CUADERNILLO DE PRACTICAS DE CITOMETRÍA DE · PDF fileEjercicios de análisis: 1 Indicar el porcentaje de las células leucocitarias que aparecen en el siguiente dot plot de tamaño

J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas 2008/2009

CUADERNILLO DE PRACTICAS DE

CITOMETRÍA DE FLUJO

TIPOS DE ANÁLISIS

BASES EN INMUNOLOGÍA Inmunología. Curso 2008-2009

Jorge Monserrat Sanz

E. Reyes, A. Prieto, D. Díaz.

Departamento de Medicina

Facultad de Medicina

Universidad de Alcalá

J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas Biología 2007/2008

Tema 1: Fenotipo: Ideas Generales de Análisis

En esta práctica hay 10 ejercicios de análisis. Cada pregunta tiene un número que

le relaciona con la hoja de análisis sobre la cual tenéis que trabajar para responder a

las preguntas. Las hojas de análisis se encuentran detrás del grupo de preguntas, y

tienen en su margen inferior izquierda números para saber a que preguntas

pertenecen. Primero leer la pregunta y el número, después localizar la hoja de análisis

y estudiar sobre ella lo que se os pida.

Ideas generales que hay que conocer para realizar la práctica:

- Dot plots e Histogramas

- Cuadrantes de los dots plots

- Gates o puertas lógicas

- Estadísticas: %, números, y MFI.

Ejercicios de análisis:

1 Indicar el porcentaje de las células leucocitarias que aparecen en el siguiente dot

plot de tamaño (FSC) y granularidad (SSC) sabiendo que:

a. Los linfocitos son más pequeños que los monocitos que a su vez tienen un

tamaño menor o igual que los granulocitos.

b. Los monocitos teñen un retículo endoplasmático más desarrollado que los

linfocitos pero presentan menos granulos que los neutrofilos.

NOTA: Una vez identificadas las poblaciones, recalcular los porcentajes como sí

la población de leucocitos fueran el 100 % de la población.

2. Si el hemograma de una persona nos indica que tiene 10000 leucocitos por

microlitro, ¿Que número de células por microlitro tendrá de cada tipo

leucocitario?

(Puesta en común y Discusión)

3. Relacionar los siguientes histogramas de tamaño y granularidad con el dot plot

anterior. Identificar las poblaciones leucocitarias.Indicar su porcentajes sabiendo

que pertenecen al dot plot anterior (es decir: son las mismas células usadas en el

dibujo anterior pero vistas en histogramas en vez de dot plots).

4. Como demostrarías que cada nube de células identificadas en el dot plot anterior

de tamaño (FSC) y complejidad celular (SSC) son realmente linfocitos, monocitos

y granulocitos. ¿Que técnica experimental usarías para identificar estos tipos

linfocitarios?. Pensar que os podíamos estar engañando.


5. Caracterizar según mareaje de superficie las principales poblaciones leucocitarias.


J. Monserrat. Dto Medicina. Prácticas Biología 2007/2008

6. Indicar los porcentajes y MFI (Intensidad Media de Fluorescencia) de las

principales subpoblaciones celulares en que se dividen los linfocitos de sangre

periférica que aparecen en los siguientes dot plots.

7. Relacionar los siguientes histogramas de fluorescencia con sus dot plots

Comprobar los porcentajes y MFI


8. Se presentan dos casos distintos para estudiar las diferencias entre ellos. Comparar

el caso estudiado en el punto anterior (6) con el nuevo caso. Una vez identificadas

las poblaciones, indicar las diferencias encontradas entre ellos (en porcentage y

mfi).

Pensar que:Los porcentajes normales de los linfocitos en sangre son: 60-70% de

linfocitos T, 5-15 % de linfocitos B, 10-15 % de células NK

Una vez encontradas las diferencias comparar el caso estudiando si el número

de linfocitos por microlitro es:

En el caso 6 : 2000 linfocitos por microlitro

En el caso 8 : A. 10000 linfocitos por microlitro

B. 2000 linfocitos por microlitro


9. Leucemia Linfática Crónica: Diagnóstico diferencial mediante la expresión de

células CD5+

Estudio comparativo de dos muestras: Indicar solo el % de células B (CD19+) que

expresan CD5+ sobre el 100% de las B (y no sobre el total de linfocitos, que es lo

que hemos hecho en el ejercicio anterior) y el % de células B (CD19+) que expresan

CD20+ sobre el 100% de las B.

¿Cual de los dos ejemplos sugeriríais que tiene una leucemia linfática?


10. Sida (HIV): Cuantificación de subpoblaciones linfocitarias para el diagnóstico y

seguimiento de enfermos con HIV mediante el cálculo del ratio CD4/CD8.

Estudio comparativo de dos muestras:Indicar el porcentaje de T (CD3+) que expresan

CD4+, CD8+ y dobles positivas. Calcular el ratio CD4/CD8 y sacar el número de

cifras absolutas en función de los posibles hemogramas que el profesor de prácticas

proponga. Caso 1: 2000 linfocitos/ul. Caso 2: 800 linfocitos/iU

¿Cual de los dos ejemplos sospecharías una infección con un HIV?

Nota: El manejo clínico de estos pacientes en la actualidad se hace con el número

absoluto de CD4+ y con la cuantificación de la carga viral (PCR)


FSC.001

200 400 600

FSC-Height

800 1000

Región Statistics

File: FSC.001

SamplelD:SP10BASAL

Tube: tube #1

Acquisition Date: 12-Apr-99

Gated Events: 56643

X Parameter FSC-H FSC-Height (Linear)

Log Data Units: Linear Valúes

Patient ID: 12/4/99

Panel: MODS

Gate: No Gate

Total Events: 56643

Y Parameten SSC-H SSC-Height (Linear)

Región Events % Gated % Total XMear. XGeoMaan Y Mean YGeoMean Px.Py

RÍ 2006 Ü51 3.54 285.63 282.87 111.50 105.38 Í7Í* R2 2986 5.27 5.27 492.09 490.07 336.87 332.37 1,2

R3 44321 78.25 78.25 494.95 491.24 672.39 657.77 1.2

Page 1

Counts

80 120 40

Counls

80 120 160 200

a (O

(D

Counts

40 80 120 160 200

Counls

80 120 160 200

-A

Counts Counts Counts

200

o-

FSC.041

200

400

600

FSC-Height

800

1000

SE APLICA LA REGIÓN R1

FSC.041

",ÓP io1

io2 1¿3

1Ó4 C015

"o.

£csi

8 *"

°o

FSC.041

1 *-c

10v 10

10

CD4S

,2" "lT«3 10%

10'

FSC.041

10


co o

ü

o

o

FSC.041

To2 CD15

103 10*

FSC.041

co o J

Q

o-

o

• o.

FSC.041

10"

10' CD45

103


FSC.041

10

FSC.041

10

CD45

fscspii.034

200

File: fscspi 1.034

Patient ID: 26/6/99

Gate: G1

Total Events: 21270

400 600

' FSC-Height

600 1000

Sample ID: sp11 basal


Gated Events: 2449

Quad Location: 7,14 LU

Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean YGeoMean

UL

UR

LL

LR

256

260

435

1498

10.45

10.62

17.76

61.17

1.20

1.22

2.05

7.04

2.96

270.06

3.26

254.45

2.73

220.57

220.62

407.66

199.74

4.48

3.11

308.30

108.18

3.79

2.13

o.

^i%

fscspi 1.034

0 '1 '2 '3

fscspi 1.034 CD3RTC

P

§

o-

10° 101 CD3FITC

fscspi 1.034

File: fscspi 1.034

Patient ID: 26/6/99

Gate: G1

Total Events: 21270

Sanrtple ID: sp 11 basal


Gated Events: 2449

Quad Location: 12, 10

Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean Y Geo" Mean

UL 421 17.19 1.98 4.56

UR 59 2.41 0.28 113.75

LL 1477 60.31 6.94 2.88

LR 492 20.09 2.31 304.93

CD56 PE

Page 1

fscspi 1.034

File: fscspi 1.034

Patient ID: 26/6/99

Gate: G1

Total Events: 21270

Sample ID: spi 1 basal

Acquisrtion Date: 26-Apr-99

Gated Events: 2449

Marker Le», Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean

AÜ 1, 9910 2449 100.00 11.51 185.20 64.98 M1 1. 10 690 28.17 3.24 3.26 2.99

M2 10, 764 1752 71.54 8.24 257.61 223.30

CD3FITC

fscspi 1.034

10

CD56PE

fscsp.11.034

CD19TC 10

Page Z

F_S_C.OO3

1

O 200 400 600 800 1000

FSC-Height F_S_C.OO3

10"

F_S_C.OO3

Gate: G2

Total Events: 14917

Gated Events: 9686

Quad Location: 15,22

Quad Events % Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

UL

UR

LL

LR

7600 78.46 50.95 4.42

51 0.53 0.34 258.04

1286 13.28 8.62 5.05

749 7.73 5.02 275.90

F_-S_C.G03

°OJ

.• 102 1¿3 CD3F1TC

4

Page 1

F_S_C.OO3

File: F_S_C.OO3

Patient ID: L-210

Gated Events: 9686

Sample ID: F. S.C.

Gate: G2

Total Events: 14917

Marker Events % Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh

All

M1

M2

9686

8309

1378

100.00

85.78

14.23

64.93

55.70

9.24

43.98

3.76

286.48

6.48

3.51

259.68

97

97

27

4

4

266

F_S_C.OO3

10

F_S_C.OO3

10

Page 2

FSC20119.034

600

FSC-Height

1000 FSC20119.034

noJ

UJ 0C

o-

101 102 cd20FITC

10"

'o. FSC20119.034

o.

FSC20119.034

10 10 102 cd20FITC

103 10" Page 1

FSC20119.034

8. M1

10"

M2

102 103 CD20FITC

10"

FSC20119.034

10

File: FSC20119.034

Patient ID: ED1 24 h

Gated Events: 1964

Sample ID: fsc 20/11/98

Gate: G2

Total Events: 14458


All

M1

M2

1964

400

1568

100.00

20.37

79.84

13.58

2.77

10.85

118.58

3.94

147.55

42.88

3.53

80.73

12

12

11

1

1

203

FSC20119.034

10

Ríe: FSC20119.034

Patient ID: ED1 24 h

Gated Events: 1964

Sample ID: fsc 20/11/98

Gate: G2

Total Events: 14458


All

M1

M2

1964

1808

156

100.00

92.06

7.94

13.58

12.51

1.08

22.83

3.92

242.02

4.07

2.92

196.19

231

231

4

1

1

106 Page 2

F_S_C.O22

200 400 600

FSC-Height

800 1000

F_S_C.O22

8° u

o-

°OJ

F_S_C.O22

Gde: G2

Total Events: 14836

1¿2 CD20FITC

Gated Events: 9900

Quad Location: 15,22

Quad Events % Gated % Total XMean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

UL 168 1.70 1.13 9.85

UR 7531 76.07 50.76 189.47

LL 149 1.51 1.00 8.54

LR 2052 20.73 13.83 284.29

10'

F_S_C.O22

102 CD20FITC

M1

10'

F_S_C.O22

M2

102 CD20F1TC

■ ""'¡A

Ríe: F_S_C.O22

Patient ID: L-210

Gated Events: 9900

Sample ID: F. S.C.

Gate: G2

Total Events: 14836


All

M1

M2

9900

2317

7558

100.00

23.40

76.34

66.73

15.62

50.94

30.25

3.26

38.61

17.80

3.00

30.83

56

34

56

41

1

41

F_S_C.O22

10 10

Ríe: F_S_C.O22

Patient ID: L-210

Gated Events: 9900

Sample ID: F. S.C.

Gate: G2

Total Events: 14836


All

M1

M2

9900

213

9691

100.00

2.15

97.89

66.73

1.44

65.32

203.35

7.00

207.59

134.22

5.96

143.59

53

4

53

152

1

152

F_S_C.O22

1¿2 CD19PerCP

10

Ríe: F_S_C.O22

Patient ID: L-210

Gated Events: 9900

Sample ID: F. S.C.

Gate: G2

Total Events: 14836

Marker Events % Gated % Total Mean. GeoMean Peak PeakCh

All

MI

M2

9900

1901

7998

100.00

19.20

80.79

66.73

12.81

53.91

70.93

4.61

80.88

40.04

3.61

70.50

140

140

88

1

1

76 Page2

fscleti.003

fscleti.003

200

Gate: G2

Total Events: 8897

400 600

FSC-Height

800 1000

Gated Events: 2913

Quad Location: 6. S

Quad Events % Gated % Total X Mean XGeoMean Y Mean YGeoMean

UL

UR

LL

LR

1379

73

578

883

47.34

2.51

19.84

30.31

15.50

0.82

6.50

-932

2.53

138.91

2.50

225.61

2.33

55.64

2.29

171.36

153.99

69.19

2.92

1.95

130.78

33.34

2.57

1.58

10 102 CD8FITC

fscleti.003

°OJ

O. * •■ ■ ■

1¿2 CD4PE

fscleti.003

o o-

'.-•■' .

, 102 CD8FITC

1¿3 10* Page 1

fsclet¡.003

M1

M2

File: fscleti.003

Patient ID: 26/6/99

Gated Events: 2913

Sample ID: leti

Gate: G2

Total Events: 8897


All

M1

M2

2913

1973

941

100.00

67.73

32.30

32.74

22.18

10.58

73.57

2.55

222.39

9.24

2.33

165.61

100

100

14

1

1

268

fscleti.003

10'

hile: fscleti.003

Patient ID: 26/6/99

Gated Events: 2913

Sample ID: leti

Gate: G2

Total Events: 8897


All

M1

M2

2913

1020

1425

100.00

35.02

48.92

32.74

11.46

16.02

75.80

3.12

152.40

15.20

2.69

128.32

458

11

17

1

2

174

fscleti.003

10

File: fscleti.003

Patient ID: 26/6/99

Gated Events: 2913

Sample ID: leti

Gate: G2

Total Events: 8897


to

Ail

M1

M2

2913

581

2332

100.00

19.95

80.05

32.74

6.53

26.21

137.39

3.78

170.68

66.94

3.19

142.88

26

26

25

1

1

201

Page 2

GATED3FSC.003

GATED3FSC.003

200

Gate: G2

Total Events: 46617

400 600

•FSC-Height

800 1000

Gated Events: 1114

Quad Location: 6, 8

°OJ

üJ Quad Events % Gated % Total XMean XGeoMean Y Mean YGeoMean tu*

UL

UR

LL

LR

115 10.32 0.25 3.09

18 1.62 0.04 138.74

736 66.07 1.58 1.97

245 21.99 -0:53 222.30 o.

°o

■*.V"!

__^£

CD8FITC

GATED3FSC.003

o.

hÍ

• •'.* '

10' i¿ CD4PE

1¿3 '4

GATED3FSC.003

/O Page 1

GATED3 FSC.003

1¿2 CD8FITC

File: GATED3 FSC.003

Patient ID: 12/4/99

GatedEvents: 1114

SamplelD:SP10BASAL

Gate: G2

Total Events: 46617

Marker Events %Gated % Total Mean GeoMean Peak PeakCh

All

M1

M2

1114

856

258

100.00

76.84

23.16

2.39

1.84

0.55

52.75

2.15

220.66

5.13

1.92

132.82

100

100

5

1

1

305

10'

GATED3 FSC.003

10

File: GATED3 FSC.003

Patient ID: 12/4/99

GatedEvents: 1114

SamplelD:SP10BASAL

Gate: G2

Total Events: 46617


All

M1

M2

1114

852

125

100.00

76.48

11.22

2.39

1.83

0.27

32.71

2.87

270.89

3.80

2.56

240.90

126

15

5

1

3

207

GATED3 FSC.003

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