_1992;_Kasai_2002).

Vitrificacin frente a congelamientoEl_ congelamiento_ convencional_ tiene_una_ ventaja_ comparativa_ frente_ a_ los_otros_ mtodos_ de_ criopreservacin,_ al_ser_ una_ metodologa_ que_ permite_ la_utilizacin_ de_ bajas_ concentraciones_ de_crioprotectores_ y_ permite_ la_ transferen-cia_directa_de_los_embriones_despus_de_la_ descongelacin_ (Volkel_ y_Hu_ 1992)._Sin_embargo,_su_habilidad_para_prevenir_la_formacin_de_hielo_intracelular_an_es_limitada,_adems,_los_resultados_in vitro_de_la_criopreservacin_de_embriones_han_sido_variables_(Hasler_et_l._1995;_Massip_et_l._1995;_Hochi_et_l._1996;_Kaidi_et_l._ 2001)_ y_menores_ en_ comparacin_ a_los_datos_obtenidos_en_embriones_in_vivo_(Alvarenga_ et_ l._ 2007;_Dinnyes_ y_Ne-dambale_2009).

La_razn_por_la_cual_existe_esta_varia-cin_ en_ la_ viabilidad_ de_ los_ embriones_producidos_in vitro,_en_comparacin_con_los_producidos_in_vivo,_es_probablemen-te_ por_ las_ caractersticas_ fsicas_ propias_del_primer_tipo_de_embriones,_que_hacen_

que_sean_ms_sensibles_a_bajas_tempera-turas_(Dinnyes_y_Nedambale_2009;_Ro-drigues_1996;_Vajta_1997)._Entre_dichas_caractersticas,_ se_ encuentran_ diferen-cias_no_ solo_morfolgicas_ sino_ tambin_fisiolgicas,_ como:_1)_ el_ aumento_ en_ el_nmero_de_vacuolas_(Shamsuddin_et_l._1992),_ 2)_ mayor_ fragilidad_ de_ la_ zona_pelcida_ (Duby_et_ l._1997),_3)_menor_compactacin_ embrionaria_ (Van_ Soom_et_ l._ 1992),_ 4)_ un_ menor_ nmero_ de_blastmeras,_sobre_todo_en_la_masa_celu-lar_interna_(Iwasaki_et_l._1990;_Rizos_et_l._2002),_5)_alteraciones_en_la_expresin_gnica_ (Niemann_ y_ Wrenzychi_ 2000;_Lazzari_ et_ l._ 2002;_ Rizos_ et_ l._ 2003;_Lonergan_et_l._2003),_6)_mayor_tasa_de_apoptosis_ (Pomar_ et_ l._ 2005)_ y_ 7)_ au-mento_en_el_alto_contenido_citoplasmti-co_de_lpidos_(Massip_et_l._1995).

Por_estas_razones,_y_en_especial_la_lti-ma,_se_ha_considerado_que_el_mtodo_de_congelacin_ convencional_ genera_ unas_tasas_ de_ viabilidad_ considerablemente_disminuidas_ en_ este_ tipo_ de_ embriones_(Pereira_ y_Marques_ 2008)._ El_ aumento_de_los_tiempos_de_exposicin,_debido_al_descenso_ progresivo_ de_ la_ temperatura_durante_el_congelamiento,_permite_que_el_embrin_permanezca_un_ tiempo_mayor_en_la_franja_de_temperatura_termotrpi-ca_de_la_transicin_de_los_lpidos_(16C-4C),_lo_cual_genera_un_mayor_dao_en_la_membrana,_afectndolo_considerable-mente_(Zeron_et_l._1999)._Mucci_et_l._(2006)_confirmaron_esta_observacin,_al_comparar_la_criopreservacin_de_embrio-nes_bovinos_producidos_in vitro;_por_me-dio_de_las_dos_metodologas,_los_autores_observaron_un_aumento_en_la_viabilidad_72_horas_despus_del_descongelamiento_de_los_embriones_que_fueron_conservados_por_medio_de_la_vitrificacin_(114/265;_43%),_en_comparacin_con_los_que_fue-


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ron_congelados_(33/275;_12%)._De_igual_forma,_ varios_ autores_ reportaron_ el_ au-mento_de_las_tasas_de_viabilidad_no_solo_in vitro,_sino_tambin_in_vivo,_despus_de_la_vitrificacin,_al_comparar_las_dos_me-todologas_(Hasler_et_l._1995;_Kaidi_et_l._2001;_Dinnyes_et_l._1995;_Reinders_et_l._1995;_Agca_et_l._1996;_Lane_et_l._1999;_Mezzalira_ et_ l._ 2004)._ Adems,_la_vitrificacin_es_una_ tcnica_que_ tiene_otras_ ventajas_ comparativas_ frente_ a_ la_congelacin_ tradicional,_ ya_ que_ utiliza_procedimientos_ms_simples,_no_necesi-ta_ de_ equipos_ costosos_ y_ requiere_ poco_tiempo_ para_ su_ realizacin_ (Baril_ et_ l._2001).

VitrificacinGracias_a_sus_posibles_efectos_benficos,_esta_ tcnica_ ha_ tomado_ gran_ impor-tancia_ en_ la_ criopreservacin_ no_ solo_de_embriones_ in vitro,_ sino_ tambin_de_oocitos_y_embriones_producidos_in_vivo._Sin_ embargo,_ desde_ el_ primer_ procedi-miento_realizado_con_xito_en_embriones_mamferos_ por_ Rall_ y_ Fahy_ (1985),_ la_vitrificacin_ha_sufrido_mltiples_modi-ficaciones,_ en_el_ intento_por_ simplificar_sus_ procedimientos_ y_ mejorar_ las_ tasas_de_ viabilidad._ Algunas_ de_ estas_ tienen_relacin_con_el_uso_de_diferentes_criopro-tectores,_sitemas_de_empaque_de_los_em-briones_u_oocitos_y_el_uso_de_nitrgeno_spercongelado.

CrioprotectoresVarios_de_los_estudios_han_sido_enfocados_a_la_disminucin_de_los_efectos_txicos_y_osmticos_causados_por_las_altas_concen-traciones_de_ los_crioprotectores_(Kasai_y_Mukaida_ 2004)._ La_ vitrificacin,_ al_ ser_una_tcnica_que_consiste_en_la_criopreser-vacin_a_travs_del_aumento_de_la_visco-sidad_ de_ las_ soluciones_ crioprotectoras,_

necesita_ de_ concentraciones_ de_ criopro-tectores_mayores_(4-8_M)_a_las_utilizadas_normalmente_en_las_tcnicas_convencio-nales_de_congelacin_(1-2_M)_(Woods_et_l._ 2004)._Por_ lo_ tanto,_ la_ bsqueda_de_la_disminucin_de_estos_efectos_deletreos_se_ha_encaminado_a_ travs_de_diferentes_tcnicas,_ como_ por_ ejemplo,_ el_ uso_ de_crioprotectores_menos_txicos,_el_estable-cimiento_de_volmenes_mnimos,_niveles_de_concentracin_menores_por_medio_de_la_asociacin_de_ms_de_un_crioprotector,_la_adicin_progresiva_de_los_crioprotecto-res,_as_como_cambios_de_temperatura_y_tiempos_en_el_momento_de_su_exposicin_(Liebermann_et_l._2003)._

El_uso_de_ soluciones_crioprotectoras_con_bajo_peso_molecular_es_una_de_estas_estrategias;_ los_ crioprotectores,_ al_ tener_una_mayor_ permeabilidad,_ permiten_ la_reduccin_de_los_tiempos_de_exposicin_y_ la_ concentracin,_ con_ lo_ cual_ se_ pre-viene_ el_ dao_ osmtico_ causado_ en_ la_celula_ (Kasai_ y_ Mukaida_ 2004)._ Entre_los_crioprotectores_de_bajo_peso_molecu-lar,_el_ms_usado_es_el_etilenglicol_(EG)_(Massip_2001)._Sin_embargo,_varios_ex-perimentos_sugieren_que_crioprotectores_como_ 1-2_ propanediol_ (PROH),_ glice-rol_ (GLY),_ dimetilsulfoxido_ (DMSO)_y_ sus_posibles_combinaciones_con_otros_crioprotectores,_ son_ igualmente_ buenos_candidatos_para_ser_empleados_en_la_vi-trificacin_de_embriones_(Ishimori_et_l._1992;_Hublek_2003)._De_ igual_ forma,_la_ asociacin_de_uno_o_ms_ crioprotec-tores_ con_ caractersticas_ ms_ estables,_permitir_ la_ utilizacin_ de_ soluciones_ms_simples_y_la_reduccin_de_su_toxici-dad_especfica._De_acuerdo_con_algunos_investigadores,_ la_ permeabilidad_ de_ la_combinacin_ de_ crioprotectores_ es_ma-yor_que_la_de_sus_componentes_de_forma_individual_(Vajta_y_Nagy_2006)._La_aso-


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ciacin_ ms_ comnmente_ utilizada_ en_vitrificacin_ es_ la_ compuesta_ por_EG_ y_DMSO_ (Mezzalira_ et_ l._ 2004;_Vajta_ y_Nagy_2006),_sin_embargo,_esta_puede_ser_reemplazada_por_otro_tipo_de_combina-ciones_de_agentes_crioprotectores,_como_el_EG_y_PROH,_con_lo_cual_se_obtienen_excelentes_resultados_en_la_vitrificacin_de_embriones_producidos_in vitro_y_oocitos_inmaduros_(Vieira_et_l._2008)._La_adi-cin_ de_ crioprotectores_ no_ permeables,_tales_como_disacridos_(sucrosa,_trealosa)_o_macromolculas_(Ficoll,_poilivinilalco-hol_(PVA),_polivinilpirrolidona_(PVP)),_igualmente_contribuye_a_la_reduccin_de_su_ toxicidad,_ya_que_ayuda_a_disminuir_las_ concentraciones_ del_ crioprotector_dentro_de_ las_ clulas_ (Kasai_ y_Mukaida_2004;_Liebermann_et_l._2003).

Sistemas de empaqueLos_ grandes_ volmenes_ de_ crioprotec-tores_tambin_son_limitantes_de_las_tasas_de_ enfriamiento._ Los_ primeros_ elemen-tos_de_empaque_utilizados_con_xito_en_la_ vitrificacin_de_ oocitos_ y_ embriones,_fueron_ las_ pajillas_ de_ inseminacin_ de_bovinos,_ las_ cuales_ utilizaban_ relativa-mente_ grandes_ volmenes_ (>_ 20_ L)_ y_solo_alcanzaban_tasas_de_enfriamiento_de_2.500C/min_(Palasz_y_Mapletof,_1996)._Posteriormente,_ con_ el_ desarrollo_ de_empaques_de_menor_volumen_(


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TABlA 1. Viabilidad posvitrificacin de embriones bovinos producidos in vitro en diferentes tipos de empaque

Mtodo Autores

Viabilidad

% Eclosin % Preez

Pajilla 0,25 mL Massip et l. (1987) - 38%

Open pulled straws (OPS) Vajta et l. (1998) 94% -

Cryoloop Lane et l. (1999) 80% -

Mnimo volumen de congelacin (MVC) Hamawaki et l. (1999) 75% -

Pajilla 0,25 mL (microvolumen) Pugh et l. (2000) 71% 32%

Hemi-pajilla Vanderzwalmen et l. (2000) 44% -

Gel loading tips Tominaga y Hanada (2005) 17% -

Micropipeta de vidrio (GMP) Vieira et l. (2006) 75% 19%

Cryotop De Rosa et l. (2007) 75% -

Micropipeta de vidrio (GMP) Rios et l. (2010) 61,30% -

OPS sellada (CPS) Yu et l. (2010) 34,7%

FIgURAS 1 Y 2. Comparacin del dimetro interno entre la pajilla convencional ( di: 1,7 mm) OPS ( di: 0,8 mm) y GMP ( di: 0.3 mm)

30.000C/min._ Varios_ autores_ demos-traron_esta_eficacia,_al_alcanzar_mayores_tasas_ de_ congelacin_ con_ micropipetas_de_vidrio_(GMP)_en_comparacin_con_las_OPS,_y_mayores_tasas_de_sobrevivencia_in vitro_posvitrificacin._En_el_experimento_realizado_ con_ embriones_ bovinos,_ por_ejemplo,_ se_ obtuvieron_ 36/63_ (57,1%)_

de_ blastocitos_ eclosionados_ al_ ser_ vitri-fcados_con_ las_GMP_en_comparacin_a_28/54_ (51,8%)_ con_ las_OPS,_ debido_ a_la_mayor_conductividad_del_ empaque_y_la_utilizacin_de_un_menor_volumen_de_crioprotectores_ (Kong_et_l._2000;_Cho_et_l._2002)_(figuras_1_y_2).


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Nitrgeno spercongeladoPor_ ltimo,_ otra_ de_ las_ estrategias_ para_aumentar_ la_velocidad_de_congelamien-to_ha_ sido_ la_ reduccin_de_ temperatura_del_ nitrgeno_ lquido._El_ uso_ de_ nitr-geno_ spercongelado_ (slush de_ nitrge-no,_SN2)_reduce_el_punto_de_ebullicin,_mediante_la_estabilizacin_a_travs_de_la_presin_negativa,_minimizando_el_efecto_aislante_del_vapor_del_nitrgeno,_lo_cual_permite_mayor_ eficiencia_ en_ la_ transfe-rencia_ de_ calor_ entre_ las_ muestras_ y_ el_nitrgeno_ lquido_ (Vieira_ et_ l._ 2008)._De_esta_ forma,_ al_ evitar_ el_ revestimien-to_de_ las_capas_de_nitrgeno_durante_ la_inmersin,_ el_ nitrgeno_ lquido_ puede_alcanzar_ temperaturas_hasta_de_ -210C,_con_curvas_de_congelamiento_ms_rpi-das_(32.200C/min),_que_reducen_la_po-sibilidad_ de_ recristalizacin_ (formacin_irregular_ de_ hielo_ intracelular),_ que_ se_puede_presentar_en_ las_muestras_duran-te_el_descongelamiento,_y_la_vitrificacin_de_ muestras_ ms_ sensibles_ como_ en_ el_caso_ de_ los_ oocitos_ humanos_ (Arav_ et_l._2000;_Santos_et_l._2006)._Sobre_este_sistema,_se_han_realizado_varios_trabajos_que_demuestran_su_efecto_positivo,_aun_con_ el_ procedimiento_ de_ envases_ sella-dos,_y_ se_han_alcanzado_ tasas_de_ super-vivencia_ in vitro_ superiores_ (56%)_ en_comparacin_ con_ las_ de_ un_ sistema_ de_vitrificacin_ convencional_ en_nitrgeno_lquido_a_-196C_(10%)_(p_


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vitrificacin_(Seidel_2006)._La_adicin_de_la_hialurona_(Palasz_et_l._2008)_o_cido_linoleico_(Hochi_et_l._1999;_Laowtam-mathron_et_l._2005;_Pereira_y_Marques_2008)_ tambin_ aumenta_ la_ criotoleran-cia_ de_ los_ embriones_ bovinos_ in vitro,_cultivados_en_medios_de_cultivo_libres_de_suero._

Por_otro_lado,_se_puede_reducir_igual-mente_el_alto_nivel_de_lpidos_que_se_en-cuentra_en_los_embriones_producidos_in vitro,_por_medio_de_la_remocin_de_lpi-dos_ por_ centrifugacin_ o_ a_ travs_ de_ la_micromanipulacin_por_medio_del_des-nudamiento_por_micropipeta_o_pipetea-do_intenso,_con_lo_cual_se_aumentan_las_tasas_de_ sobrevivencia_de_ los_embriones_criopreservados._

Por_su_parte,_la_formacin_de_radicales_libres_durante_la_criopreservacin_puede_causar_dao_celular_y_disminuir_la_viabi-lidad_de_los_embriones._Por_esta_razn,_la_adicin_de_EDTA_(0,1_mM)_y/o_gluta-tion_(GSH;_1_mM)_en_el_cultivo_antes_de_la_vitrificacin_puede_llegar_a_mejorar_el_desarrollo_de_los_embriones,_al_disminuir_la_oxidacin_de_las_membranas_celulares_insaturadas_de_ lpidos,_promoviendo_ su_integridad_ celular_ (Aksoy_ et_ l._ 1999)._Adems,_ la_ adicin_de_ agentes_ como_ el_EDTA_ y_ el_ -_mercaptoetanol,_ pueden_llegar_a_aumentar_sustancialmente_las_ta-sas_ de_ sobrevivencia,_ aun_ en_ ambientes_con_bajos_niveles_de_oxgeno,_al_proteger_al_embrin_de_los_radicales_libres_y_la_au-toperoxidacin_de_lpidos_(Nedambale_et_l._2006).

Otras_estrategias_de_optimizacin_del_proceso_de_vitrificacin_pueden_realizar-se_por_medio_de_ la_modificacin_de_ las_caractersticas_propias_del_embrin_antes_de_ ser_ expuesto_ al_ proceso_ de_ criopre-servacin._Por_ ejemplo,_ la_ inyeccin_de_trealosa_ en_ oocitos_ aumenta_ la_ protec-

cin_ de_ las_ estructuras,_ principalmente_en_las_membranas,_y_disminuye_los_efec-tos_ deletreos_ debido_ a_ la_ toxicidad_ de_los_crioprotectores_(Eroglu_et_l._2003)._Por_otra_parte,_la_reduccin_artificial_del_fluido_blastoclico,_al_modificar_el_volu-men_de_lquido_intracelular,_consigue_re-ducir_el_shock_osmtico_y_los_problemas_de_permeabilidad,_as_como_la_formacin_de_ cristales_ de_ hielo_ (Vanderzwalmen_et_ l._ 2002;_ Chen_ et_ l._ 2001;_ Son_ et_l._ 2003)._ Por_ ltimo,_ la_ utilizacin_ de_estabilizadores_ del_ citoesqueleto_ con_ la_adicin_de_citocalasina_B_(Dobrinsky_et_l._2000)_reduce_la_despolimerizacin_de_los_ microfilamentos_ y_ microtbulos,_ y_mejora_ las_ tasas_de_ sobrevivencia_de_ los_oocitos_y_embriones_criopreservados._Por_lo_tanto,_todas_estas_metodologas_sern_probablemente_tiles_al_minimizar_cier-tas_ anormalidades_ celulares_ propias_ de_los_embriones_producidos_in vitro,_y_ha-cer_que_cada_vez_sean_menos_sensibles_a_la_vitrificacin.

CONClUSIN

La_ utilizacin_ de_ la_ vitrificacin_ como_mtodo_ de_ criopreservacin_ de_ em-briones_ producidos_ in vitro_ ha_ abierto_nuevas_ perspectivas_ en_ relacin_ con_ la_mejora_ de_ los_ sistemas_ de_ preservacin_o_ congelacin_ de_ embriones_ y_ oocitos,_ya_que_ha_disminuido_el_riesgo_de_lesin_del_embrin_producido_por_los_mtodos_convencionales._ Sin_ embargo,_ an_ se_necesitan_varias_modificaciones_y_mejo-ras_en_su_metodologa_para_que_sea_una_herramienta_aplicada_ampliamente_en_el_mbito_comercial.

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Criopreservación. Dra Claudia Jimenez