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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIÓN
HPLC High Performance Liquid
Chromatograpy
Comparación HPLC y CG
Volatilidad de la muestra
HPLC
oLa volatilidad no es necesaria
oLa muestras deben ser solubles en la fase
móvil
CG
oLa muestra debe ser volátil
oBajo PM
C.L.S. adsorción
C:L:L: Reparto
Cromatografía líquida
Fase Normal
•Fase Estacionaria polar
•Fase Móvil no polar a lo polar
incremento de la fuerza
eluotrópica
Fase Reversa
FE no polar
FM polar a lo no polar incremento
de la fuerza eluotrópica
Hidrófilo
Hidrófobo
Ácidos
carboxílicos
volátiles
Sulfonamidas
Cetonas de
aldehídos
Glifosatos
Aminoácidos Iones inorgánicos
Colorantes
alimentarios
sintéticos
Azúcares Alcoholes de
azúcares
Enzimas
PG, OG, DG
fenoles Glicoles
Nitrilos
Nitrosamina
BHT (butilhidroxitolueno),
BHA (butilhidroxianisol),
THBO antioxidantes
Ácidos grasos
Aflatoxinas
Antibióticos
Flavonoides
Colorantes alim. naturales
Vitaminas solubles en grasas
Anabólicos PAHs
Aminas aromáticas
Alcohol Pesticidas
organofósforos TMS derivado
de azúcares
Epóxidos Aceites esenciales
PCB
Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos
C2/C5 hidrocarburos Metiléster
ácidos grasos Ésteres aromáticos
Volátil No volátil Volatilidad
Polaridad
6
HPLC Isocrático
Bomba
Inyector
Columna
Registrador
Electrometro
Detector
Solvente
Solventes
• Pureza – Grado HPLC
• Filtración – Poro de 0.45 micras
– Nylon
– Teflón
• Desgacificación
Bombas
Se requiere de una bomba que de
una presión alta para forzar al
líquido a pasar por la columna a
una velocidad satisfactoria.
Debe mantener el flujo constante
durante períodos relativamente
largos.
Las Bombas de Pistón dual
INJECTORES
Columnas
acero inoxidable (soportan presiones
hasta 5000 psi)
Diámetro de 1 a 6 mm
Longitud de 10 a 30 cm
El soportes para la fase líquida
tierra de diatomeas, zipax o corasil
Columnas de HPLC
Columna
analítica
Fase móvil
desde la bomba
Precolumna Muestreador
Al detector
Actúa sobre la muestra para
atrapar partículas y
componentes de muestras
retenidos con fuerza.
Las columnas varían en los siguientes aspectos:
• Longitud
• Diámetro interno
• Material de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula de la fase estacionaria
La columna
analítica lleva
a cabo la
separación.
17
Columna - Acero inoxidable
estándar
Capilar
Frita de filtro de
acero inoxidable
Tamaño de poro de 2
um
Relleno de
columna
18
Materiales de relleno de columnas -
Sílice
Soles de sílice Xerogeles
Esférico
Irregular Las partículas tienen un diámetro de
3 a 10 μm en las columnas estándar.
19
Materiales de relleno de columnas -
Fases enlazadas
Si R1
R2
Si CH3 H3C
O
O
Si
O O
OH
Poros
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl
R1
R2
Fase enlazada monomérica
Cadena de carbono
con forma de cepillo
20
Materiales de relleno de columnas - Fases
enlazadas extensamente utilizadas
CH3
|
-0-Si- R
|
CH3
HPLC de fase inversa •C18
•C8
•C4
•C1
•Fenilo
Las columnas de HPLC más utilizadas
Separaciones de proteínas
Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares
HPLC de fase normal o inversa • CN
• NH2
HPLC de fase normal • Diol Separaciones de compuestos con
polaridades muy diferentes
Polaridad intermedia
Intercambio iónico
DEAE (dietilaminoetanol)
QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
Exclusión de tamaño
Glicerilpropilo
21
Número aproximado de platos (N) y volumen
vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna
(N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:
◦ Mantener la resolución
◦ Reducir el tiempo de análisis
◦ Reducir el uso de disolventes
Tamaño de la
columna Tamaño de partícula
Número de platos
(N)
Volumen vacío
(V m )
4,6 x 250 mm 5- m m 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5- m m 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml
4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml
4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml
4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml
4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml
22
Conseguir todo el potencial con
mayor velocidad de flujo mAU
0 100 200 300
mAU
0 100 200 300
min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9
mAU
0 100 200 300
0
Flujo
3 ml/min
2 ml/min
4 ml/min
Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm
90 bar
133 bar
181 bar
Presión
30 seg
Rs2,1 = 2,1
Rs2,1 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
23
Velocidades de flujo típicas d.i. de columna
partículas de 5 mm )
Flujo
ml/mi
n 4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09
24
Longitud de columna - Adaptar la
longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ad
sorb
ance
4,6 x 15 mm
4,6 x 30 mm
4,6 x 50 mm
4,6 x 75 mm
4,6 x 150 mm
Ab
sorb
an
cia
SB-C18
Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100
Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C
Vol. de inyección: 1 µl
Muestra:
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)
2. Cafeína
3. 2-Ac2-Acetoamidofenol
4. Acetanilida
5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
6. Ácido salicílico
7. Fenacetina (acetofenetidina)
1 2 3 4
5 6 7
los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min
25
Operación de un gradiente en
HPLC
El cambio de composición en la
fase móvil durante una corrida
cromatográfica
Definición de Gradiente
. El principal motivo de un
gradiente de elución es el de
mover los compuestos retenidos
fuertemente de una manera
rápida, pero tomando en cuenta
que el último compuesto debe ser
resuelto debidamente
Tipico gradiente
Estrategias para desarrollar
un gradiente
• Lograr la máxima separación
– Decrecer el tiempo de reequilibrio
– Reducir el ciclo de inyección
• Uso de gradientes cortos
• Uso de flujos altos
• Uso de columnas cortas o rocket
• Uso de tamaño pequeño de partícula
• Incremento de la temperatura
'k
'kx
)(xN)/(R
1
141
Eficiencia Selectividad Capacidad
Ecuación de Resolución
El tipo de elución es
mantenido durante toda la
corrida, haciendo los ciclos
mas cortos
• La composición de la FM
• La composición de la FE
• pH
• Temperatura de la columna
• Aditivos en la FM
Cambios en
Cambios en k’
• Cambiar la composición de la FM
• Incrementando la Fza de la FM decrece
la k’
• En una C18, el incremento de la
polaridad en la FM hace que los solutos
sean retenidos más fuertemente
• Bajando la polaridad de la FM
disminuyendo la cantidad de agua
causa que las moléculas de la
muestra eluyan más rápidamente
Cambios en k’
Detectores
Visible UV
Arreglo de diodos
Índice de refracción
Fluorescencia
Electroquímico
Características del detector ideal
•Bajo nivel de ruido
•Alta sensibilidad
•Respuesta rápida
•Respuesta lineal alta
•Bajo volumen muerto
•Insensible al cambio del tipo de solvente
•Operación simple y reproducible
•De preferencia no destructivo
Fracción del espectro
electromagnético
infrared (IR) 2,500 - 50,000 nm
near infrared 800 - 2,500 nm
visible 400 - 800 nm
ultraviolet (UV) 190 - 400 nm
Ley de Lamber Beer
UV variable
• Muchos solutos absorben
• Lecturas entre 0.001 a 3 ua
• Lineraridad de 5 ordenes de magnitud
• Eluciones por gradiente con solventes
que no absorben
UV variable
Arreglo de Diodos
• Registra el espectro de cada soluto conforme eluye de la columna
• Permite seleccionar mejor la longitud de onda, importante cuando no hay información disponible sobre las absortividades molares
• Pureza. La forma del pico, la absorbancia a varias longitudes de onda es particularmente útil decidiendo si la cresta representa un solo compuesto o, es una cresta compuesta.
.
Arreglo de Diodos
• Único detector universal en HPLC
• La detección es la medida en el cambio
del índice de refracción del eluyente
pasando a través de la celda.
• No permite eluciones por gradiente
Índice de Refracción
Índice de Refracción
Detector de Fluorescencia
• 15 % de los compuestos
• Alifaticos ciclicos, con grupos carbonilo,
dobles enlaces conjugados
• Compuestos aromáticos no sustituidos,
entre mas anillos mas F.
Detector de Fluorescencia
Detector Electroquímico
• Selectivo, solo ciertos analitos se
oxidan o se reducen con facilidad
• Oxidación: fenoles, aminas aromáticas,
peróxidos y mercaptanos
• Reducción: cetonas, aldehídos, nitrilos
conjugados, halógenos aromáticos y
comp. nitro aromáticos
Detector Electroquímico
Ruido