CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA- Roca, W.M. et al. CIAT. Cali, 1991

GLOSARIO

ABSCICIÓN. Separación de una hoja, flor o fruto de la planta madre

Adventicio: Referido a órganos vegetales (raíces, tallos) que aparecen a partir de estructuras no preformadas, órgano o estructura vegetal que se desarrolla ocasionalmente y de existencia no constante ( ej. raíces o tallos adventicios).

Androgénesis: Crecimiento de plantas a partir del gametófito masculino, partenogénesis masculina, haploide del polen.

ANGIOSPERMA. Planta con flores, que tienen la semilla o semillas encerradas en el ovario.

Antera: Porción terminal del estambre que contiene el polen.

APOMIXIA: Reproducción asexual ( no por fusión de gametos ).

AXÉNICO : Aislado de otros organismos.

Auxinas: Grupo de reguladores del desarrollo vegetal relacionado con la elongación celular, dominancia apical, iniciación de raíces, etc. Algunas de las auxinas usadas frecuentemente en cultivos in vitro son: Ácido indolacético (IAA), Ácido naftalenacético (NAA), Ácido indolbutírico (IBA) y Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D).

Bacteriorriza. Unión simbiótica entre una bacteria y una raíz. Común en las leguminosas.

Callo: Masa de células que surge de la proliferación desorganizada de las células de un explanto. Callosidad: tejido de cicatrización que genera cambios hormonales en el corte, que inducen formación de raíz

CÉLULA : unidad biológica totipotente.

CÍBRIDO : híbrido citoplásmico ( citoplasto + célula completa ).

CAMARA DE CULTIVO: Luz, agua y humedad controlada.

CAMARA DE FLUJO LAMINAR: cámara para inoculación con flujo de aire estéril.

Capacidad germinativa. Máximo porcentaje de semillas capaces de germinar en condiciones óptimas.

CELULAS MERISTEMÁTICAS : no diferenciadas.

Citoquininas: Grupo de reguladores del desarrollo vegetal que causan división celular, diferenciación celular, diferenciación de tallo, rotura de la dominancia apical, etc. Algunas citoquininas usadas en el cultivo de tejidos son : la quinetina, benzilaminopurina (BAP), 2-isopenteniladenina (2-ip) y zeatina. Hormonas vegetales, inducen división celular y yemas adventicias.

Clon: Población de células que provienen de una única célula mediante la sucesión de divisiones mitóticas CLONACIÓN : Hibridación parasexual o hibridación somática.

CLORURO DE TRIFENIL TETRAZOLIO. Sustancia utilizada para evaluar la viabilidad de las semillas. Los embriones vivos se tiñen de rojo con esta sustancia.

Crioprotectores. Sustancias que penetran en los tejidos impidiendo la formación de cristales de hielo en temperaturas bajas.

Cultivo Crecimiento de células, tejidos, órganos o plantas enteras en un medio nutritivo bajo condiciones de esterilidad.

Cultivo de células: Cultivo de células aisladas o en pequeños grupos.

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES: grupo heterogéneo de técnicas (como la organogénesis) para cultivar un explante asépticamente en un medio de composición química definida bajo condiciones ambientales controladas (t˚ y luz)

Diáspora. Estructura para la propagación de una semilla o un fruto.

DETERGENTE: que disminuye la tensión superficial de una solución.

Diferenciación: Desarrollo en el explanto de nuevas características morfológicas o fisiológicas.

Embriogénesis: Proceso de iniciación y desarrollo del embrión

Embrión. Cuerpo de células resultado de la fecundación del óvulo. Es el primordio de la planta encerrado en la semilla que germina en condiciones favorables para convertirse en plántula.

Escarificación. Acción de romper la testa de la semilla por medios químicos o mecánicos.

Explanto: Trozo de tejido o órgano usado para iniciar un cultivo, porción de tejido escindida. EXPLANTE: yema apical o lateral para propagación in vitro de plantas, flor, hoja, raíz, polen, semillas, cotiledones, nudo ( las más fáciles son yemas apicales o tres últimas laterales o subapicales), meristemos ( tejido más seguro para plantas sin virus)

Fenología. Cambio de apariencia de las plantas durante las estaciones (determinado por factores físicos del ambiente y mecanismos de regulación internos: floración, producción de hojas jóvenes, fructificación y caída de sus hojas.)

Fotoblastismo. Respuesta de las semillas a la luz. __positivo cuando requieren de luz para germinar, y negativo cuando la luz inhibe su germinación. Indiferente, semillas insensibles a la luz.

Fotoperiodo: Alternancia de horas de luz y de oscuridad en un día.

Genoma. Material genético de una célula

GIBERELINA: Hormona vegetal, produce elongación y división celular. Intervienen principalmente en la germinación y crecimiento de tallo. La más común es el ácido giberélico- GA3

Gimnospermas. Plantas con semilla al descubierto o sin la protección de fruto (pinos, abetos).

IMBIBICIÓN. Absorción pasiva de agua en las semillas que precede a la germinación.

In vitro: Literalmente "en vidrio", se aplica a los cultivos (o procesos) que se desarrollan en recipientes estériles.

Inducir: Causar la iniciación de un proceso o estructura.

In vitro. En vidrio, cultivo en recipientes de vidrio en condiciones asépticas laboratorio.

Isoterma. En un mapa, línea que conecta puntos de va lores iguales de temperatura.

KINETINA: hormona de la división celular. (Ojo: proporción citokinina :auxina )

Lábil. Que se descompone fácilmente.

Latencia. En las semillas, período de interrupción del desarrollo debido al bloqueo químico, metabólico o estructural que impide la germinación

LINAJE CELULAR: células seleccionadas o clonadas.

LINEA CELULAR: células que se cultivan varias veces.

Longevidad potencial. Duración de vida promedio de las semillas bajo condiciones óptimas de almacenamiento en un medio controlado. __ ___ecológica, duración de vida promedio de las semillas en condiciones naturales.

Meristemo: Grupo localizado de células en continua división, a partir de las cuales se forman nuevos tejidos y órganos (raíces, tallos, hojas o flores).

Meristemático: Que tiene las características del meristemo.

Micropropagación: Propagación asexual (vegetativa) in vitro de plantas.

MICROSCOPIO BINOCULAR: con aumentos de 5 – 20 X.

Morfogénesis: Desarrollo de algún carácter morfológico o estructura del organismo

Nudo: Zona del tallo en la que se halla una hoja con una yema axilar. Parte que generalmente sobresale del tallo, de la que salen algunos órganos de la planta

Ontogenia. Desarrollo del ser a partir de su ovocélula hasta su formación definitiva.

pH. Medida de la acidez o alcalinidad de una solución en una escala de 0 a 14 ( ácido a base), donde un pH =7 es una solución neutra.

Plántula. Plantita recién nacida.

PLATABANDAS. Estructura construida para proteger a las plántulas del exceso de sol y de la desecación.

POTENCIAL OSMOTICO (valor del) : potencial conseguido disolviendo una sustancia en agua; 1 mol de glucosa por litro de agua produce un potencial osmótico de 22,4 atmosferas. Componente del potencial hídrico producto de la presencia de partículas de soluto.

Propágulo. Estructura que sirve para propagar o multiplicar vegetativamente una planta.

Protoplasto: Célula desprovista de su pared celular. Célula vegetal sin pared por degeneración enzimática de esta (Células con digestión enzimática de las paredes celulares ). Contenido plasmático de la célula. Protoplastos viables para regeneración de plantas completas se llevan a hibridación parasexual o hibridación somática. (I.E. clonación ).

Pubescente. Planta que tiene pelos o vellos.

QUELANTE. Un quelante, o antagonista de metales pesados, es una sustancia que forma complejos con iones de metales pesados. A estos complejos se les conoce como quelatos, palabra que proviene de la palabra griega chele que significa "garra". Una de las aplicaciones de los quelantes es evitar la toxicidad de los metales pesados para los seres vivos.

Quiescencia. Estado de reposo metabólico en las semillas que se rompe con la entrada de agua.

Selección clonal. Empleo de métodos de mejora de plantas utilizando la multiplicación asexual, ya sea por selección de clones más favorables de una población mezclada o por elección y propagación de variaciones favorables dentro de los clones.

Somático: Relativo o perteneciente al "soma" o cuerpo. En cultivo in vitro se usa para referirse a células, tejidos, órganos o procesos que no están relacionados con la reproducción sexual.

Temperaturas cardinales. Temperaturas mínima, máxima y óptima que caracterizan la respuesta fisiológica de una especie.

Variabilidad genética/ fenotípica. Variación que se produce en el genotipo/ fenotipo.

Viabilidad. Situación en que bajo condiciones óptimas las semillas son capaces de germinar.

Yema. Rudimento de vástago que se forma habitualmente en la axila de las hojas. Exilares, adventicias, terminales, etc.

www.etsea2.udl.es

Cultivos: plantas, semillas, embriones, órganos, explantes, tejidos, células, protoplastos, callos, ápices de vástagos, anteras y micro esporas.

En tejidos: aislados, suspensión y de callos.

1. Planta intacta – semilla.2. Embrión. Sin otros tejidos de la semilla.3. Órgano. Meristemos, ápices de vástago, raíces, anteras, etc. (I.E. Explantos.).4. Callo: Una porción de tejido se desdiferencia in vitro, dando un callo.5. Células aisladas: de tejido, callo o cultivo en suspensión (por enzimas ).6. Protoplastos: por digestión enzimática de la pared celular.

PROTOPLASTOS: Célula vegetal sin pared por degeneración enzimática de esta

(Células con digestión enzimática de las paredes celulares).

REQUERIMIENTOS:

Granatario y balanza de precisión ( hasta 0,1 mg )Espátulas.Horno microondas.PH-metro.Destilador.Reloj de tiempo.Cierres : algodón, papel aluminio, película plástica, tapones metálicos.Esterilizador seco.Papel filtro o placas de vidrio.Centrífuga.Hipoclorito cálcico. ( para esterilizar material vegetal. )Escobillas de limpieza.Refrigerador + congelador.Acido crómico + acido sulfúrico.Iluminación fluorescente.Reloj para fotoperiodo.Agitador.

AREAS DE TRABAJO DEL LABORATORIO

1. Área de PREPARACIÓN: Preparación de medios de cultivo

Almacenamiento de materiales de vidrio, plástico, reactivos

Una mesa de trabajo para preparación de medios

Balanzas (balanza analítica 5 mill), pH, platos calientes de agitación

Vitrinas, estanterías, refrigeración

Incubadora o cámara de crecimiento

2. LAVADO Y ESTERILIZACIÓN

Lavadero amplio, agua fría y caliente, H2O bidestilada, destilador, desionizador (entre lavadero y

lavadero), almacenar agua, basurero. (EXTRAN, 5 lt $ 120mil o axion )

3. Área de siembra o TRANSFERENCIA- (cabina flujo laminar), excisión, inoculación y transferencia de explantes a

Medios. Microscopio. Máxima limpieza.

4. Área de incubación y crecimiento (luz y t, guantes, churruscos, esponjas)

Control de temperatura (20-28˚C)

Control de iluminación: 1000 a 5000 lux.

Humedad relativa. 70-80 %

Estantería metálica (ANCHO 0.3x 1.00, LARGO por dimensiones del cuarto, ALTO- 1.8x 2.20 y 0.2x 0.5

entrepaños)

Área de cultivos en agitación

Área de cultivos estáticos en oscuridad

Aire acondicionado (cortar luz al fallar el aire acondicionado, porque la luz calienta)

5. Área de observación y examen

6. Área de crecimiento: plantas que provienen de incubación mientras se acondicionan o aclimatan para su trasplante

(Invernadero casa-malla)

7. SEGURIDAD. Primeros auxilios, extintores, ducha ojos/cuerpo entero.

EQUIPO

Preparación: refrigerador, balanzas, potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos Erlenmeyer ( 125-250-500 ml.). Botellas de vidrio y plástico.

Lavado y esterilización: autoclave, destilador, gradillas, bandejas, estufas para esterilización y secado.

Transferencia. CFL, microscopio, cuchillas(10-11), mangos, agujas de disección, , tijeras, navaja.

Frasco alcohol, mechero, máscara, guantes, marcadores, bandejas, canecas.

Incubación. Temperatura, humedad, iluminación controlada. Estantes iluminados, gradillas,

termómetro de máxima y mínima

Área de examen. Microscopio, lentes de aumento, estreoscopio.

Área de crecimiento. Macetas, suelo, bandejas, cámaras de humedad.

OTROS: Agitador (hormonas y el auxiliar de Steward) para cultivos en suspensión

Centrífuga, filtros para esterilizar medios de cultivo. Desionizador de agua, secado de aire

Caliente, gabinete de solventes, congelador.

Jeringas, pipetas Pasteur y automáticas, cajas de Pietri desechables, horno microondas,

extractor de vapores, cámaras de crecimiento controladas, propagador de nebulización,

energía de emergencia.

Pisos lisos sin esquineras, pintura epóxica lavable NB: Yasmin (Quim F,), Goretti (micro) Ericsson (tecnólogo pasante)

CONTAMINANTES: medio, planta, personas.

Aseo especial: en la infraestructura barrer-trapeo piso con hipoclorito al 1 %, limpiar mesones por secciones con servilletas o gasas con hipoclorito o alcohol al 70 %, los e1uipos se limpian con alcohol al 70%, lámparas UV o germicidas con encendido externo, una hora lejos después de apagada. Escobas y traperos para cada área.

Operarios: indumentaria y lavado de manos

Material vegetal: detergente quita mugre (Extran o fab o yodo, primero el fab y luego el yodo)

ETANOL al 70 % quita grasa en superficies.

Hipoclorito de sodio- desinfectante, BLANCOX 5-5,6 % elimina

microorganismos contaminantes

Esterilizar: materiales inertes 15 libras de presión a 121 grados C por 15-20 minutos- medios de cultivo, estufa ( calor seco 170 grados por 2 horas).

Plancha calentamiento y agitación

Temporizadores para foto-período y termo-higrómetro (no más de 28 grados C)

LAVADO 10-PREPARACIÓN 25-SIEMBRA 23- INCUBACIÓN 42

1. Laboratorio de preparación de medios.

Medios, calentador de agua, granatario, micro-ondas,

PH-metro, mechero, esterilizador seco, centrífuga, Petri,

Material de envoltura (Kraft-vinipel)

Armarios. Autoclave, lavaplatos.

Área de lavado.

Almacén: vidrio, químicos, medios.

PREPARACIÓN DE MEDIOS.

25 %

2.INOCULACIONMicroscopio binocular, luz fluorescente

INOCULADORA

23 %

3. CAMARA DE CULTIVO.

Luz fluorescente,

Estanterías, gradillas,

Temperatura ( 17-27oC ) refri-calefacción.

Agitador.

INVERNADERO para cultivo y crecimiento.

CAMARA DE CULTIVO

42 %

NECESIDADES NUTRICIONALES Y HORMONALES EN CULTIVOS DE

ÓRGANOS Y TEJIDOS.

AGUA

Sustancias orgnicasMacro Micro

elementos pH

Azucares

Aminoácidos

Vitaminas

Auxinas

Citokininas

Reguladores. Giberilinas

Ac, Abscisico.

Etileno.

N Fe Co

P Zn Ni

K B Al

Ca Mn Mo

Mg Cu I

S

Mezclas de sustancias poco definidas: Extracto de levadura

Leche de coco

Extractos vegetales

Hidrolizado de caseína

Peptona y triptona.

MEDIO NUTRITIVO DE AMPLIO ESPECTRO.

Nutrientes, sales minerales ( macro y micronutrientes o sales inorgánicas- fuente de carbono- hormonas como reguladores de crecimiento vegetal como citoquininas, auxinas, giberilinas )

Azúcar ( sacarosa ) 1,2,4 %

Macrosales: Murashige y Skoog, disoluciones 1/ 4, ½, 1/1.

Auxina (ej. IBA, acido indolbutírico.): 0,01-0,5-5,0 mg-l.

Citokinina ( ej. BA, 6-bencilaminopurina ) 0.01-0,5-5,0 mg-l

En concentraciones baja, media y alta.

Otras sustancias :

1. AGAR, agente gelificante: polímero sintético BIOGEL(poliacrilamida ), Alginatos, Celulosa,

GELRITE (gelificante Merk).

2. Sacarosa 1-2-4 % ( 2-3 %)

3. Auxinas. IBA 0,01-0,5-5,0 mg l Las auxinas generan raíces adventicias. IAA ac indolacetico. Es una auxina débil. Ojo: conservar en frasco oscuro (como sales potásicas) Son inestables a la luz.(0,01-10 mgl=5mgl). NAA ac alfa naftalenacetico. Es una auxina fuerte. 2,4 D Nota: Las auxinas sintéticas : IBA,NAA y 2,4 D=( 0,001-10 mgl=1mgl) Producen elongación celular, expansión de tejidos, división celular, raíces adventicias, inhiben vástagos.

En cantidad: 0.01 a 10 mg/lSe disuelven en NaOH al 1N

4. Citokinina. 0,01-0,5-5,0 mg l Las citokininas inducen formación de vástagos axilares, estimulan crecimiento

y desarrollo.: En cantidad 0.03 a 10 mg/l, se disuelven en HCl al 1N

Kinetina. BA 6-benciaminopurina. ZIP. 6 dimetilalilamino purina. PBA 6 bencilamino 9tetrahidropiranil 9 purina.. EDTA Ac etilendiaminotetraacetico, quelante. (Na2EDTA).

5. Giberilinas: GA3 Es muy termolábil, inducen crecimiento de meristemos o yemas, se usan en cultivos de meristemas para elongación. Inhiben raíces y vástagos. Etileno

6. Ac abscísico ABA.

PARTE AEREA: MENOS AUXINAS, MAYOR CANTIDAD DE CITOQUININAS.ENRAIZAMIENTO : MAS AUXINAS MENOS CITOQUININAS

FUENTES DE NITRÓGENO Y VITAMINAS :Caseína 0,1-1,0 glPeptona 0,25-3 gl

Triptona 0,25-2 glExtracto de malta 0,5-1 glExtracto de levadura 0,25- 2 gl.

GA Ac. Giberelico

PEG Polietilenglicol.

TIBA Ac Triiodobenzoico.

ZEATINA 6 H-3M –2 butenilaminopurina (ribósido).

ABA ac abscisico. Hormona vegetal, dormición y senescencia.

MANITOL (y/o polietilenglicol, añadidos a los medios, disminuyen el potencial osmótico.)

CONCENTRACIONES.

Leche de coco al 5%: 50 ml + 950 H2O en dilución.

Porcentaje en peso: Para agar y azucares. 2% = 20 gr/1000 gr ( un litro) de medio.

MOLAR. Para los reguladores (hormonas). 0,01 M = 1 / 100mol por litro.

Mol es el peso molecular expresado en gramos.

CONCENTRACIÓN MOLAR: es la más deseable porque dos sustancias con igual concentración molar contienen el mismo número de moléculas de cada principio o sustancia por litro.

UNA SOLUCION MOLAR CONTIENE POR LITRO EL No DE GRAMOS DE SUSTANCIA QUE INDICA SU PESO MOLECULAR.

1 M = x gr / peso molecular. De donde,

PF = CM. PM CM = PF : PM

PM = PF : CM

MOLAR - MILIMOLAR – MICROMOLAR.

Gramo-litro, Miligramo-litro, Microgramo-litro.

PF = CM. PM - PM = PF: CM - CM = PF: PM .

PESO FISICO. PESO MOLECULAR. CONCENTRACIÓN MOLAR.

Microgramo / litro = 0,001 mg /litro.

Partes por millón PPM = 1 ppm = 1 mg / litro.

Gramo / litro = 10 a 3

Miligramo / litro = 10 a 6.

ppm = 10 a 6 o 1 mg / l. 1

Ejemplo: El peso molecular de la auxina IAA es 175,18.

Una solución 1 M de Iaa contiene 175,18 gr por litro.

1 mM –mili molar 0,17518 g por litro = 175,18 mgl-1

1 micro molar 0,00017518 g por litro = 0,17518 mg l-1

pesos moleculares ; Ca Cl2H2O = 40,08 + 2(35,453) + 4 (1,008)+ 2 (16,00)= 147,018.

ESTERILIZACIÓN.

La mayor parte de los medios se esterilizan por auto claveado. En el autoclave se recomienda el uso de agua desionizada

MEDIOS NUTRITIVOS DE CULTIVO.

Factores: 1. genética vegetal

2. nutrientes: agua, macro-micro elementos, azucares.

3. factores físicos; luz, t˚, pH, O2 y Co2.

4. Sustancias orgánicas: vitaminas, reguladores.

CLASIFICACION HORMONAS FUNCIONES

AUXINAS

Ácido indolacético (AIA), Ácido Naftilacético (ANA), Ácido indolbutírico (AIB),Naftalenacetamida (NAAM)Acido 4 clorofenoxiacetico (4-CP)Acido 2,4,5 triclorofenoxipropionico (2,4,5 TP)

Dominancia apical, estimulan elongación celular por la cual determinan el crecimiento de la planta. Favorece la maduración del fruto.

2-isopenteniladenina (2-ip)ZeatinaKinetina

Estimulan la división celular o citoquinesis. Controlan la brotacion de yemas

1 Para calcular los ppm se divide el peso (en mg) por el volumen (en litros). Por ejemplo, una disolución

de 15 gramos (g) en 3 metros cúbicos de agua:

15 g x 1000 mg/g = 15000 mg;

3 m³ x 1000 L/m³ = 3000 L; Concentración: 15000 mg / 3000 L = 5 mg/L = 5 ppm.

CITOQUININAS Dihidrozeatindimetilaliladeninabenziladenina

laterales. Ralentizan el proceso de degradación de la clorofila, el RNA, los lípidos y las proteínas que ocurren en las hojas en el otoño o al ser separadas de la planta.

GIBERILINAS

GA1GA3GA4GA7GA9

Incrementar el crecimiento de los internudos, Interrumpir el periodo de latencia de las semillas, haciéndolas germinar, Inducir la brotación de yemas, promover el desarrollo de los frutos (floración).

ETILENOAcido 2- cloro etilfosfonico Promueve la maduración de

frutos, promueve la senescencia (envejecimiento), caída de las hojas, geotropismo en las raíces.

ACIDO ABSCISICO

esteroles caroterioides

Promueve la latencia en yemas y semillas, inhibe la división celular, causa cierre de las estomas, antagónico de las giberilinas, inhibe el crecimiento.

POLIAMINAS

putrescinaespermidina espermina

Favorecen la floración, incrementan la tolerancia al estrés, promueven la división celar, estimulan la senescencia en hojas cortadas.

MODALIDADES DE CULTIVO IN VITRO. CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS SUPERIORES:

Cultivo de meristemas.Cultivo de yemasCultivo de anterasCultivo de embrionesCultivo de protopalstos.

Multiplicación en plantas• Semillas

_ Reproducción sexual_ Progenie con distinto genotipo

• Vegetativa: bulbos, esquejes, estacas, tubérculos_ Reproducción asexual_ Progenie con idéntico genotipo_ Descendencia uniforme_ Se transmiten enfermedades

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores.

El proceso de micropropagación de especies vegetales consta de varias etapas:

ETAPA 1Elección y selección de una planta madre selectaExplantosDesinfección superficialEstablecimiento en medio de cultivo apropiado

____________________________________________

ETAPA 2Transferencia a un medio de multiplicaciónMultiplicación a través de subcultivosFormación de brotes o embrioides

____________________________________________ETAPA 3

Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes

____________________________________________

ETAPA 4 Pasaje a maceta en un invernáculo, trasplante y aclimatación. Planta entera- microtunel-invernadero y siembra final en campo.

TECNICAS DEE MICROPROPAGACIÓN

1. ORGANOGENESIS DIRECTA2

2. CULTIVO DE MERISTEMAS

3. EMBRIOGÉNESIS

Producción de plantas libres de enfermedadesMétodos

_ Tratamientos con calor: para algunos virus y micoplasmas_Cultivo de meristemas_ Ambos_ Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.

Obtención de plantas de sanidad controlada (Cultivo de meristemas) Por qué el meristema? “La concentración del patógeno no es uniforme en la planta infectada”Meristema

• Sistema vascular poco diferenciado• Elevada actividad metabólica• Elevada concentración de auxinas

Esquema para la obtención de plantas de sanidad controlada_ Extracción del ápice (0.2-0.5 mm)_ Cultivo del ápice en un medio adecuado_ Planta regenerada_ Planta establecida en sustrato Cuidadoso control de la humedad_ Planta saneada Rigurosas evaluaciones (plantas indicadoras, injertos, serología etc)_ Cultivo libre de virus Mantenimiento, multiplicación. Monitoreo de reinfecciones virósicas

CONSIDERACIONES GENERALES AL CULTIVO DE MERISTEMOS

proceso n

2 Puede haber organogénesis directa: cuando los órganos se originan directamente del explanto en ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta.

El proceso no ofrece total seguridad total seguridad• Importancia de las técnicas de diagnóstico• Análisis confiables• Sistemas de detección sensibles• Especificar de qué virus se ha liberado y la técnica de diagnóstico empleada.

MICROINJERTOSInjertar ápices caulinares en un porta-injertoEtapas:

_ Germinación in vitro de las semillas del porta-injerto_ Preparación de la plántula para ser injertada_ Extracción del ápice de la planta infectada_ Mantenimiento de la plántula injertada en cultivo_ Mantener la planta obtenida en invernadero_ Indexar las plantas obtenidas

INFLUENCIA DEL MATERIAL DE PARTIDA: PLANTA MADRE

Capacidad regenerativa_ Genotipo_ Edad_ Estado del órgano o tejido_ Estado fisiológico_ Estado sanitario_ Año_ Condiciones de crecimiento_ Posición del explanto_ Tamaño del explanto

_ Condiciones fisiológicasCapacidad regenerativa

_ Genotipo: Dicotiledóneas mejor que mono-cotiledóneas, y entre ellas las Solanáceas, crucíferas muy fácil regeneración_ Edad: Partes juveniles mejor que las adultas_ Estado del órgano o tejido: Mejor no leñosos_ Estado fisiológico: Partes vegetativas mejor que partes generativas_Estado sanitario: Las más saludables y vigorosas_ Año: sobre todo si el material proviene de campo (inviernos severos ó veranos secos)_ Condiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece encampo que en invernadero_ Posición del explanto: Hay un gradiente de regeneración en la planta_ Tamaño del explanto: En general a mayor tamaño mayor capacidad regenerativa

PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

_ Recomendable que crezca en invernadero o cámara de crecimiento_ Usar material homogéneo_ Elegir plantas vigorosas_ Promover nuevas brotaciones: podas_ En maceta con sustrato estéril_ Programa sanitario_ Controles y manipulación de intensidad de luz, fotoperíodo y temperatura_ Aplicación de fitoreguladores_Prevenir insectos de cualquier tipo_Prevenir hongos y bacterias_Regar sólo en la maceta (evitar riegos por encima)_Mantener baja la humedad

OBTENCIÓN DE EXPLANTO Y DESINFECCIÓNEn invernadero

_ Elementos limpios en la colección_ Ubicarlos en bolsas identificadas_ En conservadoras

En laboratorio_ Agua corriente_ Se retiran hojas_ Soluciones desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio)_ Enjuagues con agua estéril en cabina de flujo laminar_ Antibióticos y/o fungicidas

CULTIVO DE ANTERASEn qué consiste?Polen inmaduro en medios adecuados para la formación de embriones o callos:

Aplicaciones en fitomejoramiento-Cruzamiento A X B-Plantas F1-Cultivo de anteras-Líneas haploides-Selección

CULTIVO DE EMBRIONES CIGÓTICOSPara qué se usa?

_ Superar dormición_ Inhibidores en el endosperma_ Estudios fisiológicos y nutricionales_ Acortar el ciclo en mejora_ Rescatar híbridos de cruzamientos

Las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:

i) una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametas),

ii) una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).

La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.

Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas.

Forma de Crecimiento Tipo de Cultivo

Determinados •• Hojas, Flores,, Frutos (enteros)

Cultivo de órganos Indeterminados • Yemas meristemáticas,

apicales y laterales, raíces

Organizada3

3 Forma de Crecimiento Organizada. Se refiere al cultivo de explantes diferenciados (especializados) que continúan su

crecimiento in vitro, manteniendo su estructura normal5 durante el tiempo de cultivo. Evidentemente, los explantes que presentan esta forma de crecimiento son los órganos (primordios de frutos, yemas vegetativas, yemas florales, raíces, primordios foliares, etc.), no obstante, cualquier otro tejido (como un fragmento de pétalo) puede dar origen a una forma organizada, como un embrión.

Cultivo de Cultivo de embriones • Semillas, embriones aislados

TejidosVegetales

Desorganizada4 Cultivo de callos Cultivo de células en suspensión Cultivo de células individuales

Cuando se cultivan órganos in vitro, se debe tener en cuenta el grado de determinación del explante, ya que de esto dependerá el crecimiento y desarrollo exhibidos durante el período de cultivo.

• Órganos determinados. Son ejemplos de éstos los frutos, las flores, las hojas; siempre que se utilice como explante los primordios de ellos, crecerán y se desarrollarán hasta formar órganos típicos, lo cual se debe a que la determinación es un fenómeno epigenético, es decir, que hereda de célula a célula la expresión de los programas genéticos y esto se mantiene durante períodos prolongados de tiempo aún cuando se modifiquen las condiciones de cultivo. En este sentido, contrasta con los fenómenos fisiológicos, que se suprimen al cambiar las condiciones ambientales.• Órganos indeterminados. Son ejemplos de éstos los ápices del tallo y ramas, yemas axilares y puntas de raíces; los tres primeros crecerán hasta dar origen a un nuevo tallo completo con hojas y sus propias yemas, y mientras el espacio y los nutrimentos los permitan continuarán su crecimiento de manera indefinida. Igualmente, las raíces se alargarán y producirán raíces secundarias y pelos absorbentes. Cabe aclarar que estos órganos son indeterminados (o más precisamente, poco determinados) desde la planta in situ, por lo que el crecimiento mostrado no es producto del cultivo in vitro.

Cultivo in Vitro de material vegetal “Cultivo de tejidos vegetales” es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas .

Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).

Esta técnica tiene numerosas aplicaciones:

Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción

Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año Obtención de plantas libres de virus Producción de semillas sintéticas Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la

variabilidad genética de una población vegetal Obtención de metabolitos secundarios Producción de nuevos híbridos Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas transgénicas Germinación de semillas. Producción de haploides. Estudios fisiológicos diversos.

dzcruzg@misena.edu.co 317 429 5106 8380191 ext 118- DIANA ZULEYI CRUZ GONZALEZ

4 Forma de Crecimiento Desorganizada. Como su nombre lo señala, los tejidos que exhiben esta forma de crecimiento

in vitro no tienen una estructura definida, son amorfos (de aspecto tumoral) y agrupan a células de muchos tipos (alargadas, redondas, isodiamétricas) y tamaños. Los callos celulares muestran crecimiento desorganizado, cuyas células no están bien adheridas entre sí, por lo que muchas veces pueden disgregarse, es decir, presentan friabilidad. Los callos pueden surgir a partir de Cultivo de cualquier tipo de explante, sobretodo cuando se exponen a altas concentraciones de hormonas del tipo auxínico. En muy pocos casos se presenta en la naturaleza el crecimiento desorganizado, pero algunas veces es causado por el proceso de cicatrización de heridas o por enfermedades como la agalla de la corona, cuyo agente etiológico es la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

SALES Y HORMONAS VEGETALES.

SALES FUNCION CELULAR DEFICIT

MAYORES

NITROGENO (N) Es constituyente esencial para las proteínas y la clorofila.

Se muestra en las hojas más viejas, pero también en hojas jóvenes mostrando un color amarillento.

FOSFORO (P) Importante para la división celular y crecimiento.

Suele comenzar en las hojas inferiores. Menor desarrollo radicular, menor floración y menor cuajado de frutos.

POTASIO (K) Se requiere en la división celular en la apertura y cierre de estomas. Importante para el funcionamiento de la clorofila y barias enzimas.

Se observa que se secan los bordes de las hojas. La planta presenta un estado de marchitez o flacidez.

CALCIO (Ca) Componente esencial en la pared y membrana celular.

Anormalidades en los puntos de crecimiento y en los ápices de las raíces.

MAGNESIO (Mg) Es el elemento constituyente de la clorofila e importante en la fotosíntesis.

Decoloración amarillenta pero las nervaduras permanecen verdes.

AZUFRE (S) Constituyente de la estructura molecular de las enzimas. cumple funciones importantes en las proteínas

Generalmente presenta hojas amarillas, planta caída con tallos cortos y escasos.

MENORES

HIERRO (Fe) Cataliza la simbiosis de la clorofila. Su función principal es activar enzimas.

Tallos cortos delgados y curvados, clorosis intervenal.

MANGANESO (Mn) Activación de enzimas, síntesis de clorofila, fotosíntesis.

Se manifiesta por aparición de decoloración amarillenta rojiza entre las nerviaciones de las hojas.

ZINC (Zn) Fundamental para la formación de clorofila y hormonas de crecimiento.

Las hojas se alargan y los entre nudos se acortan.

COBRE (Cu) Es necesario para formar la clorofila en la planta.

Se observa marchitez en la planta, muchas verduras presentan escases de hojas.

BORO (B) Ayuda a la formación del ARN, facilita el trasporte atreves de la pared celular.

Desordenes en el desarrollo normal de los frutos.

MOLIBDENO (Mo) Contribuye con las propiedades mecánicas de la pared celular como son la rigidez y la elasticidad.

Las hojas tienen un tamaño más reducido, presentando clorosis y moteados de color marrón

CLORO (Cl) Importante en la fotosíntesis y en la activación de enzimas.

Marchitamiento de las hojas, clorosis. Raíces enana y gruesa.

SODIO (Na) Estimula el crecimiento a través del alargamiento celular y puede sustituir al potasio como un soluto osmóticamente activo.

Causa en esas plantas clorosis y necrosis, e inclusive impide la formación de flores.

15

ESTERILIZACION MATERIAL DE LABORATORIO

Filtración: filtros de celulosa, sustancias termolábiles. Irradiación - rayos U.V: vidrio y cámara de flujo laminar Calor Seco (Estufa): 170°C x 2h: vidrio

Vapor bajo Presión (Autoclave) :

q 15 lb de presión (121°C)por 15-20 minutos

Medios de cultivo

q 15 lb de presión (121°C)por 30 minutos

Batas de laboratorio, tapabocas, polainas, gorro,Pinzas, bisturí, frascos,Agua destilada.

q 15 lb de presión (121°C)por 1-2 horas Material contaminado

Para esterilización de medios en frascos: 121˚ x 90 minutos

90˚ x 360 minutos.

En el micro-ondas (método de golpe de calor x 6 veces)

Olla a presión: 6 pitadas (frascos tapados con papel aluminio)

+ tres capas de VINIPEL (un roto con aguja), se espera 8 días para saber cuáles frascos o medios se han contaminado. Un hongo aparece en un medio de cultivo en 2-3 días. La gelatina se saca de pectina y la pureza del agar es proporcional a la transparencia y al precio

DESINFECCIÓN (de contaminación) EXÓGENA: las infecciones endógenas aparecen 1.al mes. 2. debajo de la herida del tejido o del explante.

SIEMBRA DE MATERIAL: Semillas o material de siembra ya desinfectado. Disponer:

1. Medios de cultivo.

2. Instrumentos de trabajo. Pinzas quirúrgicas de punta lisa/ acanalada, cortas y largas. Bisturí No. 3 / cuchilla No.10/ y No 4/ cuchilla no. 24/. Se mantienen en alcohol al 96 % y se flamean para secar el alcohol antes de cada uso.

3. Elementos.

Se trabaja sobre superficie de papel KRAPT en cuadrados o cajas de PIETRI o en baldosas, todo estéril. Servilletas estériles en la cabina. Mesones limpios y limpiar repetidamente.

Mechero: mecha cola de patos o trapero nuevo. Entre cámara de flujo y área puntual de siembra.

Rollo de material VINIPEL

Marcador para frascos para TRAZABILIDAD.

La tapa de aluminio solo para esterilizar, pero se tapa con VINIPEL para cultivo y crecimiento (tres capas en tapa).

DESINFECCION DE MATERIAL VEGETAL

• DETERGENTE - EXTRAN: elimina las suciedades del tejido, cepillado x 10 minutos

• ALCOHOL- ETANOL 70% - 96%: retira las grasas superficiales que posee el tejido, frotas con algodón impregnado en alcohol

• HIPOCLORITO DE SODIO 0.01% - 13%: desinfecta, eliminando los microorganismos contaminantes ubicados en la superficie del tejido vegetal. Lavado con agua estéril.

De testa dura

1. Lavado con EXTRAN (detergente) al 2 % entre 5-10 minutos, o hasta 15 minutos en semillas de testa dura (durazno, cedro).

2. Luego ALCOHOL al 70% quita grasas x un minuto. Cambiar luego de cada pasada y limpiar en una sola dirección.

3. Luego el HIPOCLORITO DE SODIO (Clorox 5,2 % presentación comercial) diluciones entre el 0.1% al 13 %, más frecuentemente entre 1 y 5 %, por 5 minutos o tiempos largos o cortos dependiente de concentraciones bajas o altas. Se recomienda concentraciones bajas por períodos de tiempo largos. Lavado con agua estéril

4. Cómo ajustar los nutrientes y los protocolos de desinfección? Establecer mediante ensayo las variables concentración: tiempo. Es más difícil en plantas con potencial alto de oxidación por fenoles que causan muerte celular, contrarrestables con soluciones frías saladas de nevera al hipoclorito más 1-2 gotas de TWEEN-20-

Detergente (tres enjuagues cada uno de tres minutos), pasar por

alcohol y agua destilada, sigue Na0Cl y de nuevo agua estéril.

Nunca sembrar explantes húmedos, secar con servilletas estériles.

La desinfección es diferente para frutos cerrados:

- Lavado con jabón y cepillo ( con detergente o extran) lavado con agua común

- Con 4-5 motas de algodón aplicar alcohol 70 % en una sola dirección, de arriba hacia abajo.

- Aplicar alcohol al 96% o en spray y se flamea o quema por dos veces.

- Corte de la cápsula con una cuchilla y con otra se saca la semilla. Igual procedimiento en esporas maduras de helecho que se dejan en papel FILTRO (hay filtro cualitativo y cuantitativo) blanco para que boten las esporas y se esterilizan .

- Abiertas las cápsulas maduras, hipoclorito sobre cajas de Petri, sumergir el filtro con el alcohol 70 % por un minuto y se enjuagan ( agua se vierte sobre el-filtro sobre la boca del-frasco).Se aplican en dos concentraciones (alta+ corto tiempo y baja +´mayor tiempo ) y entre cada uno se enjuagan. Se secan solas en cabina de flujo laminar entre mecheros en petri ( 2 horas) y

se siembran espolvoreando en los frascos , se hace en centrífuga para embriones de orquídeas.

ESTERILIZAR.Calor seco a 250 ˚ x dos horas para material metálico.Envolver pinza en papel metálico y luego en papel KRAFT. Una vez estéril puede mantenerse estéril hasta por 15 días.

CONSIDERACIONES SOBRE PROTOCOLO DE DESINFECCION 1. Existen aportes de otros investigadores sobre

micropropagación in vitro de esta planta en particular?2. Revisar revistas científicas.3. Revisar bases de datos (bibliotecas temáticas en internet).

Dan acceso a revistas científicas4. En INTERNET: utilizar el buscador SCIRUS para artículos

científicos solamente.5. Buscar por nombre científico de la planta. Nombre y

apellido/ género y especie.6. Las plantas es posible identificarlos en los herbarios

aportando flor, fruto, hojas, fotos, etc. (Herbario SURCO y el la U del Tolima el herbario se llama Ezequiel.)

7. Usar las palabras-clave en el buscador, como: in vitro, micropropagación, biotecnología.

OJO: CLAVES PARA EL BUSCADOR: PASSIFLORA + IN VITRO PASSIFLORA IN VITRO ¿?????????Usar traductores de Google

8. ALGUNAS REVISTAS ESPECIALIZADAS: PLANT CELL HORTICULTURE SCIENCE BIOTECNOLOGY

Para el protocolo:

1. Antecedentes: edad de la planta madre, explante colectado, desinfectantes utilizados ( hipoclorito , suponiendo el

2. uso inmediatamente anterior de extran y alcohol)3. Concentraciones y tiempo de exposición.4. Inicialmente tres ensayos o muestras y cambiando

concentración

No. Desinfectan Concentraci Tiempo N0 explantes

de ensayo te ón No.

Réplicas %contaminaci

ón

viables

1 NaOCl 1% 10 min.

2 NaOCl 1,5% 10 min.3 NaOCl 2% 10 min.

Se elige el protocolo que presente: menor Concentración- máxima Viabilidad y mínima Contaminación.Cantidad de frascos-porcentaje de contaminación y No explantes viables.Las observaciones han de hacerse diariamente, o periódicamente de manera constante. Tiempo total de 20 a 30 días.Normalmente se acepta hasta un 10 % de contaminación.Sobre lo anterior se hacen las gráficas de barras en Excel.

Se inicia el siguiente ensayo en el que ya se disminuye la concentración, se amplía el tiempo, o se correlacionan dos o más variables de estudio cambiando su intensidad, y así hasta 8 0 10 ensayos.

SENA -101105. DESINFECCIÓN DE YEMAS DE CHOLUPA.

La cholupa presenta virosis por tipo SMV Y CMV. Los meristemos son menos libres de virus.

Para la extracción de meristemos, en el centro del ápice de crecimiento apical se halla el meristemo, translúcido y son las células menos diferenciadas de las plantas, son polos de crecimiento, no tienen desarrollado su sistema de transporte como el xilema o floema, y se usan para producción de plantas limpias o libres de virus.

La planta madre debe ser fitosanitariamente limpias, lo cual se certifica mediante pruebas de ELISA o de inmuno-detección, para determinar su limpieza de virus por aplicación de kits específicos. Para esto, igualmente debe apoyarse en un invernadero (tierra fría anti-trips5) o casa-malla en tierra

5 Mallas construidas en monofilamento y estabilizadas a los rayos U.V. El tamaño del poro es pequeño para evitar el paso de insectos. Especialmente indicada para ventanas o para la

entrada de aire del ventilador que incorpora aire al invernadero. Plagas- Trips (Frankliniella occidentalis). Los trips son pequeños insectos que se ven a simple vista, miden entre 1-2 milímetros. Moviendo la planta observaremos como caen al suelo varios de ellos. Los daños producidos por los trips no son muy graves pero es conveniente combatirlos porque pueden ser transmisores de enfermedades.

caliente para certificación ICA, demostrando la técnica usada (origen del material del cual se hace la preparación y demostrar el trabajo con meristemos.Es decir, debe tener dos características:1. Genética seleccionada (planta de mayor producción,

rendimiento o característica a propagar) de plantas seleccionadas.

2. Planta fitosanitariamente limpia ( de virus)Para programas de reforestación, se toman estacas- se desinfectan+ cito-quininas foliares-brotes que se llevan a preparación al laboratorio.

Pero se pueden sembrar yemas para obtener meristemos.

Para la cholupa, se toma

1. la planta madre , la de mayor producción o carga de frutos

2. Se toma un explante (el explante ideal son las yemas apicales o las tres siguientes subapicales o laterales), nunca después de que haya llovido, se programa la siembra días después de la poda cuando hayan surgido yemas más jóvenes.

3. Siembra sobre medios de cultivo listos y siguiendo el protocolo de desinfección.

4. Cuarto de crecimiento

5. Casa-malla o vivero

6 Cultivo, cuando la plántula haya alcanzado la altura adecuada.

De los pasos 1 al 5 el productor controla el proceso con las condiciones de planta seleccionada y fitosanitariamente limpia de enfermedades y plagas. El punto 6 ya no lo controla. La gulupa tiene problemas de fusarium (hongo que ataca la raíz). De la 1 a 4 dependen del laboratorio. En el punto 5 la casa-malla o invernadero, debe estar certificada por el ICA. El punto 6 debe remitirse al ICA para certificación mediante prueba de ELISA (se requieren certificaciones de BPL e ISO 9001). El proyecto debe incluir acompañamiento al agricultor. Los principales cuellos de botella están en el protocolo de desinfección, los medios, protocolo de adaptación y planta madre.

Entre los puntos 1 y 4 debe haber un máximo de 10% de pérdida y 90 % de viabilidad.

Las yemas apicales – las de mayor crecimiento- o laterales tienen meristemos (puntos de crecimiento de la planta) que no tienen pared celular ni cloroplastos y mayor probabilidad de no tener virus. Las tres yemas subapicales se activan en el frasco por las auxinas,

aminoradas por la dormancia apical, atenuando otros ápices. Las citoquininas inducen brotes laterales

Debe tenerse en cuenta que la planta tiene predisposición genética (ej. coníferas y palmas) a no producir brotes laterales por tener células recalcitrantes6, o respuesta genética recalcitrante, especialmente las leñosas, en contraposición con las herbáceas. Las podas aceleran el crecimiento foliar.

Se debe disponer de un banco de plantas- madre para mantener siempre yemas jóvenes.

Se siembra el meristemo-organogénesis directa o indirecta7-nace la planta- hasta tres segmentos.

En el semillero se siembran las semillas (ex vitro)-se toman hasta tres yemas sub-apicales y se traslada a in-vitro donde la nueva planta produce meristemos que se siembra y se pasan al lote de cultivo.

Cualquier explante se puede llevar a organogénesis (en el microscopio se observa que las células desarrollan dos polos o embriogénesis8 ( zigótica o somática). En la orquídea se siembra la semilla-embriogénesis zigótica.

Nota: Colciencias-plan estratégico de biotecnología de 99-04.

CHOLUPA- PASSIFLORA MALIFORMIS

1. Como explante se toma yemas apicales o laterales temprano en la mañana.

2. Como DESINFECTANTE:

6 son semillas que no sobreviven en condiciones de sequedad y frío cuando son conservadas ex-situ7 organogénesis directa Formación de órganos directamente sobre la superficie de explantos cultivados intactos. El proceso no implica la formación de callo. Opuesto: organogénesis indirecta. organogénesis indirecta Formación de órganos en tejidos de callo derivados de explantos. Opuesto: organogénesis directa.

8 La embriogénesis somática (asexual o adventicia, consiste en el desarrollo de embriones a partir de células que no son el producto de una fusión gamética, o en otras palabras, es un proceso por el cual se produce una estructura bipolar (embrión) a partir de una célula somática. La diferencia principal con la embriogénesis cigótica radica, en que las células que dan origen al embrión somático no son el resultado de la fecundación sexual (Carlota et al., 1997), además de mantener la misma combinación genética que el de la planta fuente del explante (Parrott, 1993).

Una diferencia importante es que, mientras el embrión cigótico se nutre del tejido materno; el somático recibe sus nutrientes directamente de un medio de cultivo. Por lo tanto, el embrión somático al carecer de endosperma, presenta diferencias bioquímicas en relación con las sustancias de reserva que acumula durante la etapa de maduración (expansión celular). Por ejemplo, se acumulan menor cantidad de proteínas de reserva, pero mayor cantidad de almidón. Además, las estructuras que rodean al embrión cigótico le proveen de protección y controlan el intercambio gaseoso; mientras que el somático debe ser encapsulado para facilitar su manipulación y almacenamiento. Al mismo tiempo deben ser incorporados nutrientes, reguladores de crecimiento y fungicidas.

EL SISTEMA RITA. El sistema consiste en un recipiente plástico (RITA®) dividido en dos compartimentos. En el superior se colocael tejido (por ejemplo nudos) y en la parte inferior el medio de cultivo. Este sistema cuenta con dos filtroshidrófobos de 0.2μm reutilizables: uno central (entrada de aire) y uno lateral (salida de aire). El filtro centralse conecta al sistema de aireación (bomba), a una presión de salida de 0.2 bar para que impulse el medio delcompartimento inferior al superior durante un periodo corto (periodo de inmersión). Este baño temporal quereciben los explantes se controla por un reloj temporizador (automatización) que permite la abertura de unaelectro-válvula que controla el sistema

extran al 2% x 10 minutos y enjuague con agua corriente x 1 minutoEtanol 70% x 30 segundos y enjuague con agua destiladaHipoclorito de sodio al 1,5 % x 5 minutos y enjuague con agua estéril

3. ALISTAMIENTO:Pinzas- dos por operario, frascos.BisturíPapel kraft estéril en cuadrados. Cada dos explantes cambiar papel.Servilletas estérilesFrasco con alcohol al 96%Mecheros.VinipelFrascos estériles con tapa-papel de aluminio.MarcadorSoporte triángulo metálico estérilCORTE DE EXPLANTESCuchilla de bisturí.Un frasco colector no necesariamente estéril pero con tapa de aluminio.Condiciones para el explante: icopor con hielo, algodón humedecido en agua.

4. DESINFECCIÓN.Extran al 2%-250 ml- agua corrienteHipoclorito al 1.5 %-250 ml.H2O destilada y H2O destilada estéril x 2 botellasUn frasco estéril para desinfección- 8 frascos con doble tapa de aluminio.Mientras se siembran los explantes se dejan en un frasco con agua destilada estéril.

ORQUÍDEA- siembra de embrionesCHOLUPA- siembra de yemasLULO- siembra de semillas

LULO- “SOLANUM QUITOENSE”

Con fruto cerrado1. Lavar el fruto por 10 minutos con extran al 2%2. Limpiar con algodón-alcohol 70 % varias veces3. Limpiar con hipoclorito al 5% ( fruto cerrado) varias veces

y con algodón4. Flamear el fruto alcohol spray- 96% por corto tiempo.

Con fruto abierto.

1. Extran al 2 % x 5 minutos, agitando en el frasco. Agua corriente x 5 minutos.

2. Alcohol al 70% x 30 segundos. Agua destilada.3. Hipoclorito al 5 % por 5 minutos y agua destilada estéril por 5

minutos.

Nota: para semillas secas, inbibir4 en agua estéril por una noche luego de desinfectada la semilla.

ALISTAMIENTO DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN:

EXTRAN AL 2% a 250 ml, Hipoclorito al 5 %, alcohol al 70 %, frascos estériles, H2O destiladaALISTAR MATERIAL DE SIEMBRA: papel kraft, servilletas, viniera, pinzas, bisturí, mecheros, frascos, triángulos

BIOPLANTAS distribuidora en Colombia, Sr PINEDA 310 819 8435 y/o 031 6182431/ 031635 1409

PHYTOTECHNOLOGY LABORATORIES. PO Box -13481 . Tels. 913 341 5343 o 1-888 749 8682(USA) Fax 913 341 5442 1-888 449 8682. www.phytotech lab.com

EXISTEN TRES CONCEPTOS BÁSICOS QUE FUNDAMENTAN EL CULTIVO IN VITRO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES:

- Totipotencialidad celular: la célula retiene toda la información regenerar una planta completa.

- Desdiferenciación / Rediferenciación: Diferenciación cuando la célula adquiere propiedades diferentes a las de la célula que la originó/desdiferenciación: célula desdiferenciada de tipo meristemático que se obtiene de una diferenciada.- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

• La teoría de la TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR, enunciada por Haberlandt a principios del siglo XX, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperiodo, etc.

• La DESDIFERENCIACIÓN consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático.El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la REDIFERECIACIÓN de las células previamente desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de REGULADORES DEL CRECIMIENTO, fundamentalmente de AUXINAS Y CITOCININAS.

¿QUÉ ES EL CULTIVO IN VITRO?

Pierik (1987) define cultivo in vitro de plantas superiores como: El cultivo en medio nutritivo, bajo condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, tejidos, células y protoplastos de plantas superiores.

El término cultivo in vitro es un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir "dentro de vidrio", es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero también de células y tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Las porciones del vegetal que secultivan in vitro: “explantos”. No son autotróficos. En las siguientes secciones nos referiremos siempre al cultivo in vitro aplicado a las plantas, omitiendo otros usos de esa técnica.

Existen otros términos cuyo significado se solapa parcialmente con el significado de cultivo in vitro:

Cultivo de tejidos vegetales: se refiere al cultivo in vitro de partes de la planta (tejidos o frecuentemente órganos)

Micropropagación: se usa para referirse a la utilización de las técnicas de cultivo in vitro aplicadas a la propagación vegetativa de plantas.

EL ENTORNO DEL CULTIVO

El estudio de cualquier fenómeno biológico en condiciones de laboratorio exige reproducir de la forma más aproximada posible todos los factores que puedan incidir en el fenómeno estudiado cuando este sucede en la naturaleza. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biotopo de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener controlados.

Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solo una parte de él (explanto), a la dificultad de reproducir las condiciones naturales se debe añadir la dificultad de suministrar a la parte todo aquello que antes obtenía del sistema completo.

En resumen, el cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explanto. Conviene, por tanto, conocer cuáles son los principales factores que conforman el ambiente del explanto y que deberán ser controlados.

Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro como:

AMBIENTE QUÍMICO

o COMPOSICIÓN DEL MEDIO - MEDIO DE CULTIVO

El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y ocasionalmente con otras sustancias varias.

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes

minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones (Tabla 1).

Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales

Agua

Sustancias orgánicas

Macro Micro

elementos

Azúcares AminoácidosAuxinasCitoquininasGiberelinasAcido abcísico

NPKCaMgS

FeZnB

MnCuNiCoAlMoI

Mezclas de sustancias poco definidas:Extracto de levaduraLeche de cocoExtractos vegetalesHidrolizados de caseínaPeptona y triptona

Figura 1. Conjunto de sustancias que pueden formar parte de los medios nutritivos, para inducir el crecimiento y desarrollo (Pierik, 1987, modificado).

Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la especie, e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades específicas se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo .

El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor concentración de nitratos en B5. El medio WPM (1980) de baja concentración de sales está especialmente indicado para especies leñosas.

¿Qué medio elegir si no se disponen de referencias bibliográficas?

De Fossard (1976) sugirió un experimento de amplio espectro utilizando 4 grupos de los componentes más frecuentemente vitales en el medio nutritivo:

1. Sacarosa: 1 - 2 - 4% 2. Macro-sales (de acuerdo con Murashige y Skoog,1962): Diluida 1/4 - 1/2 - 1/1

3. Auxina (p.e., IBA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l-1

4. Citoquinina (p.e., BA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l -1

Las combinaciones de las tres concentraciones de cada grupo producen un total de 34 = 81 medios diferentes, de los que se elige el óptimo. A partir de aquí se puede ir afinando las concentraciones tanto como se crea conveniente: si por ejemplo, en el primer experimento la concentración de auxina óptima fue de 0,5 mg l-1 , la siguiente serie de auxina que se deberá probar será: 0,05 - 0,1 - 0,3 - 0,5 - 0,8 - 1,5 mg l-1 .

o pH Cuando se prepara un medio de cultivo, después de añadir todos sus componentes, se procede a ajustar el pH final al valor deseado, añadiendo OHNa 0.1 N o HCl 0.1N al medio. Una vez ajustado el pH se procede a esterilizar el medio.

El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones:

Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos a los medios sólidos

Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir su licuación.

El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo

El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte del explanto (p.e. la absorción de iones NO3

-aumenta con la acidez del medio)

El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a la actividad de muchos enzimas

Por todas estas razones conviene optimizar el pH del medio para cada caso en concreto. En general, no obstante, en la mayoría de situaciones se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una ligera acidificación durante el proceso de esterilización en autoclave, para, después, evolucionar nuevamente durante el decurso del cultivo, de forma que habitualmente se irá acidificando progresivamente como resultado de la absorción diferencial de algunos componentes del medio de cultivo, así como de la excreción de exudados por parte del explanto.

El control del pH inicial del medio y de su dinámica durante el cultivo tiene una gran importancia en el desarrollo de cualquier proyecto de cultivo in vitro. A pesar de su importancia, en muchos experimentos este control se limita a fijar su valor inicial sin reparar en los posibles efectos de su dinámica.

AMBIENTE FÍSICO

o TEMPERATURA -

Introducción

La temperatura a la que está expuesto el explanto cultivado in vitro afecta a la mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar.

En general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que se produce el crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función del genotipo, del órgano del que se ha obtenido el explanto, de la época del año, de la edad de la planta madre, del fotoperiodo, etc. Una complicación adicional se produce por el hecho de que puede existir interacción entre la temperatura óptima de crecimiento y otros factores como la luz, la composición del medio (p.e: en algunos casos se ha comprobado que se obtiene mayor rendimiento haciendo fluctuar la temperatura según el fotoperiodo)

Determinar la temperatura óptima de crecimiento para cada cultivo in vitro puede ser un proceso muy laborioso que, además, exige gran cantidad de cámaras de cultivo reguladas de forma diferente. Afortunadamente, y para la mayoría de situaciones, se pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y 280C.

El control de la temperatura no es solamente importante porque pueda afectar al crecimiento del cultivo sino también porque puede ser un factor que induzca determinados procesos fisiológicos. Así, temperaturas bajas (del orden de 4-50C) permiten superar los periodos de dormición de algunas leñosas y la conservación prolongada de determinados cultivos in vitro; mientras que una temperatura constante de 200 C induce la formación de raíces en la mayoría de coníferas.

¿Cómo se controla?

El cultivo in vitro se realiza dentro de espacios denominados cámaras de cultivo, diseñados para permitir el control del ambiente físico al que será expuesto el cultivo.

LUZ Y FOTOPERÍODO

o LA LUZ

La luz, definida como una forma de energía radiante que se nos manifiesta mediante la visión es, en realidad, parte de un fenómeno físico más amplio: la energía radiante (radiación), que puede ser descrito según dos modelos diferentes: el modelo ondulatorio (radiación electromagnética) y el modelo corpuscular.

Los diferentes tipos de radiación electromagnética se pueden clasificar según sea su longitud de onda, así podemos obtener un espectro electromagnético formado por las diferentes longitudes de onda de la radiación electromagnética, que van desde los 10-16 m hasta los 104m. De todas estas longitudes de onda sólo las comprendidas entre 380 y 775 nm pueden ser percibidas por el ojo humano: ese conjunto de radiaciones es el que denominamos luz en el lenguaje coloquial.

Como quiera que sólo una parte de la energía radiante (la luz y algunas de las radiaciones infrarrojas y ultravioletas próximas) tiene influencia conocida sobre el desarrollo de las plantas, a veces, se usa el término luz para referirse a ese conjunto de radiaciones cuando en realidad se refiere al conjunto de radiaciones electromagnéticas con efectos fisiológicos.

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro.

Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN La calidad de la luz: EL ESPECTRO

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO

LA IRRADIACIÓN

La cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintéticas de las plantas determinará en gran medida la capacidad fotosintética de éstas. Esta cantidad de luz puede ser medida de formas diversas, bien midiendo la iluminación de una superficie y expresándola en lux (en realidad se trata de una unidad definida en términos de percepción del ojo humano); o bien midiendo la irradiancia, es decir, la energía radiante que llega a una superficie dada en un intervalo de tiempo. La irradiancia puede ser expresada en función de la energía: Wm-2 ; o en función de los fotones: µmol m-2 s-1

Cuando el sensor del equipo con el que medimos la irradiancia está diseñado para detectar solo las longitudes de onda comprendidas entre 400 y 700 nm, obtenemos una medida de la radiación fotosintéticamente activa (PAR)

Se asume que las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las de la planta in vivo, dado que el medio de cultivo contiene cantidades importantes de sacarosa, los cultivos in vitro se comportan sólo parcialmente de forma autotrófica. Además, una irradiación excesiva produciría un aumento notable de la temperatura dentro del recipiente de cultivo debido al efecto invernadero.

La irradiación habitual en el campo (a plena insolación puede llegar a 450 W m-2) es nociva en condiciones in vitro. Es habitual usar irradiaciones mucho menores (un 10% o incluso menos del valor de plena insolación)

EL ESPECTRO

La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía necesaria para la fotosíntesis. La clorofila y los demás pigmentos fotosintéticos captan la energía contenida en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas reacciones químicas que constituyen el proceso. Pero la luz también puede intervenir en otros procesos fisiológicos, como el fototropismo, la germinación, la floración,...

Todos estos fenómenos no son producidos en igual medida por todos los tipos de luz (radiaciones de cualquier longitud de onda) sino que algunas radiaciones concretas tienen un efecto notable mientras que otras tiene poco o ningún efecto. Es por ello que es preciso conocer el espectro de la radiación que es activo en el proceso fisiológico estudiado. La cámara de cultivo deberá reproducir lo mejor posible ese espectro de luz activo, por lo tanto conviene conocer cuál es el espectro que emiten nuestras fuentes de luz y en qué medida se adapta éste a las necesidades de nuestro cultivo.

La tabla siguiente resume las principales fuentes de luz usadas en las cámaras de cultivo

LAMPARAS INCANDESCENTES

Producen la luz por fenómenos de incandescencia del filamento calentado por el paso de la corriente eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad de calor y mucho consumo de electricidad.

LAMPARAS FLUORESCENTES

Producen la luz por fenómenos de fluorescencia del gas sometido a un arco voltaico. El espectro de la luz producida es rico en la zona del azul, existen fluorescentes especiales con un espectro rico en la zona azul y roja. Consumen menos electricidad.

LAMPARAS DE VAPOR DE MERCURIO Y SODIO

Producen la luz por efecto del paso de la corriente eléctrica a través de gases calientes de mercurio (azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente eficientes en el consumo de electricidad.

De todas ellas, son las fluorescentes las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo, aunque también se pueden encontrar, generalmente en instalaciones industriales, lámparas de vapor.

EL FOTOPERIODO

Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

TIPOS DE CULTIVOS IN VITRO

El siguiente esquema resume los principales tipos de cultivo in vitro. Algunas de las zona del esquema son puntos calientes, es decir, si se clica con el ratón en la zona adecuada se va a la página correspondiente.

Figura 1. Tipos de cultivos in vitro. ( Modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. Open University Press, Wiley, Chichester, p 59)

El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier célula, tejido u órgano de la planta. Se puede partir de fragmentos de tallo, raíz, hoja, meristemos, embriones,... es decir de tejidos somáticos, pero también se puede iniciar a partir de células o tejidos no somáticos: anteras, polen, micro esporas, óvulos, etc. Según sea el explanto utilizado se hablará de cultivo de secciones nodales, cultivo de hoja, de meristemo, de polen, de embriones, etc.

Las condiciones de cultivo pueden pretender la proliferación desorganizada de las células del explanto hasta dar lugar a un callo o incluso a un cultivo de células cuando se separan éstas del callo. Si se elimina la pared celular de las células se obtiene un cultivo de protoplastos.

En otros casos se puede pretender la regeneración de la planta completa (morfogénesis) mediante la formación de raíces (rizogénesis) y/o de tallos. La morfogénesis se produce a partir del explanto inicial mediante la formación de raíces y/o tallos en posición normal o en posición no normal (adventicias/os). Sí la morfogénesis se produce después de la formación de un callo, entonces se habla de morfogénesis indirecta, mientras que si se produce directamente del explanto sin que este pase por una fase de callo, entonces se habla de morfogénesis directa.

Una situación particular surge cuando en el explanto se producen unas estructuras bipolares que presentan las propiedades morfológicas de los embriones zigóticos. Estas estructuras se denominan embriones somáticos. Según que estos embriones somáticos surjan directamente del explanto o bien de un callo se habla de embriogénesis directa o indirecta, respectivamente.

MICROPROPAGACIÓN

Micropropagar es el proceso de multiplicar pantas in vitro.

Práctica que consiste en multiplicar rápidamente y/o regenerar materia vegetal para producir una gran cantidad de nuevas plantas genéticamente idénticas, con métodos de laboratorio modernos.

Dependiendo de las especies, ciertas partes de la planta tales como parte del tallo, de una hoja o del bulbo, se cultivan en condiciones de laboratorio. Estas partes de la planta crecen y se transforman en retoños, que a su vez pueden ser cortados y propagados. Esto se puede repetir varias veces, hasta que el número de plantas, y por lo tanto la cantidad de labranza, aumente con el tiempo.

Cuando se han creado suficientes plantas, se cultivan hasta que se desarrollan las raíces, luego se fortalecen y se transfieren a condiciones normales de invernadero o de campo.

TECNICAS DE MICROPROPAGACIÓN

En: BIOTECNOLOGÍA. DIANA ZULEYI CRUZ. Bióloga. U. Tolima. LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL SENA “CEFA” REGIONAL HUILA. Octubre 2010. Presentación PowerPoint.

A través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia.

Este proceso incluye varias fases:

FASE 0 : Preparación de la planta madre FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia

FASE II : Multiplicación de brotes

FASE III : Enraizamiento

FASE IV: Aclimatación

FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.

Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperiodo y de la irradiancia recibida.

Figura 1- Imagen de un invernadero

FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos.

Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.

Figura 2. Esquema de la fase I del proceso de micropropagación.

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.

Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

Figura 3. Esquema del proceso de multiplicación de los brotes.

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser más flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

Figura 4. Fotografía de un cultivo en la fase de enraizado in vitro.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-system".

Figura 5. Fotografía de un cultivo en la fase de enraizado ex vitro.

FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.

Figura 6. Esquema del proceso de aclimatación ex vitro.

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para evitar la desecación del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

Figura 7. Fotografía de una zona de aclimatación .

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

Figura 8. Esquema de la finalización de la aclimatación ex vitro.

CULTIVO DE MERISTEMOS

Es el cultivo in vitro del domo apical (meristemo apical que como media mide 100x100 µm) más los primeros primordios9 foliares.

El cultivo de meristemos es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma.

La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta. Existen otros factores:

El meristemo apical tiene una mayor velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanza" al meristemo.

En una célula meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido.

Existe una competencia por uso de algunos metabolitos entre células y virus.

9 En Botánica, el primordio es el estado rudimentario en que se encuentra un órgano en formación, usualmente protegido en el interior de una yema en las Spermatophyta. Un sinónimo que se utiliza en algunos textos es rudimento, usado sobre todo en los términos rudimento seminal por óvulo o rudimento radical por radícula.

Figura 1. Sección de un meristemo apical de un tubérculo de patata visto al microscopio óptico

Figura 2. Aspecto de una plántula de ajo obtenida por cultivo de meristemos.

El tamaño óptimo a utilizar se decide tomando en cuenta dos factores: tamaño óptimo para la liberación del virus y tamaño óptimo para facilitar el cultivo. Existe una mayor posibilidad de obtener plantas libres de virus si sólo se aísla el meristemo, pero la posibilidad de que el meristemo sobreviva sin primordios foliares es muy pequeña. Por otro lado, utilizar meristemos más grandes (con más primordios foliares) hace que la probabilidad de obtener plantas libres de virus sea pequeña.

De manera general se puede decir que los meristemos apicales tienen más probabilidad de estar libres de virus que los meristemos axilares, y que si los meristemos provienen de una planta en plena actividad hay mayor probabilidad de obtener plantas libres de virus.

Medio y condiciones de cultivo

De manera general, el medio de cultivo debe ser rico en elementos minerales, en particular el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicación vegetativa; desde este punto de vista, el medio Murashige y Skoog es conveniente.

Los meristemos se cultivan generalmente sobre medio sólido, aunque en algunos casos se utilizan medios líquidos (empleando puente de papel). El pH normalmente se sitúa entre 5,4-6,0. El contenido de sacarosa es de un 2-4%. Frecuentemente se utilizan las siguientes vitaminas: vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico y ácido pantoténico. Los reguladores que se suelen utilizar en bajas concentraciones (0,1-0,5 mg l-1); son auxinas y citoquininas para promover la división celular; el GA3 es mucho menos utilizado.

Los tubos con los meristemos se ponen bajo luz fluorescente (en general de 1,000 a 3,000 lux) - en ocasiones es necesario utilizar una irradiancia menor en los primeros días después del aislamiento- bajo un fotoperiodo de 14-16 horas y a una temperatura de 23-25 oC.

PROTOCOLO DEL CULTIVO DE MERISTEMOS EN PATATA

Protocolo de cultivo de meristemos de Patata Solanum tuberosum L.

1. Obtención de material

a. Cortar secciones de tubérculos de 20 g aproximadamente, con una yema.

b. Remojar las secciones en una solución de ácido giberélico 0.3 mM durante una hora, con el fin de

romper la dormancia.

c. Hacer brotar las secciones en una bandeja con vermiculita 10estéril dentro de una cámara de

crecimiento (oscuridad).

d. Cosechar brotes terminales de 3 a 5 cm.

2. Desinfección

Ver LA ESTERILIZACION DE MATERIAL VEGETAL

3. Disección

a. Poner la muestra bajo un microscopio estereoscopio ubicado dentro de la cámara de flujo laminar.

b. Separar el domo meristemático con los primeros primordios foliares11 (aproximadamente de 175 -

300 µm).

4. Fase 1- Primer cultivo

a. Transferir cada explanto dentro de tubos de 15 x 19 mm que contienen medio Mellor y Stace-Smith

(1977).

10 Silicato de hierro o magnesio del grupo de las micas. Usada en cultivos hidropónicos11 En Botánica, el primordio es el estado rudimentario en que se encuentra un órgano en formación, usualmente protegido en el interior de una yema en las Spermatophyta. Un sinónimo que se utiliza en algunos textos es rudimento, usado sobre todo en los términos rudimento seminal por óvulo o rudimento radical por radícula. El p. foliar es la prominencia lateral del ápice del brote, que da lugar a la hoja.

b. Incubar los cultivos a 25 0C, en fotoperiodo de 12 horas, con una intensidad de luz de 150 lux

durante el primer mes y de 500 lux durante el segundo mes. La fuente de luz debe ser luz fría.

c. En dos meses se regeneran plántulas de 3 cm con raíces.

5. Fase 2. Proliferación

a. Transferir las plántulas regeneradas a medio MS sólido con NAA 5 µM, en frascos de 250 ml.

b. A los 20 días aproximadamente se desarrollarán dos o tres tallos axilares, con raíces adventicias.

c. Repicar estos tallos axilares (más raíces adventicias) en el medio MS sólido con NAA 5 µM en frascos

de 250 ml.

d. Repetir el paso c después de 20 días, hasta obtener una cantidad suficiente de material.

6. tuberización 12In vitro

a. transferir los tallos axilares a medio MS líquido con 22,0 - 44,0 µM de BAP y 0,23 M de sacarosa, en

frascos de 300 ó 500 ml.

b. Incubar a 18-20 oC, con un fotoperiodo de 8 horas y de 100-500 lux.

c. Después de 4 meses se obtendrán minitubérculos en dormancia.13

LA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo in vitro deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los cultivos. Para disponer de una superficie de trabajo estéril que no ponga en peligro la esterilidad de los cultivos se usan las cámaras de flujo laminar.

Una cámara de flujo laminar es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo. La esterilidad de la

12 Los fenómenos de tuberización se desarrollan en tres etapas sucesivas: inducción, iniciación y crecimiento radical de los tubérculos. La inducción se traduce en una detención de la elongación de los estolones, después de un período de crecimiento cuya duración es variable en función de las condiciones ambientales y del genotipo. El estadio de la tuberización comprende la formación de los esbozos de los tubérculos por crecimiento radial del primer entrenudo situado por debajo de la yema apical del estolón y está considerado desde el diámetro de los esbozos es doble que el de los estolones que lo soportan.13 Se llama dormancia a un período en el ciclo biológico de un organismo en el que el crecimiento, desarrollo y, en los animales, la actividad física se suspenden temporariamente. Esto reduce drásticamente la actividad metabólica permitiendo que el organismo conserve energía.

zona de trabajo se consigue porque se hace circular a través del interior de la cámara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partícula extraña. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revés.

Según el grado de sofisticación de la cámara, puede disponer de elementos accesorios como son: fuente de luz, lámpara de esterilización por U.V., pilotos indicadores de funcionamiento diversos, contador de horas de funcionamiento, indicador de presión interior, etc.

Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la que se hace circular el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se mueven perpendicularmente a ella.

desea ve

Figura 1. Esquema de una cámara de flujo laminar horizontal

CÁMARAS DE CULTIVO

Una cámara de cultivo es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico. Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la iluminación y el fotoperiodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición.

Existen muchos modelos de cámaras de cultivo, en unos casos se trata de espacios reducidos, frecuentemente móviles, mientras que en otros casos son verdaderos recintos acondicionados para permitir el control del ambiente interior.

Figura 1. Cámara de cultivo tipo cubículo Figura 2. Cámara de cultivo tipo recinto

Control de la temperatura

La temperatura de la cámara de cultivo viene afectada por: la temperatura ambiente de la sala donde se sitúe y el calor generado por las fuentes de luz de que dispone.

El control de la temperatura a la que se desarrolla el cultivo in vitro se efectúa mediante un sistema de refrigeración-calefacción controlado a través de un termostato. El sistema de refrigeración-calefacción debe estar correctamente dimensionado a fin de conseguir que la temperatura de la zona de cultivo se mantenga dentro de los límites deseados.

Para poder caracterizar adecuadamente el funcionamiento respecto de la temperatura de una cámara de cultivo conviene conocer:

La homogeneidad de temperatura: es decir la variación de la temperatura en diferentes zonas de la cámara. Se puede aumentar la homogeneidad haciendo circular el aire dentro de la cámara mediante un sistema de ventilación

La estabilidad de la temperatura: es decir, una medida de la variación de la temperatura de la cámara de cultivo a lo largo del tiempo

Todas las cámaras disponen de un programador que permite regular la temperatura a la que está la cámara en cada momento

Control de la iluminación.

Las cámaras de cultivo disponen de una serie de unidades productoras de luz situadas de tal forma que iluminen toda la superficie útil de la cámara. Las unidades productoras de luz acostumbran a ser fluorescentes (ver luz) y pueden estar situadas de formas distintas:

horizontales: la batería de fluorescentes se coloca sobre el techo (Figura 2) de cada área de cultivo. Este sistema tiene la ventaja de que consigue una distribución más uniforme de la luz

en toda el área (Figura 3), pero tiene el inconveniente de que calienta el techo y éste suele ser, a la vez, la base de otro nivel de cultivo, por lo cual puede dar lugar a una distribución irregular de la temperatura.

Figura 3 . Distribución en horizontal de la irradiación (µmol s-1cm-2) a 53.5 cm de una fuente de luz formada por una parrilla de fluorescentes. (se ha representado las irradiaciones en intervalos de 20 µmol s-1 cm-2 mediante colores diferentes; las coordenadas de los ejes X y Z representan las coordenadas del suelo de la cámara de cultivo)

verticales: la batería de fluorescentes se coloca en los laterales (Figura 1) de la cámara de cultivo de forma que producen una distribución más irregular de la luz en el área de cultivo pero generan menos problemas con la distribución del calor

Las reactancias necesarias para el funcionamiento de los fluorescentes se sitúan siempre en el exterior de la cámara, para evitar que el calor generado por estas dificulte el control de la temperatura. Por esa misma razón, cuando las cámaras de cultivo son del tipo cubículo acostumbran a agruparse en salas especiales dotadas de un sistema de refrigeración propio que permita un mejor funcionamiento del sistema de refrigeración de cada una de ellas.

La combinación entre fuentes de luz y filtros debe ser la correcta para crear condiciones lumínicas precisas para el estudio del fotoblastismo. Es muy importante que la fuente de luz sea la adecuada.

AMBIENTES DE LUZ CON CALIDAD ESPECTRAL CONOCIDA

Calidad espectral Material para el filtro Fuente de luz

___________________________________________________________________________

Luz roja Plexiglass Rubí. Rohm and Hass no. 2423 Luz fluorescente

Plastiglass Rubí Luz fluorescente

Micas de iluminación teatral ( Lee filtres No. 182 Luz fluorescente

Gam color No. 250)

Luz azul Plexiglass Zafiro R[omh and Hass no 2424 Luz fluorescente

Plastiglass zafiro Luz fluorescente

Micas para iluminación teatral (Lee filters Luz fluorescente

No 195, gam color No 850)

Luz roja lejana Sobreponer un filtro rojo con un filtro azul Luz incandescente

Luz blanca con R:RL Mezclar luz fluorescente e incandescente

similar a luz diurna

Con un espectrofotómetro debe medirse la transmitancia de los filtros en las diferentes bandas del espectro, para que la fuente de luz sea la adecuada.

Control del fotoperiodo.

Además de la radiación luminosa recibida por el cultivo, otro factor a controlar es el número de horas de luz diarias que recibe el cultivo (fotoperiodo). La regulación del fotoperiodo se consigue mediante un programador (analógico o digital) conectado al circuito de iluminación. El programador del fotoperiodo puede estar relacionado con el programador de temperaturas, de forma que se puedan programar diferentes temperaturas según sea la fase del fotoperiodo en la que se halle el cultivo

LA ESTERILIZACIÓN DE UTILLAJE Y MEDIOS

La esterilización tanto del material y medios frescos, como de los medios ya usados que hayan sufrido contaminación, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves. En situaciones especiales, como en el caso de que algún componente del medio sea termolábil, pueden usarse un sistema de esterilización por filtración.

ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

La puesta en cultivo es un proceso que consiste en obtener material vegetal in vitro libre de microorganismos, a partir de material vegetal ex vitro.

El paso previo y obligado para obtener el material vegetal libre de micro-organismos es la esterilización de la superficie de éste. En general, el proceso de esterilización puede resumirse en los siguientes pasos:

Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras partículas (opcional).

Eliminación de las partes muertas e infectadas de la planta.

Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al 80% durante unos segundos.

Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio (por ejemplo al 1%) con un agente humectante (por ejemplo Tween 20 o Tween 80)14, durante 10-30 minutos. La fuente más utilizada de hipoclorito de sodio es la lejía. Ésta contiene un 5% de hipoclorito de sodio como agente activo, con lo que la solución estará formada por un 10-20% (v/v) de lejía. Para una mayor eficacia se recomienda agitar la solución mientras dura el proceso.

Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de hipoclorito de sodio. El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos cada una.

Este proceso de esterilización presenta, principalmente, dos problemas: la capacidad de los agentes esterilizantes para dañar los tejidos vegetales y la presencia de microorganismos en el interior de dichos tejidos.

En el primer caso, se aconseja disminuir la concentración y/o tiempo de exposición a los agentes esterilizantes. Con esta medida disminuyen los daños al material vegetal pero aumenta el porcentaje de contaminaciones.

En el segundo caso, el proceso de esterilización no tiene el efecto deseado puesto que los microorganismos internos no se eliminan y pueden proliferar en el medio de cultivo.

Un producto alternativo al hipoclorito de sodio es el hipoclorito de calcio. Se presenta en forma de polvo que se mezcla con agua a una concentración de 35-100 g/l. El material vegetal debe permanecer sumergido entre 5-30 minutos y ser enjuagado con agua estéril al finalizar.

Otro agente esterilizante es el cloruro de mercurio, el cual se disuelve en agua a una concentración de 0,01-0,05 (p/v). El material vegetal está en contacto con el producto durante 2-12 minutos, para ser enjuagado concienzudamente con agua estéril al final del proceso. Este producto debe utilizarse bajo medidas de seguridad, ya que es nocivo para la salud.

PUESTA EN CULTIVO

En el cultivo in vitro se presentan dos situaciones diferentes respecto de la puesta en cultivo:

que los explantos procedan de un material no estéril que los explantos procedan de un material estéril

En el primer caso, se deberán preparar los explantos previamente esterilizados cortando los extremos que hayan podido ser afectados por la substancia esterilizante antes de ponerlo en contacto con el medio de cultivo.

14 El Tween 20 es un surfactante hidrofílico. Se utiliza para la emulsificación de aceite en agua (O/W), dispersión o solubilización de aceites, y para hacer lavables las pomadas anhidras.

En el segundo caso, una vez obtenidos los explantos en el entorno estéril de la cámara de flujo se procederá a ponerlos en contacto con el nuevo medio de cultivo.

MICROPROPGACIÓN DE VIOLETAS AFRICANAS VERSUS PROPAGACIÓN POR ESQUEJE.

INTRODUCCIÓN

La violeta africana (Saintpaulina ionantha) fue descubierta por el barón Walter von Saint Paul St Claire en las montañas de Usambara, en la provincia del Cabo (Suráfrica), a finales de siglo pasado. Cultivada por primera vez como planta de interior hará unos cincuenta años, hoy es una de las plantas de flor de interior más populares. Inicialmente se reproducía por semilla o, sobre todo, por esqueje foliar. Hoy la forma más habitual de reproducirla es el cultivo in vitro de secciones de peciolo.

La producción de violetas africanas en diversos países da una idea de la importancia económica de la

micropropagación:

Paísn° de plantas

año

Francia 1.5 x 106 1985

Países Bajos 4.0x106 1988

EEUU 1.5x106 1985

Datos de producción de Violetas africanas por micropropagaciónsegún Debergh y Zimmerman

En un experimento conducido por alumnos de secundaria, sin formación específica en cultivo in vitro, se realizó una comparación (en términos esencialmente cualitativos) de los dos sistemas de reproducción comercial de la violeta africana: el esqueje de hoja y la micropropagación.

ESQUEMA DEL TRABAJO

MATERIAL Y MÉTODOS

Medio de cultivo

El medio de cultivo usado en este experimento fue MS con 2% de sacarosa (p/v) y una combinación de BA y NAA de forma que se obtuvieron relaciones de citoquininas-auxinas del 5:1, 10:1 y 50:1. Se ha denominado a estos medios Medio I, II, y III respectivamente. Se solidificaron los medios con agar al 1% (p/v). El pH de la solución fue ajustado antes de la esterilización a 5.7. Los medios así preparado fue esterilizado a 121 °C durante 20'.

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

Ratio Citoquin./Auxin.

MEDIO I 0.1 0.5 5:1

MEDIO II 0.1 1.0 10:1

MEDIO III

0.1 5.0 50:1

Material vegetal

El material vegetal de partida fue violetas africanas obtenidas en un Centro de Jardinería.

Obtención de secciones.

Se separaron algunas hojas para ser lavadas con agua jabonosa y aclaradas posteriormente. A continuación, se procedió a seccionar las hojas obteniéndose trozos de peciolo de 1.5 cm de longitud aproximadamente y trozos de limbo foliar de 1.5 cm de lado.

Esterilización del material vegetal

Las secciones obtenidas fueron esterilizadas dentro de un vaso de precipitados por inmersión en una solución acuosa de lejía comercial al 20% (v/v) con Tween 20. La esterilización se prolongó diez minutos, durante los cuales se sometió al recipiente a varias agitaciones. Trasladado el vaso de precipitados al interior de la cámara de flujo, se procedió a decantar la solución esterilizante y a efectuar tres aclarados con agua destilada estéril.

Puesta en cultivo

Se recortaron los bordes de las secciones previamente esterilizadas para eliminar los tejidos que pudiesen haber sido afectados por el tratamiento esterilizante, de forma que se obtuvieron secciones de 1 cm2 aproximadamente. Cada una de las secciones obtenidas fue introducida en un tubo de cultivo con 20 ml del medio a ensayar.

Se situaron los tubos de cultivo en una cámara de cultivo regulada a un fotoperiodo de 16 h y sin control de temperatura (por lo tanto a temperatura ambiente: aprox 20-220C).

Propagación vegetativa

Con los restos de las hojas producidos en el experimento de micropropagación, se procedió a semienterrarlos en los alvéolos de una bandeja de siembra llena de tierra para plantas de interior. Se mantuvieron los esquejes en una habitación soleada hasta el final del experimento.

Aclimatación

Al final del experimento se procedió a extraer los explantos que habían desarrollado tallos adventicios, los cuales se seccionaron hasta aislar cada uno de los tallos. Se plantaron estos tallos en una bandeja de siembra en la que se había dispuesto una mezcla de tierra de jardinería y vermiculita, previamente

esterilizadas. Se tapó la bandeja con un plástico transparente y se mantuvo unos días en la cámara de cultivo para ser posteriormente trasladada a las proximidades de la ventana y finalmente al exterior, agujereando progresivamente la cubierta de plástico para facilitar la aireación de las plantas.

Cuando las plantas tuvieron el tamaño adecuado se trasplantaron a un tiesto de mayor tamaño.

Conclusiones

Como ya hemos visto, el experimento se planteó no tanto en términos cuantitativos sino en términos cualitativos . Los objetivos que se pretendieron alcanzar eran: comprobar si es posible desarrollar técnicas de cultivo in vitro con personas no experimentadas en este campo y con escasos recursos materiales (alumnos de secundaria y laboratorio escolar), así como comparar dos sistemas de propagación diferentes (in vitro y esquejes), también se pretendió aprovechar el experimento para aproximar a los alumnos al método científico.

A pesar de que se planteó una comparación entre medios con diferente concentración de reguladores, finalmente no se procesaron los datos puesto que el reducido número inicial de tubos por tratamiento y tipo de explanto (en torno a 13) y las pérdidas de material vegetal por contaminaciones (en torno de un 60%) redujeron el número de datos finales disponibles a valores pequeños.

A pesar de ese hecho, al final del experimento se obtuvieron en la técnica in vitro 14 tubos de cultivo viables, de los cuales, una vez seccionados en brotes con una sola yema terminal, se obtuvieron 50 plántulas listas para la aclimatación. Desde el inicio del experimento hasta que se dio por terminada la aclimatación transcurrieron 90 días.

El experimento de propagación por esqueje foliar resultó menos problemático en lo referente a las pérdidas por contaminación pero mucho más lento, puesto que no se obtuvieron plantas comparables a las plantas ya aclimatadas del experimento in vitro hasta transcurridos 150 días. Las plantas obtenidas in vitro florecieron antes que las obtenidas a partir de esqueje.

TÉCNICAS DEL CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES.

• Micropropagación vegetal

• Regeneración de plantas15 (embriogénesis y organogénesis)• Cultivo de meristemos• Cultivo de suspensiones de células vegetales• Cultivo de protoplastos• Cultivo de anteras• Cultivo de óvulos y embriones

LA MICROPROPAGACIÓN CONSTITUYE LA PRINCIPAL APLICACIÓN COMERCIAL DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala.• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperiodo.

ALCANCES DE LA MICROPROPAGACIÓN VEGETAL

• Propagación vegetativa rápida y a gran escala• Uniformidad seleccionada del material clonado• Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales• Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin• Mayor control sobre la sanidad del material propagado• Introducción rápida de nuevos cultivares• Conservación de germoplasma• Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

La propagación clonal o vegetativa de plantas es una producción a partir de partes vegetativas, utilizando tejidos con potencialidad de multiplicación y diferenciación celular de sus diversos órganos ( Tres variantes:

1. Micropropagación a partir de tejidos vegetales en cultivo in vitro

15 La regeneración de plantas a partir de cultivo de tejidos es la manifestación de la totipotencia celular; la cual puede ocurrir de manera parcial siguiendo la ruta organogénica (caulogénesis o rizogénesis) o en forma completa siguiendo la ruta embriogénica. Ambos fenómenos pueden ocurrir directa o indirectamente, es decir sin la presencia de fase callosa previa a la regeneración o con ella respectivamente, aunque en la práctica no siempre es posible distinguir estos dos modelos de desarrollo (Montoya, 1991, Segura, 1993; Lítz y Jarret, 1991; George and Sherrington, 1984).

2. Propagación a partir de bulbos, rizomas, estolones, tubérculos o segmentos (esquejes) de plantas que conserven potencialidad de enraizamiento.

3. Propagación por injertos de segmentos de la planta sobre tallos de plantas receptoras más resistentes. )

Las técnicas se basan en que los tejidos vegetales conservan su toti-potencialidad. Las que más la tienen son las menos diferenciadas hacia una función específica (yemas, extremos de raíces, segmentos nodales, semillas, etc.). Un segmento en crecimiento se esteriliza y se cultiva en soluciones nutritivas, con frecuencia gelificadas, con hormonas para la proliferación celular del segmento.Pueden ocurrir las siguientes variantes:

1. De esta proliferación celular, surgir una o varias plantas nuevas completas

2. Inducir la multiplicación de las células germinales del explante para formar un callo poco diferenciado o protoplastos.Otras aplicaciones :

- Obtención de líneas de plantas genéticamente uniformes con fines de estudio experimental

- Almacenamiento o transporte de germoplasma- Obtención de propágulos 16 libres de virus o infecciones

para control de enfermedades sistémicas.- Ingeniería genética: transgénesis, hibridación

interespecífica y generación y selección de variantes genéticas de plantas.

MICROPROPAGACIÓN A PARTIR DE TEJIDOS VEGETALES EN CULTIVO IN VITRO.Los procedimientos más usados en laboratorios de micropropagación son cuatro métodos de multiplicar plantas in vitro:

1. Activación de la ramificación axilar.2. Segmentos nodales3. Tallos adventicios4. Embriogénesis somática17

ACTIVACIÓN DE RAMIFICACIÓN AXILAR: Se toman meristemos axilares del tallo o apicales y se induce la ramificación axilar mediante hormonas y suprimiendo la dominancia apical. Subsiguientes subdivisiones en fragmentos del cultivo permiten multiplicar los explantes hasta alcanzar el número deseado de tallos que pueden enraizar invitro o directamente en el suelo.

16 Propágulo. Estructura que sirve para propagar o multiplicar vegetativamente una planta.

17 La embriogénesis somática (asexual o adventicia, consiste en el desarrollo de embriones a partir de células que no son el producto de una fusión gamética, o en otras palabras, es un proceso por el cual se produce una estructura bipolar (embrión) a partir de una célula somática.

SEGMENTOS NODALES: genera poca variación genética, ya que no se forma callo. Se escinden segmentos de tallo con yema axilar que crecen formando nuevos segmentos nodales que pueden ser de nuevo escindidos que pueden dar origen a tallos y raíces in vitro o en el suelo mediante la alteración hormonal del medio.TALLOS ADVENTICIOS: Inducidos a partir de tallos originados por explantes de ramas u hojas para obtener callos cambiando el ambiente hormonal del callo original o sus fragmentos para enraizar in vitro o en el suelo. Se genera más variabilidad genética ya que utiliza un estadio calloso intermediario, no es útil si se busca integridad genética. Al formarse el callo acurre una desdiferenciación del tejido vegetal que puede conllevar a una alteración genética que induce variabilidad en la información genética entre las células del callo.EMBRIOGÉNESIS SOMATICA: Embriones somáticos o asexuales resultantes de un proceso de diferenciación directa o indirecta18 a partir de células, órganos o

18 Podemos promover la formación de tallos adventicios (tallos que no había). Esto se hace cogiendo un explanto que se somete a unas condiciones adecuadas, inicialmente tengo un callo (masa de células indiferenciadas) en los bordes o lesiones del explanto, tras un tiempo se formarán internamente. Tras un tiempo aparecen órganos (dependiendo de si en el medio hay auxinas o citoquininas).

Puede haber organogénesis directa: cuando los órganos se originan directamente del explanto en ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta. Puede haber variación monoclonal cuando hay células que mutan espontáneamente.

También podemos recurrir a la embriogénesis somática, con el fin de obtener embriones somáticos (es una ruta alternativa a la organogénesis). Un embrión somático se forma en el cuerpo de la planta por los diferentes tratamientos, son estructuras bipolares. Para que se forme un embrión somático, hay que inducirlo, el principal inductor son las hormonas.

Puede haber embriogénesis directa: si en la superficie del explanto se forma directamente el embrión. Puede haber embriogénesis indirecta: si en la superficie del explanto, se forman callos y sobre este callo surge el embrión. La embriogénesis puede ser: zigótica: el zigoto está dentro de la planta protegido por ella. Somática: es más variable.

Para inducir la formación de un embrión somático es imprescindible un tratamiento con auxinas (2,4-D) y una vez que se ha inducido el crecimiento del embrión hay que retirarles del medio ya que en vez de estimularse, se inhibe. Además de auxinas, en el medio ha de haber Potasio y Prolina que desarrollan algo más los embriones.

Para el desarrollo y maduración del embrión podemos utilizar 2 medios, líquido o sólido.

Las auxinas hacen que se formen células más densas del normal que son las que luego darán el embrión. Cuando quitamos las auxinas se forman glomérulos de células: FASE GLOMERULAR DE EMBRIÓN. Los glomérulos pasan por distintas fases:

Estado de corazón fase de torpedo estado cotiledón embrión

Diferencias entre embriogénesis /organogénesis:

EMBRIÓN: estructura bipolar, surge normalmente a partir de una célula, ápices cerrados y hay conexión entre ellos.

ÓRGANO: formación de estructura monopolar, surge a partir de de varias células, tallos y raíces se forman de modo independiente, ápices sin cerrar.

EMBRIÓN CIGÓTICO: de embrión pasa a semilla

estados callosos intermedios de una planta. Los embriones somáticos pueden proliferar y producir embriones secundarios a partir de meristemos somáticos, como las yemas axilares, partes de las flores o de semillas, adquieren morfología y comportamiento igual a embriones naturales de origen sexual de plantas y pueden germinar en el suelo.La embriogénesis somática hace la micropropagación más eficiente, muchas plantas de pequeña cantidad de tejido de cultivo. Estos embriones somáticos pueden convertirse en semillas encapsulándolos en testas artificiales.La técnica de producción de embriones somáticos parte de producir un tejido calloso para obtener unos protoplastos que un determinado medio de cultivo desarrollan embriones somáticos.

CONSIDERACIONES TÉCNICAS DE LA PROPAGACIÓN CLONAL MASIVA DE PLANTAS:

LA MICROPROPAGACIÓN REQUIERE UNA INFRAESTRUCTURA MÍNIMA ESPECIALIZADA Y CONDICIONES CONTROLADAS DE CULTIVO.

• Laboratorio- Área de preparación de medios- Área de lavado y esterilización- Cuarto estéril- Cámara de cultivo- Área de rusticación

• Material vegetal- Plantas madres seleccionadas(pre-acondicionamiento)- Explantos (elección, disección, esterilización, etc.)

• Condiciones de cultivo- Asepsia- Recipientes- Temperatura- Luz y fotoperiodo

MEDIOS DE CULTIVO: COMPOSICIÓN GENERAL –

Compuestos inorgánicos

E. SOMÁTICO: de embrión pasa directamente a planta

Macronutrientes trientes: NO4- , PO4/3- , K+, Ca2+,Mg2+, SO4/2-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+,Mo2+, Co2+, I

Carbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol

VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina

Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento

AuxinasCitocininasGiberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®

pH5,6 – 5,8

Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave

PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS MEDIO DE CULTIVO

Consistencia del medio Semisólido Líquido

• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

- Inducción de embriogénesis- Cultivo de protoplastos- Cultivo de suspensiones celulares

PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

• Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resiniteı) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.

- La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno- La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes

• pH:- Constituye un factor crítico- Se ajusta en el rango 5,5-5,8- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

ELECCIÓN DEL EXPLANTO INICIAL

ESCARIFICACIÓN ESTERILIZACIÓN (Tritón X-100 3%, 10 minHipoclorito de Na 15%, 20 min)

SEMILLAS ESTÉRILES GERMINACIÓN ( Esterilidad /Medio de Hoagland)

% DE GERMINACIÓN?

Disección bajo lupa Pietri: ( MS+2.4-D)

M. apical-Hoja-M. axilar-Tallo-RaízM. radicular

1.AREAS DEL LABORATORIO

1. AREA DE PREPARACIÓN

Preparación de medios de cultivo Almacenamiento de materiales de vidrio, p0lástico, reactivos (Una mesa de trabajo para preparación de medios,

- Balanzas, pH, platos calientes de agitación.- Vitrinas, estanterías, refrigeración.- Incubadora o cámara de crecimiento-

2. LAVADO Y ESTERILIZACIÓN

- Lavadero grande- Agua fría y caliente + agua bidestilada+destilador+desionizador

(entre destilador y lavadero).- Almacenamiento de agua + basurero.

En Esterilización: autoclave, estufas, secadero y lavadero.

3. AREA DE TRASFERENCIA.

(Ex cisión, inoculación y transferencia ) de explantes a medios: máxima limpieza. ´*Microscopio*

- Gabinete de flujo laminar

4. AREA DE INCUBACIÓN * Microscopio*

- Control de temperatura : 20-28 ˚- Control de iluminación: 1000 a 5000 lux- Humedad relativa : 70-80 %- Aire acondicionado: hay que cortar la iluminación por su calor,

cuando falle el aire acondicionado.

= Estantería metálica (0.3 x 1.0- 0.8 x 2.20 altura y 0.2 -0.5 entrepaños)

= Área de cultivos en agitación

= Área de cultivos estáticos en oscuridad

5. AREA DE OBSERVACIÓN Y EXÁMEN.

OTROS:

ÁREA DE CRECIMIENTO, plantas que provienen de incubación para acondicionamiento y aclimatación para su trasplante.

SEGURIDAD: 1. Primeros auxilios

2. Extintores

3. Ducha: ojos y cuerpo entero

2. EQUIPO

1) PREPARACIÓN: Refrigerador, balanzas, potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos Erlenmeyer (125, 250 y 500 ml.), botellas vidrio y plástico.

2) LAVADO Y ESTERILIZACIÓN: autoclave, destilador, gradillas, bandejas, estufas para esterilización y secado.

3) TRASFERENCIA: CFL, microscopio, cuchillas No. 10 y 11 con mangos, agujas de disección, pinzas, tijeras, navaja.

Frasco de alcohol, mechero, máscara, guantes, marcadores, bandejas, canecas.

4) INCUBACIÓN: t˚, humedad, iluminación controlada.

Estantes iluminados, gradillas.

AREA EXAMINACIÓN: microscopio, lentes de aumento- estereoscopio.

AREA DE CRECIMIENTO: Macetas, suelo, bandejas, cámaras de humedad.

OTROS: Agitador (horizontal y el auxiliar de Steward) para

cultivos en suspensión.

Centrífuga, filtros para esterilizar medios de cultivo, desionizador de agua, secado en aire caliente, gabinete de solventes, congelador.

Jeringas, pipetas Pasteur, cajas de Pietri desechables, distribuidores automáticos, horno microondas, extractor de vapores, cámaras de crecimiento controladas, propagador de nebulización, energía de emergencia (electricidad, gas o aire a presión).

3. PREVENCIÓN DE CONTAMINACIÓN.

Cultivos libres de microorganismos contaminantes procedentes de:

LOS TEJIDOS: Los de superficie por desinfección

Dentro de los tejidos: fungistáticos y bacteriostáticos en el medio de cultivoEj. Sulfato de gentamicina, penicilina, sulfato de streptomicina (10 a 50 mg /lt)

ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

La puesta en cultivo es un proceso que consiste en obtener material vegetal in vitro libre de microorganismos, a partir de material vegetal ex vitro.

El paso previo y obligado para obtener el material vegetal libre de microorganimos es la esterilización de la superficie de éste.

En general, el proceso de esterilización puede resumirse en los siguientes pasos:

Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de tierra u otras partículas (opcional).

Eliminación de las partes muertas e infectadas de la planta.

Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al 80% durante unos segundos.

Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio (por ejemplo al 1%) con un agente humectante (por ejemplo Tween 20 o Tween 80), durante 10-30 minutos. La fuente más utilizada de hipoclorito de sodio es la lejía. Ésta contiene un 5% de hipoclorito de sodio como agente activo, con lo que la solución estará formada por un 10-20% (v/v) de lejía. Para una mayor eficacia se recomienda agitar la solución mientras dura el proceso.

Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de hipoclorito de sodio. El enjuague debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos cada una.

Este proceso de esterilización presenta, principalmente, dos problemas: la capacidad de los agentes esterilizantes para dañar los tejidos vegetales y la presencia de microorganismos en el interior de dichos tejidos.

En el primer caso, se aconseja disminuir la concentración y/o tiempo de exposición a los agentes esterilizantes. Con esta medida disminuyen los daños al material vegetal pero aumenta el porcentaje de contaminaciones.

En el segundo caso, el proceso de esterilización no tiene el efecto deseado puesto que los microorganismos internos no se eliminan y pueden proliferar en el medio de cultivo.

Un producto alternativo al hipoclorito de sodio es el hipoclorito de calcio. Se presenta en forma de polvo que se mezcla con agua a una concentración de 35-100 g/l. El material vegetal debe permanecer sumergido entre 5-30 minutos y ser enjuagado con agua estéril al finalizar.

Otro agente esterilizante es el cloruro de mercurio, el cual se disuelve en agua a una concentración de 0,01-0,05 (p/v). El material vegetal está en contacto con el producto durante 2-12 minutos, para ser enjuagado concienzudamente con agua estéril al final del proceso. Este producto debe utilizarse bajo medidas de seguridad, ya que es nocivo para la salud.

AREAS DE TRABAJO: contra bacterias y esporas de hongos.

- CFL- Limpiar paredes y mesas- Trabajo por cortos períodos.

INSTRUMENTOS: Esterilización (pero contaminables por microbios del aire, superficies vegetales mal desinfectadas, manos o exhalación del investigador. Alternarlos, 2-3 minutos en alcohol etílico y flameado.

EXTERIOR DE RECIPIENTES DE CULTIVO: Flamear obligatoriamente la boca de cada tubo antes y después de sembrar el explante.

EL INVESTIGADOR: Batas y guantes limpios, protección de cabello, boca y nariz (especialmente sin CFL). Lavado de manos y brazos con agua, jabón y alcohol al 70% antes de iniciar sesión.

4. ESTERILIZACIÓN

Liberación de microorganismos vivos o esporas (asepsia- aséptico).

DESINFECCIÓN: proceso de destrucción química de microorganismos.

ESTERILIZACIÓN: método físico de destrucción de microorganismos

AXENICO es la preparación libre de virus, viroides o micoplasmas.

PREPARACION DEL EXPLANTE.

Generalmente asépticos en su interior pero requieren esterilización superficial: HIPOCLORITO DE SODIO ( NaOCl) 1-3%, es germicida y agente oxidante, esterilizante superficial de tejido de plantas, enjuagar para eliminar residuos oxidantes indeseables. Como es alcalino puede enjuagarse con agua acidulada de HCl muy diluida eliminando el hipoclorito residual.

PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÓN.

Calor húmedo (vapor): vapor abierto o calor bajo presión: para recipientes de vidrio secos, en estufas de aire caliente mínimo a 170˚ durante dos horas ( no menos de una)

Calor húmedo a 100˚ -Método de Koch- mata esporas en tres exposición por tres ( microbios- esporas- esporas lentas) días de 30 a 60 minutos

Calor seco (aire caliente): autoclave: materiales y medios de cultivo ( sin componentes termolábiles) El vapor expulsa el aire del aparato y entonces se cierra la válvula. La temperatura es proporcional a la presión en el manómetro.

Usualmente a presión de 15 lb durante 20 minutos la temperatura alcanza 121˚ Otros:

Colocar detectores de esterilización

Filtración: filtros (Millipore) a prueba de hongos y bacterias con esterilización previa

LA ESTERILIZACIÓN DE UTILLAJE Y MEDIOS

La esterilización, tanto del material y medios frescos, como de los medios ya usados que haya sufrido contaminación, es un proceso esencial en todo laboratorio de cultivo in vitro. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos denominados autoclaves. En situaciones especiales, como en el caso de que algún componente del medio sea termolábil, puede usarse un sistema de esterilización por filtración.

El autoclave.

El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro. En esencia, un autoclave (Figura 1) es un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullición del agua, gracias a aumentar la presión.

10 lb presión x 115.5 durante 30 minutos

15 lb 121.5 20

20 lb 126.5 15

Figura 1. Esquema de

un autoclave

FUNCIONAMIENTO.

El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fase:

FASE DE PURGADO. A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.

FASE DE ESTERILIZACIÓN. Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización.

FASE DE DESCARGA. Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura del calderín empiezan a bajar poco a poco.

Hay que tener en cuenta algunas normas para una correcta esterilización del material:

Para que la esterilización de medios de cultivo sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido. Como quiera que la transmisión del calor en el líquido de los recipientes se realiza de fuera hacia dentro, es evidente que la eficacia del proceso dependerá del volumen de líquido. En general, no conviene esterilizar juntos recipientes grandes y pequeños. En todo caso la selección de la temperatura y tiempo se efectuará según sea el volumen de los recipientes

Los recipientes con cierre hermético deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al vaciar el autoclave después de la esterilización procederemos a cerrar totalmente estos recipientes.

Los recipientes vacíos precisan de un tiempo de esterilización mayor que los recipientes con líquido en su interior

Hay que tener en cuenta que algunas substancias químicas son termolábiles a las temperaturas de esterilización con autoclave. En esos casos es preciso utilizar otros sistemas de esterilización, como el filtrado.

• PROTOCOLO TIPO DE ESTERILIZACIÓN SUPERFICIAL DE MATERIAL VEGETAL:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluidas de bicloruro de mercurio(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.- Enjuagues con abundante H2O estéril(4 ó 5 veces).- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

LIMPIEZA DE RECIPIENTES DE VIDRIO:

no utilizar jabón sino detergentes con agua caliente, luego agua caliente sola, luego con agua desionizada y finalmente con agua destilada.

5. CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO.

Heterogéneo grupo de técnicas por las cuales un explante (parte separada de un vegetal: protoplasto, célula, tejido, órgano) se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.

OBJETIVOS:

1. Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines2. Bioconversion y producción de compuestos útiles3. Incremento de variabilidad genética4. Obtención de plantas libres de patógenos5. Propagación de plantas6. Conservación e intercambio de germoplasma7.

Las técnicas, separación de explante, su incubación dependen del tipo de explante, del sistema de cultivo y del objetivo perseguido. ( Ej. Los protoplastos de los meristemas son diferentes)

RESPUESTA

5.1. EXPLANTE. 1. Sin respuesta

5.2 NORMAS DE ASEPSIA 2. Cultivo infestado

5.3 MEDIOS DE CULTIVO 3. Callo+ regeneración ind.

5.4 CONDICIONES AMBIENTAS DE INCUBACIÓN 4. Regeneración directa

PLANTA EXPLANTE (asepsia) CULTIVO (ambiente/medio) RESPUESTA

La opción 4.Regeneración directa es ideal para micropropagar plantas.

VÍAS MORFOGENÉTICAS:

ORGANOGÉNESIS Y EMBRIOGÉNESIS

Existen dos posibles vías morfogenéticas para la diferenciación de novo de brotes o plantas completas. • Posibles vías morfogenéticas:

- Organogénesis- Embriogénesis

• Diferencias entre las dos posibles vías:

- La ORGANOGÉNESIS es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas.

- LA EMBRIOGÉNESIS se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa

.

PROPAGACIÓN VEGETATIVA POR EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

Explanto (disco de hoja) Explanto (células vegetales)

Callo

Suspensión celular REGENERACIÓN Embriones somáticos (en la suspensión)

GERMINACIÓN ENCAPSULACIÓN

GERMINACIÓN Semilla artificial

SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN VEGETAL

PROLIFERACIÓN VEGETATIVA A PARTIR

DE YEMAS AXILARES O APICALES PREEXISTENTES.

• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos.- La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año a partir de una única yema inicial.- El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica.

SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN VEGETAL

PROLIFERACIÓN DE TEJIDOS DESDIFERENCIADOSResulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

• Consideraciones generales:

- Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, células en suspensión, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos.

- Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

Explanto (disco de tejido) Explanto (suspensión de células)

Regeneración directa Regeneración indirecta

Callo

Formación directa de brotes Brotes aislados (plántulas aisladas)

Planta regenerada Formación indirecta de brotes

Muchos brotes de un solo callo

SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN VEGETAL CULTIVO DE MERISTEMAS

Cultivo de meristemos19 :El empleo de meristemos como explantos es una posible herramienta para el saneamientode plantas infectadas

• Posibilitan la micropropagación de diferentes espLOS MERISTEMAS DETERMINAN EL CRECIMIENTO DE LA PLANTA Y DAN ORIGEN A SUS DIFERENTES ÓRGANOS

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales.

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma

19 Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta.

LIBERACIÓN DE PATÓGENOS El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos.

- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).

- El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa yDahlia.

El cultivo de tejidos posibilita el saneamiento de las plantas multiplicadas vegetativamente

Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides.

El TRATAMIENTO DE PLANTAS MADRES puede efectuarse por distintas técnicas

El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:

• Termoterapia• Quimioterapia• Cultivo de meristemos

Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.

CULTIVO IN VITRO DE CÉLULAS HAPLOIDESY EMBRIONESAplicaciones del cultivo in vitro de células haploides.

• Mejoramiento vegetal.• Estudios de genética cuantitativa.• Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones.

Cultivo in vitro de anteras

Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintéticos que promueven la división celular y la formación de embriones o callos.Los embriones, transferidos a un medio de regeneración, darán lugar a plantas haploides.

Condiciones que afectan el cultivo de anteras:

- Genotipo de las plantas donantes- Fisiología de las plantas donantes

- Caracterización citológica y bioquímica de etapas muy tempranas del desarrollo de los granos de polen- Pre tratamiento de las anteras con altas o bajas temperaturas o con choque osmótico- Medios de cultivo con alto contenido en osmóticos para la inducción de callos y menores concentraciones de sacarosa para la regeneración de plantas

El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de interés comercial:

- Permite la expresión e identificación de alelos recesivos- Constituye una fuente útil para el mejoramiento intravarietal- Permite la rápida introducción de caracteres citoplasmáticos en un fondo genético homocigótico- Crea y acrecienta las reservas citogenéticas y citoplasmáticas de los cultivos- La obtención de haploides duplicados resulta útil para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos muy diversos y para ensayarlas en ellos.- Las microsporas o células haploides pueden usarse para la inducción de mutantes y para la selección de caracteres esporofíticos.

El cultivo de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones

• Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo.• Rescate de embriones híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos.• Producción de monoploides.• Superación de la latencia de las semillas.

Aplicaciones del cultivo de óvulos

• Rescate de embriones (mediante polinización y fertilización in vitro)• Inducción de la embriogénesis somática a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.

SEMILLAS SINTÉTICASLas semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual.

Las semillasLas semillas artificiales poseen una cubierta de protección, contienen sustancias de reserva (endospermo) y portan un embrión somático en su interior.

Procedimiento para encapsular embriones somáticos:

- Alginato LF 2%- Insertar el embrión dentro de la gota- Depositarla en 100 mM de nitrato de calcio por 20

min.

- Lavar las cápsulas en agua por 5 min.

CULTIVO DE PROTOPLASTOSLos protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular.

Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnológicos .

ESQUEMA GENERAL DE LA MANIPULACIÓN GENÉTICA DE PROTOPLASTOS IN VITRO PARA LA REALIZACIÓN DE TÉCNICAS DE MUTAGÉNESIS, FUSIÓN O TRANSFORMACIÓN:

MÉTODOS PARA EL AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS:

• Método mecánico- Bajo rendimiento- Procedimiento tedioso- Aplicabilidad limitadaChoque osmótico para producir plasmólisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico.• Método enzimáticoConsiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas,hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas.• Protocolo para aislamiento y la obtención de protoplastos de mesófilo de hoja de tabaco:- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes de tabaco).- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmótico.- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporción 1:1.- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 h en oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm. Observar la liberación de los protoplastos en un microscopio invertido.- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin.- Remover el sobrenadante y resuspender los protoplastos en medio de cultivo.

VARIACIÓN SOMACLONALLa variación somaclonal puede explicar la variación fenotípica de las plantas regeneradas in vitro.

Entre otras causas:• Modificaciones genéticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro• Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos quiméricos y de mosaicos• Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composición del medio, etc.)• Aneuploides no separables en el cultivo

Otras posibles causas de la variabilidad de las plántulas regeneradas:

• Cese mitótico que lleva a líneas poliploides• Mutaciones del cariotipo• Amplificación o disminución de genes• Reordenamiento de mutaciones en genomas de organelas• Transposones20

• Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosómicos

Características de la variación somaclonal:

• Indeseable en la micropropagación de plantas de interés comercial (diversidad genotípica)• Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material genético (variabilidad)

5 a. EXPLANTE.La elección del explante depende del objetivo y de la especie de planta...

20 Elemento genético móvil que puede moverse de una localización genómica a otra, gracias a la presencia de secuencias repetidas cortas que lo flanquean y que es capaz de replicar e insertar una copia en un lugar nuevo en el genoma. Secuencia de DNA que puede moverse de un lugar a otro del cromosoma, insertar copias adicionales de ella misma en otros puntos o pasar de un cromosoma a otro. Tramo de DNA que puede incorporarse en otras moléculas de DNA en lugares donde no hay homología de secuencia. Tienen un tamaño entre 1 y 40 kb. Codifican todas las enzimas necesarias para su inserción. Pueden desplazarse dentro de un cromosoma o entre cromosomas. Elemento genético móvil que puede moverse de una localización genómica a otra, gracias a la presencia de secuencias repetidas cortas que lo flanquean y que es capaz de replicar e insertar una copia en un lugar nuevo en el genoma.

Si el objetivo es la producción de callos21 estos se obtienen de cualquier célula viva nucleada. (en las dicotiledóneas22 herbáceas se obtienen de diversos explantes23: ápices, meristemas24 caulinares, hojas (lámina foliar), entrenudos, cotiledones25, raíces, anteras 26o tejidos altamente diferenciados como los frutos.

Igualmente los callos pueden obtenerse de células (suspensión) y protoplastos27.

Se usan explanates jóvenes de invernadero o semillas germinadas asépticamente. Es más exigente el tipo de explante para leñosas y algunas gramíneas, algunos solo regeneran de explantes que contengan meristemas apicales caulinares o laterales.

En algunas es posible el crecimiento calloso pero no es posible la regeneración de plantas.

21 un callo de células (también denominado Callus, ó Calli), es una masa de células no diferenciadas.

En biología de la planta, las células del callo son esas células que cubren una herida de la planta. Un cultivo celular del callo se sustenta generalmente en los medios de gel, un medio suficiente consistiría en agar y una mezcla generalmente de macronutrientes y micronutrientes para un tipo determinado de célula. Para las células de las plantas, el enriquecimiento con nitrógeno, fósforo, y potasio es especialmente importante. El agua se proporciona como un componente de los medios del gel. Un callo de células de planta consiste en las células somáticas no diferenciadas de un espécimen de planta adulta. Los callos de células de plantas se pueden hacer, con la adición de un número de hormonas o de enzimas, para diferenciarlos en los tejidos especializados de una planta entera. Esto es una capacidad conocida como célula totipotencial. Los callos de células pueden ser la fuente de obtención de nuevas moléculas con propiedades terapéticas.2 3Un callo es a menudo, el objetivo de un marcador genético para la inserción específica de DNA en experimentos.4El tejido de callo es de uso particular en la micropropagación, donde puede ser utilizado para cultivar copias genéticamente idénticas de plantas con características deseables.5

22 Monocotiledóneas y dicotiledóneas. Dentro de las angiospermas distinguimos dos grandes grupos: el de las monocotiledóneas y el de las dicotiledóneas. La característica que distingue a ambos grupos se encuentra en la semilla. En ésta hay un embrión con unas hojas que reciben el nombre de cotiledones. Mientras que la dicotiledóneas presentan dos cotiledones, las monocotiledóneas tienen uno solo. Además, existen otras diferencias entre las monocotiledóneas y las dicotiledóneas.PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE DICOTILEDÓNEAS Y MONOCOTILEDÓNEAS Dicotiledóneas Monocotiledóneas Muchas son hierbas, pero predominan las plantas leñosas: árboles y arbustos. La mayoría son hierbas. Los vasos conductores se disponen formando anillos concéntricos en el tallo. Los vasos conductores se disponen dispersos al azar por el tallo. La raíz suele tener un eje central que se ramifica. Las raíces son fasciculadas. El tallo suele ser ramificado. El tallo no tiene ramificaciones. Las hojas suelen tener pecíolo y sus nervios se ramifican. Las hojas no suelen tener pecíolo y envuelven al tallo. Sus nervios suelen ser paralelos. Suelen tener cuatro o cinco pétalos y estambres, o múltiplos de cuatro o cinco. Suelen tener tres pétalos y estambres, o múltiplos de tres. 23 explante (parte separada de un vegetal, por ejemplo: protoplasto, célula, ....

24 Meristemos: tejidos constituidos por células proliferantes que causan el crecimiento y desarrollo de

la planta. Según su posición en la planta, los meristemos se dividen en: apicales, laterales e intercalares. Los primeros se sitúan en los extremos de las ramas del tallo y de las raíces. Los segundos forman un cilindro alrededor de las ramas y raíces: cilindro que o se sitúa en la parte más externa

(felógeno) o a cierta profundidad, en el sistema vascular (cambium vascular). Meristemos apicales caulinares: por proliferación de estos meristemos se desarrolla el ápice caulinar, por el que irán creciendo el tallo y las hojas

25 En botánica, los cotiledones (κωτυλυδών: Kotulêdôn, «hueco de un corte» )? son las hojas primordiales constitutivas de la semilla y se encuentran en el germen o embrión. Las semillas de las plantas monocotiledonas implican un único cotiledón (trigo, maíz); las de las dicotiledonas implican dos (judía, guisante, castaño); las de las coníferas implican de diez a doce. Los cotiledones a menudo se encargan de las reservas nutritivas. En las dicotiledóneas que pertenecen a las fanerógamas, se encargan de distintos tipos de reservas, proteínas, lípidos, y azúcares. Estas reservas que se encuentran bajo formas complejas, se deterioran durante la germinación, debido a enzimas. Las pequeñas moléculas resultantes de esta degradación se transportan hacia el embrión, que las utiliza para seguir su ciclo de desarrollo.

26 En las plantas angiospermas, la antera (del griego antiguo antheros, 'florecido') es la parte terminal

del estambre de una flor. Es una estructura homóloga a los microesporangio en otros clados (conjunto de especies emparentadas (con un antepasado común) y está encargado de la producción del polen. La palabra procede del griego anteros, que significa florecido, aludiendo a que la presencia visible de las anteras señala el punto álgido de la antesis (floración). Cada estambre suele fundamentarse en un piececillo llamado filamento y una antera, sujeta lateralmente al extremo del filamento

Para la obtención de plantas libre de patógenos se cultivan meristemas

Para la obtención de haploides 28se cultivan anteras.

Algunas plantas tienen gran variabilidad asociada al genotipo.

La propagación in vitro de la mayoría de plantas leñosas requiere utilizar explantes provenientes de materiales juveniles. En herbáceas se toman de explantes jóvenes.

Explantes grandes traen probabilidad de heterogenicidad y contaminación. La proliferación callosa requiere de un tamaño mínimo del explante. Pueden cultivarse varios explantes en un mismo recipiente.

5b. ASEPSIA.Los microorganismos- bacterias y hongos- pueden destruir los cultivos, deben evitarse contaminantes. Son difíciles los cultivos completamente asépticos, especialmente por los virus.

Para establecer cultivos asépticos:

1. Ambiente adecuado2. Esterilizar los medios de cultivo3. Desinfectar superficialmente los exp0lantes ( no bacterias u hongos exógenos)4. Cultivos acordes con normas de asepsia.

Desinfección de los explantes:

1. Etanol al 70%2. Hipoclorito de sodio – NaOCl- del 1 al 3 % o hipoclorito de calcio-menos frecuente- Ca(OCl)23. Agitar 80-150 rpm en la solución desinfectante.

NOTA: Útil puede ser agregar algún agente tensioactivo 29 : Tween-20 del 0.01 al 0.1%

27 Un protoplasto vegetal puede definirse como: «La parte de la célula vegetal que está delimitada e incluida dentro de la pared celular y que puede ser plasmolisada y aislada por eliminación mecánica o enzimática de la pared celular. El protoplasto es por lo tanto una célula desnuda, rodeada por su membrana plasmática, potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse» (Vasil, 1976).28

Una célula haploide es aquella que contiene un solo juego de cromosomas o la mitad (n, haploide) del número normal de cromosomas en células diploides (2n, diploide).1 Las células reproductoras, como los óvulos y los espermatozoides de los mamíferos y algunas algas contienen un sólo juego de cromosomas, mientras que el resto de las células de un organismo superior suelen tener dos juegos de ellos. Cuando los gametos se unen durante la fecundación, el huevo fecundado contiene un número normal de cromosomas (2n): es una célula diploide.

29 Los tensoactivos o tensioactivos son sustancias que influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases (p.ej., dos líquidos insolubles uno en otro). Cuando se utilizan en la tecnología doméstica se denominan como emulgentes o emulsionantes; esto es, sustancias que permiten conseguir o mantener una emulsión Entre los tensoactivos se encuentran las sustancias sintéticas que se utilizan regularmente en el lavado, entre las que se incluyen productos como detergentes para lavar la ropa, lavavajillas, productos para eliminar el polvo de superficies, y champús. Fueron desarrollados en la primera mitad del siglo XX, y han suplantado ampliamente al jabón tradicional. Estas propiedades las obtienen a través de su estructura atómica. Los tensoactivos se

Los antibióticos en los medios de cultivos solo excepcionalmente y cultivos de muy corta duración.

Usualmente: solo

Etanol, o solo NaOCl, o lo más frecuentemente, ambos ( inmersión corta etanol 70% - 4, 10, 20,60 seg. y se sigue con inmersión en hipoclorito de sodio, NaOCl al 0.5, 0.8,1.2, 1.6, 2.0 %- 5 a 30 min- y varios lavados con agua estéril).

En veces, se efectúa una doble desinfección: semillas se sumergen en etanol 70%/10seg, luego en NaOCl al 1.2%/10 min.se lavan agua destilada estéril y se ponen a germinar asépticamente. A los 3-5 días se desinfectan Na OCl 0.6 %/10 min, se retiran de las plántulas las hojas jóvenes para los cultivos

O, pre-incubación de explantes: lavado Ca(OCl)2 al 1%x15min + agua estéril+ corte e incubación en solución salina ( sales de Murashige diluidas a la mitad y sacarosa. A las 48 horas se seleccionan explantes no contaminados con coloración normal para establecer cultivos.

Algunas plantas- ej. carica- desinfección de peciolos 30 , se toman ápices caulinares de manzano se desinfectan levemente, se incuban 24 horas en medio de cultivo, de nuevo se desinfectan y se cultivan.

Explantes vegetales de invernadero o cuarto climatizado más fácilmente se desinfectan que los que crecen en campo. Igual con explantes de órganos jóvenes que de materiales adultos

PRECAUCIONES DE ASEPSIA:

- Desinfección previa de la mesa y paredes con etanol 70%. Desinfectar parte externa de recipientes de los medios de cultivo o agua estéril, antes de entrarlos a la cámara.

- Manos y antebrazos con etanol 70%. Uso de máscara y gorro.- Flamear instrumentos metálicos con etanol 95%.- Pietri o vidrio de disección deben estar estériles, igual pipetas usadas

en suspensiones celulares y protoplastos.- Transferencia y disección muy cerca del mechero.

componen de una parte hidrófoba o hidrófuga y un resto hidrófilo, o soluble en agua. Se dice que son Moléculas anfifílicas. Al contacto con el agua las moléculas individuales se orientan de tal modo que la parte hidrófuga sobresale del nivel del agua encarándose al aire o bien se juntan con las partes hidrófugas de otras moléculas formando burbujas en que las partes hidrófugas quedan en el centro, y los restos solubles en agua quedan entonces en la periferia disueltos en el agua. Estas estructuras se denominan micelas. Se obtienen por medio de otras sustancias como el agua salada,etc La clasificación se fundamenta en el poder de disociación del tensoactivo en presencia de un electrolito y de sus propiedades fisicoquímicas Pueden ser : iónicos o no-iónicos; y dentro de los iónicos según la carga que posea la parte que presenta la actividad de superficie serán: aniónicos, catiónicos y anfóteros. Los iónicos, con fuerte afinidad por el agua, motivada por su atracción electrostática hacia los dipolos del agua puede arrastrar consigo a las soluciones de cadenas de hidrocarburos, por ejemplo el ácido pálmico, prácticamente no ionizable es insoluble, mientras que el palmitato sódico es soluble completamente ionizado.

30 El peciolo o pecíolo (del latín "petiolus", forma diminutiva de "pes" "pedis", pie, tronco de una planta) es el rabillo que une la lámina de una hoja a su base foliar o al tallo. Falta en las hojas sésiles. El peciolo puede ser una característica determinante para la identificación de la planta. El peciolo se desarrolla en la fase germinativa de la plántula, en el tejido embrionario llamado hipocótilo. Del alargamiento del hipocótilo surge el cotiledón o plúmula (tejido precursor de la hoja) y el terminal o meristemo apical.

5 .3 MEDIOS DE CULTIVO.Elegir un medio apropiado de cultivo.

COMPONENTES DEL MEDIO.

- Carbono. MB= MEDIO BASAL

- Nutrientes minerales

- Vitaminas.

- Agente gelificante (medios semisólidos)

- Sustancias reguladoras de crecimiento.

- Otros compuestos.

FUENTES DE CARBONO: SACAROSA AL 2-5 %, GLUCOSA O FRUCTOSA. Son menos efectivas la galactosa y maltosa.

Incorporar MIOINOSITOL al medio ( 100 mg/lt) resulta en un mejor crecimiento de callos y suspensiones celulares.

NUTRIMENTOS MINERALES: aunque ya están en los medios de cultivo, recientemente se usan concentraciones medianamente altas de nitrógeno (nitrato y amonio) y potasio. Solo nitrato o solo amonio. En caso de amonio, se agrega ácido cítrico, succínico o málico. Otras fuentes de nitrógeno incluyen glutamina, úrea y caseína hidrolizada. Los medios contienen fósforo, calcio, magnesio, azufre= a 1-3 mM.

Puede incluirse Hierro más un agente quelante-Na2EDTA está disponible en varios pH.

VITAMINAS: generalmente puede incorporarse solo tiamina.

AGENTE GELIFICANTE. Agar- 0.6 a 1.0 %- en medios semisólidos

REGULADORES DE CRECIMIENTO: Los MB solos dan respuesta deseada, pero mayoritariamente se agregan - hormonas vegetales AUXINAS - 2,4-D/ ANA/AIA/AIB O CITOCININAS- KIN/BAP/ZEA

• Generalidades:- Actúan a bajas concentraciones- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación celular y la inducción de la Morfogénesis.

Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) • Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleoptile de gramíneas.

- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos- Formación de raíces adventicias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:- Acido indol butírico (IBA)- Acido naftalen acético (ANA)- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

- Citoquininas.

Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenéticas en combinación con las auxinas• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citoquininas)- Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citoquininas endógenas:- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 ıg/Kg.• Su transporte es no polar.

- Giberelinas: Acido giberélico (GA3)

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes.

• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada.En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormición- Floración- Movilización de reservas en la semilla

• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el embrión.• Su transporte no es polar.

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes.

Las GIBERILINAS, especialmente el AG3 son necesarias en el cultivo de ápices o meristemas caulinares. Ocasionalmente se emplea el ácido abscísico ABA

- Acido abscísico- Etileno

OTROS COMPONENTES. Como fuente de nitrógeno reducido, factores de crecimiento, carbohidratos y otros. AC – agua de coco del 5al 15%- , jugo de frutos de tomate, extracto de levadura, extracto de tubérculo de papa.

Opcionales además de la glicina, otros aminoácidos-asparigina, cisteína y L-tirosina.

En veces se adicionan ácidos orgánicos como cítrico, málico, succínico, pirúvico como precursores de aminoácidos, L-glutamina, caseína hidrolizada.

Antioxidantes-acido ascórbico, L-cisteína, polivinilpirrolidona para explantes con alto contenido de polifenoles que oscurecen y matan los explantes, u opcionalmente, incubar en oscuridad o muy baja intensidad de luz.

El carbón activado ( 0.1-5 %) absorbe metabolitos tóxicos en cultivos de explantes varios.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO.

Usar agua bidestilada o agua desmineralizada-destilada.

Medios sólidos sin sustancias termolábiles: 1. Incorporar MB , reguladores de crecimiento u oreos compuestos. Ajustar pH2. Adición y disolución de agar. Distribuir en recipientes de cultivo( tubos de ensayo, Petri..)3. Esterilizar en autoclave.

Medios líquidos con o sin sustancias termolábiles : como anterior pero sin agar y esterilización por filtración. ( Millipore u otros) si contiene sustancias termolábiles.

Medios semisólidos con una o más sustancias termolábiles: 1. Incorporar compuestos a esterilizar en autoclave ( MB, reguladores de crecimiento u

otros)2. Adición y disolución de agar.3. Esterilizar en autoclave y luego4. A temperatura de 40-50 ˚C , incorporar sustancias termolábiles esterilizadas por

filtración.

PREPARACIÓN DE MB ( según Murashigue et al.)

MB (fuente de carbono+ nutrimentos minerales+ vitaminas) ver CIAT pág. 31 y 34-35.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

SOLUCIONES STOCK Instrucciones generalesPara una correcta preparación de las soluciones stock se debe:

Pesar los componentes en una balanza de precisión. Asegurarse que el material que entrará en contacto con los componentes de las soluciones se

encuentra perfectamente limpio. En caso de duda, lavarlo y hacer un último enjuague con agua destilada para retirar los restos de las sales minerales del agua corriente.

Mezclar los componentes con la ayuda de un agitador magnético.

Una vez obtenida la solución stock, etiquetar el recipiente que la contendrá indicando qué tipo de solución es, su concentración, la fecha en que se preparó y la persona que la hizo.

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN STOCK DE MACRONUTRIENTES MS x10

Para obtener un litro de dicha solución llénese un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente:

SubstanciaPeso (en gramos)

NH4NO3 16,5

KNO3 19,0

CaCl2·2H2O 4,4

MgSO4·7H2

O 3,7

KH2PO4 1,7

Tabla 1. Macronutrientes necesarios para preparar una solución stock 10 veces concentradapara medio MS

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo. Esta solución debe guardarse a 4 ºC.

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN STOCK DE MICRONUTRIENTES MS X 100

Para obtener un litro de dicha solución llenar un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.

SubstanciaPeso (en

mg)

MnSO4·4H2O 2.230,0

ZnSO4·7H2O 860,0

H3BO3 620,0

KI 83,0

Na2MoO4·2H2

O 25,0

CuSO4·5H2O 2,5

CoCl2·6H2O 2,5

Tabla 2. Micronutrientes necesarios para preparar una solución stock 100 veces concentradapara medio MS

Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN STOCK DE HIERRO MS X 200

Para obtener 100 ml de dicha solución deben seguirse los pasos siguientes:

Calentar unos 50 ml de agua destilada en un agitador magnético preparado para tal propósito. Cuando el agua esté templada, añadir 556 mg de FeSO4·7H2O.

Una vez se haya disuelto el producto anterior, agregar 744 mg de Na2EDTA·H2O.

A continuación, añadir 1 lenteja de NaOH.

Ya disueltos todos los elementos, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, trasladar la solución a su envase definitivo y etiquetar debidamente.

Esta solución se almacena a 4 ºC.

PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN STOCK DE VITAMINAS Y INOSITOL MS X 200

Para obtener 100 ml de dicha solución llenar un erlenmeyer con unos 50 ml de agua destilada y añadir

uno a uno, hasta total disolución los siguientes componentes:

SubstanciaPeso (en

mg)

Mio-inositol 2.000

Ácido nicotínico 10

Piridoxina·HCl 10

Tiamina·HCl 2

Glicina 40

Tabla 3.Vitaminas y mioinositol necesarios para preparar una solución stock 200 veces concentradapara medio MS

A continuación, verter el contenido en una probeta de 100 ml, enrasar, llenar el recipiente definitivo con la solución y etiquetarlo.

La solución stock de vitaminas debe almacenarse a -20 ºC.

PREPARACIÓN DE MEDIO MS. Se acostumbra a ser una práctica habitual en todos los laboratorios preparar soluciones stock concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se produzcan fenómenos de precipitación.

Es habitual trabajar con 1. una solución stock de macronutrientes, 2. una de micronutrientes, 3. una de hierro con un agente quelante, 4. otra de vitaminas y mio-inositol, así como con soluciones específicas para los demás componentes del medio (reguladores, ...).

A partir de soluciones stock su preparación se reduciría a cuatro medidas de volumen y una pesada (sacarosa). Las soluciones stock pueden mantenerse durante un cierto tiempo en la nevera o en el congelador.

Una vez obtenido el volumen de medio deseado se procede a ajustar su pH al valor prefijado mediante la adición de OHNa y/o HCl 0.1-1 N. A continuación, dependiendo de que se vaya a preparar un medio sólido o líquido, se añadirá en el primer caso el agente solidificante, se fundirá por calentamiento breve para, finalmente, ser dosificado en los contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un medio líquido se procederá a dosificar directamente en los contenedores escogidos. Tanto si es un medio sólido como líquido se procederá a continuación a autoclavar los contenedores con el medio (generalmente a 121 0C durante 20 minutos).

Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo pueden ser termolábiles (algunas vitaminas, algunos reguladores,...). En este caso, la esterilización de la solución que contienen la substancia termolábil debe hacerse por filtración y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y parcialmente (en medios sólidos) o totalmente (en medios líquidos) enfriado.

La esterilización de la solución que contienen la substancia termolábil debe hacerse por filtración y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y parcialmente (en medios sólidos) o totalmente (en medios líquidos) enfriado.

PREPARACIÓN DE 1 L DE MEDIO DE CULTIVO MS

Para la obtención de 1 l de medio de cultivo MS a partir de soluciones stock, síganse los siguientes pasos:

Llenar un Erlenmeyer de 2 l de capacidad con unos 500 ml de agua destilada Añadir 100 ml de solución stock de macronutrientes (MS x 10) y agitar.

Agregar 10 ml de solución stock de micronutrientes (MS x 100) y agitar.

A continuación, añadir 5 ml de solución stock de hierro (MS x 200) y agitar.

Agregar 5 ml de solución stock de vitaminas (MS x 200) y agitar.

Añadir 30 g de sacarosa y agitar hasta que se disuelva completamente.

Verter el contenido en una probeta de 1 l y enrasar.

Devolver la solución preparada al erlenmeyer, agitar y ajustar el pH para que se encuentre entre 5,7-5,8.

Añadir 2 g de gelrita, agitar y calentar la solución hasta que la gelrita quede disuelta.

Verter el contenido en los recipientes de cultivo y esterilizarlo (20 minutos a 121 ºC).

Cuando finalice el proceso de esterilización, dejar enfriar el material para que el medio adquiera una textura gelatinosa.

En caso de trabajar con medio líquido, no se debe añadir la gelrita. El medio de cultivo puede permanecer en buenas condiciones durante una semana si se almacena a temperatura ambiente, y hasta un mes si se conserva a 4 ºC.

Diagrama de flujo del proceso de preparación de un medio de cultivo a partir de soluciones stock.

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO COMÚNMENTE USADOS

COMPOSICION DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVOa

Constituyentes Medios (mg l-1) b

White's c Heller's d

MS e ER f B5 g Nitsch'sh

NT i WPM j

Inorgánicos

NH4NO3 - - 1.650,0000

1.200,0000

- 720,0000 825,0000 400,0000

KNO3 80,0000 - 1.900,0000

1.900,0000

2.527,5000

950,0000 950,0000 -

CaCl2.2H2O - 75,0000 440,0000 440,0000 150,0000 - 220,0000 96,0000

CaCl2 - - - - - 166,0000 - -

MgSO4.7H2O 720,0000 250,0000 370,0000 370,0000 246,5000 185,0000 1.233,0000

370,0000

KH2PO4 - - 170,0000 340,0000 - 68,0000 680,0000 170,0000

K2SO4 - - - - - - - 990,0000

(NH4)2SO4 - - - - 134,0000 - - -

Ca(NO3)2.4H2O 300,0000 - - - - - - 556,0000

NaNO3 - 600,0000 - - - - - -

Na2SO4 200,0000 - - - - - - -

NaH2PO2.H2O 19,0000 125,0000 - - 150,0000 - - -

KCl 65,0000 750,0000 - - - - - -

KI 0,7500 0,0100 0,8300 - 0,7500 - 0,8300 -

H3BO3 1,3000 1,0000 6,2000 0,6300 3,0000 10,0000 6,2000 6,2000

MnSO4.4H2O 7,0000 0,1000 22,3000 2,2300 - 25,0000 22,3000 -

MnSO4.H2O - - - - 3,0000 - - 16,9000

ZnSO4.7H2O 3,0000 1,0000 8,6000 - 2,0000 10,0000 - 8,6000

ZnSO4.4H2O - - - - - - 8,6000 -

Zn.Na2.EDTA - - - 15,0000 - - - -

Na2MoO4.2H2O - - 0,2500 0,0025 0,2500 0,2500 0,2500 0,2500

MoO3 0,0001 - - - - - - -

CuSO4.5H2O 0,0010 0,0300 0,0250 0,0025 0,0250 0,0250 0,0250 0,2500

CoCl2.6H2O - - 0,0250 0,0025 0,0250 - - -

CoSO4.7H2O - - - - - - 0,0300 -

AlCl3 - 0,0300 - - - - - -

NiCl2.6H2O - 0,0300 - - - - - -

FeCl3.6H2O - 1,0000 - - - - - -

FeSO4.7H2O 27.8 - 27,8000 27,8000 - 27,8000 27,8000 27,8000

Na2.EDTA.2H2O 37.3 - 37,3000 37,3000 - 37,3000 37,3000 37,3000

Sequestrene 330Fe

- - - - 28,0000 - - -

Orgánicos

Inositol - - 100,0000 - 100,0000 100,0000 100,0000 100,0000

Acido Nicotínico 0,5000 - 0,5000 0,5000 1,0000 5,0000 - 0,5000

Piridoxina HCl 0,1000 - 0,5000 0,5000 1,0000 0,5000 - 0,5000

Tiamina HCl 0,1000 - 0,1000 0,5000 10,0000 0,5000 1,0000 1,0000

Glycina 3,0000 - 2,0000 2,0000 - 2,0000 - 2,0000

Acido Fólico - - - - - 0,5000 - -

Biotina - - - - - 0,0500 - -

Sacarosa 2% - 3% 4% 2% 2% 1% 2%

D-Manitol - - - - - - 12,7% -

a No se incluyen reguladores de crecimiento ni mezclas de nutrientes complejas

b Las concentraciones de Sacarosa y Manitol están dadas en porcentaje

c White (1963)

d Heller (1959)

e Murashige y Skoog (1962)

f Eriksson (1965)

g Gamborg et al; (1968)

h Nitsch (1969)

i Nagata y Takebe (1971)

j Lloyd y McCown (1980)

____________________________________________ETAPA 1COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK DEL MEDIO DE CULTIVOPARA MULTIPLICACON DE LULO A PARTIR DE NUDOS

SOLUCIÓN STOCK

REACTIVO FORMULA CONCENTRACION STOCK gr/l

CONCENTRRACIÓN final mg/l

CANTIDAD DE

STOCK para 250

ml DE MEDIO

ANitrato de

amonio NH4NO3 82.5- 1650 (1.65) 5 ml

BNitrato de

potasio KNO3 95.0 1900( 1.9) 5ml

CCloruro de

Calcio CaCL2.2H2O 88.0 440 (0.4) 125 ml

DFosfato biácido

potasio KH2PO4 34 170 1.25 ml

E

Acido bórico H3BO3 1.24 6.2

1.25

Yoduro de potasio KI 0.166 0.83Molibdato de sodio Na2MoO4.2H2O 0.05 0.25Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.005 0.025

F

Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 74.0 370

1.25

Sulfato de manganeso MnSO4.4H2O 3.45 22.3

Sulfato de zinc ZnSO4.7H2O 1.76 8.6

sulfato de cobre CuSO4.5H2O 0.005 0.025

GEDTA de sodio Na2EDTA 7.16 37.3

1.25Sultado de

Hierro FeSO4.7H2O 5.57 27.8

Vitaminas ( B5)Tiamina

C12H17CIN4OS.Cl 10 mg/l

Inositol C6H12O6 100 mg/l

Piridoxina C8H11NO3 1 mg/l

Acido nicotínico C6H5NO2 1 mg/l

Hormona GA3 0.1 mg/l

Sacarosa 30 grpH del medio :

5.8 AGAR 5.8 gr

El NA2EDTA y el FeSO4.7H2O se precipitan rápidamente, por lo tanto es conveniente preparar un volumen final de 250 ml. Disuelva separadamente en 50 ml de agua destilada en calentamiento y agitación FeSO4.7H2O y 932.5 mg de Na2EDTA. Mezcla las dos soluciones en calentamiento y agitando continuamente hasta obtener un color amarillo, se deja enfriar y ajuste a un volumen final de 250 ml.

Guarde la solución en un frasco ámbar o envuélvalo el frasco en papel aluminio.

MEDIO DE CULTIVO PARA CHOLUPA “PASSIFLORA MALIMORFIS”

MEDIO DE ESTABLECIMIENTO mg/lMEDIO M Y S

SOLUCIONES CANTIDADA 20 mlB 20 mlC 5 mlD 5 mlE 5 mlF 5 mlG 5 ml

VITAMINAS B5Tiamina 10 mgInositol 100 mgPiridoxina 1 mgAcido nicotínico 1 mg

OTROS COMPONENTESAzúcar 30 grpH 5.8 Agar 5.8 grHORMONA BAP 1 mg/ l

MEDIO PARA LULO “SOLANUM QUITOENSE”-MEDIO PARA SEMILLA

MEDIO DE ESTABLECIMIENTO mg / lMEDIO M Y S

SOLUCIÓN CANTIDADSolución A 20 ml/lSolución B 20 ml/lSolución C 5 ml/lSolución D 5 ml/lSolución E 5 ml/lSolución F 5 ml/lSolución G 5 ml/l

VITAMINAS B5TIAMINA 10 mgINOSITOL 100 mgPIR4IDOXINA 1 mgACIDO NICOTÍNICO 1 mg

HORMONAGA3 0,1 mg

OTROS COMPONENTESAZUCAR 30 GRpH 5.8Agar 5.8 gr

MEDIO DE CULTIVO PARA ORQUÍDEA “CATLEYA spp. ”

MEDIO M Y SSOLUCIÓN A 1/3 6.7SOLUCIÓN B 1/3 6.7SOLUCION C 1/3 1.7SOLUCIÓN D 1/3 1.7SOLUCION E 1/3 1.7SOLUCIION F 1/3 1.7SOLUCIÓN G 1/3 1.7

ANTIOXIDANTECARBON ACTIVADO 1.2 gr

AMINOACIDOGLICINA 1 mg

HORMONASBAP-KINETINA Citoquinina 1,75 mg

ANA-IBA auxina 1,75 mgOTROS COMPONENETES

Agua de coco 100 mlAzúcar 20 gr

pH 5.4-5.6Agar 5.8

NOTA: SENA: 101023 PRACTICA

DIANEA – CARNÍVORA.

Sal FLYTRAP 2,2 gr POR LITRO AGUA

VITAMINAS TIAMINA 1 mg X lt

MIO-INOSITIOL? 100 MG X LT

AZUCAR 30 gr X lt

AGAR 6 gr X lt Agitar ½ hora/lt pH 5,8 y AUTOCLAVE 15 min x (121) o

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 – 40Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

2. Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 – 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

3. Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992.

4. Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenicfungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 – 282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.

5. Litz, R. E. Cultivo de embriones y óvulos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 12: 295 – 312, 1991.

6. Roca, W. M., Núñez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 – 294, 1991.

7. Sasson, A. Biotechnology and Natural Products. Prospects for Commercial Productio, ACTS, African Centre for Technology Studies. Nairobi, Kenya. 1992. 8. Roca, W. M., Núñez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 – 294, 1991.

9. Scragg, A. H. Large scale plant tissue culture. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 9: 225 – 249. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.