CROMATOGRAFíA EN CROMATOGRAFíA EN COLUMNACOLUMNA

Licda. Carol de SantistebanAnálisis Instrumental

Departamento de FisicoquímicaEscuela de Química USAC

C. de líquidos

C. de gases

C. de fluidos supercríticos

TIPOS, SEGÚN FMTIPOS, SEGÚN FM

Todos los tipos de fases estacionarias y móviles.

Diferentes posibilidades de mecanismos de separación, según tipo de fase estacionaria.

Características esenciales de solventes: ◦ índice de polaridad (reparto)◦ fuerza eluyente (adsorción)

C. De líquidosC. De líquidos

C. de adsorción C. de reparto C. de afinidad C. de intercambio iónico C. de exclusión molecular

Mecanismos de separaciónMecanismos de separación

Fase estacionaria de acuerdo a interacciones posibles según naturaleza del analito◦ Van der Waals reparto fase reversa◦ Polar reparto fase normal◦ Medianamente polar adsorción◦ Iónico intercambio iónico

◦ Biomoléculas:◦ Distribución de tamaños exclusión molecular◦ Distribución de cargas intercambio iónico, otras◦ Actividad biológica afinidad

Fase móvil de acuerdo a fase estacionaria e interacciones deseadas

SelecciónSelección

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓNCROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Fase estacionaria adsorbente

Carbonato de calcio, Tswett

Sílica, alúmina las más utilizadas actualmente

Sílica > alúmina (capacidad de carga, variedad, reacciones indeseadas)

Forma, porosidad, superficie,

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

En sílicaEn sílica

Fases estacionarias Fases estacionarias comercialescomerciales

InteraccionesInteracciones

Dada una FS la FM controla k’ y α

Fuerza eluyente◦ Energía de adsorción del disolvente (en la FS) por unidad

de área (de FM)

A mayor valor de ε0 mayor fuerza mayor polaridad

Mezcla de solventes valores intermedios de fuerza eluyente, pero la relación no es lineal

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

Variación de retención◦ Cambio de proporciones◦ Cambio de fuerza eluyente

Variación de selectividad◦ Cambio de solventes◦ Conservación de fuerza eluyente

Pruebas preliminares en capa fina

Variación de k’ y αVariación de k’ y α

Fases móviles comunesFases móviles comunes

Alcanos < olefinas < aromáticos < haluros,

sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres

– aldehídos – cetonas < alcoholes – aminas

< sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos

carboxílicos

RETENCIÓNRETENCIÓN

Desplazamiento

Competición entre moléculas de FM y analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

MECANISMOMECANISMO

Apolares a medianamente polares Peso molecular < 5000 Poco solubles en agua Generalmente complementario a reparto

Amplio rango de aplicación Bueno para separar isómeros Todas las ramas de investigación

APLICACIONESAPLICACIONES

CROMATOGRAFÍA DE REPARTOCROMATOGRAFÍA DE REPARTO

Desarrollada como alternativa a c. de adsorción (fácil, reproducible; mejor resolución y vida útil que adsorción

Más utilizada actualmente (fases enlazadas, HPLC)

Modalidades líquido-líquido y fase enlazada

Fase normal o fase reversa

C. De repartoC. De reparto

Película de fase estacionaria líquida o pseudo-líquida unida a soporte

Idealmente el soporte no interacciona

Unión de FS física (c. líquido-líquido) o química (c. de fase enlazada)

Sangrado de columna

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

SangradoSangrado

Preparación por varios métodos.◦ Evaporación de solvente◦ Recubrimiento directo◦ Precipitación◦ Recubrimiento dinámico

Para fase normal: agua, formamida, glicerol, polialcoholes

Para fase reversa: escualano, octanol, hidrocarburos grandes

Fases líquidasFases líquidas

Unión con enlace covalente de cadena orgánica (grupo funcional) al soporte

Funcionalización de la cadena, longitud de la cadena, grado de recubrimiento del soporte

Polaridad, capacidad, retención.

Fases enlazadasFases enlazadas

Fases enlazadasFases enlazadas

Fases enlazadasFases enlazadas

De acuerdo a la polaridad de analito y fase estacionaria

Influye sobre la estructura de la fase estacionaria

Sus variaciones influyen en la resolución

Índice de polaridad (sol. En dioxano, nitrometano y etanol)

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

Efecto sobre FSEfecto sobre FS

PropiedadesPropiedades

Basado en polaridad

Polaridad analitos: Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas

< aldehídos < amidas < aminas < alcoholes

MECANISMOMECANISMO

Relaciones de polaridad Relaciones de polaridad FSFS

Relaciones de polaridad FMRelaciones de polaridad FM

Variación de k’Variación de k’

Variación de αVariación de α

Tradicionalmente, analitos polares de bajo a medio peso molecular

En general, mayoría de analitos, con la técnica adecuada

APLICACIONESAPLICACIONES

AplicacionesAplicaciones

EjemplosEjemplos

Derivatización

C. de pares iónicos

C. con fases quirales

CASOS ESPECIALESCASOS ESPECIALES

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDADCROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Mecanismo de retención basado en interacciones ESPECÍFICAS reversibles, propias de los sistemas biológicos (interacción antígeno-anticuerpo, enzima sustrato)

Modelo llave-cerradura

C. De afinidadC. De afinidad

Fase estacionaria: inmobilización al soporte (unión química) de uno de los componentes de un par (ligando de afinidad)

Ligandos generales y ligandos de alta especificidad

Ligandos de origen natural o sintético

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

Soporte: baja retención de analitos en general, fácil modificación (unión de ligandos), estable a condiciones de análisis

Bajo rendimiento: material no rígido, de partícula grande (geles orgánicos)

Alto rendimiento: rígido, partícula pequeña (sílica, vidrio, poliestireno)

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

C. De afinidadC. De afinidad

Elución por fases

Inyección del analito, en presencia de FM con las condiciones adecuadas para la unión ligando- analito (composición, pH, fuerza iónica). Fase móvil débil

Elución del analito en presencia de FM que los desplaza o promueve la disociación del complejo ligando-analito. Fase móvil fuerte

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

Elución inespecífica

Elución bioespecífica

◦ Elución bioespecífica en fase normal

◦ Elución bioespecífica en fase reversa

OJO En este tipo de cromatografía fase normal y fase reversa NO se refieren a polaridad

Tipos de eluciónTipos de elución

Normal: El buffer de elución contiene un agente que compite con el ligando por unirse con el soluto.

Reversa: El buffer de elución contiene un agente que compite con el soluto por unirse con el ligando.

La elución no específica, debilita el enlace.

Tipos de eluciónTipos de elución

MECANISMOMECANISMO

Elución bioespecíficaElución bioespecífica

Biomoléculas

Moléculas con efecto biológico

Células

APLICACIONESAPLICACIONES

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICOCROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Basado en los equilibrios de intercambio entre los distintos iones de una solución sobre la fase estacionaria

Competición entre iones de FM y de analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

C. De intercambio iónicoC. De intercambio iónico

Sólido de elevada masa molecular, insoluble en FM, superficie con grupos funcionales ionizables

Naturales (arcillas, zeolitas) o sintéticos (resinas)

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

Intercambiadores catiónicos

Intercambiadores aniónicos

Clasificación según tipo Clasificación según tipo analitoanalito

Fases estacionarias porosas: Copolímero estireno-divinilbenceno como

soporte, superficie modificada con grupos ionizables

Fases estacionarias peliculares: Partículas esféricas no porosas de soporte

(vidrio, polímero, sílica) con película de resina de intercambio

Clasificación según forma Clasificación según forma

Soluciones acuosas con o sin modificadores orgánicos (metanol)

Contienen sustancias iónicas (buffer)

pH controla ionización de FS controla retención/elución

Fuerza iónica controla competición contra analitocontrola elución

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-5.html 

MECANISMOMECANISMO

Polivalentes más que monovalentes

Para grupos con la misma carga, las diferencias de retención se dan por tamaño del ión hidratado y otras propiedades

RetenciónRetención

Analitos iónicos, bajo a medio peso molecular

Orgánicos e inorgánicos

Fármacos, metabolitos, alimentos

APLICACIONESAPLICACIONES

AplicacionesAplicaciones

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULARCROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Exclusión por tamaño

Basado en la capacidad de penetración de los analitos en los poros de la FE de acuerdo con su tamaño (y en menor medida con su forma)

C. De exclusión molecularC. De exclusión molecular

Red de poros uniforme, a manera de tamiz

Poca interacción con el analito (evitando otros mecanismos de retención)

Partículas de sílica o poliméricas

Polímeros orgánicos o inorgánicos Geles hidrofóbicos o hidrofílicos

FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS

Tamaño promedio de poro impone límites a la separación (porosidad o grado de enrecruzamiento).

Límite de exclusión: Peso molecular por encima del cual no se retienen las moléculas

Límite de penetración: Peso molecular por debajo del cual hay libre penetración

Propiedades FSPropiedades FS

Capaz de disolver completamente los analitos

En este tipo de c. NO existe fase normal y reversa:

Filtración sobre gel: rellenos hidrofílicos y solventes acuosos

Penetrabilidad sobre gel: rellenos hidrofóbicos y solventes orgánicos no polares

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-6.html 

MECANISMOMECANISMO

Moléculas grandes, amplio rango de polaridad

Biomoléculas

Polímeros

APLICACIONESAPLICACIONES

Aplicaciones de la C. Aplicaciones de la C. líquidalíquida

MUCHAS GRACIAS MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓNPOR SU ATENCIÓN

Fin