LEUCEMIAS Y HEMOSTASIA

PRACTICAS DE LABORATORIO

ESPECIALIDAD LABORATORISTA CLINICO

V SEMESTRE

Nombre:_______________________________________

CONTENIDOObjetivo

Fundamentación

Practica 1 Recuento Diferencial

Práctica 2 Determinación del Tiempo de Sangrado

Práctica 3 Recuento de Plaquetas

Práctica 4 Determinación del Tiempo de Protrombina.

Práctica 5 Determinación del Tiempo de Tromboplastina

Parcial.

Práctica 6 Determinación del Tiempo de Coagulación.

Práctica 7 Determinación del Tiempo de Trombina.

Práctica 8 Determinación Cuantitativa de Fibrinógeno.

Práctica 9 Determinación del Tiempo de Retracción del

Coágulo.

Bibliografía

OBJETIVO

El alumno conoce y aplica los procedimientos para el

diagnóstico de leucemias así como las pruebas que

permiten evaluar la función hemostática de los pacientes.

FUNDAMENTACION

El estado de salud de un individuo se investiga desde

diversos puntos de vista; uno de ellos es a través de la

sangre; donde se pueden encontrar importantes

alteraciones en nuestro organismo, ya que está en

contacto directo con todos los órganos de nuestra

economía.

Con este submódulo el estudiante identificará las

patologías de la serie blanca así como las alteraciones en

el proceso de hemostasia, aplicando las técnicas

pertinentes para su estudio.

PRACTICA 1 RECUENTO TOTAL Y DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

La prueba de conteo de glóbulos blancos (GB) mide dos cosas: el número total de glóbulos blancos (leucocitos) y la cuenta diferencial. La cuenta diferencial mide los porcentajes de cada tipo de leucocito. Los glóbulos blancos están compuestos de granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) y no granulocitos (linfocitos y monocitos).

Los glóbulos blancos (GB) son un componente principal del sistema inmunológico del cuerpo.

El conteo de glóbulos blancos puede indicar enfermedades infecciosas e inflamatorias, leucemia, linfoma y trastornos de la médula ósea.

FUNDAMENTO: Los leucocitos son células blancas en circulación, invisibles bajo el microscopio, por lo que se hace necesaria la aplicación de un colorante para evidenciarlas.Para hacerlas visibles en el recuento total se utiliza una solución de acido acético con un toque de azúl de metileno y durante el recuento diferencial las características morfológicas de cada uno de ellos, se ponen de manifiesto gracias a su reacción frente al colorante de Wright.

MATERIAL Y EQUIPO:

-Tubo de ensaye con anticoagulante E.D.T.A. para muestra de sangre total

RECUENTO TOTAL-Pipeta de Thoma-Boquilla-Líquido de Turk-Tubo de Kahn-Cámara de Neubauer-Microscopio-Contador celular

RECUENTO DIFERENCIAL-Laminillas portaobjetos-Colorante de Wright (en su defecto hemocolorantes rápidos)- Solución buffer para colorante de Wright-Varillas de tinción-Agua destilada-Microscopio-Contador celular diferencial

PROCEDIMIENTO:

RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS1.- Homogeneizar la muestra de sangre con movimientos de inversión lenta del tubo.2.- Conectar la boquilla en la pipeta de Thoma y aspirar muestra de sangre hasta la marca de 0.5, cuidadosamente limpiar el capilar de la pipeta y enrasar la muestra.3.- Introducir la punta de la pipeta de forma vertical y rápidamente aspirar Líquido de Turk hasta la marca de 11.4.- Desconectar la boquilla y agitar la pipeta vigorosamente durante 2 minutos, cuidando tapar ambos extremos de la pipeta.5.- Desechar las primeras tres gotas del capilar y llenar la cámara de Neubauer con la cuarta.6.- Dejar reposar la cámara durante un minuto sobre el microscopio, transcurrido éste tiempo enfocar el rayado central con objetivo de 10x.7.- Realizar el recuento en las 4 cuadrículas grandes de los extremos.8.- Obtener el número de leucocitos por mm3 (uL) multiplicando por 50.

RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS 1.- Limpiar cuidadosamente los portaobjetos, dejándolos libres de restos de detergente, agua, grasa, etc.2.- Realizar un frotis con una gota de la sangre, y dejar secar, durante al menos 15 minutos.

3.- Colocar el frotis sobre las varillas de tinción y agregar el colorante de Wright, dejar actuar durante 8 minutos. 4.- Sobre el colorante agregar solución buffer hasta que se forme una superficie como de espejo, dejar actuar durante 5 minutos.5.- Eliminar los reactivos y enjuagar con agua corriente, evitando el chorro directo.6.- Limpiar la base del portaobjetos y dejar secar.7.- Observar al microscopio con objetivo de 100x.8.- Contar un mínimo de 100 células (de preferencia 200), ayudados de un contador hematológico y sacar porcentaje de las células observadas.

NOTA: Para utilizar los hemocolorantes rápidos, se introduce la laminilla durante 5 a 10 segundos primero en Metanol, enseguida la Eosina y por último en el Azul de Metileno, cuidando de escurrir al máximo el portaobjetos antes de introducirlo al siguiente reactivo..

RESULTADO: Diferenciar de acuerdo a sus características, los diferentes tipos de leucocitos

VALORES NORMALES:Linfocitos 20 – 45% Neutrófilos segmentados 40-75% Mielocitos 0%Monocitos 2 – 10% Neutrófilos en banda 2 – 7% Metamielocitos 0%Basófilos Hasta 1% Eosinófilos 1 – 6%

ACTIVIDAD

1.- Define el principio de la tinción de Wright

2.- Especifica que es una tinción tipo Romanowsky

3.- ¿Cual es la imprtancia de las tinciones en la detección de Leucemias?

4.- Dibuja las diferentes alteraciones morfológicas que presentan los leucocitos

5.- De internet busca un artículo sobre el tema de leucemias y su actual

diagnóstico, y posteriormente realiza una síntesis del mismo

PRACTICA 3 RECUENTO DE PLAQUETAS

MÉTODO DEL OXALATO DE AMONIO

FUNDAMENTO: Las plaquetas son los elementos formes mas pequeños de la sangre, actúan en la hemostasia y en el mantenimiento de la integridad vascular, además de participar en el proceso de la coagulación sanguínea.

MATERIAL Y EQUIPO:- Tubo de ensaye con anticoagulante EDTA- Pipeta de Thoma para glóbulos rojos- Caja Petri- Cámara de Neubauer- Cubrehematímetro- Agitador mecánico de pipetas de Thoma- Solución de Oxalato de amonio al 1%

PROCEDIMIENTO:1.- Llenar con sangre la pipeta de Thoma para glóbulos rojos hasta la marca de 0.52.- Llenar con Oxalato de amonio al 1% hasta la marca de 101.3.- Agitar durante 30 segundos.4.- Llenar la cámara de Neubauer y reposar en un ambiente húmedo dentro de una caja petri por 20 minutos.5.- Contar las plaquetas en 10 cuadros pequeños (en el área correspondiente para glóbulos rojos).

RESULTADO:Las Plaquetas se observarán refringentes con objetivo de 40x.

CALCULO:

Número de plaquetas contadas------------------------------------- X Dilución X 250 = miles de plaquetas / mm3 Número de cuadros contados

VALORES NORMALES: 150,000 – 400, 000 plaquetas / mm3 (µl)

ACTIVIDAD

1.- ¿Que otros métodos son utilizados para el recuento Plaquetario?

2.- ¿Que alteraciones pueden presentar las plaquetas causando patologías en el ser humano?

3.- Dibuja una plaqueta inactiva y una activada identificando sus principales Características

4.- Esquematiza la actividad de las plaquetas en una lesión vascular

PRACTICA 2 DETERMINACION DEL TIEMPO DE SANGRADO

FUNDAMENTO: La duración de la hemorragia procedente de una punción cutánea habitual es una medida de la función plaquetaria, así como de la integridad de la pared vascular.

MATERIAL Y EQUIPO:- Reloj de laboratorio o cronómetro- Lanceta estéril- Papel filtro- Portaobjetos- Torundas de alcohol

PROCEDIMIENTO:1.- Limpiar el lóbulo de la oreja (o parte interna de la yema del dedo anular) con alcohol y dejar secar 2.- Colocar el portaobjetos detrás del lóbulo para proporcionar un sitio firme y estable.3.- Se punciona el lóbulo utilizando la lanceta. Se retira el portaobjetos y se pone el reloj en marcha.4.- Se permitirá que la sangre fluya de la herida sin presión, dejándola gotear sobre el papel de filtro, el cual se moverá de modo que cada gota caiga en un área limpia. Cuando la hemorragia vaya siendo más lenta, se toca la herida suavemente con una parte limpia del papel filtro, a intervalos de 30 segundos cuando la sangre ya no tiña el papel, se para el reloj y se registra el tiempo empleado.

VALORES NORMALES: Entre 6 y 10 minutos

OBSERVACIONES: En los niños pequeños, se puede utilizar el talón para la punción.

ACTIVIDAD

1.- ¿Que cuidados se deben tener al tomar la muestra para ésta determinación?

2.- ¿Que información proporciona ésta determinación dentro del diagnóstico de laboratorio de las alteraciones hemostáticas?

3.- Diferencia mediante esquemas la estructura de las venas y arterias

4.- Esquematiza el proceso de vasoconstricción

5.- ¿Cual es el resultado de la primera fase de la coagulación?

PRACTICA 6 DETERMINACION DEL TIEMPO DE COAGULACIÓN

FUNDAMENTO: La sangre total formará un coágulo firme, cuando se extrae del sistema vascular y se expone a una superficie extraña. Dentro de unos límites, el tiempo requerido para la formación de un coágulo sólido es una medida de la coagulación.

MATERIAL Y EQUIPO:- Cronómetro- Jeringa y aguja estéril- Tubos de ensaye- Baño de agua a 37 ºC

PROCEDIMIENTO:1.- Extraer cuatro mililitros de sangre, poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que la sangre entra en la jeringa.2.- Se colocan aproximadamente un mililitro de sangre en cada uno de los cuatro tubos de ensayo.3.- Colocarlos en baño de agua a 37 ºC.4.- Se inspeccionan los tubos inclinándolos suavemente cada 30 segundos hasta que se le pueda invertir sin que fluya sangre por los lados de los tubos.5.- Una vez formado el coágulo se registra el tiempo.

VALORES NORMALES:Entre 5 y 8 minutos.

OBSERVACIONES:Efectuar un promedio de las cuatro determinaciones el cual se reportará como resultado final del tiempo de coagulación.

ACTIVIDAD

1.- ¿Qué factores influyen en el tiempo de coagulación?

2.- Esquematiza la constitución de un coágulo

PRACTICA 9 DETERMINACION DE LA RETRACCION DEL COAGULO

FUNDAMENTO: La sangre total formará un coágulo firme, cuando se extrae del sistema vascular y se expone a una superficie extraña. Dentro de unos límites, el tiempo requerido para la formación de un coágulo sólido, estable y compacto es una medida de la coagulación, que aporta valiosa información sobre ciertos trastornos de la coagulación.

MATERIAL Y EQUIPO:- Cronómetro- Jeringa y aguja estéril- Tubo cónico y graduado- Resorte o alambre metálico

PROCEDIMIENTO:1.- Extraer 10 mililitros de sangre, poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que la sangre entra en la jeringa.2.- Se colocan en el tubo cónico y se le agrega el resorte metálico.3.- Se deja a temperatura ambiente y se observa a los 15 minutos, período en el cual ya debe existir un coágulo.4.- Al cabo de una hora se inspecciona y se anota el grado de retracción y el tamaño del coágulo (si la retracción es normal, el coágulo debe ocupar un volumen igual a la mitad del de la sangre total.5.- Al cabo de cuatro horas nuevamente debe inspeccionarse y medirse, así como después de su incubación toda la noche.

En los pacientes con coagulación intravascular y excesiva fibrinolisis secundaria, el coágulo puede lisarse con extrema rapidez y puede desaparecer completamente.

En los casos en que la concentración del fibrinógeno es muy baja puede formarse inicialmente un coágulo de tamaño normal, pero al retraerse es demasiado pequeño y cae al fondo del tubo; a menudo éste pasa inadvertido si no se vierte el contenido del tubo en un papel filtro y se busca cuidadosamente.

El volumen del coágulo, expresado en porcentaje del volumen total de sangre, es un índice burdo de la retracción del coágulo. Y éste varía inversamente proporcional al hematocrito y a la concentración de fibrinógeno

ACTIVIDAD

1.- ¿A que se refiere una relación inversamente proporcional?

2.- Esquematiza el proceso de retracción del coágulo en función del tiempo

3- ¿A que e debe el proceso de retracción del coágulo?

PRACTICA 4 DETERMINACION DEL TIEMPO DE PROTROMBINA

FUNDAMENTO: El plasma obtenido de una sangre a la que se ha añadido un anticoagulante que fija el calcio, se coagulará en pocos segundos cuando se recalcifique en presencia de tromboplastina hística. El tiempo transcurrido entre la adición del calcio y la presencia del coágulo es el tiempo de protrombina.El tiempo de protrombina prolongado es indicativo de un nivel disminuido de uno o mas factores del sistema extrínseco, cuya causa puede deberse a trastornos hereditarios de la coagulación, deficiencia de vitamina K, enfermedad hepática, o a la administración de medicamentos.

MATERIAL Y REACTIVOS:- Jeringa y aguja desechables- Tubos de ensaye- Cronómetro- Baño de agua a 37 ºC- Centrífuga- Pipetas serológicas de 0.1 y 0.2 ml- Anticoagulante citrato de sodio al 3.2%- Reactivo de Tromboplastina Hística- Plasma fresco

PROCEDIMIENTO:1.- Preincubar a 37 ºC un volumen suficiente de reactivo de tromboplastina reconstituidos. Evitar la evaporación del reactivo y no mantenerlo a 37 ºC destapado por más de 60 minutos.2.- Marcar un tubo de ensayo para cada muestra (paciente y controles).3.- Pipetear 0.1 ml de Plasma al tubo.4.- Incubar cada muestra a 37 ºC durante 2 a 3 minutos.5.- Pipetear rápidamente 0.2 ml de reactivo de tromboplastina preincubado. Simultáneamente poner el cronómetro en marcha hasta la detección del coágulo.6.- Anotar el tiempo transcurrido, en segundos, hasta la detección del coágulo.

VALORES NORMALES:De 10 a 14 segundos.

OBSERVACIONES:Los resultados obtenidos dependen de numerosos factores tales como temperatura, calidad del agua, pH, fuerza iónica, método utilizado, conservación de las muestras y población de pacientes estudiada.

ACTIVIDAD1.- De las siguientes alteraciones especifica el resultado esperado en la determinación del tiempo de protrombina

Anomalías Congénitas Anomalías Adquiridas Resultado del TP

Déficit de FVII

Déficit de vitamina KEnfermedad hepática

Tratamiento con anticoagulantes orales

Amiloidosis

Déficit de FVIII, FIX o FXI

Inhibidor adquirido anti-FVIII u otros

Déficit de FXII, precalicreina o

cininógeno

Anticoagulante lúpico Presencia de heparina

Enfermedad de von Willebrand

Hematocrito elevado

Déficit de FX o FVDéficit de vitamina K

Déficit de protrombinaEnfermedad hepática

Déficit de fibrinógeno

Tratamiento con anticoagulantes oralesHematocrito elevado

Anticoagulante circulanteTratamiento trombolíticoCoagulación intravascular

diseminadaFibrinolisis

Déficit de FXIII Trombopenia y/o trombopatía

Déficit de a-2-antiplasmina Anomalías vasculares

DisfibrinogenemiaDéficit leve factores

(>20% y < 40%)Gammapatía monoclonal

2.- Esquematiza la vía extrínseca de la coagulación y especifica en donde se activa este mecanismo

PRACTICA 5 DETERMINACION DEL TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA

FUNDAMENTO: Esta prueba mide el tiempo que tarda en coagular el plasma en presencia de una tomboplastina parcial que actúa como sustituto plaquetario. El tiempo parcial de tromboplastina es sensible a todos los factores que intervienen en el sistema intrínseco de la coagulación, a excepción del factor plaquetario tres.

MATERIAL Y REACTIVOS:- Tubo de ensaye- Baño maría eléctrico- Pipetas graduadas - Cronómetro- Cloruro de calcio 0.025 M

PROCEDIMIENTO:1.- Calentar previamente a 37 ºC un volumen suficiente de solución de cloruro de calcio 0.025 M.2.- Identificar un tubo de ensayo para cada muestra a analizar. Se aconseja hacer las pruebas por duplicado.3.- Dispensar 0.1 ml de plasma a su tubo correspondiente. Añadir 0.1 ml de reactivo de factor plaquetario 3 (tromboplastina parcial) a cada tubo.4.- Incubar a 37 ºC durante 5 minutos exactos.5.- Inmediatamente añadir 0.1 ml de CaCl2 0.025 M (37 ºC). Simultáneamente poner el cronómetro en marcha y determinar la formación del coágulo.6.- Anotar el tiempo, en segundos, transcurrido hasta la formación del coágulo.

VALORES NORMALES:De 25 a 43 segundos.

NOTAS SOBRE LA PRUEBA:- Es importante usar material de vidrio muy limpio.- El anticoagulante empleado es citrato Trisódico al 3.2 ó 3.8% en agua destilada.- Para la preparación de las muestras, se utilizará una parte de solución

anticoagulante con nueve partes de sangre recién obtenida. Mezclar con suavidad. El plasma puede emplearse dentro de las cuatro horas siguientes.

ACTIVIDAD

1.- De las siguientes alteraciones especifica el resultado esperado en la determinación del tiempo parcial de tromboplastina activada

Anomalías Congénitas Anomalías Adquiridas Resultado del ATTP

Déficit de FVII

Déficit de vitamina KEnfermedad hepática

Tratamiento con anticoagulantes orales

Amiloidosis

Déficit de FVIII, FIX o FXI

Inhibidor adquirido anti-FVIII u otros

Déficit de FXII, precalicreina o

cininógeno

Anticoagulante lúpico Presencia de heparina

Enfermedad de von Willebrand

Hematocrito elevado

Déficit de FX o FVDéficit de vitamina K

Déficit de protrombinaEnfermedad hepática

Déficit de fibrinógeno

Tratamiento con anticoagulantes oralesHematocrito elevado

Anticoagulante circulanteTratamiento trombolíticoCoagulación intravascular

diseminadaFibrinolisis

Déficit de FXIII Trombopenia y/o trombopatía

Déficit de a-2-antiplasmina Anomalías vasculares

DisfibrinogenemiaDéficit leve factores

(>20% y < 40%)Gammapatía monoclonal

2.- Esquematiza la vía intrínseca de la coagulación y especifica en donde se activa este mecanismo

PRACTICA 7 DETERMINACION DEL TIEMPO DE TROMBINA

FUNDAMENTO: En el esquema de la coagulación, la trombina cataliza la polimerización de fibrinógeno a fibrina. La adición in Vitro de trombina a un espécimen de plasma, conduce normalmente a la formación de un coágulo. La prueba de tiempo de trombina, realizada al combinar una concentración determinada de reactivo de trombina con plasma, determina el tiempo requerido para la formación de dicho coágulo.

MATERIAL Y EQUIPO:-Tubo de ensaye- Pipeta serológica de 0.1 y 0.2 ml- Cronómetro- Baño María- Centrífuga- Anticoagulante citrato de sodio al 3.8%- Reactivo de Trombina- Plasma fresco

PROCEDIMIENTO:1.- Incubar una cantidad suficiente de reactivo de trombina (0.2 ml por prueba) hasta que alcance la temperatura de 37 ºC (mínimo 2 minutos).2.- Rotular los tubos de ensayo para cada muestra (paciente y controles).3.- Dispensar 0.2 ml de plasma a su correspondiente tubo. Preincubar un mínimo de 2 minutos antes de proceder la prueba.4.- Dispensar 0.2 ml de reactivo de Trombina (previa incubación a 37 ºC) a uno de los tubos anteriores simultáneamente poner el cronómetro.5.- Parar el cronómetro en el momento de la formación del coágulo y anotar el tiempo.

VALORES NORMALES:De 10.7 – 13.7 segundos.

OBSERVACIONES:En las alteraciones que afectan a ésta fase de la coagulación se incluyen alteraciones del fibrinógeno, actividad fibrinolítica aumentada que producen variaciones en los

productos de degradación de la fibrina e interferencias en la polimerización del fibrinógeno. El tiempo de Trombina también es sensible a la heparina y a otras antitrombinas circulantes.

ACTIVIDAD

1.- ¿Por que se ha denominado vía común al proceso de activación del factor X y cual es el objetivo principal de éste mecanismo?

2.- Esquematiza la vía común resaltando los catalizadores de la reacción

PRACTICA 8 DETERMINACION CUANTITATIVA DE FIBRINOGENO

FUDAMENTO: Al añadir trombina a una muestra de plasma, el fibrinógeno se transforma vía enzimática a fibrina, la cual progresivamente se polimeriza, dando lugar a una red de fibrina soluble. El factor XIII, activado por la trombina, cataliza la formación de las uniones entrecruzadas estables entre las cadenas de fibrina, produciendo un coágulo visible e insoluble. El tiempo que transcurre entre la adicción de trombina y la formación del coágulo, es inversamente proporcional al nivel de fibrinógeno.

MATERIAL Y EQUIPO:- Tubos de ensayo - Anticoagulante citrato de sodio- Pipetas serológicas de 0.2 ml al 3.8%- Termómetro - Reactivo de Trombina- Baño María - Solución Tampon (reguladora)- Cronómetro - Solución Patrón (estándar) de

Referencia de Fibrinógeno

PROCEDIMIENTO:1.- Rotular un tubo para cada muestra a ensayar; se requiere hacer las pruebas por duplicado.2.- Dejar que el reactivo de trombina alcance la temperatura ambiente (20 – 25 ºC) antes de su empleo.3.- Preparar una dilución al 1:10 para cada muestra de paciente y control a ensayar (01. ml de muestra + 0.9 ml de tampon).4.- A cada tubo, añadir 0.2 ml de cada dilución de las muestras, a temperatura de 37 ºC, por un mínimo de dos minutos, antes de realizar la prueba.5.- Añadir 0.1 ml de reactivo de trombina a cada tubo conteniendo 0.2 ml del plasma diluido. Simultáneamente, poner el cronómetro en marcha para determinar el tiempo de coagulación.6.- Anotar el tiempo transcurrido hasta la formación del coágulo con una precisión de + 0.1 seg.7.- Mediante la curva de calibración, deducir la concentración de fibrinógeno de la muestra ( mg/dL).

VALORES NORMALES:

146 - 380 mg/dL

ACTIVIDAD

1.- ¿Que es el fibrinógeno y cual es su participación dentro de la cascada de la coagulación?

2.- ¿En que afecta altas o bajas concentraciones de éste factor?

3.- ¿Qué sustancia se produce de la activación del fibrinógeno y como afecta al coágulo formado en la primera fase de la coagulación?

BIBLIOGRAFIA:

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO CLINICO por el laboratorio, John Bernard Henrry, MASSON-SALVAT, Barcelona, España.

METODOS DE LABORATORIO, Lynch Raphael, editorial INTERAMERICANA, México, D.F.

EL MANUAL DE MERCK DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICA, Editorial OCEANO/CENTRUM, 9ª EDICIÓN.

DIAGNÓSTICO CLÍNICO POR EL LABORATORIO , Tood-Sanford, SALVAT Editores, 6ª Edición, Barcelona, España.