SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DEL HIDROLIZADO DE LA GELATINA POR EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

L. Bermúdez, K. Galindo, Y. Vargas, J. Ojeda, F. Triviño

Facultad de Ciencias Básicas

Programa de Química

Fecha de entrega: Septiembre 27 de 2010

RESUMEN.

En el siguiente estudio se ejecuto la separación de los aminoácidos: arginina, fenilalanina, glicina, metionina, tirosina, triptófano y aspartico, presentes en un hidrolizado de gelatina (Gelhada®) por medio del método de cromatografía de capa fina, usando como fase estacionaria Silica gel HF254, y las fases móviles: butanol, agua, acido acético glacial (4:1:1) y fenol, agua (3:1). Utilizando como agente revelador la Ninhidrina, ya que este presenta una reacción de coloración con los aminoácidos, con la cual se pudo determinar la presencia de los mismos en la muestra.

INTRODUCCIÓN.

La cromatografía de capa fina (TLC) es uno de los métodos más ampliamente utilizados para separar, identificar y, en algunos casos hacer el seguimiento de una reacción química. El principio de la

cromatografía de capa fina es sencillo. Se produce una capa uniforme de absorbente sólido adecuado (fase estacionaria) sostenida sobre una placa de aluminio o vidrio. Se coloca con un capilar en el origen de la placa una mancha de solución de compuesto orgánico o mezcla en estudio, se deja que un solvente adecuado (eluyente o fase móvil) ascienda por la capa del absorbente por capilaridad. Dependiendo de la naturaleza del solido extendido sobre la capa, existen distintos tipos de TLC:

De partición, en la que el sólido es el soporte inerte de la fase estacionaria liquida, que normalmente es de naturaleza polar. Con este fin suele utilizarse Silica gel hidratada, celulosa o tierra de diatomeas.

De absorción, en la que la capa extendida es el sólido absorbente (alúmina, etc.).

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De intercambio iónico, en la que se utiliza un cambiador de iones finamente dividido extendido sobre la capa (resinas o celulosa tratada). De exclusión, donde se utiliza material poroso muy pulverizado que origina fenómenos de exclusión según el tamaño molecular del analito (Sephadex® o gel dextrano).

Figura 1. Esqueleto de Silica gel

Una cantidad conocida como factor de retención (Rf) es en forma general un poco más útil que la distancia recorrida por la muestra.

Los valores de Rf son muy sensibles a la temperatura, y son propios de cada sustancia, pero dependiendo del sistema cromatografico (fase móvil y fase estacionaria). Los valores de Rf pueden ser útiles al estimar lo que podría ser una muestra desconocida e identificarla.

PROCEDIMIENTO.

Para la elaboración del hidrolizado se agregaron 30g de gelatina a la cual se le adicionó ácido sulfúrico al 80% y se llevo a reflujo por 4 horas aproximadamente.Se preparo una serie de placas de vidrio de 10 por 20 cm con Silica gel HF254. Con ayuda de un lápiz cuidadosamente se traza la zona de aplicación. Se aplican sobre la placa (con ayuda de un tubo capilar) las soluciones patrón en una placa en las columnas 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 y solución problema (hidrolizado de gelatina) en las columnas 1 y 9 de la misma placa. Se secan las manchas.

Figura 2. Esquema de TLC

La placa se sumergió en una cubeta con la fase móvil (como indica la figura 2), se procedió a tapar la cubeta para que esta se saturara con los vapores desprendidos por nuestro eluyente. Se dejo desarrollar hasta la línea límite de recorrido (¾ de la longitud), después se saco la placa y se

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seco con ayuda de un secador. Para después rociarla con el revelador Ninhidrina con un espray, y así observar las manchas de cada aminoácido, después se midió la longitud recorrida para cada aminoácido y la del frente del solvente. Para calcular sus respectivos valores de Rf

en los dos sistemas cromatografico.

Fase móvil #120 mL CH3CH2CH2CH2-OH5 mL CH3COOH glacial5 mL H2O

Fase móvil #275 g Ph-OH (fenol)25 mL H2O

Fase estacionaria Silica gel GF- 254

Agente revelador3.5 g Ninhidrina95 mL CH3CH2CH2CH2-OH5 mL CH3COOH al 10%

Figura 2. Estructura de la Ninhidrina

Figura 3. Montaje para el hidrolizado

ANALISIS Y RESULTADOS.

A continuación se expondrán los resultados obtenidos a manera de tabla para una mayor comprensión e interpretación de los mismos.

Tabla 1. Rf obtenidos con la fase móvil 1: Agua, butanol y ácido acético glacial (1:4:1)

N° Aminoácido Distancia recorrida

Rf

1 Arginina 2.9 cm 0.202 Aspartico 7.3 cm 0.513 Fenilalanina 8.0 cm 0.564 Glicina 8.7 cm 0.615 Metionina 8.5 cm 0.606 Tirosina 9.3 cm 0.657 Triptófano No revelo -

Distancia desde la zona de aplicación hasta el frente de la fase móvil 14.2 cm

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Figura 4. Revelado (fase móvil 1)

Tabla 2. Rf obtenidos con la fase móvil 2:Agua y fenol (1:3)

N° Aminoácido Distancia recorrida

Rf

1 Arginina 4.5 cm 0.272 Aspartico 1.0 cm 0.063 Fenilalanina 8.6 cm 0.514 Glicina 4.7 cm 0.285 Metionina 8.2 cm 0.496 Tirosina 8.0 cm 0.487 Triptófano 10.4 cm 0.62

Distancia desde la zona de aplicación hasta el frente de la fase móvil 16.8 cm

Figura 5. Revelado (fase móvil 2)

DISCUSIÓN.

Los aminoácidos con cadenas laterales apolares como la glicina y la fenilalanina no tienen una alta afinada con la Silica gel, originando como resultado unos valores menores de Rf sobre todo en la fase móvil 2 de naturaleza acida. Y en aquellos con cadenas laterales polares como la tirosina o el triptófano ascenderán más rápidos que los otros.

Figura 6. Esquema de la reacción de la Ninhidrina con los Aminoácidos

La Ninhidrina es un reactivo usado para ver las manchas de bandas de aminoácidos separados por croma-

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tografía. La Ninhidrina reacciona con el aminoácido dando como producto un anión color violeta intenso, llamado púrpura de Ruhemann, que se estabiliza por resonancia. En esta reacción se pierde la cadena lateral en forma de aldehído.

Al determinar los factores de retención se pudo observar que el triptófano es el que mayor factor de retención obtuvo, esto se debe a que el sustituyente de este aminoácido es de una alta polaridad, lo cual demuestra tener una gran afinidad con la fase estacionaria, y el de menor fue el ácido aspartico, utilizando como solvente la fase móvil #2. En cuanto a los valores obtenidos en la fase móvil #1 la arginina fu la que presento menor factor de retención y el mayor Rf fue el de la tirosina.Hay que tener en cuenta el carácter acido de la fase móvil 2 que le aporta el fenol, ya que el factor de pH incide en la afinidad de un componente con la Silica gel, ya que si esta es de carácter básico reaccionaria con el eluyente disminuyendo las partículas que posiblemente ascenderían por la capa.

La celulosa es actualmente el mejor material que se puede usar en la fase estacionaria para la separación por cromatografía en capa fina de los aminoácidos.

CONCLUSIONES.

La cromatografía de capa fina (TLC) evidenció que es una técnica eficiente a la hora de separar aminoácidos.Los aminoácidos incoloros pueden ser separados e identificados por medio de esta técnica, mediante el uso de un revelador (Ninhidrina) que los transforma en manchas coloreadas sobre la capa; pero parece ser que la Silica gel no es el mejor material para los aminoácidos porque produce manchas difusas y menos satisfactorias.

A manera de recomendación para obtener unos resultados más exactos, hay que tener más en cuenta los siguientes parámetros:

Un buen espacio en el lugar de trabajo y una buena organización de él, es decir buena ubicación de los reactivos y materiales con los cuales vamos a trabajar. Buscar las condiciones ideales a la hora de realizar la práctica (temperatura, humedad, presión, etc.). Una buena limpieza por parte de los materiales, y alta pureza por parte de los reactivos, para así obtener resultados precisos y reproducibles.

FUENTES DE INFORMACIÓN

[1] RUBINSON, Kenneth. Análisis Instrumental. 1ª ediciòn. Madrid: Pentice Hall, 2001. p. 325-327.

[2] VALCÀRCEL CASES, M. Técnicas Analíticas de Separaciòn. 1ª edición Barcelona: Revertè, 1988. p. 405-408.

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Fecha de 26 ANEXOS.

abril 2010

C COOH

H

NH2

CH2CH2CH2NHC

NH

H2N

ARGININA

C COOH

H

NH2

CH2HOOC

ÁCIDO ASPÁRTICO

C COOH

H

NH2

CH2

FENILALANINA

C COOH

H

NH2

CH2CH2SCH3

METIONINA

C COOH

H

NH2

CH2HO

TIROSINA

C COOH

H

NH2

CH2

N

H

TRIPTOFANO

CH2 COOH

NH2

GLICINA

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