Cromatografía de Capa Fina de Aas (Tecnica))

8/18/2019 Cromatografía de Capa Fina de Aas (Tecnica))

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PRÁCTICA 1

Separación de aminoácidos por técnicas de cromatografía de capa fina. Reacciones coloreadas deaminoácidos: prueba de ninhidrina.

Introducción.

Con la siguiente práctica conseguimos conocer los aminoácidos de una muestra problema y su identificacióngracias a la reacción coloreada con ninhidrina.

Tenemos una serie de muestras patrón con diferentes aminoácidos.

La cromatografía es una técnica que permite la separación y purificación de mezclas complejas en lasbiomoléculas que la componen.

Reactivas.

−Glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina al 1% en n−propanol al 10% en agua destilada.

−Solución problema de aminoácidos.

−Eluyente: etanol: hidróxido amónico al 34% en una proporción 7:3.

Resultados y discusión.

1. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice.

Una vez revelada la placa hay que medir la distancia que separa el frente de avance de la línea de aplicaciónde los patrones y de la muestra problema, a lo que denominamos Df (12,7).

Después calculamos la Rf de cada uno de los aminoácidos de la siguiente forma: Rf=D/Df siendo D ladistancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de avance.

MUESTRA D(cm) Rf

Lisina 0.5 0.03

Glicina03.5

0.27

Glutamato12

0.94

Prolina 4 0.31

Leucina 9 0.70

Al variar Rf según los distintos aminoácidos, nos permite distinguir más fácilmente los aminoácidos queconstituyen el problema. Esta variación se produce debido a que las fuerzas de avance ejercidas por la fasemóvil en su desplazamiento sobre la estacionaria son diferentes. Hay que tener en cuenta la absorción delmaterial utilizado.

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Los compuestos más solubles seguirán el camino del eluyente con más velocidad lo que nos permite determinar las distintas alturas alcanzadas por las manchas de los diferentes patrones.

2. Identificación de los aminoácidos que componen la molécula.

Ya revelada la muestra observamos que tiene dos manchas, debido a que la muestra se compone de dos

aminoácidos. Observando la similitud que guarda la muestra problema con los patrones, determinamos losaminoácidos que componen la muestra (glutamato y leucina)

PRACTICA 2

Reacciones coloreadas para la determinación cualitativa de azúcares. Prueba de la antrona y fehling.

Introducción.

La prueba de la antrona se basa en determinar la naturaleza de un azúcar problema mediante esta sustancia.Llegaremos a una conclusión contrastando el problema con los patrones.

La prueba del fehling se basa en determinar si el azúcar posee poder reductor ya que los azúcares reductorestienen una coloración rojiza debido al oxido cuproso que es forma por oxidación del azúcar por medio delcatión Cu 2+.

Los azúcares utilizados son la glucosa, fructosa, xilosa y sacarosa.

Resultados.

1. Prueba de fehling.

Ponemos en tubos de ensayo 2 ml de solución de azúcares y solución problema. El blanco se obtiene con 2 mlde agua destilada. Después se añaden 5 gotas de fehling a los tubos. Una vez agitados se sitúan al baño maríaobservando los cambios de color de cada compuesto. Si hay cambio de color el azúcar es reductor (maltesa), ysi no, no es reductor (sacarosa).

BLANCO SACAROSA GLUCOSA XILOSA FRUCTOSA PROBLEMA

5 min. azul azul Azul Azul amari. azul

1 min.

100*C azul claro azul claro Naranja claroNaranjaoscuro naranja claro azul claro

5 min. " " " " " "

De esta tabla se deduce que los azúcares reductores son la glucosa, la xilosa y la fructosa, dado que cambiande color.

2. Prueba de la antrona.

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Preparamos el blanco con dos gotas de agua destilada y 2 ml de antrona, 4 tubos con las muestras patrón conuna gota de cada azúcar y 2 ml de antrona, y otro tubo con una gota de la muestra problema y 2 ml de antrona,poniéndolos a continuación al baño maría.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

BLANCO SACAROSA GLUCOSA XILOSA FRUCTOSA PROBLEMA

5 min. Amarillo Verde oscuro Verde−azul Verde−azul verde oscuro verde oscuro

1 min.

100*CAmarillo−verde negro Negro Negro negro negro

5 min. " " " " " "

Discusión.

En la prueba de antrona todas las muestras dieron positivo porque utilizamos azúcares en forma de hexosa opentosa, sin embargo, en la prueba de fehling la sacarosa no dio positivo porque tiene carácter no reductordebido al enlace glucosídico (1−2) donde están situados los hidroxilos de los carbonos anoméricos de laglucosa y de la fructosa.

PRÁCTICA 3

Determinación cuantitativa de p−nitrofenol por espectrofotometría visible

Introducción.

La espectrofotometría visible consiste en una Técnica analítica basada en la capacidad de absorción dedeterminadas moléculas para determinadas radiaciones.

Obtención del espectro de absorción del p−nitrofenol.

Preparamos una disolución con 2,5 ml de solución de p−nitrofenol 0,2 mM con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml deagua destilada, y otra disolución (blanco) con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada.

Llevamos las disoluciones al espectrofotómetro y medimos la absorbancia de la primera disolución con

distintas longitudes de onda, sirviéndonos el blanco para calibrar la máquina.

ð 360 380 390 395 400 405 415 440 460

Llevando los datos a una gráfica.

Observando la curva vemos que la máxima absorbancia se da a una longitud de onda de aproximadamente400 nm.

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Curva de calibrado de p−nitrofenol.

Preparamos seis disoluciones a partir de la de p−nitrofenol 0,2 mM indicadas en la tabla, y de cada unatomamos 2,5 ml, añadiéndole 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada.

A continuación determinamos la absorbancia de las muestras fijando la longitud de onda máxima (400 nm),utilizando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.

MUESTRA [P−NITROFENOL] (mM) ABSORBANCIA

0 0 0.054

1 10 0.156

2 20 0.247

3 40 0.448

4 50 0.526

5 100 0.562

6 200 1.180

Llevando los datos a una gráfica obtenemos:

Cálculo del coeficiente de extinción molar del p−nitrofenol en su longitud de onda máxima y la ecuación deLambert−Beer.

La ecuación de dicha ley es: A=EmdC

siendo:

Em= coeficiente de extinción molar

d= longitud del medio (cubeta de d=1 cm)

C= concentración

A, cuando d=1 cm, se denomina densidad óptica y se representa como DO .

Esta ley dice que cuando una radiación pasa a través de una sustancia que absorbe luz, parte de esa radiaciónes absorbida,

y parte sale con menor intensidad de la que llega, con base a esta ley conociendo la absorbancia de ladisolución podremos hallar su concentración, pero cuando una disolución demasiado concentrada se produceun apantallamiento de la luz que llega.

Utilizando los datos del tubo 2:

Em=A/dxC=0,25/1x20mM=12500 1/cmxM

Determinación de la concentración de una solución problema de p−nitrofenol.

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La solución problema de p−nitrofenol se obtiene mezclando en un tubo de ensayo 2,5 ml de soluciónproblema con 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada. Medimos la absorbancia a 400nm y fue 0,315.

Llevando este dato a la curva obtenemos que tenemos una concentración de 24 mM.

Despejando la concentración de la fórmula de Lambert−Beer obtenemos: C=A/12500=0,315/12500=25,2mM

El NaOH es muy necesario porque neutraliza la acidez a la que queda la disolución de p−nitrofenol que es unácido débil, y es una molécula polar que aumenta, la salida de iones H+, y por lo tanto, la acidez.

PRÁCTICA 4

Extracción y ensayo de actividades glicosidasas de girasol. Efecto de la concentración de enzimas, pH,temperatura y concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

Introducción.

Estudiaremos la reacción:

p−nitrofenol− −D−manopiranósido −−−> p−nitrofenol + manosa

catalizada por la −o−manosidasa.

Resultado y discusión.

1. Determinación de las velocidades iniciales.

TIEMPO (min.) 5 10 20 30

ABSORB. 400nm 0,8 1,54 2,86 3,4

[P−NITROF]

(mM)68,3 131,62 244,4 290,6

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Pte de la gráfica (K)=(yi−yo)/(xi−xo)=(244,4−131,62)/(20−10)= 11,28 t.

v=−d[p−nitrofenol− ð−D−manopiranósido]/dt=Kt=11,28

siendo esta la ecuación aproximada de la gráfica, ya que hay imperfecciones en la medición, observándoseque la concentración aumenta con el tiempo.

2. Efecto de la concentración de enzimas sobre la actividad enzimática.

DILUCIÓN [P−NITROFENOL] ML DE ESTRACTO ABSORBANCIA

1/1 136,75 0,25 1,6

1/10 42,73 0,025 0,5

1/50 8,54 0,005 0,1

1/100 4,27 0,0025 0,05

La actividad enzimática son los moles de producto por segundo que se forman de sustrato. Vo=[p]/t nKat

DILUCIÓN 1/1 1/10 1/50 1/100

ACTIVIDADENZIMÁTICA

75,97 23,73 4,74 2,37

La recta responde a la ecuación siguiente: V=Kcat[E]

Kcat=Pte=tg =(23,73x10 −4,74x10 )Kat/(0,025−0,005)ml= 9,5x10 Kat/ml

entonces: V=9,5x10 Kat/ml [volumen enzima]

[ −D−manosidasa]

La ecuación responde a la primera parte de la gráfica, cuando hay una cantidad de enzimas.

3. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

pHABSORBANCIA400 nm

[P−NITROFENOL]ACTIVIDADENZIMÁTICA

3,0 0,4 34,2 mM 19 nKat

3,5 0,6 51,3 28,5

4,0 0,8 68,4 38

4,5 1,4 119,6 66,4

5,0 0,7 52,8 33,2

6,0 0,3 25,6 14,2

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7,0 0,1 8,5 4,7

El pH óptimo de la reacción está alrededor de 4,5.

4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

TEMPERATURA ABSORBANCIA [P/NITROFENOL] ACT.ENZIMÁTICA

20ºC 0,4 34,2 19 nKat

30 1,3 111,1 61,7

40 1,6 136,7 75,9

50 2,0 170,9 94,9

60 2,5 213,6 118,6

70 0,4 34,2 19

La temperatura óptima está alrededor de los 50ºC. A partir de esta temperatura se observa una caída muybrusca de la velocidad debido a que a temperaturas altas los enzimas se desnaturalizan.

Qio es el aumento de la velocidad con un incremento de 10ºC.

Qio entre 30 y 40ºC=14,2 nKat |

Qio entre 40 y 50ºC=19 |> Qio=18,97 nKat

Qio entre 50 y 60ºC=23,7 |

Representación de Arrhenius

1/T (K ) log[Vo/(Vmax−Vo)]

3,09x10 0,6

3,19x10 0,249

3,3x10 0,035

3,41x10 −0,72

Pte recta=tg =−Ea/R=−(0,6−0,249)/[(3,19−3,09)x x10 ]=−3510 K Ea=6,97 Kcal/mol

log [Vo/(Vmax−Vo)]=log K−(Ea/R)(1/T)

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5.Efecto de concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

SUSTRATO ABSORBANCIA [P−NITROFENOL] ACT.ENZIMÁTICA

10 mM 0,25 21 11,6 nKat

20 0,46 39,3 21,8

40 0,71 60,7 33,7

60 0,87 74,3 41,280 1,00 85,4 47,4

100 1,10 94,0 52,2

200 1,30 111,1 61,7

400 1,42 121,4 67,4

600 1,43 121,9 67,6

V=Vmax[S]/(Km+[S]) siendo Km la cte. de Michaelis que nos da la afinidad del enzima por el sustrato.

Observando la gráfica vemos primero un aumento de velocidad rápido para después ir aumentando máslentamente.

Ecuación de Linewearer−Burk (cálculo Vmax)

1/[S] 0,0116 0,0125 0,0100 0,005 0,0025

1/Vo 0,024 0,021 0,019 0,016 0,014

Representación de Eadie−Hafstee.

Vo [S] Vo/[S]11,6 10 1,16

21,8 20 1,099

33,7 40 0,8425

41,2 60 0,680

47,4 80 0,5925

52,2 100 0,522

61,7 200 0,3085

67,4 400 1,168

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