CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES- CULTIVO IN VITRO SEMILLAS DE LULO Maldonado Giraldo, Melissa. Garzn Grisales, Cristian. Hidalgo, Diego. Bedoya. Jairo. Estudiantes de Ingeniera de Alimentos, Universidad del Quindo, Armenia (Colombia)

RESUMEN Resumen Establecimiento En primer lugar se inicio con la preparacin del medio de cultivo compuesto por microsales, macrosales acido ascrbico y otros nutrientes. Preparamos la solucin indicada, posteriormente llevados a calentamiento por 10 minutos, luego enfriados a temperatura ambiente para posteriormente, ser esterilizados en autoclave. Una vez tenamos los medios de cultivo, iniciamos con la desinfeccin de las semillas con agua y detergente, luego llevndolas a una solucin de hipoclorito por 15 minutos,

despus la trasladamos a un recipiente con alcohol, de nuevo hipoclorito, posteriormente adicionamos dos gotas del reactivo tween para finalmente lavar y sembrar. La siembra se realizo en una cmara de flujo laminar previamente desinfectada se pusieron las semillas dispersas en el medio de cultivo y finalmente se tap el frasco.

ABSTRACT First we start with the preparation of culture medium composed of Microsales, macrosales, ascorbic acid and other nutrients. Prepare the solution mentioned later brought to heating for 10 minutes, then cooled at ambient temperature to subsequently be sterilized by autoclaving. Once we had growth media, we begin with the disinfection of seeds with water and detergent, then bringing them to a hypochlorite solution for 15 minutes, then moved to a container of alcohol, again hypochlorite, then we added two drops of reagent tween to finally wash and seed. Sowing was performed in a laminar flow chamber previously disinfected seeds were dispersed in the growth medium and finally covered the bottle.

Cuando se habla del cultivo de plantas, generalmente nos referimos a cultivarlas en macetas, arriates o cultivarlas en el campo. En 1904 Hanning desarroll un nuevo mtodo de cultivo de plantas al que se llam cultivo de embriones. Aisl in vitro embriones inmaduros de algunos miembros de la familia Crucferas, obteniendo plntulas viables. El cultivo in vitro se define como el cultivo en un medio nutritivo, en condiciones estriles, de plantas, semillas, rganos, explantos, tejidos, clulas y protoplastos de plantas superiores. Estas tcnicas se caracterizan porque: Ocurren a microescala, sobre todo en una superficie pequea. Se optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere a factores fsicos, nutricionales y hormonales. Se excluyen todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), as como tambin las plagas de las plantas superiores (insectos y nematodos).

PALABRAS CLAVES Cultivo, semilla, nutriente, desinfeccin. clon,

1. INTRODUCCIN

Generalmente no se reproduce el patrn normal de desarrollo de una planta, resultando que un tejido aislado puede dar origen a un callo o puede desarrollarse de otras formas

poco usuales (por ejemplo, formacin de rganos, embriogenesis somtica). La capacidad de cultivar protoplastoso clulas individuales permite manipulaciones que antes era imposibles. El nombre de cultivo in vitro (que generalmente quiere decir en vidrio), se utiliz porque, al menos inicialmente, se usaron recipientes de vidrio para el cultivo.

condiciones estriles y con unas instalaciones especiales. Lo fundamental en un cultivo in vitro es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estriles: utensilios, cmara de manipulacin, etc., todo est desinfectado en autoclave. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatacin en el laboratorio; en el invernadero y despus una segunda aclimatacin en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros slo se encargan del primer paso.

Fase de aclimatacin en invernadero Aplicaciones prcticas del cultivo in vitro:

Propagacin vegetativa. Esto es lo ms prctico. Dos tcnicas: Micropropagacin de estaquillas - Organognesis de callos

El cultivo in vitro es un mtodo de propagacin de plantas de aplicacin profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas

Produccin de plantas libres de virus mediante dos

tcnicas: -Cultivo de meristemos - Microinjerto in vitro

Aplicacin en mejora gentica para obtener hbridos, para introducir material gentico, etc. Acortar los ciclos de mejora gentica. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del rbol para ver resultados. Produccin de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras).Ventajas: - Obtencin rpida de homocigotos. - Produccin de hbridos (frutos puros).

ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirn en el medio a su vez estril y se mantendrn all en condiciones aspticas.

2- Multiplicacin: Una vez que la primera fase se ha completado con xito, comienza la multiplicacin de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azcares, hormonas, etc). Tras un perodo de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicacin de las plantas.

Podemos distinguir cuatro etapas en el cultivo in vitro, tales como: Iniciacin, multiplicacin, enraizamiento y aclimatacin. 1Establecimiento del cultivo (iniciacin): El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extrados de la planta madre. Estos pequeos rganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural estn contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de

3- Enraizamiento: Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una raz con la que sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se

encuentren de nuevo en el medio natural. La induccin de estas races se produce modificando ligeramente las caractersticas del medio de cultivo adecundolas para la generacin de races.

en un medio de cultivo apto para su micropropagacin y se realiz la desinfeccin de las mismas respectivamente. Cabe indicar que el lulo es una planta semisilvestre que crece en ecosistemas abiertos por el hombre, especialmente en sitios frescos, sombreados y con buena humedad (reas de sotobosque en las partes bajas del bosque primario), bajo estas condiciones, la planta es exuberante, muy verde y vigorosa. Su nombre comn es lulo o naranjilla, su nombre cientfico es Solanumquitoense y pertenece a la familia Solanaceae. El lulo o naranjilla es una planta originaria de los bosques hmedos de los Andes de Sudamrica, ms especficamente en Colombia, Ecuador y Per, en regiones frescas y sombreadas. Esta especie que se ha difundido a lo largo del Continente Americano, desde Chile hasta Mxico, se cultiva en pases como Per, Ecuador, Colombia, Panam, Costa Rica y Honduras

4- Aclimatacin: Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran nmero de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo estn en una atmsfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el tejido epitelial se caracterizar por tener menos ceras que protejan a las plantas contra la deshidratacin. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se efectuar por tanto cuidadosamente, utililizando para ello invernaderos.

2. MATERIALES Y METODOS Materiales utilizados: En este laboratorio trabajamos con el lulo, principalmente sus semillas, a las cuales ubicamos Frascos de vidrio Agitadores de vidrio

Probetas Matrz Erlenmeyer Autoclave Balanza Estufa elctrica Pinzas metlicas

aluminio y se esterilizaron en el autoclave. Se procedi a la desprender las semillas de lulo del fruto, las cuales fueron desinfectadas lavndose con agua y jabn, agregndolas en hipoclorito al 5% durante 15 minutos, enjuagndolas con agua, luego, se introdujeron en alcohol al 70% durante 10 minutos, se enjuagaron y nuevamente en hipoclorito al 5% durante 5 minutos, se les agregaron 2 gotas de tween durante 10 minutos y se enjuagaron, para as, finalmente proceder a la siembra de las semillas. Para la siembra, nos dirigimos al cuarto respectivo, el cual ha sido debidamente desinfectado y nos ubicamos en la cabina de flujo laminar y procedimos a sembrar los explantes en el medio de cultivo, esterilizado y fro. Acercamos las pinzas metlicas al mechero y tomamos el explante suavemente, depositndolo sobre el medio de cultivo, al cual se le retir la tapa de aluminio. Terminando, cubrimos nuevamente con aluminio y se dispusieron en cmaras de crecimiento. Cabe resaltar, claramente que la Micropropagacin es el conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para

Mtodos y/o metodologa: Primeramente, se esteriliz el rea de trabajo y la dotacin necesaria para la prctica, limpiando con alcohol las zonas con menor potencial de asepsia y en el autoclave a 15 lb de presin y 121 C durante 20 minutos (respectivamente). Se prepar el medio de cultivo respectivo para la micropropagacin de lulo, en nuestro caso semillas del mismo fruto, para este se utilizaron macrosales, microsales, EDTA, sln D, Kl, myo-inositos, cido ascrbico, tiemina, ANA, BAP, GA3, azcar y agar, los cuales se fueron adicionando en el mismo orden para obtener nuestro medio de cultivo especfico. Hay que indicar que todo lo anterior se debe calentar para disolver el agar y seguidamente, se verti en frascos de vidrio, los cuales fueron tapados con papel

multiplicar plantas asexualmente en forma rpida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagacin se utiliza, bsicamente, para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

5. BIBLIOGRAFA

http://www.jardinbotanicodeco rdoba.com/inves_cons_cult_inv i.php

http://articulos.infojardin.com/ Frutales/cultivo-in-vitroreproduccion.htm

3. ANLISIS RESULTADOS

DE

En total, se realizaron 19 muestras y/o siembras. Las semillas de lulo, a los 7 das de haberse hecho la siembra, se observ que no tenan cambios visibles, es decir, no presentaron contaminacin alguna con hongos u otro microorganismo y lucan como el primer da de la siembra. Ya, para los prximos 15 das (a partir de la siembra) se observ que las semillas an permanecieron sin contaminar, por lo cual, se deduce que la desinfeccin de las mismas fue la adecuada y se efectu correctamente.

http://www.fao.org/inpho_archi ve/content/documents/vlibrary /AE620s/Pfrescos/LULO.HTM

ANEXOS Equipo necesario para el cultivo in vitro - Autoclave:

4. CONCLUSIONES

Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presin, pero de mayor tamao, donde se controla

la presin y la temperatura (hasta 120).

- Cmara de flujo laminar: La cmara de cultivo es una habitacin de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variacin da-noche, etc.

Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitculo con un operario en un ambiente estril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

Condiciones vitro

del

cultivo

in

En la cmara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema ms importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones. Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio slido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente slo tiene que llevar agua, fuente de energa (azcares) y reguladores de crecimiento.

- Medio de cultivo:

Agua y nutrientes (hormonas).

- Cmara de cultivo

En la cmara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). Tambin existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas tambin varan. Lo normal son 2226C, aunque en ocasiones se exigen fros de 4C y tambin 28-30C para plantas tropicales. Igualmente, en el xito de esta tcnica de propagacin tambin influyen determinadas caractersticas de la planta, como el tipo, gentica e incluso el tipo de implante, parte ms juvenil o ms adulta. En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la prdida de agua, lo que provocara un aumento de la concentracin de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ah la importancia del cierre.

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