Cromatografía de capa fina y de columna Objetivos:

Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, (ccf), sus características y los factores que en ella intervienen.

Calcular valores de Rf de varias sustancias y correlacionarlo a la selección adecuada del eluyente y deducir la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.

Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina como criterio de pureza identificación de sustancias.

Marco teórico: Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina (CCF) es una técnica cromatográfica que utiliza una placa inmersa verticalmente. Esta placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una superficie sólida. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatográfica sobre algún recipiente o cámara mente un centímetro (la distancia entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar).Está técnica deriva de los trabajos del farmacéutico alemán Egon Stahl (1924-1986), que la presentó en 1956.

Cromatografía en columnaSe emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación, se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo.

Observaciones: Cromatografía en capa fina La papilla (sílica gel y agua) tiene que usarse rápidamente y de ser necesario

agitar intensamente debido a que esta se endurece rápidamente. Luego de colocar las placas en la estufa se observa que el gel se solidifica y

se seca completamente, justamente en esto consiste la activación de las placas.

Al forrar los vasos con papel bond, añadir la fase móvil y tapar con la luna de reloj, se observa una saturación homogénea de todo el sistema. Esto se realiza para un desempeño adecuado de la experiencia.

Una vez introducida la placa cromatográfica con la muestra en el sistema (vaso con hoja bond y fase móvil liquida) se aprecia como el solvente asciende lentamente a través de la placa, mientras arrastraba consigo los diferentes pigmentos a distintas velocidades cada uno.

Cromatografía en columna Tener cuidado de que el solvente no sobrepase por debajo de la línea de

arena ya que se puede fragmentar la columna cromatográfica y se detendrá automáticamente el proceso.

Al momento de añadir la alúmina en el solvente (éter de petróleo), observar que se vaya formando una columna homogénea para que el proceso de separación posterior no se vea interrumpido.

El goteo sin abrir la llave de vacío es muy lento por lo cual debemos ajustar adecuadamente para generar un goteo moderado.

Luego de añadir nuestra muestra que se desea separar, rápidamente se formó una capa amarilla (carotenoide) que desciende en primer lugar detrás de ella empieza a descender una capa de color verde (clorofila). Esta separación se debe a las polaridades relativas de los pigmentos con el solvente éter de petróleo (fase móvil).

Se repitió el flujo de éter de petróleo hasta que el solvente con muestra quede incoloro.

Cálculos y resultados:Cálculo de los “Rf” para cada una de las placas según el solvente utilizado.

Con éter puro:

Compuesto “A”: Rf = (1.3)/(5.4) = 0.24074

4.9 cm. Compuesto “B”:

Rf = (4.9)/(5.4) = 0.90741.3 cm.

Con éter – cetona (4:1)

Compuesto “A”: Rf = (1.1)/(5.8) = 0.1897

5.5 cm. Compuesto “B”: Rf = (5.5)/(5.8) = 0.9483

1.1 cm.

Con éter – cetona (3:1)

Compuesto “A”: Rf = (1.4)/(5.3) = 0.2642

4.8 cm. Compuesto “B”: Rf = (4.8)/(5.3) = 0.9057

1.4 cm.

Conclusiones: Cromatografía en capa fina El solvente utilizado asciende por el fenómeno de capilaridad arrastrando

por afinidad polar a los segmentos (a cada pigmento lo atrae a distinta velocidad).

En una de las placas se observan dos puntos bien definidos, en otra solo una y parcialmente en otros 3 puntos bien definidos.

Cada una de esas placas se tratan con solventes de distinta polaridad, es decir, la polaridad del sistema influye en la cantidad de pigmentos que se puede separar.

Algún tipo de humedad influye de manera negativa en la cromatografía debido a la polaridad del agua, y por ello se realiza la “activación de placas”.

Cromatografía en columna Este tubo de cromatografía demostró ser mucho más eficiente. Esta cromatografía se puede usar cuantitativamente mientras que la de

capa fina cualitativamente. Éter de petróleo es apolar, arrastra primero a los carotenoides y luego a la

clorofila. Esto indica que la clorofila es en cierto grao más polar que los carotenoides.

Un mayor grado de pureza se podría obtener con una fase solida con polaridad adecuada mucho más afín de uno de los pigmentos.

Anexos: Las técnicas de aplicación de la cromatografía en capa fina se aplican para

desarrollar las condiciones para la separación en cromatografía en líquidos de alta resolución.

La cromatografía en capa fina tiene amplio uso en los laboratorios clínicos y es la estructura de apoyo de muchos estudios bioquímicos y biológicos. También tiene una gran aplicación en los laboratorios industriales.

Bibliografía: https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa “Introducción a la cromatografía”, David Abbott y R. S. Andrew,

Editorial Alhambra