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Cromatografía
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CROMATROGRAFIA DE GAS
En cromatografía de gas el analito gaseoso es transportado a través de la columna por un fase móvil gaseosa llamado .CARRIER GAS.
CROMATOGRAFIA GAS LIQUIDO (partición):La fase estacionaria es un líquido no volátil que cubre la parte interna de la columna o está sobre un soporte sólido.
CROMATOGRAFIA GAS SÓLIDO (adsorción) El analito es adsorbido directamente sobre las partículas sólidas de la
fase estacionaria.
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Continuación
CROMATOGRAFIA DE GAS: Fase móvil: gas ( generalmente He, N2 , o H2
Fase estacionaria: ( generalmente un liquido no volátil, algunas veces un sólido)
Analito: gas o líquido volátil
Columna: debe estar lo suficientemente caliente para proveer presión de vapor del analito y pueda ser eluído en un tiempo razonable.
El detector es mantenido a una temperatura mas alta que la columna así que todos los analitos serán gaseosos.
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ELEMENTOS BASICOS EN GCSUMINISTRO DE GAS
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INYECTOR CON AUTOMUESTREADOR
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OPEN TUBULAR COLUMN
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OPEN TUBULAR DENTRO DEL HORNO
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DATA RECORDER
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SCHEMATIC DIAGRAM OF GAS CHROMATOGRAPH
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Columnas open tubular
La mayoría de los análisis usan open tubular column, largas y estrechas hechas de sílica fundida ( SiO2) y revestida con poliamida (un plástico capaz de resistir hasta 350oC) para soporte y protección de la humedad atmosférica.
Diametro interno de las columnas están entre 0.10 – 0.53 mm y longitud de 15 – 100 m.
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Clases de columnas open tubular
WCOT :wall coated tubular column Características: el espesor de la película de la fase estacionaria en el
interior de la columna está entre 0.1 a 5 um. Disminuyendo el espesor de la película de la fase estacionaria aumenta la resolución, disminuye el tiempo de retención y disminuye la cantidad de muestra.
La fase estacionaria esta adherida a las paredes internas de la columna.
SCOT: support coated open tubular column. Características: partículas sólidas con la fase estacionaria liquida están
adheridas a las paredes internas de la columna.
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PLOT: porous layer open tubular column. Fase estacionaria sólida está unida a las paredes internas de
la columna. Para aumentar el área de contacto se tratan las paredes de la
columna con HF, luego se deposita allí la fase estacionaria.
La eficiencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT y las columnas empacadas.
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FUSED SILICA OPEN TUBULAR COLUMN (FSOT)nuevo tipo de columnas wcot
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VENTAJAS DE LAS OPEN TUBULAR
Comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:
Alta resolución Tiempo de análisis mas cortos Gran sensibilidad Mas baja capacidad de muestra
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolución que las wider open tubular pero requieren mas alta presión para operar y tienen menos capacidad de muestra.
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CLASES DE FASE ESTACIONARIA
(Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
(Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane .
Polaridad intermedia
Carbowax (poly(ethyleneglycol)) :fuertemente polar.
(biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane. : fuerte polaridad
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ESCOGENCIA DE LA FASE ESTACIONARIA
La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se basa en la regla:semejante disuelve semejante.
Columnas no polares son mejores para solutos no polares. Columnas de polaridad intermedia son mejores para solutos de polaridad
intermedia. Advertencia: Las altas temperaturas y la exposición al oxigeno causan degradación de
la columna y producen cola en los cromatogramas.
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Entre sólidos usados para columnas PLOT tenemos alúmina Al2O3 la cual es una fase estacionaria que separa hidrocarburos en cromatografía de adsorción gas sólido.
MALLAS MOLECULARES: son material inorgánico o polímeros orgánicos con grandes cavidades dentro de las cuales pequeñas moléculas entran y son parcialmente retenidas. Moléculas, tales como H2 , O2 , CO2 y CH4 pueden ser separadas una de otras.
Los gases pueden ser secados a través de trampas que contienen mallas moleculares ya que el agua es fuertemente retenida por estas mallas.
Las mallas inorgánicas pueden ser regeneradas calentando a 300oC al vacío o bajo flujo de N2
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COLUMANAS EMPACADAS
Contienen un soporte sólido fino con un líquido no volátil como fase estacionaria o sólo el soporte sólido puede actuar como fase estacionaria.
Las columnas son generalmente hechas de acero inoxidable, níkel o vidrio. El diámetro interno es de 3 – 6 mm y la longitud es de 5 y 20 cm., el soporte sólido a menudo es de diatomea que es silanizado..
En las columnas empacadas el tamaño uniforme de las partículas disminuye el termino múltiples caminos (A) en la ecuación de VAN DEEMTER reduciendo así la altura de plato y aumentando por ende la resolución
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El pequeño tamaño de las partículas disminuye el tiempo requerido para que el soluto alcance el equilibrio mejorando la eficiencia de la columna, sin embargo entre mas pequeño es el tamaño de las partículas se requiere mas presión para que la fase móvil pase a través de la columna.
El tamaño de las partículas se expresa en micrómetros o tamaños MESH esto se refiere al tamaño del tamiz a través del cual las partículas son pasadas o retenidas.
Una partícula de 100/200 mesh pasa a través de un tamiz de 100 mesh pero no a través de uno de 200. Es decir el mesh da la apertura por pulgada lineal del tamiz.
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INDICE DE RETENCIÓN
Los índices de retención de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces el número de átomos de carbono. Para el octano el (I) es de 800 para el nonano es de 900.
ntrNtr
ntrodesconocidtrnNnI
!log!log
!log!log100
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Donde n es el número de átomos de carbono en el alcano mas pequeño, N es el número de átomos de carbono en el alcano mas grade.
Tr´n es el tiempo de retención ajustado del alcano mas pequeño.
Tr’N = tiempo de retención ajustado del alcano mas grande ej:
Si el tiempo de retención en la figura : Tr (CH4) = 0.5 Tr (octano) = 14.3 min. Tr (desconocido) = 15.7min Tr (nonano) = 18.5 min. Encontrar el I para el desconocido. Índice de Retención es = 836
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PROGRAMACION DE PRESION TEMPERATURA
En la programación de la temperatura, de la columna es subida durante la separación para incrementar la presión de vapor de soluto y disminuir el tiempo de retención de los compuestos eluídos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos más volátiles pueden emerger juntos y los menos volátiles pueden aún no se eluídos de la columna.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250oC a una velocidad de 8o/min, todos los compuestos son eluídos y la separación de los picos son uniformes.
Hay que evitar subir la temperatura demasiado para prevenir descomposición térmica del analito o la fase estacionaria.
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La programación de la presión es útil para analitos lábiles que no puedan tolerar altas temperaturas.
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CARRIER GAS
La eficiencia de la columna y el detector depende de la identidad del gas soporte.
El He , N2 , y H2 dan alturas de plato óptimos a una velocidad de flujo diferente. (ver curva de van deemter)
Entre más rápidamente un soluto se difunde entre las fases, mas pequeña es la transferencia de masa, termino Cux en la ecuación de Van Deempter
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Para la eficiencia de la columna y la velocidad de análisis, el H2 es un buen gas soporte. .
El H2 puede reaccionar catalíticamente con compuestos insaturados sobre superficies metálicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
Se deben usar gases de alta calidad y a aún así estos deben pasarse a través de filtros para remover el oxigeno , agua y trazas de compuestos orgánicos antes de que estos entren a la columna.
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INYECCION DE LA MUESTRA
Los líquidos son inyectados con una jeringa a través de un serpentín de caucho pasando por el glass liner silanizado.
El gas soporte barre la muestra vaporizada desde el puerto de inyección hacia la columna cromatográfica.
El volumen de inyección es típicamente 0,1 – 2 uL de muestra.
La muestra descompuesta y componentes no volátiles lentamente se acumulan en el glass liner el cual debe ser reemplazado periódicamente.
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INYECCIÓN SPLIT
Medio de introducir pequeños volúmenes de muestra en columnas open tubular
Este modo se utiliza si el analito de interés constituye mas del 0.1% de la muestra .
Para trabajos de alta resolución, los mejores resultados son obtenidos con este modo de introducción de la muestra, preferiblemente conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno de los componentes.
Una inyección split libera solamente 0,2 – 2 % de la muestra en la columna.
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INYECCION SPLITLESS
Modo de inyección preferido para análisis a nivel de trazas, el analito constituye menos del 0,01% en la muestra.
La temperatura de inyección para el modo splitless es mas bajo que para el modo split, aprox 220 0C por que la muestra gasta mucho mas tiempo en el puerto de inyección y no queremos que ocurra descomposición térmica.
El tiempo de residencia en el glass liner es aprox de 1 min por que el gas soporte fluye a través del liner a la columna con una velocidad de flujo aprox 1 mL/min.
En este modo el 80% de la muestra entra a la columna. Este modo es mejor a niveles de trazas para solutos de alta ebullición en
solventes de baja ebullición
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SOLVENT TRAPPING
La temperatura inicial de la columna esta a 400C por debajo del punto de ebullición del solvente el cual se condensa al inicio de la columna.
Cuando llega el soluto a ese punto de la columna es atrapado por el solvente en una banda estrecha al principio de la columna.
El solvent trapping conduce a picos cromatograficos agudos. Sin el solvent trapping no se pueden conseguir picos agudos. La cromatografía es iniciada elevando la temperatura de la columna para
evaporar el solvente atrapado en la cabeza de la columna.
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COLD TRAPPING
Otro medio de condensar solutos en una banda estrecha al inicio de la columna.
La temperatura inicial de la columna es 1500C mas bajo que el punto de ebullición del soluto de interés.
El solvente y componentes con baja ebullición son eluídos rápidamente, pero los solutos con alta ebullición permanecen en un banda estrecha.
La columna es rápidamente calentada para iniciar la cromatografía de los solutos de alta ebullición
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INYECCION ON COLUMN
Se usa para solutos térmicamente inestables, y solventes con alto punto de ebullición. Es mejor para análisis cuantitativos que la inyección split /splitless.
La solución es inyectada directamente en la columna.
En este procedimiento la muestra es sometida a la mas baja temperatura posible para evitar la perdida de soluto.
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DETECTORES
Un detector no identifica que está eluyendo de la columna, sino que algo está emergiendo.
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CLASES DE DETECTORES
DETECTOR DE IONIZACIÓN POR LLAMA. FID
DETECTOR CAPTURA DE ELECTRONES. ECD
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TERMICA . TCD
DETECTOR NITROGENO FOSFORO. NPD
DETECTOR FOTOMETRICO DE LLAMA. FPD
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DETECTOR IONIZACION POR LLAMA . FID
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos orgánicos.
CARACTERISTICAS: Sensibilidad Estabilidad Excelente rango lineal Fácil operación y mantenimiento Amplia aplicabilidad Todo estos detalles lo hace el más popular de los detectores en
cromatografía de gas.
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PRINCIPIOS: FID Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colector. El carrier gas
que sale de la columna es mezclado con hidrogeno y quemado en la punta de la boquilla, luego se aplica oxigeno como una mezcla de aire en la cámara de combustión para asegurar la eficiencia de la ionización del efluente de la columna.
Esta combustión genera iones. El movimiento de estos iones desde la llama al colector cargado positivamente produce una pequeña corriente, estando presente siempre una señal de fondo.
Al introducir un compuesto orgánico en la llama produce unos iones que incrementa la corriente de base. Esta señal es procesada por el registrador en un correspondiente pico cromatográfico.
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DETECTOR CAPTURA DE ELECTRONES ECD
Es un detector de ionización que es específico para compuestos que capturan electrones.
Es usado para análisis de compuestos halogenados debido a la sensibilidad extrema para estos compuestos.
PRINCIPIOS Y OPERACIÓN. Unos electrones de una fuente radiactiva Ni63 es usado para bombardear
el efluente de la columna pasando a través del detector. El make up gas es ionizado por los electrones libres de la fuente,
produciéndose un plasma que contiene entre otras especies electrones térmicos.
Se aplica una diferencia de potencial a la celda del detector, el cual permite la captura de iones cargados negativamente y de electrones.
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Esto crea una corriente que es la base para todas las medidas. Cuando llegan los compuestos afines a los electrones estos son capturados produciéndose una diferencia de corriente que es registrada y transformada en una señal.
La cantidad de corriente reducida es una función de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de capturar electrones.
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DETECTOR CONDUCTIVIDAD TERMICA. TCD
Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza casi universal del FID ha hecho la utilidad del TCD útil solamente en áreas de aplicación limitada.
PRINCIPIO: Consiste en dos celdas cada una con un filamento calentado cuya
resistencia al flujo de corriente es mantenida electrónicamente. El carrier gas con el compuesto de interés pasará a través de una celda,
mientras que la otra celda (referencia) recibirá solamente el carrier gas que no ha pasado a través de la columna.
Los filamentos se calientan simultáneamente, cuando pasa la muestra con el carrier gas hay una absorción de calor por la muestra, lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos filamentos de los dos compartimientos.
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. Un cambio en la temperatura es medido por el correspondiente cambio
en la resistencia del filamento. El cambio resultante en la resistencia del filamento ( temperatura) es comparado con el filamento de la celda de referencia.
La diferencia entre las corrientes de las dos celdas es la señal, que es enviada al registrador para procesarlo en un pico cromatográfico
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DETECTOR NITROGENO FOSFORO. NPD
Es un detector de ionización que es selectivo hacia compuestos que contienen atomos de nitrógeno o fósforo.
PRINCIPIOS DE OPERACIÓN: Funciona casi similar a FID excepto que tiene una sal alcalina sobre la
llama en la cámara de combustión. Una bolita de silicato de aluminio (sulfato de rubidio) es calentada
electrónicamente a 600 – 800oC por aplicación de una corriente, produciéndose un plasma sostenida por adición de hidrogeno y aire.
Los iones del metal alcalino son emitidos desde aquí interactuando con el efluente de la columna.
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Una pequeña corriente es producida por los movimientos de iones generados desde el plasma al colector cargada positivamente.
La introducción de nitrógeno o fósforo contenidos en los compuestos causa un aumento en la corriente por encima de la corriente base.
Esta señal es procesada por el registrador en un pico cromatográfico.
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DETECTOR FOTOMETRICO DE LLAMA
Es un detector óptico. Es específico para compuestos que contienen fósforo y sulfuros. PRINCIPIOS DE OPERACIÓN: Se combina H2 y aire (O2) para producir una llama, el compuesto
azufrado que proviene del efluente de la columna se quema en la llama y emite una longitud de onda característica del S2, la cual es seleccionado por un filtro, luego esta luz emitida es enviada a un tubo foto multiplicador que la transforma en corriente, la cual es enviada al registrador para su procesamiento en el correspondiente pico cromatográfico. H2/O2 flame
Compuesto azufrado SO + Producto S0 + O3 SO2
* + O2
SO2* SO2 + energia
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PREPARACION DE LA MUESTRA
Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea adecuada para el análisis.
El proceso podría evaluar: extracción del analito en una muestra compleja, preconcentración de analito muy diluida para su medición, remover o enmascarar las especies interferentes, o transformar químicamente el analito en una especie mas conveniente a una forma mas fácilmente detectable. (derivatización)
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MICROEXTRACCION EN FASE SÓLIDA SPME
Método por medio del cual se puede extraer compuestos de líquidos, aire o lodo sin usar ningún solvente.
PURGA Y TRAMPA Es un método para remover analitos volátiles de líquidos o sólidos (tal
como aguas subterránea o suelos)concentrando el analito e introduciéndolo en el cromatógrafo.
En contraste con la SPME el cual remueve una porción del analito de la muestra , el objetivo de purga y trampa es remover el 100% del analito en la muestra.
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Se burbujea el gas de purga He en el recipiente donde se encuentra la muestra, el cual es calentado para ayudar a la evaporación del analito, el gas de purga junto con el analito salen y pasan a través de un tubo de adsorción que contiene tres capas de compuestos de adsorbente con fuerzas adsorbentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado
el tubo con los analitos adsorbidos e inyectados en el cromatógrafo de gas, donde empieza la desorción.
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SELECCIÓN DEL METODO EN CROMATOGRAFIA DE GAS
Para seleccionar un método en cromatografía de gas se debe tener en cuenta lo siguiente:
OBJETIVO DEL ANALISIS PREPARACION DE LA MUESTRA DETECTOR COLUMNA INYECCION
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OBJETIVO DEL ANALISIS: Que se requiere del análisis?: La identificación cualitativa de los componentes de una mezcla? Requiere la separación una alta resolución en todo el cromatograma?
O una buena resolución en una porción de este? Puede sacrificar resolución por tiempo de análisis cortos? Necesita el análisis cuantitativo de uno o mas componentes? Necesita alta precisión? Se encuentra el analito en concentración adecuada o necesita técnicas
especiales para ultra análisis (preconcentración y un detector muy sensible).
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PREPARACION DE LA MUESTRA. La clave para una cromatografía exitosa en una muestra compleja es
limpiarla antes de entrar a la columna, para ello se usa la técnica SPME o purga y trampa.
Otros métodos incluyen extracción líquida, extracción fluidos supercríticos, extracción en fase sólida, desorción térmica de volátiles de un material sólido.
Estas técnicas aíslan el analito deseado de sustancias interferentes y pueden además concentrar analitos diluidos hasta niveles detectables.
Si la muestra no se limpia bien pueden aparecer un gran numero de picos no resueltos y sustancias no volátiles pueden arruinar su costosa columna cromatográfica.
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ESCOGENCIA DEL DETECTOR
Para ello se hace necesario si quiere un detector específico para un elemento en particular, o para una clase particular de compuesto ej: el FID requiere que la muestra contenga mayor o igual a 10 ppm de cada analito para la inyección split.
El de conductividad térmica detecta toda clase de compuestos pero no es suficientemente sensible para análisis alta resolución y columnas open tubular de diámetro estrecho.
El ECD es específico para moléculas que contienen halógenos, carbonilos conjugados, nitrilos, y compuestos nitro.
La muestra debe contener concentración mayor o igual a 100 ppb de cada analito.
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El detector de fotoionización es específico para compuestos aromáticos.
NPD para compuestos no nitrógeno y fósforo.
FPD para compuestos que contienen sulfuros.
Fotométrico de llama para elementos como S, P , Pb o Sn.
Los detectores de masas e IR son utilizados para identificar los eluatos.
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SELECCIÓN DE LA COLUMNA
Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el diámetro de la columna, la longitud y el espesor de la fase estacionaria.
Las columnas pueden ser de polaridad intermedia, no polar y altamente polar: por ejemplo:
Para compuestos altamente polar se necesita una columna fuertemente POLAR.
Una columna con fase estacionaria intermedia hará las mayorías de las separaciones que la columnas no polar no pueden hacer.
Las mas alta resolución es alcanzada con columnas estrechas y una fase estacionaria con espesor muy delgado. Esta combinación minimiza la resistencia a la transferencia de masa termino C en la ecuación de van Deemter, la fase estacionaria y la móvil reducen la altura de plato.
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Columnas de películas delgada, estrechas son especialmente buenas para separaciones de mezclas de compuestos de alto punto de ebullición que son retenidos demasiado fuertemente sobre columnas con películas gruesas.
El tiempo de retención corto provee alta velocidad de análisis, sin embargo película con espesor de películas delgado, diámetro estrecho tienen muy poca capacidad de muestras y requieren un detector con alta sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos con bajo punto de ebullición y podría sufrir exposición de sitios activos sobre la superficie de la sílice.
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Columnas con películas gruesa y estrecha dan una buena combinación entre resolución y capacidad de muestra y pueden ser usada con la mayoría de los detectores (excepto los TCD y el IR) y con compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retención son más largos que aquellos de columnas con película delgada.
Columnas con diámetro grande y películas gruesa son sugeridas para detectores de conductividad térmica TCD e IR ya que tienen alta capacidad de muestra y pueden manejar compuestos volátiles, pero dan baja resolución y tiempos de retención muy largos
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Si una columna en particular satisface la mayoría de sus requerimientos pero no provee suficiente resolución, entonces una columna mas larga del mismo tipo podría ser usada. Doblando la longitud de la columna dobla el número de platos y aumenta la resolución en 21/2, aunque esta no es la mejor manera de aumentar la resolución por que dobla el tiempo de retención.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas delgada incrementa la resolución sin perjudicar el tiempo de retención. Cambiando completamente el tiempo de retención cambia también la retención relativa de los componentes y podría resolver los componentes de interés.
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ESCOGENCIA DEL MODO DE INYECCION
INYECCION SPLIT es útil para analitos altamente concentrados y análisis de gases. Es muy pobre para análisis cuantitativo.
Alta resolución.
Muestras concentradas.
Muestras sucias (usa un adsorbente en el liner)
Podría causar descomposición térmica
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INYECCION SPLITLESS
Es requerida para muestra muy diluidas.
Alta resolución Pobre en análisis cuantitativo (perdida de compuestos volátiles durante
la inyección) Requiere cold trapping o solvent trapping (introducción de la muestra
lentamente en la columna)
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INYECCION ON COLUMN
Es mejor para análisis cuantitativo y compuestos térmicamente sensibles.
Es una técnica de baja resolución y no puede ser usada con columnas cuyo diámetro interno sea menor de 0.25 mm.
Puede manejar soluciones diluidas o concentradas y volúmenes relativamente grandes o pequeños.
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ANALISIS CUANTITATIVO Y CUALITATIVO
Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El espectrómetro de masas y el IR con transformada de fourier.
Un pico puede se identificado comparando su espectro con una biblioteca de espectros que tiene el computador.
CO-CHROMATOGRAPHY. Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retención. Una muestra autentica es agregada a una desconocida. Si el componente
agregado es idéntico a la desconocida, entonces el área relativa del pico aumenta.
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ANALISIS CUANTITATIVO
Se basa en el área del pico cromatográfico, normalmente se escogen las condiciones bajo los cuales la respuesta es lineal, lo que quiere decir que el área del pico es proporcional a la cantidad del componente.
Si el pico tiene forma gausiana, o se mide manualmente el área del pico se calcula así:
Área pico = 1.064 x altura de pico x W1/2.
En cromatografía el análisis cuantitativo es llevado acabo agregando una cantidad conocida de un estándar interno al desconocido. Después se mide el factor de respuesta del estándar según la ecuación:
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continuación
Ax/[X] = F (As/[S]
Ax = área de la señal del analito
As = área del estándar interno
[X] = concentración del analito [ S ] = concentración del estándar F = factor de respuesta
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