Benemrita Universidad Autnoma de Puebla

Estructura y funcin molecular I

Prctica de laboratorio: Cuantificacin de protenas por el mtodo Bradford

INTRODUCCIN

Mtodo de Bradford Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin azul entre los residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el colorante Azul Coomassie. Absorbe luz a 595 nm. El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estndar). La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y aromticos.Blanco: Este tubo no contiene protena, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.Curva de calibracin: Para su realizacin se utilizar la solucin testigo de concentracin conocida. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de protenas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibracin (grfico A595 vs g de protena). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentracin del TESTIGO es 100 g/ml.Muestra incgnita: se procesa en simultneo y en las mismas condiciones que la curva de calibracin. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de protenas de la muestra (g), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibracin. OBJETIVOS

Aprender los pasos para utilizar el mtodo Bradford Obtener la concentracin de protena en albmina bovina

MATERIALES Y MTODO

Tubos de ensaye. Espectrofotmetro. Gradilla. Extracto libre de clulas. Vaso de precipitado. Tijeras. Cinta masquin. Reactivo Bradford.1.-Etiquetar los tubos de ensaye por triplicado para generar la curva patrn de albmina.2.- Mezclar los reactivos de izquierda a derecha de la tabla que se muestra a continuacin.3.- Leer en el espectrofotmetro a 560nm.6.-Anotar las lecturas en la tabla.7.-Graficar los datos de absorbancia contra la concentracin de albumina.8.-Apliar una regresin lineal para obtener una lnea recta9.-Extrapolar los datos de absorbancia de las muestras desconocidas, para determinar la concentracin de protena, expresar la concentracin en mg/ml.

TuboAgua (ml)BSA (ml)BradfordDO560nm

1 a90102 ml.0.049

1 b90100.154

1 c90100.141

2 a 80200.246

2 b 80200.272

2 c 80200.252

3 a 60400.445

3 b60400.523

3 c60400.507

Blanco10000.0

Z 9500.320

RESULTADOS

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

Se logra analizar que la curva de calibracin sufri una alteracin, esto debido a la baja cantidad de absorbancia obtenida de algunas muestras, otra alteracin que pudo haber sufrido es la mala utilizacin de la Micropipeta o tal vez que el tubo no hubiese estado ceso por completo.

En conclusin en la prctica realizada el objetivo era descubrir la concentracin desconocida de una protena, la albmina bovina, para lo que utilizo el mtodo del Bradford. Este es un mtodo muy confiable, siempre y cuando se tengan las precauciones del caso, como sera la limpieza en el trabajo, el orden y la precisin.En la prctica realizada nos sirvi para valorar este mtodo bioqumico, ya que es muy usado en la industria alimenticia.Adems nos permiti darnos cuenta de la precisin y la dedicacin que se debe tener al realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier error en el mtodo nos entregara un resultado equivoco.

BIBLIOGRAFA

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Proteinas_8075.pdf