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Cultivo de clulas animales
Mara Isabel Correa Estrada Alejandra Muoz Rendn
PARA EL DESARROLLO DE UNA SUSTANCIA NUEVA CON ACTIVIDAD BIOLOGICA1. 2. 3. 4. 5. 6.
Ingeniera gentica Seleccin de la lnea celular y del clon Definicin y optimizacin del medio de cultivo Caracterizacin de las clulas Determinacin de las estrategias ptimas de cultivo Evaluacin de la calidad y actividad del producto obtenido.Cultivo de clulas animales
Siglo XIX Estudio del comportamiento de clulas animales. Actualmente Cultivos en laboratorios, de clulas procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Condiciones de crecimiento Temperatura, mezcla de gases y pH. Medio de cultivo Factores de crecimiento, indicadores de pH, antibiticos y antimicticos.
Cultivo de clulas animales
AplicacionesIngeniera de tejidos y rganos Terapia gnica
BiofarmacologaMedicina Toxicologa y fisiologa in vitro Nanobiotecnologa Dispositivos bioelectromecnicosCultivo de clulas animales
Ventajas
Produccin de protenas altamente similares a las humanas. Procesamientos complejos, como la glicosilacin. Mercado de ms de diez mil millones de dlares anuales.
Bajas velocidades de crecimiento Largos tiempos de cultivo. Uso de suplementos y medios de cultivo costosos. Fragilidad de las clulas.
Desventajas
Potencial presencia de virus endgenos. Equipos, instalaciones y bioprocesos son sofisticados y costosos. Bajas productividades.
Incalculable impacto en el incremento de la calidad de vida y salud humana.
Cultivo de clulas animales
Procedencia del cultivo
TejidosEpitelial Conectivo Muscular Nervioso
Fluidos y otrosSistema hematopoyticoMdula sea Tejido linfoide
Crecen adheridas a una superficie y formando monocapa
Crecen suspendidas en forma esfrica
Cultivo de clulas animales
Clasificacin del cultivo celular
Cultivo de clulas animales
Tipos de cultivos celulares
Cultivo de clulas animales
http://www.innoprot.com/es_productos _escaparate.asp
Lneas celulares en la biofarmacologa
Aplicaciones industrialesPrincipales lneas celulares: Ovario de Hmster Chino (CHO) Mieloma de ratn SP2/0
Mieloma de ratn NS0 Usadas para producir 11 de los 21 productos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) entre los aos 1996 y 2000
Cultivo de clulas animales
Vacunas y tejidos para transplantes
Protenas o anticuerpos recombinantes
http://www.smbb.com.mx/anuncios /applikon/applikon.html
Aplicaciones industriales
Cultivo de clulas animales
Aplicaciones industriales Dao debido a la agitacin y aireacin: Diseo y control de los biorreactores Pluronic F68. Acumulacin de productos residuales: Sistemas en perfusin Expresin de la glutamina sintetasa (Celltech).
Calidad de productos Activador tisular t-PA:
Rata de crecimiento Estado de las clulas mAB humano, Synagis: Tiempo de cultivo Fed-Batch Medio libre de suero
Cultivo de clulas animales
Cultivo de clulas animales
Cultivo de clulas animales
Biorreactores y tipos de operacin utilizadosCultivo de clulas animales
Cultivo de clulas adherentes Botella cilndrica Sistemas de platos apilados Microportadores suspendidos en tanques agitados No tradicionales: Biorreactor de columna de burbujeo, Reactor de membrana de dilisis, reactor de lecho empacado en perfusin
Usadas en campo especializados: Produccin de eritropoyetina Terapia gnica Produccin de vacunas
Cultivo de clulas animales
Cultivo de clulas adherentes Microportadores suspendidos en tanques agitados: Escalas por encima de 10000 L Optimizacin ms eficiente Flexibilidad en el diseo de la alimentacin Perfusin Filtros Spin Concentracin para aumentar el rea superficial Diseo del agitador para altas cantidades de microportadores.
Cultivo de clulas animales
Clulas adherentes Microaireacin con O2 puro previene el dao por gaseado excesivo Acumulacin de CO2
Es muy necesario el uso de sueros y protenas en el medio de cultivo Mayor probabilidad de contaminacin
Cultivo de clulas animales
Aplicaciones industrialesProduccin de protenas y anticuerpos: Suspensiones en tanques agitados con alimentacin controlada (Fed-Batch, Perfusin, etc.). Cultivos a gran escala: o o o o o Maximizar la productividad Mantener la calidad del producto Remover componentes no deseados en el cultivo Minimizar la contaminacin Controlar la remocin de CO2.Cultivo de clulas animales
ESCALADOCultivo de clulas animales
Rata de transferencia de masa Agitacin Sensibilidad a los esfuerzos cortantes
Balance
Cultivo de clulas animales
Criterios de seleccin de un sistema de cultivo celular
Operacin estril Agitacin sin causar dao las clulas sensibles
Facilidad del escalado Posibilidad de automatizacin y control del proceso
Suficiente transferencia Compatibilidad con los de gas (O2 y CO2) procesos aguas arriba y aguas abajoCultivo de clulas animales
Modos de operacin reportados
Batch o Fed-Batch STRs8-10 m3 15 m3
Continuos en perfusinMs comn para produccin de protena.
Cultivo de clulas animales
Escala Utilizada
Reactor Utilizado
Productividad de la lnea celular
Cantidad de producto requerida
Cultivo de clulas animales
PROTENAS TERAPUTICAS(kg/ao)
ANTICUERPOS MONOCLONALES
EL ESCALADO EXITOSO: Cortos perodos de tiempo. Ahorra en costos de produccin. Ofrece ventajas competitivas.
VARIACIONES EN LAS PRODUCCIONES REQUERIDASCultivo de clulas animales
AGITACINCultivo de clulas animales
Nmero de Bodenstein (Bo):
Nmero de Peclet (Pe)
Indicador deo Mezcla en distintas regiones del reactor o ndice de mezcla longitudinal
Tambin usado para caracterizar la agitacin o mezcla
Pe = vD/ D1D: Dimetro del tanque
Bo= Lv/ D1 L: Longitud caracterstica v: velocidad media D1 : Difusividad axial
USADOS EN STRs Y EN AIRLIFTS Cultivo de clulas animales
Gradientes de pH
Dispersin de los nutrientes
FACTORES CRTICOS EN EL CULTIVO
Productos de desecho
Aireacin
Cultivo de clulas animales
TRANSFERENCIA DE MASACultivo de clulas animales
Nutrientes Productos txicos Gases
Micro Macro Lactato Amonio
O2 CO2
Cultivo de clulas animales
Requerimientos de O2
Dependientes de la lnea celular Lneas celulares comerciales comunes:2.5 mg/108 cel*h
Clulas humanas:0.5 (mmol/L* h)Para 106 cel/mL
0.05 (mmol/L* h)
0.1 mg/108 cel*h
Cultivo de clulas animales
Transferencia de gas
La mayora de las correlaciones realizadas para obtener kLa no son apropiadas para los cultivos de clulas animales
Cultivo de clulas animales
Membranas permeables al gasEsparcimiento directo de aire u oxgeno Esparcimiento de oxgeno puro usando dispositivos especiales
Generacin in situ de oxgeno usando:Perxido de hidrgeno Peroxidasas
Mtodos de aireacinCultivo de clulas animales
Enfoque: Diseo de inyectores de gas Disolucin completa de las burbujas antes de que alcancen la superficie
Transferir gas sin producir burbujas
Membranas permeables
Tubos vibratorios de silicona
Cultivo de clulas animales
Burbujas
Zhang et al. (1992) midieron las ratas de transferencia de
oxgeno en bioreactores aireados de clulas animales, comofuncin del dimetro de burbuja.
Los dimetros de burbuja estudiados fueron: 5 mm 1 mm 100 m
La transferencia aumenta a medida que el dimetro de la burbuja disminuye
Cultivo de clulas animales
Burbujas
En las clulas animales los dimetros de burbuja estarn casi siembre entre 46 mm.
Regmenes de formacin de las burbujas1. 2. 3. Formacin de burbujas separadas. Burbujeo en cadena Rgimen jet ((Re) >2000)
4.
Rgimen turbulento
1.Burbujas separadas
2.Burbujeo en cadena
Cultivo de clulas animales
Transferencia del CO2
Producto del metabolismo Su transferencia de la solucin a las burbujas de gas clulas animalesAumentos en CO2 Aumentos en HCO3Disminucin en el pH
Crtica para las
ESFUERZOS CORTANTESCultivo de clulas animales
Posibles causas del dao celular
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Colisiones directas de las clulas con los aspersores y/o baffles Diferencias de presin entre la parte frontal y tracera de los impulsores Turbulencia mediada por las diferencias en las longitudes del vector del campo del flujo no laminar Microeddies con dimetro menos al dimetro celular
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Interacciones clula-burbuja
Regiones principales donde puede ocurrir el dao:1. Regin de generacin de la burbuja (Incluyendo la
regin donde el aspersor induce incorporacin yrompimiento) 2. Regin de ascensin de la burbuja 3. Regin de rompimiento de la burbuja
Depende tambin de la lnea celular y su resistencia a la deformacin.Cultivo de clulas animales
Tramper et al (1987)
En columnas de burbujeoJobses et al (1991)
Muerte celular por contacto con las burbujas
Kioukia et al. (1992)
Cultivo de clulas animales
Efectos del esfuerzo cortante segn la etapa de crecimiento
Estado de crecimiento del inculo Mayor fragilidad Mayor resistencia Fases: lag y estacionaria Fase exponencial
Si la lnea celular se desarroll desde la fase de laboratorio en cultivos bien agitados Menos sensible. Si las clulas estn expuestas a un ambiente altamente inhibitorio ms sensibles.Cultivo de clulas animales
Temperatura del fluido
Concentracin celular
Otros factores
Caractersticas de las superficies contenedoras
Historia de estrs y deformacin de la muestra
Concluyendo1.
Muchas
suspensiones
celulares
4.
Los esfuerzos mecnicos afectan tambin:
(hibridomas) no son tan sensibles a
los esfuerzos cortantes como sepensaba.
HomogenizacinTransferencia de masa Formacin de producto Suspensin de las clulas
2.
En STRs la muerte celular ocurre
principalmentelas burbujas
por el estallido de5.
La
aireacin que
combinada posibles dejan un
con
la
agitacin3.
tiene
efectos rango
La muerte celular en suspensiones
nocivos
aumentaremolinos
ade
medida
que
losse
limitado de velocidades de agitacin disponibles.
Kolmogorov
aproximan al tamao de las clulas
Cultivo de clulas animales
PRESINCultivo de clulas animales
La presin afecta:
Solubilidades del O2 y CO2 El tamao de las burbujas La viabilidad y fisiologa celulares Pocos estudios Takagi et al. (1995): Efectos de variaciones de 0.1 a 0.9 MPa. Cambios en las ratas de conversin Glucosa a lactato
Consumo de glutamina
Aumento del 20% en la rata especfica de produccin de anticuerpos monoclonales, con el incremento de presin.
CRITERIOS PARA ESCALADO ASCENDENTECultivo de clulas animales
Criterios
Dimensiones del reactor. kLa. Tasa de deformacin (valor mximo). P/V (muy usado en cultivos microbianos). Flujo volumtrico de gas por unidad de volumen de lquido. Velocidad superficial de gas. Tiempo de mezcla (no muy usado). Velocidad en la punta del impulsor (para STRs).Cultivo de clulas animales
ESCALADO DESCENDENTECultivo de clulas animales
Para qu se usa ?
Entender fenmenos vistos Mejoramiento de procesos La similitud geomtrica no es un parmetro necesariamente importante.
Lo ms importante es encontrar en la pequeaescala las mismas constantes cinticas del proceso realizado en la escala original.
Optimizacin de los procesos.Cultivo de clulas animales
TIPOS DE REACTORESCultivo de clulas animales
A PEQUEA ESCALA
Biorreactores desechables Hexascreen mini biorreactores
Cultivo de clulas animales
Biorreactores desechables1. Filtro de venteo 2. Puerto de sobrepresin de gases de salida 3. Puertos para adicin de medio de cultivo y otros componentes 4. Sello de cojinete para el agitador 5. Impulsor de polietileno moldeado ensamblado por una tubera que da la forma al agitador 6. Puertos para la integracin de electrodos de pH y oxgeno disuelto estndar de 1/2 pulgada 7. Puerto para el sensor de temperatura 8. Puerto de muestreo 9. Puerto para drenado 10.Sistema de aireacin
Cultivo de clulas animales
Biorreactores desechables1. Contenedor de acero inoxidable 304 2. Motor 3. Chaqueta de calentamiento 4. Plataforma 5. Unidad de control de temperatura y Mezclado nicamente.Los parmetros de cultivo son controlados por sistemas adicionales convencionales.
Cultivo de clulas animales
Biorreactores desechables
www.hyclone.com www.xcellerx.com www.startorious-ste Diagrama de los perfiles de flujo de un Wave Bioreactor. Cultivo de clulas animales
Biorreactores desechablesFabricantes:
Thermofisher Xcellerx Startorius-stedim GE healthcare Applikon Amprotein Cellexus Biosystems Atmi-lifescience Pall Co Upfront ChromtographyCultivo de clulas animales
Hexascreen mini Biorreactores Volmenes entre 10 y 15 mL Seis experimentos en paralelo y monitoreo en lnea Sistema adecuado tanto para cultivos en suspensin como adherentes Informacin cintica en tiempo real del crecimiento celular y la actividad metablica: concentracin de clulas (OD), oxgeno disuelto y pH.
Cultivo de clulas animales
A GRAN ESCALA
Tanques agitados (STRs)
Fermentadores air-liftColumnas de burbujeo
Reactores de lecho empacadoReactores de lecho fluidizado Reactores de membranaCultivo de clulas animales
En general
Se prefieren los sistemas de suspensin a los de inmovilizacin.o Se operaban en modo Fed-Batch y luego se impuso el cultivo en perfusin.
Sistemas de Inmovilizacin:o Fibra hueca o Lechos de vidrio
o Microportadores
Los ltimos pueden presentar problemas Heterogeneidad en el pH y la TOD
Cultivo de clulas animales
Tanques AgitadosConsideraciones del Diseo: Velocidad del Impulsor. Geometra del impulsor (Di, Hi) Relacin (Di/Dt) Detalles del aspersor Tasas de flujo gaseoso Ubicacin de alimentaciones Alclis Puntos de muestreo Diseo de la base del tanque Sondas de pH y OD Diseo del eje del impulsor (Motores y sellos) Bafles Control de la Temperatura Relacin de aspecto
Cultivo de clulas animales
Tanques Agitados
Hidrodinmica:
La
dispersin
del
gas
debe
encontrarse
generalmente en el rgimen de inundacin.
Eleccin de impulsor: Altos nmeros de flujo (Fl) y bajos nmeros de potencia (Np). Grandes impulsores agitando lentamente. Impulsores de turbina: Dainos para muchas lneas celulares Propela marina: Se ha utilizado ampliamente
Relacin de aspecto: Se prefieren altas. Alturas muy grandes pueden afectar: Control y monitoreo de pH. Presin hidrosttica en el tanque.
Cultivo de clulas animales
Reactores Airlift:
Consideraciones del Diseo Relacin de aspecto Detalles del aspersor Flujo gaseoso Posicin de alimentaciones Alkali Puntos de muestreo Sondas para pH y OD Diseo de la base del tanque Control de la temperaturaCultivo de clulas animales
TANQUE AGITADO
AIRLIFT
Similitud geomtrica
Similitud geomtrica
Esfuerzos cortantesconstantes (Velocidad en la punta del
KlaVelocidad superficial del gas
impulsor)
Rata de flujo de gas porunidad de volumen Tiempo de mezcla
Kla QG / V
ESCALADOCultivo de clulas animales
Comparacin entre los sistemas Relacin de aspecto ms favorable para el adecuado mezclado en el caso de tanques agitados. Ratas de flujo de gas similares. Mayor flexibilidad en la perfusin, particularmente respecto al uso de filtros.
Cultivo de clulas animales
Mecanismos para incrementar la productividadAdems de cambios en el diseo del reactor, condiciones del proceso y remocin de compuestos, se ha probado: Adicin de agentes osmoprotectores Adicin de glutamina Adicin de butirato de sodio
Cultivo de clulas animales
RetosEstrs hidrodinmico Apoptosis Productividad
Agitacin Aireacin Sulfactantes Plurnicos
Disponibilidad de oxgeno y nutrientes Elevacin de T Disminucin de pH
Cantidad Calidad Remocin de compuestos no deseados Contaminacin
Cultivo de clulas animales
Bibliografa Palomares L. A., Valdez N.A. y Ramrez O.T. (2007) Superando los retos de clulas animales a travs de la bioingeniera. Biotecnologa, Vol. 14, pp. 385399. Tavira C. A., Ortega A., Dvila I., Estrada S. y Meneses A (2009) Alcances y perspectivas del cultivo de clulas animales en la biotecnologa farmacutica. Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, Vol. 40, Nm. 4, pp. 35-46. Chu L. and Robinson D.K. (2001) Industrial choices for protein production by large-scale cell culture. Biochemical engineering, Vol. 12, pp. 180-187Cultivo de clulas animales
Bibliografa Varley J. and Birch J. (1999) Reactor design for large scale suspension animal cell culture. Citotechnology, Vol. 29, pp. 177-205. Trujillo M.A. y Valdez N.A. (2009) El uso de biorreactores desechables en la industria Biofarmacutica y sus implicaciones en la ingeniera. Dyna, Vol. 76, Nm. 158, pp. 275-283
Cultivo de clulas animales