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8/17/2019 Cultivo Por Lote y Alimentado
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALUnidad Profesional Interdisciplinaria De Ingeniería Campus
Guanajuato
LABORATORIO DE BIORREACTORES
5MB1
Práctica: 4
Cultivo por Lo te y Lote Al imentado
PROFESORES:
Rosa Isela Jiménez Castillo
Juan Carlos Rodríguez Sierra
Guillermo Garibay Benítez
Equipo 1 Sección 1
Integrantes:
Lozano Ramírez Yadira Elizabeth
Méndez Viramontes Claudia
Marmolejo Pérez Omar Marmolejo Pérez Viridiana
Morales Carmona Estefanía
Yáñez Retes Flor Angélica
Fecha:
8/17/2019 Cultivo Por Lote y Alimentado
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Resumen
Introducción
Baci l lus subt i l is
Bacillus subtilis es una bacteria gram positiva, estas bacterias producen endosporas
las cuales proporcionan mayor resistencia a factores ambientales como por ejemplo
la temperatura, esta bacteria puede sobrevivir en un límite de temperaturas de 55°C
a 70°C y puede soportar pH hasta de 2 a 3 (Lisboa, 2003).
B. subtilis es una de las 40 especies reconocidas del género Bacillus que tiene la
capacidad de moverse. Esta bacteria produce enzimas hidrofílicas extracelulares
que degradan polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, los que utiliza como fuente
de energía. (Sierra, 2008).B subtilis presenta una mayor resistencia al final de la fase exponencial debido a la
formación de endosporas, y el grado de resistencia de éstas depende de las
condiciones ambientales en las que se encuentre (León, 2001).
Una de las sustancias producidas por las endosporas, es el ácido dipicolínico, el
cual se localiza en el núcleo de la endospora, además también de este compuesto
también son ricas en iones Ca+ las cuales forman un complejo el cual representa el
10% del peso seco de la endospora (León, 2001).
Cultivo por lote
Un cultivo por lote es un sistema de cultivo cerrado en el que existe una cantidad
inicial limitada de nutriente. El inoculo pasa por 4 diferentes fases, la de adaptación
o fase lag, una fase de crecimiento exponencial o fase log, otra en la que la
velocidad de muerte y la de crecimiento son iguales, fase estacionaria, y una fase
de muerte, en la que la velocidad de muerte es mucho mayor que la de crecimiento.
La fase exponencial puede describirse por la siguiente ecuación:
=
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Donde:
= ó =
Para determinar la concentración de biomasa en un intervalo específico de tiempo,
la ecuación anterior se puede integrar, de tal forma que:
=+
El incremento o decremento en la velocidad de crecimiento está dado por el
agotamiento de la concentración de sustrato, observándose en una gráfica que
relacione μ con la concentración de sustrato limitante residual, representado por la
siguiente ecuación (Monood):
= +
Donde:
= á
= 12
Una manera de determinar estos parámetros cinéticos mediante los datos
experimentales de un quimiostato es con la linealización de la ecuación de Monood:1 =
max + 1
Realizando un análisis similar al de biomasa, es posible expresar el cambio de la
concentración del producto microbiano, en función de la concentración de biomasa:
= y = +
Donde:
= í ó = í ó
Los patrones o modelos de flujo de sustrato en células que sintetizan productos
dependen de si la formación de producto se encuentra asociada o no al metabolismo
energético. En cultivos donde la síntesis del producto está asociado solo de forma
indirecta al metabolismo energético, la velocidad de consumo de sustrato es función
de 3 factores: la velocidad de crecimiento, la velocidad de formación de producto y
la velocidad de consumo de sustrato necesario para el crecimiento y el
mantenimiento.
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= − (
+ +)
Donde:
=
Cultivo por lote alimentado
La operación por lote alimentado se utiliza con el fin de controlar la concentración
de sustrato en el medio, ya sea para mantenerlo bajo si se desea una baja
concentración de biomasa o para mantenerlo alto ya que grandes cantidades de
sustrato pueden producir vías metabólicas alternas deseadas.En este tipo de operación se comienza con un volumen bajo de medio inoculado,
en el que el sustrato es alimentado y no existe corriente de producto. Por esta razón
el volumen dentro del tanque no es constante y es función del tiempo.
=
Entonces la masa de células en el reactor es igual V*(x) y la variación con respecto
al tiempo considerando una muerte celular despreciable, es igual a:
=+
Integrando y dividiendo entre el volumen, V, toda la expresión se obtiene:
= −
Donde:
= ó ()
La velocidad de consumo de sustrato en un cultivo por lote alimentado dependeademás de las variables ya mencionadas en el cultivo por lote, del factor de dilución:
= − − (
+ +)
Pirt (1979) ha expresado el cambio de la concentración de producto en un reactor
con volumen variable igual que para un reactor en cultivo continuo como se muestra
a continuación:
= −
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Entonces, la concentración de producto cambia de acuerdo a la relación entre la
velocidad de producción y la de dilución.
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVO ESPECÍFICO
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MATERIAL Y EQUIPO
Material Equipo
Matraz Erlenmeyer de 250 mL (2)
Autoclave
Micropipeta de 1000 µL (2)
Biorreactor Tanque agitado
Puntas para micropipeta de 1000 µL (1 caja) EZ-Control
Probeta 1000 mL (1)
Potenciómetro
Tubos eppendorf (40)
Parrillas eléctricas
Micropipeta de 100 a 1000 µL (1)
Incubadora rotatoria de temperatura controlada
Frasco de taparrosca de 1 L (1)
Bombas peristáltica (0 a 2 L/h)
Manguera de silicón (varias)
Balanza analítica
Torundas de algodón-alcohol
Electrodos de pH, temperatura y oxígeno disuelto.
Celdas de 1 µL (18)
Espectrofotómetro
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Preparación de Medio inicial e inóculo 2L
Reactivo
Cantidad (g)
Extracto de Levadura 40.0096
Glucosa 10.0093
Sulfato de Magnesio 1.0025
Cloruro de Calcio 0.0208
*Se tomaron 200 ml de ésta solución como medio de inóculo de B. subtillis (2 μl) y se llevó a un pH
7.
Preparación de Medio para lote alimentado 2.85L
Reactivo Cantidad (g)
Extracto de Levadura 57
Sacarosa 14.5
Sulfato de Magnesio 1.425
Cloruro de Calcio 0.0285
*Se preparó por partes y se llevó a un pH de 7.
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Descripción Del Sistema
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Metodología
Preparación de medios de cultivo (Día 1)
Cultivo por Lote (Día 2)
Preparaciónde 1.8 L demedio de
cultivo
(glucosa)inicial y 0.2 Lpara inocular
Esterilizar los200 ml demedio en
autoclave (15min, 121°C y
15 psi)
Dejar enfriare inocular encampana con
2 µL deBacillusSubtillis
Dejar incubarel medioinoculado
por 10 haprox. A 37°Cy 200 rpm
Guardar los1.8 L demedio
glucosa en
refrigeraciónhasta el día
siguiente
Preparar 2.85L de medio
de cultivo(sacarosa)
Dejar enrefrigeració
hasta el díasiguiente
Sellar Biorreactor conmangueras e introducir lossensores de pH y oxígenodejando un escape para la
presión.
Esterilizar Biorreactor conmedio inicial en autoclave(15 min, 121°C y 15 libras)
Dejar enfriar en CampanaVaciar el medio inoculaden Campana cuidando la
condiciones estériles
Conectar Biorreactor a EZ-Control
Monitorear condicionesde medio y establecer una
agitación de 100 rpm
Tomar muestra inicialpara medir densidad
celular en
espectrofotómetro a 600nm
Realizar DNS y Bradfordleyendo
espectrofotómetro a 540y 595 nm respectivament
Tomar muestra cada horay realizar Bradford, DNS ydensidad celular a cada
muestra
Realizar curva deproteínas, azúcares
reductores y densidadcelular
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Resultados
Se realizaron toma de muestras cada hora, y a cada una de las muestras se le hicieron mediciones debiomas, azucares reductores y proteína total, los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.
El comportamiento de los datos experimentales con respecto al tiempo, y modo de operación se muestran
en la figura 1.
Figura 1.- Cambio de concentración de biomas, azucares reductores y proteína total con el tiempo
Azucares
reductores
A= 540nm
Proteina
A= 595nm
Biomasa
A= 660 nm
Azucares
reductores
(μg/mL)
Proteina
(μg/mL)
Biomasa
(Células/mL)
1
2 0.157 0.197 0.047 24.40 107.89 9907
3 0.208 0.16 0.073 24.40 87.33 10928
4 0.268 0.213 0.15 8.71 116.78 13951
5 0.742 0.267 0.203 6.68 146.78 16031
6 0.138 0.266 0.408 2.96 146.22 24080
7 0.126 0.232 0.267 2.49 127.33 18544
8 - 0.053 0.127 0.215 2.43 69.00 16503
9 3 0.208 0.205 2.09 114.00 16110
10 0.201 0.213 0.217 1.94 116.78 16581
11 0.047 0.243 0.012 1.93 133.44 8533
12 3 0.312 0.028 1.85 171.78 9161
13 0.137 0.46 0.159 1.23 254.00 14304
14 1 0.733 0.523 0.44 405.67 28595
Cultivo por Lote
Alimentado
Tabla 1.- Datos experimentales de absorbancia y concentración para cultivo por lote y lote alimentado de B.
Absorbancia Concentracion
Tiempo
(h)Configuración
Cultivo por Lote
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Por definición la constante Ks es numéricamente igual a la concentración de
sustrato necesaria para llegar a ½ de μmax, entonces se graficaron las μ con
respecto a la concentración de sustrato consumido y se ajustó un modelo para
determinarla.
Sustituyendo el valor de la μmax/2 en el modelo y despejando x se obtuvo Ks.
= 6.026 /
Figura 2.- Determinación gráfica de parámetros cinéticos A) determinación de la velocidad especifica de crecimiento μ. B) Determinación de la
velocidad máxima de crecimiento μmax.
y = 0.0638x
R² = 0.9379
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8
L n ( X / X o )
Tiempo (h)
Determinación de μ0.0746
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0 2 4 6 8
μ
( h -
1 )
Tiempo (h)
μ max (h-1)
Figura 3.- Obtención de la constante de sustrato Ks.
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Mediante los parámetros cinéticos obtenidos con los datos experimentales, serealizó una simulación del lote alimentado y se calculó el % de error absoluto para
cada una de las mediciones tal como se muestra en la tabla siguiente:
Posteriormente se graficaron estos datos y se observó el comportamiento de la
concentración de los compuestos
2 2.089 2.009 4.0 114.00 114 0.0 16109.9 16109.90 0.0
2.194 1.940 1.666 16.4 116.78 138.44 15.6 16581.02 19907.82 16.7
2.372 1.932 1.356 42.5 133.44 165.48 19.4 8532.72 24144.87 64.72.538 1.845 1.122 64.5 171.78 195.33 12.1 9160.88 28848.10 68.2
2.693 1.225 0.939 30.5 254.00 228.22 11.3 14303.94 34044.90 58.0
2.84 0.440 0.795 44.6 405.67 304.08 33.4 28594.58 39763.00 28.1
Cultivo por
Lote
Alimentado
Simulación %Error
Configura
ción
Factor de
dilución D
(h-1) Simulación %Error Simulación %Erro
Azucares reductores (μg/mL) Proteina (μg/mL) Biomasa (Células/mL)
ExperimentoExperimento Experimento
Tabla 2.- Datos experimentales y simulados de concentración de biomasa, proteína y azucares reductores durante la alimentación.
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
7 8 9 10 11 12 13 14
C o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a t o t a l
μ g / m L
C
o n c e n t r a c i ó n d e a u c a r e s r e d u c t o r e s
μ g / m L
Tiempo (h)
Datos experimentales vs Simulación
Lote alimentado
Azucares reductores Azucares reductores simulación Proteína Proteina simulacion
Figura 4.- Simulación de la concentración de proteína y de azucares reductores durante el tiempo de alimentación.
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Discusión
Conclusión
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
7 8 9 10 11 12 13 14
C o n c e n t r a c i ó n d e b i o m a s a
C é l u l a s / m L
Tiempo (h)
Datos experimentales y simulación
Lote alimentado
Biomasa Biomasa (simulación)
Figura 5.- Simulación de la concentración de la concentración de biomasa durante el tiempo de alimentación.
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CUESTIONARIO.
1. Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no
sean las mencionadas durante la práctica (p.e. sales amortiguadoras,
producción de metabolitos secundarios, etc.).
2. Realiza un diagrama de flujo para obtener ron con el uso de un
biorreactor empleando un sustrato seleccionado por usted.
3. Menciona 5 modificaciones que le realizarías al biorreactor para mejorar
el proceso.
Anexos
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