1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Que son los biosensores catalticos Menciona 4 ventajas de las enzimas como elemento de reconocimientos Que tipos de clulas completas pueden utilizarse como biosensores Cual son las desventajas de utilizar clulas completas Cual es la ventaja de utilizar orgnulos subcelulares como biosensores Que son las lectinas y que tipo de molculas se puede identificar con ellas? Que caractersticas tienen los biosensores que utilizan a los cidos nucleicos y PIM Explica la diferencia entre seguridad alimentaria y calidad alimentaria Como se aplican los biosensores para asegurar la seguridad alimentaria?

10. Como se aplican los biosensores para asegurar la calidad alimentaria? 11. Que tipo de compuestos identifican los biosensores utilizados para evaluar la presencia y contenido de componentes normales del alimento (4 componentes) 12. Que tipo de compuestos identifican los biosensores utilizados para evaluar la presencia y contenido de componentes normales del alimento (4 componentes) 13. De las respuestas de la pregunta anterior selecciona 2 donde indiques: 14. Analito/matriz/elememnto de reconocimiento 15. Por que es importante evaluar el ndice de frescura en alimentos 16. Menciona 3 tipos de evaluaciones que se pueden realizar con biosensores para determinar la vida til e indica 3 tipos de enzimas utilizados como biosensores 17. Menciona 3 ejemplos de la aplicacin de biosensores para el control de procesos CAPTULO 2 Introduccin Un biosensor se define como un dispositivo compacto de anlisis que incorpora un elemento de reconocimiento biolgico (cido nucleico, enzima, anticuerpo, receptor, tejido, clula) o biomimtico (PIMs, aptmeros, PNAs) asociado a un sistema de transduccin que permite procesar la seal producida por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito. El principio de deteccin de un biosensor se basa en la interaccin especfica entre el compuesto o microorganismo de inters y el elemento de reconocimiento. Como resultado de esta unin se produce la variacin de una varias propiedades fsico-qumicas (pH, transferencia de electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variacin de las propiedades pticas, etc) que detecta el transductor. Este sistema transforma la respuesta del elemento de reconocimiento en una seal electrnica indicativa de la presencia del analito sometido a estudio o proporcional a su concentracin en la muestra. (5) El trmino biosensor aparece en la literatura cientfica a finales de los aos 70, aunque el concepto bsico e incluso la comercializacin comenz antes. El primer biosensor fue un analizador de glucosa desarrollado por Clark y Lyons en 1962 y comercializado a partir de 1975 por Yellow Springs Instrument Company. Este biosensor se denomin enzyme electrode y consista en una enzima glucosa oxidasa acoplada a un electrodo para oxgeno. La enzima oxida la glucosa y como consecuencia se produce un descenso proporcional de la concentracin de oxgeno en la muestra, que es detectado por el electrodo. En los aos siguientes se desarrollaron electrodos enzimticos para distintas sustancias de inters clnico mediante la unin de enzimas apropiadas a sensores electroqumicos. El trmino biosensor comenz a utilizarse a partir de 1977 cuando se desarroll el primer dispositivo utilizando microorganismos vivos inmovilizados en la superficie de un electrodo sensible a amonio. Este

dispositivo se utilizaba para detectar el aminocido arginina y sus creadores lo denominaron sensor bioselectivo. Posteriormente para acortar, se denomin biosensor y este trmino ha permanecido desde entonces para designar la unin entre un material biolgico y un transductor fsico. A partir de ese momento el diseo y las aplicaciones de los biosensores en distintos campos de la qumica analtica ha continuado creciendo. El desarrollo de los biosensores desde entonces ha estado centrado principalmente en el campo del diagnstico clnico (con un gran xito de los biosensores para glucosa) y existe un inters ms reciente en los campos medioambiental, qumico, farmacutico y militar. En el campo agroalimentario, que es del que nos ocuparemos en este informe, su inters se centra en el anlisis de la composicin de los alimentos, en la seguridad alimentaria (deteccin de compuestos contaminantes, alrgenos, antinutrientes, toxinas y microorganismos patgenos) y en el control de procesos on line. El nmero de publicaciones cientficas, revisiones y patentes sobre biosensores desarrollados en los ltimos aos es muy elevado, lo que refleja el gran inters que despierta este tema en la comunidad cientfica. A pesar de este inters, la salida de estos dispositivos del laboratorio al mercado agroalimentario ha sido lenta (5), salvo algunas excepciones, debido a una serie de obstculos relacionados principalmente con las caractersticas del propio mercado (legislacin, inercia metodolgica, capacidad de absorcin, etc). El desarrollo de las diferentes tecnologas implicadas en el diseo y construccin de biosensores ha permitido en los ltimos aos solventar las dificultades tcnicas que inicialmente presentaban estos dispositivos para su aplicacin en la industria agroalimentaria. La diversidad de dispositivos ensayados en la actualidad, con diferentes combinaciones entre los distintos elementos que los componen, permite un diseo a la carta de los biosensores que cubre, desde el punto de vista tcnico, la prctica totalidad de las necesidades. Clasificacin de Biosensores Como indica la siguiente tabla estos dispositivos pueden clasificarse en funcin de: el tipo de interaccin que se establece entre el elemento de reconocimiento y el analito; el mtodo utilizado para detectar dicha interaccin; la naturaleza del elemento de reconocimiento; o del sistema de transduccin. TABLA 1. Criterios de clasificacin de los biosensores Tipo de interaccin Biocataltica Bioafinidad. Deteccin de la interaccin Directa. Indirecta. Elemento de reconocimiento Enzima. Orgnulo, tejido o clula completa. Receptor biolgico Anticuerpo cidos nucleicos PIM, PNA, aptmero. Sistema de transduccin

E Piezoelctrico.

lectroqumico. ptico. Termomtrico. Nanomecnico. Existen mltiples elementos de reconocimiento y sistemas de transduccin. Tericamente estos componentes admiten diversas combinaciones. En la prctica, la eleccin del material biolgico/biomimtico depende de las caractersticas del compuesto a analizar. Por ejemplo, cuando se trata de detectar una sustancia alrgena se utilizan anticuerpos. La eleccin del transductor est condicionada por el tipo de elemento de reconocimiento elegido, ya que ste determina cul ser la variacin en las propiedades fsico-qumicas que ocurra como consecuencia de la interaccin. Caractersticas de Biosensores En las mltiples aplicaciones de los biosensores dentro de la industria agroalimentaria es deseable que estos dispositivos cuenten con las siguientes caractersticas: Alta sensibilidad para el anlisis de ciertos analitos -como por ejemplo, muchos compuestos xenobiticos- con efectos txicos sobre la salud humana y animal incluso a concentraciones de partes por billn (mg/l). Existen unidades capaces de detectar cantidades inferiores a los lmites exigidos por la ley en el caso de residuos de plaguicidas. (5) Alta selectividad para que el dispositivo interaccione exclusivamente con el compuesto de inters y no con otros de propiedades similares. Se consigue mediante elementos de reconocimiento muy especficos. A pesar de ello, se conocen algunas excepciones de biosensores que sufren interferencias con sustancias de la misma familia que el analito o bien con componentes del alimento. Alta fiabilidad. Los sistemas de transduccin se disean de manera que no puedan ser alterados (o lo sean mnimamente) por la muestra y no tengan problemas de ruidos. Tiempo de vida largo que no obligue al empleo del dispositivo tras un corto perodo desde su fabricacin ni a sustituciones frecuentes del mismo si est integrado en la lnea de produccin de una industria. La estabilidad qumica, fsica y mecnica del elemento de reconocimiento condiciona su duracin. Los componentes biolgicos por su propia naturaleza cuentan con una vida media limitada pero las nuevas alternativas basadas en molculas biomimticas no presentan este inconveniente. Bajo coste de produccin. En general, estos sistemas pueden fabricarse a escala industrial, lo cual redundara en un ms que considerable abaratamiento de los costes de produccin. A pesar de ello, la disponibilidad limitada de algunas enzimas y la existencia de fases crticas en su construccin (procesos de inmovilizacin) dificultan, en algunos casos, la fabricacin de biosensores en masa. Tiempo de anlisis corto que posibilite una actuacin rpida, por ejemplo, la retirada de materias primas o productos contaminados o deteriorados antes de su uso o venta o la intervencin para corregir algn parmetro en un proceso industrial. Muchos biosensores consumen pocos minutos en cuantificar el compuesto de inters y no precisan un perodo de espera largo hasta el siguiente anlisis. Pretratamiento de la muestra innecesario lo que supone un ahorro de tiempo, materiales y reactivos. Aunque en la mayora de las ocasiones esto es as, en ciertas determinaciones son imprescindibles las etapas de concentracin y purificacin. stas permiten eliminar interferencias y asegurar la presencia de una cantidad suficiente del analito en el pequeo volumen utilizado (deteccin de microorganismos patgenos). Manejo sencillo. Esta tecnologa no requiere personal cualificado. Capaces de realizar anlisis en tiempo real. Esta caracterstica es especialmente interesante en el control de procesos, ya que permite controlar los parmetros deseados de forma inmediata y automtica. Porttiles para que sea posible realizar anlisis in situ.

Automatizables. Prescindir del control manual de estas unidades facilita su integracin dentro de los sistemas que monitorizan los procesos industriales. Miniaturizables. Gracias a los desarrollos en microelectrnica y nanotecnologa se han logrado reducir las dimensiones de estos dispositivos. As pueden ensamblarse varios de ellos en un mismo sistema que realiza varias tareas a la vez y son aplicables a ensayos donde el tamao fsico del dispositivo, el volumen de la muestra o la localizacin de la medida son factores limitantes. Pocos requerimientos operativos y de almacenamiento que faciliten su empleo y no supongan un coste adicional. Los biosensores que incorporan molculas biomimticas suelen presentar estas caractersticas. En el resto de dispositivos, los componentes biolgicos pueden necesitar condiciones controladas (pH, temperatura) para su uso y conservacin debido a su baja estabilidad. Con capacidad multi-anlisis. Ciertos biosensores llevan a cabo la determinacin de diferentes analitos de forma simultnea. Existe una amplia variedad de biosensores distintos y no todos poseen cada una de las caractersticas citadas anteriormente. La combinacin de varias de ellas podra situar a muchos de estos dispositivos en una posicin ventajosa frente a las tcnicas de anlisis convencionales (cromatografa, espectrometra, etc). Adems, permiten que sean aplicables a la monitorizacin en tiempo real de procesos industriales. (6) (7) CAPTULO 3 Tecnologas de Biosensores Tipo de Interaccin 3.1.1 Sensores Biocatalticos Son los biosensores mejor conocidos y los ms aplicados. Se basan en la utilizacin de biocatalizadores, que son elementos que favorecen que ocurra una reaccin qumica en la cual a partir de uno o varios sustratos se forman uno o varios productos conocidos sin consumo del biocatalizador, que se regenera y puede ser utilizado de nuevo. Estos biocatalizadores pueden ser sistemas que contienen enzimas o sistemas multienzimticos aislados, orgnulos celulares, clulas completas o tejidos animales o vegetales en los que estos sistemas se encuentran en su medio natural (7). Pueden utilizarse para detectar la presencia de alguno de los sustratos que participan en la reaccin, mediante la deteccin de la desaparicin de algn cosustrato conocido distinto de aquel que se quiere detectar o bien por la aparicin de algn producto conocido. Existen sustancias txicas como insecticidas o herbicidas que inhiben la actividad sistemas enzimticos de manera selectiva, de modo que estos sistemas se utilizan presencia. Si en presencia de los sustratos adecuados no se produce la aparicin correspondientes o sta ocurre en menor extensin de la esperada, significa que en una sustancia txica que inhibe la reaccin que favorece el biocatalizador. de determinados para detectar su de los productos la muestra existe

A continuacin se describen los elementos de reconocimiento de tipo biocataltico. Estos elementos de reconocimiento pueden acoplarse a distintos tipos de transductores como electroqumicos, pticos, termomtricos y acsticos. 3.1.1.1 Enzimas Las enzimas son protenas que catalizan reacciones qumicas en los seres vivos. En una reaccin catalizada por una enzima se produce una unin del sustrato en una regin concreta de la enzima denominada centro activo, que comprende un sitio de unin y un sitio cataltico. Una vez formados los productos la enzima se recupera pudiendo comenzar un nuevo ciclo de reaccin. En ocasiones puede ser necesaria la presencia de cofactores para que la enzima pueda regenerarse y estar activa de nuevo. La actividad enzimtica est controlada normalmente por el pH, la fuerza inica, la temperatura y la presencia de cofactores. La estabilidad de las enzimas es un factor limitante para el tiempo de vida de un biosensor de tipo enzimtico y se utilizan distintas tcnicas para aumentarla, como estabilizacin qumica y/o inmovilizacin. En algunas ocasiones se utilizan cascadas multienzimticas, en las que la enzima que acta como elemento de reconocimiento no acta directamente sobre el analito, sino sobre algn producto derivado

del mismo. Este sistema es muy utilizado en el caso de algunos azcares en los que se utilizan enzimas que actan sobre los productos de la hidrlisis de los mismos. Entre las enzimas disponibles comercialmente las ms utilizadas suelen ser las xidoreductasas. Son enzimas muy estables que catalizan fenmenos de oxidacin o reduccin utilizando oxgeno o cofactores. (7) Las enzimas pueden acoplarse a transductores de los tipos potenciomtrico, amperomtrico, optoelctrico, calorimtrico o piezoelctrico, y bsicamente todas funcionan por inmovilizacin de la enzima en el propio transductor. (7) Existen enzimas que no se pueden utilizar aisladas debido a que no son suficientemente estables o a que su purificacin es difcil o demasiado cara. En estas circunstancias pueden utilizarse orgnulos celulares, clulas completas o tejidos que contienen las enzimas en una forma natural en un medio ms estable. VENTAJAS DE LAS ENZIMAS COMO ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO Las ventajas que presentan las enzimas para su utilizacin en biosensores son: Elevada selectividad. Respuesta rpida. Elevada variedad de enzimas disponibles. (8) Autorregenerables. Algunas resultan econmicas. Simplicidad de construccin de los dispositivos. 3.1.1.2 Clulas Completas Pueden ser clulas bacterianas, fngicas, protozoos o clulas procedentes de organismos superiores y pueden ser viables o no viables. (7) En este caso en lugar de purificar las enzimas se utiliza como elemento biolgico una clula completa, que posee en su interior mltiples sistemas multienzimticos en su medio natural. Se pueden utilizar clulas modificadas genticamente que expresen enzimas determinadas que no se expresen normalmente o que posean una actividad mayor. Las clulas viables pueden metabolizar diversos compuestos orgnicos dando lugar a la aparicin de distintos productos como amonio, dixido de carbono o cidos que pueden ser monitorizados mediante distintos transductores. Se pueden utilizar para detectar la presencia de compuestos relacionados con el crecimiento como vitaminas, azcares, cidos orgnicos o compuestos nitrogenados, o bien para detectar compuestos que inhiben la respiracin microbiana como contaminantes ambientales o sustancias txicas. (9) La mayor limitacin a la hora de utilizar clulas completas es la difusin de sustratos y productos a travs de la membrana celular, que da como resultado una respuesta ms lenta comparada con los sensores basados en enzimas. (9) Esta limitacin se puede paliar mediante la permeabilizacin de la membrana por medio de mtodos fsicos (congelacin y descongelacin), qumicos (detergentes) o enzimticos (lisozima, papana). Mediante estos tratamientos se forman poros en las membranas que permiten la difusin de molculas de pequeo tamao, reteniendo la mayor parte de los compuestos macromoleculares, como es el caso de las enzimas, dentro de la clula. Como consecuencia de estos tratamientos la clula deja de ser viable, pero puede servir como una fuente econmica de enzimas intracelulares. Se pueden utilizar para aplicaciones que no requieren regeneracin celular de cofactores o respiracin metablica, como es el caso de glucosa oxidasa, b-galactosidasa, aminocido oxidasas, invertasas, etc. (9) Otra limitacin de las clulas completas, en comparacin con enzimas purificadas, es que tienen una menor especificidad debido a reacciones catalizadas por otras enzimas presentes en la clula. Una posible solucin para minimizar estas reacciones indeseables es permeabilizar la membrana de modo que los cofactores salgan al exterior de la clula. (9)

Las clulas se pueden inmovilizar en membranas de acetato o celulosa, o atraparse en una matriz, como un gel de agar. (6) 3.1.1.3 Orgnulos Subcelulares En ocasiones en lugar de utilizar clulas completas o sistemas multienzimticos aislados, pueden utilizarse orgnulos subcelulares, que contienen determinados sistemas enzimticos completos, pero no poseen todos aquellos que presenta una clula completa, como es el caso de cloroplastos completos, tilacoides o mitocondrias. (9) Mitocondrias y cloroplastos son orgnulos de doble membrana que poseen sistemas enzimticos relacionados con la obtencin de energa en la membrana interior. Determinados agentes txicos como plaguicidas, metales pesados o detergentes actan sobre estos sistemas enzimticos inhibindolos, de modo que estos orgnulos o sus membranas internas pueden utilizarse como biosensores para detectar este tipo de compuestos. (9) 3.1.1.4 Tejidos Existen determinados tejidos vegetales que debido a su funcin fisiolgica en el organismo son una fuente de determinadas enzimas o sistemas enzimticos. Pueden utilizarse distintos tejidos como hojas, races, frutas o semillas, en rodajas o bien en forma de homogeneizados. Suelen ir asociados a transductores electroqumicos.(10) Algunos ejemplos que aparecen en la literatura cientfica son la utilizacin de rodajas de patata (ricas en la enzima polifenol oxidasa) junto con electrodos de oxgeno para la determinacin de mono y polifenoles (9), o de homogeneizados del hongo Agaricus bisporus para la determinacin de alcohol. (11) La utilizacin de orgnulos, clulas completas o tejidos vegetales en biosensores posee varias ventajas e inconvenientes comparada con la utilizacin de enzimas o sistemas enzimticos aislados. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE TEJIDOS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO Ventajas Bajo coste. Evitan procesos de extraccin y purificacin de enzimas. No requieren la adicin de cofactores para la regeneracin enzimtica. Simplicidad de construccin. Elevada estabilidad. Vida til larga. Elevada actividad. Inconvenientes Baja sensibilidad. Respuesta lenta. Limitada selectividad. 3.1.2 Sensores de Bioafinidad Los sensores de bioafinidad se basan en la interaccin del analito de inters con el elemento de reconocimiento, sin que exista transformacin cataltica, sino que se produce una reaccin de equilibrio en la que se forma un complejo analito-receptor. (7) Para medir la interaccin, ya que no existe consumo de sustratos ni generacin de productos, se suele utilizar un marcaje del receptor o bien de un elemento que compita con el analito por la unin al receptor, con una enzima que da una reaccin biocataltica complementaria que es la que se detecta por el sistema de transduccin. El inconveniente que plantea este tipo de sistema es que se requieren pasos

posteriores de lavado y separacin del exceso de molculas marcadas y la adicin de sustratos para que ocurra la reaccin que cataliza la enzima que se usa como marcaje. (7) Puede utilizarse tambin un sistema de deteccin directa de la interaccin entre el receptor y el analito basndose en los cambios que se producen en la masa de la superficie, o bien por los cambios en las propiedades de la luz que se producen como consecuencia de esta unin. Este tipo de interacciones presenta en ocasiones un rango de operacin de concentracin estrecho, debido a que se puede producir una saturacin del receptor y a menudo no permiten una monitorizacin continua de la concentracin del analito. El elemento de reconocimiento debe estar en contacto directo con la muestra y no se puede incorporar una membrana exterior para separar el elemento receptor de la matriz de la muestra, de modo que algunos de estos biosensores tienen dificultades para operar en matrices biolgicas complejas. Se pueden utilizar para la deteccin de material gentico de microorganismos, para detectar la presencia de patgenos o pesticidas o de cualquier tipo de sustancias que puedan causar una respuesta inmune (y por tanto permitir el desarrollo de anticuerpos). Existen distintos tipos de receptores de bioafinidad como anticuerpos, lectinas, receptores, clulas completas, cidos nucleicos, PIMs, aptmeros y PNAs. 3.1.2.1 Anticuerpos Un anticuerpo es una protena que se une de manera selectiva a una molcula complementaria denominada antgeno, que en este caso corresponde al analito. La mayor parte de los biosensores de bioafinidad se basan en reacciones de unin de antgenos a anticuerpos especficos. La deteccin de cada antgeno requiere la produccin de un anticuerpo particular, su aislamiento y en ocasiones su purificacin. Pueden utilizarse anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos policlonales son poblaciones complejas de anticuerpos formadas por distintos tipos de anticuerpos que reconocen diferentes regiones del antgeno, mientras que los monoclonales son molculas idnticas y poseen la misma especificidad. Los anticuerpos policlonales poseen mayor sensibilidad y menor especificidad que los monoclonales, de modo que en funcin de qu caracterstica se quiera potenciar se elegirn unos u otros. La deteccin del complejo antgeno-anticuerpo se puede hacer directamente, aunque para aumentar la sensibilidad se suelen acoplar enzimas para el marcaje de los anticuerpos o los antgenos. (7) La especificidad y afinidad de la interaccin antgeno-anticuerpo determinan la selectividad y la sensibilidad del inmunosensor as como la posibilidad de regeneracin. En la prctica para alcanzar una sensibilidad adecuada se necesita que el complejo tenga una afinidad alta, siendo difcil su disociacin, por lo que suelen ser sistemas de un solo uso. No obstante, el anticuerpo puede regenerarse por disociacin de los complejos mediante la aplicacin de distintos agentes que cambian las condiciones del medio y favorecen esta disociacin, aunque estas condiciones suelen daar la estructura del anticuerpo. (8) Por ltimo, es necesario minimizar las uniones no especficas, para garantizar la especificidad de la deteccin del analito. 3.1.2.2 Receptores En las membranas celulares existen distintos receptores moleculares y protenas de unin que pueden aislarse e inmovilizarse en diferentes superficies y utilizarse como elementos de reconocimiento asociados a diversos transductores. Existen protenas transportadoras que forman canales que pueden acoplarse a membranas lipdicas sintetizadas de manera artificial. La unin del analito a estos receptores produce la formacin de canales a travs de los que se genera un flujo de iones que se puede monitorizar mediante distintos tipos de transductores como los electroqumicos, por lo que normalmente este tipo de receptores no necesitan que haya un marcaje enzimtico. Pueden utilizarse para determinar compuestos txicos que ejercen su accin en los organismos mediante la unin a dianas especficas como el caso de los ganglisidos que se utilizan como receptores para detectar la toxina colrica (17). 3.1.2.3 Clulas Completas

En las clulas existen distintos receptores moleculares de membrana que ante la unin de su ligando correspondiente disparan respuestas fisiolgicas amplificadas, como la apertura de canales inicos, la activacin de sistemas mensajeros secundarios y la activacin de enzimas, que pueden ser monitorizados por distintos transductores. Determinados compuestos txicos ejercen su accin bloqueando los sistemas de seales asociados a estos receptores debido a que se unen a ellos de manera especfica e impiden la unin del ligando correspondiente, por lo que pueden usarse para detectar la presencia de estos compuestos. Por ejemplo las toxinas paralizantes de origen marino ejercen su accin toxica bloqueando canales de sodio, que son muy abundantes en las clulas que forman la membrana de la vejiga de rana, de modo que puede utilizarse este tejido para la fabricacin de biosensores. (13) Este tipo de receptores suelen tener afinidad por compuestos relacionados estructuralmente, lo cual resulta interesante para la deteccin multianalito. Pueden utilizarse clulas que expresen los receptores de manera natural o bien se pueden modificar genticamente para que expresen los receptores que interesan. 3.1.2.4 Lectinas Las lectinas son un grupo de protenas que se unen de manera selectiva y reversible a distintos sacridos, como los oligosacridos que se encuentran en las paredes celulares bacterianas. Son molculas de reconocimiento fcilmente disponibles y econmicas que pueden asociarse a distintos transductores como transductores piezoelctricos o de resonancia de plasmones superficiales. 3.1.2.5 cidos Nucleicos Los biosensores para el anlisis de ADN se basan en el proceso de hibridacin, que es la unin de una cadena de ADN con su cadena complementaria. Estos biosensores, tambin conocidos como gene chips se usan para el reconocimiento y cuantificacin de ADNs diana en muestras de inters. La hibridacin puede hacerse en disolucin o en soportes slidos y una vez que se ha realizado se utilizan marcajes especficos que se unen a las secuencia hibridadas, como marcajes fluorescentes o enzimticos. Pueden acoplarse sistemas de transduccin pticos, gravimtricos o electroqumicos. (14) Algunos de estos chips son lo suficientemente sensibles como para eliminar la necesidad de amplificacin mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Este tipo de elementos de reconocimiento pueden utilizarse para la deteccin de organismos modificados genticamente y microorganismos patgenos. 3.1.2.6 Polmeros de Impresin Molecular Los polmeros de impresin molecular o PIMs son matrices sintetizadas artificialmente que presentan, en teora, la capacidad de reconocer e interaccionar de forma especfica con determinados compuestos. Es decir, se trata de materiales biomimticos que reproducen de un modo ms bsico el mecanismo de reconocimiento de los sistemas biolgicos (hormona-receptor, enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo). Idealmente, ste es el comportamiento que cabra esperar; sin embargo, en la prctica no sucede as debido a la existencia de interacciones de distinta naturaleza. Estos polmeros con memoria selectiva cuentan con una serie de caractersticas muy interesantes para las tecnologas de los biosensores. Su gran potencial como sustitutos de las estructuras de origen biolgico se ha materializado en el desarrollo de los primeros dispositivos que incorporan PIMs como elementos de reconocimiento, por ejemplo, para la deteccin de plaguicidas, frmacos o toxinas marinas. En el proceso de obtencin de los PIMs participan: El analito de inters que acta como molde o plantilla. Los monmeros funcionales que interaccionan con el analito y para cuya eleccin debe considerarse la naturaleza qumica del mismo (cida, bsica, ion metlico) y los monmeros de entrecruzamiento que contribuyen a estabilizar la estructura del polmero. Otros compuestos: iniciadores de la polimerizacin, disolventes para la fase de sntesis, disolventes para la extraccin del analito,...

Los principales mecanismos de preparacin de los PIMs se dividen en covalentes y no covalentes. En el primer caso, las uniones que se establecen entre el analito o molcula molde y los monmeros funcionales son de carcter covalente. En cambio, en la ruta de sntesis no covalente las interacciones son de tipo enlace de hidrgeno, enlace de Van der Waals, interacciones electrostticas,... A partir de estas uniones los monmeros funcionales se organizan en torno al analito, polimerizan y junto con las unidades de entrecruzamiento generan una red tridimensional. Por ltimo, la molcula molde se extrae de esta matriz para dejar libres los puntos de reconocimiento mediante diversas tcnicas (reaccin de hidrlisis para la ruptura de enlaces covalentes o extraccin con disolventes en la va de preparacin no covalente). (15) VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS PIMs COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO Ventajas Sensibilidad y selectividad elevadas. Posibilidad de desarrollar PIMs destinados a muy diversos analitos incluyendo especies para las que an no se ha encontrado un elemento de reconocimiento biolgico. Especificidad predecible tericamente aunque, en la prctica, la existencia de interacciones de carcter no especfico hace difcil su determinacin. Produccin con un bajo coste a gran escala. Tiempo de vida largo: estabilidad qumica, trmica y mecnica altas. (16) Inconvenientes Tecnologa en desarrollo en el mbito de los biosensores. En general, las constantes de afinidad son bajas, es decir, que la tendencia del analito y del PIM a unirse es pequea. Esto implica mayores tiempos de anlisis. Requiere altas concentraciones de molcula molde. El procedimento de sntesis de los PIMs conlleva mltiples etapas y resulta laborioso. Adems hay prdidas de material til y se obtienen redes con una distribucin poco homognea de los puntos de unin. Dificultad para operar en medios acuosos porque no se produce el reconocimiento del analito. (17) 3.1.2.7 Aptmeros Un aptmero es una secuencia de oligonucleticos (ADN o ARN) de cadena sencilla sintetizada artificialmente, capaz de reconocer diversas molculas diana con una afinidad y especificidad elevadas. Estas molculas biomimticas se asemejan a los anticuerpos. Se pliegan en el espacio y adquieren una conformacin con determinadas regiones a las que puede unirse el analito. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS APTMEROS COMO ELEMENTOS DE RECONOCIMIENTO Ventajas Mayor estabilidad en comparacin con los elementos biolgicos. Inmovilizacin sencilla sobre las superficies. Produccin a gran escala con un coste bajo. Inconvenientes Constantes de afinidad pequeas. 3.1.2.8 cidos Nucleicos Peptdicos Los cidos nucleicos peptdicos o PNAs (en sus siglas inglesas) son otro tipo de molculas sintticas que mimetizan al ADN-ARN. De hecho, su estructura es muy similar a la de estos cidos. Estn formados por

un esqueleto de monmeros (N-2-aminoetilglicina) unidos por enlaces peptdicos con bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas. A diferencia de los cidos nucleicos, los PNAs no contienen pentosas ni grupos fosfato. La principal ventaja de estas molculas biomimticas frente a sus anlogos naturales es su gran afinidad para establecer enlaces con cadenas de ADN. La falta de repulsin electrosttica entre ellas hace que dichos enlaces sean ms fuertes que los existentes entre dos hebras de ADN. Este elemento de reconocimiento se utiliza en la deteccin de microorganismos patgenos junto a transductores pticos de tipo SPR. (18) La tabla 2 recoge las principales ventajas e inconvenientes de los elementos de reconocimiento ms utilizados en biosensores, es decir, enzimas en el caso de los biosensores de tipo biocataltico, y anticuerpos en el caso de los biosensores de bioafinidad. TABLA 2. Ventajas e inconvenientes de enzimas y anticuerpos como elementos de reconocimiento en biosensores ENZIMAS Ventajas Elevada sensibilidad Respuesta rpida Autorregenerables Permiten monitorizacin continua No requieren pasos de lavado. Gran variedad de enzimas disponibles Permiten detectar txicos desconocidos que inhiben enzimas. Permiten amplificar seales. Diseo sencillo. Fcil construccin. Bajo coste. Manejo sencillo. Inconvenientes Sensibilidad frente a condiciones ambientales (pH, temperatura o fuerza inica). En ocasiones requieren presencia de cofactores. Pueden ser inhibidos por sustancias de la muestra. Tiempo de vida limitado. ANTICUERPOS Ventajas Elevadas sensibilidad y especificidad. Estabilidad qumica. Afinidad variable. Respuesta rpida. Inconvenientes Difcil regeneracin. Requieren contacto directo con la muestra. En ocasiones requieren marcaje. No amplifican la seal.

Bajo coste.

No existe consumo del analito por lo que se saturan (rango de operacin de concentracin estrecho). No permiten detectar sustancias desconocidas.

3.2 Tcnicas de Inmovilizacin Una etapa clave en la construccin de un biosensor es la inmovilizacin del elemento de reconocimiento sobre una membrana o matriz, que a su vez se fija a la superficie del transductor. Este material de base puede actuar nicamente como soporte del componente biolgico o participar adems en la transmisin de la seal al sistema de transduccin (por ejemplo, mediante la inclusin de mediadores para las reacciones redox). Entre las tcnicas empleadas las ms comunes son la adsorcin fsica, el atrapamiento, el entrecruzamiento o reticulado (cross-linking) y la formacin de enlaces covalentes. La siguiente tabla resume las principales caractersticas de cada uno de ellos. La eleccin de uno u otro procedimiento depende de la naturaleza del elemento biolgico, el tipo de transductor, las propiedades fsico-qumicas del analito y las condiciones de trabajo del biosensor. (7) TABLA 3.- Ventajas e incovenientes de las tcnicas de inmovilizacin ms comunes en la fabricacin de biosensores. (7) (9) Tcnica de Inmovilizacin Ventajas Adsorcin fsica Unin dbil: prdida Descripcin Inconvenientes Unin del ER* a la Celulosa. Matriz

Sencilla.

matriz mediante . de ER por condiciones interacciones regenerable. externas. inicas, puentes de Control estricto hidrgeno, fuerzas del proceso. de Van der Waals. Atrapamiento Unin dbil. Retencin fsica

Gel de slice.

Bajo coste

Colgeno.

Matriz

Hidroxiapatita.

Sin

modificaciones

Acetato.

en ER.

Geles: agar,

Sencilla.

del ER en las Control estricto cavidades interiores de la polimerizacin de la matriz. de la matriz.

nylon, almidn,

Bajo coste.

poliacrilamida.

Se necesita poca

Matrices

cantidad de

ER.

electrdicas modificaciones No regenerable. compositas rgidas: grafito-tefln o entre grafito-resina epoxi. transductor. en ER.

Sin

Proximidad

ER y el

Entrecruzamiento moderado.

Uniones Tratamiento con

Reactivos:

Coste

en

irreversibles sustancias qumicas de los ER entre s

Glutaraldehdo

Estable

Hexametilen-di-

condiciones

txicas. mediante reactivos No regenerable. funcionales. isocianato, 2,4extremas.

Mnima

dinitro-benceno. +++

prdida de ER Manipulacin

Enlaces covalentes Alteracin del ER

Uniones covalentes

del ER con grupos (centro activo en enzimas). qumicos activados Inadecuado para ERs muy de la matriz o sensibles (pH, temperatura) directamente del No regenerable.

sencilla.

Estable en

condiciones

extremas.

transductor. Tratamiento con sustancias

qumicas txicas.

Coste elevado. 3.3 Sistema de Transduccin El sistema de transduccin o transductor es el elemento que convierte las variaciones de las propiedades fsicas o qumicas que se producen por la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito en una seal que puede ser amplificada, almacenada y registrada. La seal generada por el transductor en algunos casos no puede ser interpretada directamente y es necesario la utilizacin de un software para su procesamiento. Existen varios tipos de transductores: electroqumicos, pticos, piezoelctricos (msicos, gravimtricos, acsticos), termomtricos y nanomecnicos. Dependiendo de la naturaleza de la interaccin entre el elemento de reconocimiento y la especie de inters se puede utilizar un tipo de transductor u otro. (20) 3.3.1 Transductor Electroqumico Los transductores electroqumicos transforman la seal que se produce por la interaccin entre el sistema de reconocimiento y el analito a detectar en una seal elctrica. Proporcionan informacin analtica cuantitativa o semicuantitativa especfica. El elemento de reconocimiento biolgico y el elemento de transduccin deben estar en contacto. Se diferencian cuatro tipos de biosensores electroqumicos que son conductimtricos, potenciomtricos, amperomtricos e impedimtricos en funcin de si detectan cambios en la conductividad, en el potencial, en una corriente generada o en la impedancia. En general se utilizan junto con elementos de reconocimiento biocatalticos ya que las reacciones enzimticas generan aparicin de sustancias electroactivas, cambios en el pH o en el potencial, etc.

TABLA 4. Tipos de transductores electroqumicos. (5) (6) (7) (21)

Transductor Electroqumico InconvenientesConductmetro Potenciomtrico Menor sensibilidad amperomtricos. inespecfica a otros es presentes en la estra. muestras con gran antidad de analito. Amperomtrico Pueden tener baja selectividad.

Tipo de medida

Ventajas

Variacin de conductividad del medio. Diferencia de potencial elctrico.

Simplicidad de operacin. Pequeo tamao. que Unin ion mu Para c

Corriente generada por la reduccin u oxidacin de especies electroactivas. Incremento de conductancia.

Pequeos y robustos. Sensibles. Rpidos. Econmicos. Fcil para ensayos de campo.

Impedimtrico

Existe un tipo de sensores de reciente desarrollo consistente en una combinacin entre los sistemas de transduccin ptico y electroqumico denominados light-addressable potentiometric sensor (LAPS) (6). Estos sensores permiten detectar cambios de pH en las disoluciones, lo que se puede aplicar en la monitorizacin de algunas reacciones enzimticas o alteraciones celulares que producen variaciones en el pH del medio. Un LAPS es un sensor qumico cuya estructura consta de un electrolito, un aislante cuya superficie se encuentra en contacto con la muestra que debe ser una disolucin acuosa, y un semiconductor de silicio. El aislante se encuentra cargado en funcin del pH de la disolucin acuosa que baa el chip. Cuando se aplica una diferencia de potencial a esta estructura y se ilumina la parte posterior mediante un diodo, se produce una fotocorriente que depende del voltaje aplicado y de la carga de la superficie de la capa aislante. Si se produce un cambio en el pH del medio, el voltaje aplicado debe ser ajustado para que la fotocorriente permanezca constante. Este cambio de voltaje es proporcional al cambio de pH que se ha producido en el medio. La fotocorriente slo se genera en zonas discretas, donde el sensor es iluminado por el diodo, de modo que podran medirse cambios locales con mltiples diodos lo que permitira la deteccin simultnea de mltiples analitos usando un solo sensor. Existe un LAPS disponible comercialmente que se denomina Threshold Immunoassay System y sirve para detectar bacterias y esporas. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS TRANSDUCTORES ELECTROQUMICOS Ventajas Econmicos, posibilidad de produccin masiva. Fcil miniaturizacin. Respuesta rpida. Alta sensibilidad. Posibilidad de automatizacin.

Aplicaciones en elevada variedad de muestras. Inconvenientes Es necesaria la utilizacin de electrodos de referencia (excepto en los conductimtricos). 3.3.2 Transductor ptico Los transductores pticos se basan en la medicin de las variaciones que se producen en las propiedades de la luz como consecuencia de la interaccin fsica o qumica entre el analito a detectar y el elemento biolgico de reconocimiento del biosensor. Las bases fsicas de este tipo de sensores son los cambios que ocurren en absorcin, fluorescencia, luminiscencia, dispersin o ndice de refraccin, cuando la luz se refleja en las superficies de reconocimiento. El sistema bsico de medida consiste en una fuente de luz, el elemento sensor (donde se encontraran las molculas receptoras) y el detector. Se diferencian mtodos de deteccin directa, sin necesidad de marcaje y deteccin indirecta, en la que es necesario utilizar marcaje. (5) Este tipo de transductores pueden acoplarse a elementos de reconocimiento biocatalticos o de bioafinidad. Los transductores que tienen propiedades pticas son muy variados en funcin de las propiedades, incluyendo sensores de fibra ptica, sensores de resonancia de plasmones y sensores de onda evanescente. 3.3.2.1 Sensor de Fibra ptica Tambin conocido como optodo u optrodo, consiste en una fibra ptica en uno de cuyos extremos se inmoviliza el elemento de reconocimiento, que puede ser de tipo biocatalco o de bioafinidad y en el otro el elemento de deteccin (figura 4). Es necesaria la utilizacin de marcadores que pueden ser indicadores pticamente activos como colorantes sensibles al pH, a la concentracin de oxgeno o al perxido de hidrgeno, molculas fluorescentes y, en menor medida, molculas bio o quimioluminiscentes. Como consecuencia de la interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento se produce un cambio detectable en el marcador que se propaga por la fibra ptica hacia el detector. (7) Existe otro tipo de transductores pticos que se basa en las interacciones que ocurren en la interfase entre una superficie en la que se encuentra el elemento de reconocimiento y la disolucin en la que se encuentra el analito. La superficie suele ser un prisma de cristal recubierto con una capa de oro o plata. Cuando esta interfase se ilumina con un rayo de luz, se producen cambios en el ngulo de resonancia. Se diferencian transductores de resonancia de plasmones superficiales y de resonancia de espejos. 3.3.2.2 Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR). Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conduccin de un metal. La resonancia de plasmones superficiales es un fenmeno ptico que ocurre cuando una luz polarizada se dirige desde una capa de mayor ndice de refraccin (un prisma) hacia una de menor ndice de refraccin, que en este caso es una capa metlica, de oro o de plata, que se sita entre el prisma y la muestra. La luz que incide en la interfase entre el metal y el prisma provoca la excitacin de un plasmn superficial para un determinado ngulo de incidencia de dicha luz, llamado ngulo de resonancia. El ngulo de resonancia depende fuertemente del ndice de refraccin del medio colindante a la lmina metlica, por lo que las variaciones que se produzcan en el mismo van a ser detectadas como cambios del ngulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentracin. La unin de los analitos al elemento de reconocimiento supone un cambio de ndice de refraccin sobre la superficie del metal y, como consecuencia, un desplazamiento del ngulo de resonancia. Esto permite realizar medidas directas en tiempo real, sin marcaje, as como el anlisis de muestras complejas sin purificacin previa. (8) Puede utilizarse tambin con marcaje con molculas fluorescentes. Esto presenta como ventaja una mejora en la sensibilidad relativa por la reflexin total interna de fluorescencia. La instrumentacin que requiere este tipo de anlisis es un sensor, un detector de SPR, software para el control y tratamiento de datos y un sistema para introducir los reactivos y analitos en la superficie del sensor. 3.3.2.3 Resonancia de Espejos

Es una variacin de la SPR en la cual se utilizan filtros polarizados para bloquear la luz reflejada internamente. Un espejo de resonancia consiste en una capa de silicio de bajo ndice de refraccin tapizado con un material de alto ndice de refraccin. Esta estructura se utiliza en lugar de la capa de metal que se usa en la SPR. La luz que entra en la capa de silicio con un ngulo de incidencia (ngulo de resonancia), va hacia la capa con elevado ndice de refraccin y sufre una serie de reflexiones que producen un campo evanescente, que penetra en la muestra. Cambios en el ndice de refraccin en la superficie debidos a la interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento producen cambios en el ngulo de resonancia que se pueden detectar y relacionar con la concentracin de analito. Las reflexiones que se producen incrementan la sensibilidad del mtodo con respecto a la SPR pudiendo llegar a ser 10 veces ms sensible. (8) 3.3.2.4 Onda Evanescente (Ew) Se basa en un fenmeno conocido como reflexin interna total de fluorescencia, que consiste en la absorcin y emisin de fotones. En este sensor una radiacin que viaja a travs de una gua de ondas por reflexin interna total crea un campo electromagntico denominado campo evanescente, que puede penetrar una determinada distancia desde la superficie dependiendo del ngulo de incidencia en la interfase y la longitud de onda de la radiacin de excitacin. Cualquier interaccin molecular que se produzca en este campo (como la unin de un analito a un receptor inmovilizado en la superficie de la gua de ondas) produce cambios en las caractersticas de la luz que se propaga por la gua de ondas que pueden medirse y relacionarse con la concentracin de analito. Es necesario utilizar marcaje con molculas con propiedades fluorescentes. Permite una deteccin directa, rpida y selectiva del analito. (6) Existe otro tipo de transductores basados en la onda evanescente que son los interfermetros MachZender. En estos sensores la propagacin de la radiacin se divide en dos ramas, una de las cuales contiene el elemento de reconocimiento y la otra acta como referencia. Estas ramas tras recorrer una cierta distancia vuelven a unirse. La interaccin entre el analito y el elemento de reconocimiento produce cambios en el campo evanescente que dependern de la concentracin de analito en el medio. (22)

TABLA 5. Caractersticas de los distintos transductores pticosTransductor Inconvenientes Optrodos marcaje. (Fibra ptica) la cantidad de analito. componente biolgico. Ventajas Flexibilidad. Bajo coste. Anlisis in situ remoto. Anlisis en tiempo real. Fcil miniaturizacin Fciles de usar. Deteccin directa. Deteccin en tiempo real. Elevada sensibilidad. Muestras sin purificar. Mayor sensibilidad que SPR. Detecin directa, rpida y selectiva del analito. Requiere Seal proporcional a Vida limitada del

Sensibles a Ineficaz para (requiere Ineficaz para Elevado coste. Elevado Requiere

temperatura. diluidos Resonancia (SPR) preenriquecimiento). de plasmones pequeo tamao. Superficiales (21) (SPR) Resonancia coste. (21) de espejos Onda marcaje. evanescente (EW)3.3.3 Transductor Piezoelctrico

Los sistemas de transduccin piezoelctricos, msicos, gravimtricos o acsticos miden cambios directos de masa inducidos por la formacin del complejo antgeno-anticuerpo. Los materiales que se utilizan para el diseo de este tipo de biosensores son materiales piezoelctricos, que son aquellos que entran en resonancia por la aplicacin de un campo elctrico alterno externo. Estos cristales se recubren con el elemento de reconocimiento que suele ser de bioafinidad (anticuerpos, lectinas, etc) y se ponen en contacto con la muestra que contiene el analito que se desea detectar (14). La frecuencia de oscilacin viene determinada por la masa del cristal, que vara cuando se produce la interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito y da lugar a una variacin en la frecuencia de oscilacin. Se diferencian dos tipos principales: Bulk acoustic wave (BW), tambin denominados quartz crystal microbalance (QCM) o thickness slear mode. La resonancia ocurre en toda la masa del cristal. Surface acustic wave (SAW). Ondas acsticas de superficie. La resonancia ocurre slo en la superficie del cristal. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS BIOSENSORES PIEZOELCTRICOS. Ventajas (21) Deteccin directa (sin marcaje) en tiempo real de la reaccin de unin. Anlisis on-line. Permite varios formatos de inmunoensayo. Fciles de usar. Bajo coste. (5) Inconvenientes (21) (14) Falta de selectividad. Tiempos de incubacin relativamente largos. Problemas con la regeneracin de la superficie del cristal. Nmero de pasos de lavado y secado elevado. Puede haber dificultades para recubrir los cristales al inmovilizar el elemento de reconocimiento. Es necesaria la calibracin de cada cristal. (5) Interferencias producidas cuando se usa en medio lquido. 3.3.4 Transductor Termomtrico Los transductores termomtricos se basan en la deteccin del calor generado en las reacciones enzimticas exotrmicas, que se puede relacionar con la concentracin de analito. Estos cambios de temperatura normalmente se determinan por medio de termistores a la entrada y a la salida del dispositivo en el que se encuentran inmovilizadas las enzimas. Presentan como inconveniente que pueden existir prdidas de calor por irradiacin, conduccin o conveccin. 3.3.5 Transductor Nanomecnico En los transductores nanomecnicos el elemento de reconocimiento biolgico se inmoviliza sobre la superficie de una micropalanca de silicio, que se sumerge en una muestra lquida. Generalmente se utilizan anticuerpos. La interaccin entre el elemento de reconocimiento y el analito produce un cambio diferencial en la tensin superficial del lquido y la micropalanca sufre una respuesta de tipo nanomecnico que consiste en un cambio de la deflexin y/o de la frecuencia de resonancia. (23)

La deteccin de la respuesta nanomecnica puede hacerse de modo dinmico o de modo esttico. En el modo esttico, la magnitud medida es la deflexin de la micropalanca. Las molculas receptoras se inmovilizan slo en uno de los lados de la micropalanca. Cuando se introducen en la disolucin las molculas del analito, stas se enlazan sobre la superficie funcionalizada, producindose un cambio de la tensin superficial de este lado con respecto al otro lado de la micropalanca, dando lugar a un curvamiento de la micropalanca y una deflexin del orden del nanometro. Sin embargo, la deflexin de la micropalanca es muy sensible a cambios de temperatura debido al efecto bimetlico. En el modo dinmico se mide la frecuencia de resonancia, que depende tanto del cambio de tensin superficial como del cambio de masa. La frecuencia de resonancia es independiente de los cambios de temperatura. Trabajos recientes han mostrado que esta tcnica puede detectar errores de hibridacin de una sola base en oligonucletidos y pequeos contenidos de protenas antignicas con gran sensibilidad (24). Actualmente estos dispositivos se estn desarrollando para detectar mutaciones y polimorfismos en genes humanos as como para la deteccin de contaminantes en aguas con alta sensibilidad. CAPTULO 4 Aplicaciones de Biosensores en Agroalimentacin Como muestra la tabla 6 las aplicaciones actuales de los biosensores en el mbito agroalimentario se orientan hacia las siguientes reas principales: la seguridad alimentaria, la calidad alimentaria y el control de procesos industriales. TABLA 6. Principales reas de aplicacin de las tecnologas de biosensores dentro del campo Agroalimentario Seguridad alimentaria Compuesto xenobiticos Aditivos. Frmacos. Plaguicidas y fertilizantes. Otros contaminantes (dioxinas, PCBs, HAPs, metales pesados) Biotoxinas Toxinas bacterianas. Micotoxinas. Toxinas marinas. Microorganismos patgenos Virus. Bacterias. Protozoos. Control de procesos Azcares (fermentacin y pasteurizacin). Alcoholes (fermentacin alcohlica). Aminocidos (fermentacin). cido lctico (elaboracin de quesos). 4.1 Seguridad Alimentaria El concepto de seguridad alimentaria implica garantizar la produccin y comercializacin de alimentos que no supongan un riesgo potencial para la salud del consumidor. En este campo los biosensores se utilizan para detectar: Compuestos xenobiticos, es decir, sustancias externas al producto alimenticio que no han sintetizado los seres vivos (aditivos, frmacos, plaguicidas,...). Ciertos componentes del alimento (alrgenos y antinutrientes). Toxinas de diversos orgenes (toxinas bacterianas, micotoxinas y toxinas marinas). Calidad alimentaria Composicin del alimento Azcares. Aminocidos. Alcoholes. cidos orgnicos. Colesterol. Vida til Polifenoles y cidos grasos (enranciamiento). Azcares y cidos orgnicos (madurez). Aminas bigenas (ndice de frescura). Compuestos aromticos Alina (ajo y cebolla).

Otras aplicaciones OMGs. Ciclo reproductivo animal.

Microorganismos patgenos que afectan al hombre, al ganado y a los cultivos. 4.1.1 Aditivos Alimentarios La cantidad y tipo de aditivos alimentarios incorporados a un producto se encuentran estrechamente regulados por la legislacin comunitaria. Su deteccin y cuantificacin son importantes para evitar posibles usos fraudulentos o malas prcticas de fabricacin. Adems, estos compuestos pueden provocar problemas de intolerancias, alergias u otras reacciones adversas a determinados grupos de la poblacin. De momento, son pocos los ejemplos de biosensores aplicados a este campo. Se han identificado dispositivos para el anlisis de edulcorantes artificiales, aspartamo y sorbitol, y de conservantes, cido benzico y sulfitos. En el primer caso se trata de sustancias con efecto laxante cuando se ingieren en grandes cantidades. Al mismo tiempo, el aspartamo contiene fenilalanina un aminocido que los enfermos fenilcetonricos son incapaces de metabolizar y acumulan en el organismo. Como muestra la tabla 7 generalmente se emplean biosensores enzimticos en la determinacin de aditivos alimentarios. En algunos casos se han observado reacciones de interferencia que disminuyen la eficacia de estos dispositivos. Por ejemplo, ciertos biosensores utilizados para detectar sorbitol interaccionan tambin con otro edulcorante artificial, el xilitol. En algunos dispositivos destinados a la determinacin del cido benzico tambin surgen problemas de este tipo por la presencia de otros antioxidantes (BHA y propil galato).

TABLA 7. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de aditivos alimentariosAnalito Sistema de transduccin Tipo de interaccin Sistema de reconocimiento (una o varias clases de enzimas)

Aspartamo (25) Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Amperomtrico Sorbitol (26) Amperomtrico cido benzico (27 ) Amperomtrico Sulfitos (7) Amperomtrico 4.1.2 Frmacos

Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica Biocataltica

Carboxil esterasa y alcohol oxidasa Caboxipeptidasa y L-aspartasa Peptidasa y aspartato aminotransferasa y glutamo oxidasa -Quimotripsina y alcohol y oxidasa Sorbitol deshidrogenasa y NAD Tirosinasa Sulfito oxidasa

El uso de frmacos para el tratamiento de animales, tanto con fines teraputicos como con fines de promocin del crecimiento est muy extendido en ganadera. Como consecuencia de este uso, pueden aparecer residuos en los alimentos de origen animal, de ah el inters en su deteccin, tanto en los animales vivos, como en las canales o en los productos derivados de los mismos (leche, huevos, miel, etc.). Los mtodos tradicionales de cribado de muestras para detectar estos frmacos en ocasiones no tienen suficiente sensibilidad, y los mtodos ms actuales como cromatografa y espectrometra de masas requieren personal cualificado. (5) Los biosensores desarrollados para la deteccin de este tipo de compuestos son principalmente biosensores de bioafinidad, combinados con transductores pticos de tipo SRP. En la tabla 8 se recogen algunos de los biosensores de resonancia de plasmones superficiales desarrollados en los ltimos aos para la deteccin de antibiticos y promotores del crecimiento.

TABLA 8. Ejemplos de biosensores utilizados en el anlisis de frmacosAnalito Referencias Tejido

Levamisol

Hgado y leche

Crooks, et al (28)

Sulfonamidas (29) Penicilina G (30) Nicarbacina (31) Aminoglucosidos (32) Cloranfenicol Sulphametacina Residuos de -agonistas (35)

Suero de pollo Leche Hgado y huevos Leche desnatada Leche Orina Hgado

Haasnoot, et al Gustavsson, et al McCarney, et al Haasnoot, et al Gaudin, et al (33) Akkoyun et al (34) Traynor, et al

4.1.3 Residuos de Plaguicidas y Fertilizantes La presencia de residuos de plaguicidas y fertilizantes en productos destinados al consumo humano es indeseable porque muchos de ellos cuentan con una toxicidad elevada. Algunos plaguicidas tienen la capacidad de acumularse en el tejido graso animal mientras que los nitratos, nitritos y fosfatos procedentes del empleo abusivo de fertilizantes contaminan el medio, fundamentalmente, los acuferos subterrneos. La tabla 9 recoge los principales biosensores utilizados en la deteccin de este tipo de compuestos en alimentos y agua. Entre ellos los ms extendidos son los biosensores enzimticos, dentro de los cuales se diferencian: Dispositivos basados en la inhibicin de la actividad enzimtica. Aqu se encuentran los biosensores que incorporan enzimas como colinesterasas (acetil y/o butirilcolinesterasas), tirosinasas o fosfatasas alcalinas. Unidades en las que se catalizan reacciones que afectan al analito de inters. ste es el caso de los biosensores que incluyen hidrolasas, reductasas,... Con respecto a los herbicidas (fenilureas, triazinas) -que actan inhibiendo la fotosntesis- se han diseado biosensores con receptores (de membrana de tilacoides y cloroplastos, fotosistemas, centros de reaccin) o clulas completas (algas unicelulares, bacterias prpuras) que participan o realizan este proceso. Aqu se emplean, sobre todo, transductores amperomtricos y pticos. (6) 4.1.4 Otros Contaminantes Este epgrafe engloba un conjunto heterogneo de sustancias potencialmente txicas para el hombre con un alto impacto sobre el medioambiente. Se trata de residuos contaminantes presentes en el agua y el suelo que pueden alcanzar la cadena alimentaria de manera accidental. Se dividen en: Compuestos orgnicos, subproductos originados en diversos procesos industriales (dioxinas), usados como agentes dielctricos o fluidos hidrulicos (bifenilos policlorados o PCBs) o generados en la combustin de carbn, petrleo o madera (hidrocarburos aromticos policclicos o HAPs). Tambin se incluyen el benceno, tolueno y xileno (denominados BETX) y derivados fenlicos (tabla 9). Metales pesados (arsnico, cadmio, mercurio, plomo,...) (tabla 10). Aunque no se destinan al anlisis en matrices alimentarias, se han diseado numerosos dispositivos para determinar los niveles de estos contaminantes en muestras del medio ambiente. Se utilizan inmunosensores, biosensores enzimticos y biosensores con clulas completas en la deteccin de los compuestos orgnicos descritos (6) (39), mientras que para los metales pesados son mayoritarios los biosensores que incorporan microorganismos modificados genticamente y enzimas (ureasa, colinesterasas, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina, ascorbato oxidasa, peroxidasa,...) (40). En ambos casos los sistemas de transduccin destacados son los electroqumicos y los pticos. TABLA 9.