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Cultivos celulares y sus aplicaciones
Instituto de Oncología
“Angel H. Roffo”
Área de Investigación
Dpto. Biología Celular
El cultivo celular
Téc. Alicia Rivelli
Breve introducción histórica
En 1907 el Dr. Harrison cultivó células del tubo neural de embrión de rana
En 1910 el Dr. Burrows cultivó explantos de tejido de embrión de pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de células de mamíferos.
Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre células cultivadas. En 1952 se establece la línea celular HeLa (primera línea celular de
origen humano) Durante la década del 70 los cultivos celulares se incorporan a la
ingeniería genética. En 1975 los Drs. Koehler y Milstein establecen la primera línea
celular productora de anticuerpos monoclonales. En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo
celular a permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.
¿Para qué cultivar células in vitro?
ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN: comprender la fisiología celular, toxicología, y virología.
INGENIERIA DE TEJIDOS: transplantes , injertos (piel, hígado, hueso, cartílago).
PRODUCCIÓN DE BIOLOGICOS: anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.)
CITOGENÉTICA: estudios cromosómicos.
TRANSGENICOS: organismos genéticamente modificados.
Diferentes tipos de cultivos de tejidos:
Cultivo de órganos: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro (por ejemplo corazón).
Cultivo de tejidos y explantes: mantenimiento de tejidos in vitro.
Cultivo de células
Cultivo de células:
Se define como el conjunto de técnicas de aislamiento de células y obtención de poblaciones celulares in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Diferentes tipos de cultivos celulares
Primario: iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo.
Líneas celulares: se origina del cultivo primario, a partir del primer subcultivo exitoso.
Línea celular continua: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.
Cultivo primario:
Pasos: Aislamiento del tejido de interés.
Disociación mecánica y enzimática del tejido
Obtención de la suspensión celular.
Siembra en soporte adecuado para la proliferación en monocapa o en suspensión.
Subcultivos
Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (máxima proliferación posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porción células y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).
Crecimiento celular:
En monocapa
Las células crecen
En suspensión
Células en monocapa
Los cultivos cuyas células son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de células adheridas al plástico o vidrio.
Para despegar las células se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.
Células en monocapa
Células en suspensión
Las células que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (característico de células hematopoyéticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente.
El repique se realiza mediante una dilución de la suspensión celular.
Líneas celulares continuas
BHK: fibroblastos de riñón hámster cirio dorado.CrFK: fibroblasto de riñóngato doméstico.MDCK: epitelio de riñón canino.CHO: epitelio de ovario dehámster chino.HeLa: epitelio tumoral decuello uterino humano.MDBK: epitelio de riñón adulto.HUVEC: endotelio de vena umbilical humana
Línea celular LM3
Línea celular establecida a partir de pasajes sucesivos in vitro de un cultivo primario del adenocarcinoma mamario murino M3.
El adenocarcinoma mamario M3 surgió espontáneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”.
Las células LM3 presentan un fenotipo altamente invasivo y metastásico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo muestran una morfología epitelial poliédrica
ABAC
Asociación BancoArgentino de Células
Desde 1987 mantiene y administra líneas celulares en distintos centros de investigación, proveyendo células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.
Mantenimiento de líneas celulares
Repique o pasaje: para mantener las células en cultivo.
Congelación (criopreservación): para preservar las células a lo largo del tiempo (años) y mantener un stock para los próximos usos.
Criopreservación
Técnica:
Se levanta la monocapa por tripsinización Se obtiene una suspensión celular. Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min,
para separar la fracción celular del medio de cultivo.
El pellet celular se resuspende en medio de congelación (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol –anticongelantes-)
Criopreservación
Se fraccionan en criotubos. Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en
heladera y luego se la lleva a freezer -80°C durante 24-48 hs
Se guardan en tanque de nitrógeno líquido
Componentes del medioambiente del cultivo:
Medio de cultivo:( aporta nutrientes, vitaminas etc.)
Suplementos: (ej suero que aporta factores de crecimiento)
pH: ( ej: 7,4 )
Temperatura: (ej. 37° C)
Gas: Dióxido de carbono (ej. 5-7%)
Soportes: materiales adecuados para el crecimiento (ej vidrio, plástico, biológicos etc.)
Medios de cultivo
Suplementos
Atmósfera y temperatura
Estufa de cultivo con atmósfera de Dióxido de carbono
Soportes
Estériles Generalmente se utiliza material de plástico:
Soportes
Biológicos:
El laboratorio de cultivo celular
Además del equipamiento usual se requiere:
Microscopios: invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.
El laboratorio de cultivo celular
Flujo Laminar o campana de seguridad biológica: mantienen la esterilidad del área de trabajo.
El laboratorio de cultivo celular
Espacios fríos:- Heladeras (4°C)- Freezer (-20, -40,-80 °C)- Tanque de Nitrógeno Liquido (- 196°C)
El laboratorio de cultivo celular
Factores críticos
No biológicos: orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc.
Biológicos: CONTAMINACIONES
La contaminacióncontaminación puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos
tiene efectos adversos
Contaminaciones Biológicas
Microorganismos:
Bacterias
Hongos/Levaduras
Mycoplasmas
Otras células
Contaminaciones Biológicas
Efectos adversos sobre el metabolismo celular
Pobre calidad de resultados experimentales Pérdida de células valiosas Pérdida de productos celulares (por
ejemplo producción de antígenos para vacunas, etc.)
Pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo
MUCHAS GRACIAS!!!
Aplicaciones en Oncología
Téc. Silvina Romero
Instituto de Oncología “Angel H. Roffo”
Aplicaciones de los cultivos celulares en la Investigación en cáncer
Investigación en Oncología
Se realizan ensayos tendientes a:
Caracterizar el comportamiento de las células tumorales in vitro e in vivo.
Revertir la agresividad tumoral mediante drogas y herramientas genéticas tanto in vitro como in vivo.
Introducción
El cáncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células, con crecimiento y división más allá de los límites normales, invasión del tejido circundante y, a veces, metástasis.
La metástasis es la propagación a distancia de las celulas tumorales, por vía linfática o sanguínea, lo que implica el crecimiento de nuevos tumores en un lugar diferente al tumor original (primario).
Estas propiedades diferencian a los tumores malignos de los benignos, que son limitados y no producen metástasis.
Celulas normales vs tumorales
Células normales
Células tumorales
Características de las células tumorales
1. Forma (pleomorfismo): cambio de en la morfología y tamaño del citoplasma.
2. Adhesión/ Movilidad: la reducción de la adhesión entre células y con la matriz celular facilita la movilidad celular favoreciendo la aparición de metástasis
Cambios en el citoesqueleto: estos cambios afectan:
Características de las células tumorales
Cambios nucleares: tiene valor diagnóstico Número: celulas multinucleadas Forma: mas grandes o mas
pequeños Organización de los núcleos:
(nucleolos prominentes) Hipercromasia: por la presencia
de mayor cantidad de ADN.
Características de las células tumorales
Producción de enzimas proteolíticas: permiten invadir los tejidos adyacentes facilitando la migración y la propagación de las células tumorales.
Características de las células tumorales
Grado de diferenciación celular: las células neoplásicas por su alta tasa de proliferación se desdiferencian pareciéndose al tipo celular que le dio origen.
Alteraciones en el crecimiento: crecen de manera desordenada, pierden la polaridad celular y no respetan límites por contacto célula-célula.
Resistencia a la apoptosis: muerte celular programada
Biología Molecular del Cáncer
La transformación maligna implica la adquisición progresiva de una serie de cambios genéticos y bioquímicos específicos que actúan desobedeciendo los fuertes mecanismos antitumorales presentes en las células normales.
Investigación en Oncología
Se trabaja con dos modelos
Celulares: Líneas celulares cancerígenas (in vitro)
Animales de experimentación: Ratones (in vivo) a los cuales por inyección de la celulas tumorales se les genera la enfermedad experimentalmente.
Estudios in vitro
Investigación en Oncología
Lineas celulares tumorales usadas en nuestro laboratorio.– LM3 : Ca mamario murino– MCF7: Ca mamario humano– MB49: Ca de vejiga murino– T24: Ca de vejiga humano– LP07: Ca de pulmón murino– Entre otras…
Estudios celulares
Estudios celulares:
Morfológicos
Funcionales
Mixtos
Cromosómicos
Estudios Morfológicos:
Observación en fresco o post fijación (formol neutro) de monocapas celulares, en microscopio óptico invertido, contraste de fase, fluorescencia etc.
Estudios funcionales:
1. Viabilidad celular2. Adhesión *3. Ensayos clonogénicos*4. Migración*5. Actividad enzimática*6. Citotoxicidad
*evalúan la capacidad invasiva y metastásica.
Estudios funcionales:
1- Viabilidad celular: Se siembra en placas multipozo una cantidad
conocida de células Se las somete a “hambreado” colocando
medio de cultivo sin suero (SFB) durante 72hs Se evalúa la actividad celular (viabilidad) por
fotocolorimetría. La producción del color se debe a la
metabolización del reactivo (MTS) llevado a cabo por las células vivas.
Estudios funcionales:
1- Viabilidad celular:
Estudios funcionales:
2- Ensayo clonogénico en agar:
Capacidad de crecer en un medio independiente de anclaje .
Formación de colonias celulares a partir de una única celula.
Estudios funcionales:
2- Ensayo clonogénico:
Estudios funcionales:
3- Migración: Ensayo de cicatrización de heridas
Se realiza una herida en la monocapa y se deja a las células crecer durante un tiempo determinado en presencia de tratamientos o condiciones específicas. La migración se evaluará a través del porcentaje de cubrimiento del área inicial.
Estudios funcionales:
3- Migración: Ensayo de cicatrización de heridas
Tipo celular 1
Tipo celular 2
Tipo celular 3
Estudios funcionales:
4- Citotoxicidad celular:
Se utiliza para encontrar la dosis justa de drogas o reactivos que generen el efecto deseado sin dañar la monocapa.
Se puede buscar la muerte de la totalidad de las células (ej. Drogas quimioterápicas).
Estudios funcionales:
5- Citotoxicidad celular:
Igual cantidad de celulas en cada posillo.Dosis creciente de reactivo o drogaEl resultado se evalua con una curva dosis respuesta.
Estudios mixtos
Mofológicos y funcionales: Inmunofluorescencia: empleo de
Ac.fluorescentes
Estudios cromosómicos
Cariotipo: estudia la morfología y número de los cromosomas
Nos da una idea de la evolución de los cultivos celulares.
Regiones homogéneamente
teñidas Translocaciones
Estudios cromosómicos
Estudios Moleculares
Estudios Moleculares
Se utiliza:
Lisados celulares: el producto de la destrucción celular y purificación de la fracción a utilizar (proteínas, ácidos nucleicos, etc)
Partes celulares: obtención de núcleos, citoplasmas, membrana celulares etc.
Medios condicionados: se utilizan los medios en los que crecieron las células y se estudian factores de crecimiento, proteínas, etc. secretadas al exterior.
Fundamento:
Migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico
estas partículas migran hacia el polo – o positivo+ según la combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas.
Aportan un potente criterio de pureza
Electroforesis en gel
Utilidades:
Electroforesis en gel:
Gel de Poliacrilamida: para separar proteínas.
Gel de Agarosa: para separar Ácidos Nucleicos.
Separación de moléculas Electroforesis en gel
Estudios Moleculares
Biomoléculas mas importantes en investigación:
ADN
ARN
PROTEINAS
Estudios del ADN
Electroforesis en gel
El ADN extraído por lisis celular, se corta con enzimas para obtener diferentes fragmentos.
Se realiza la corrida electroforética en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN e identificarlos según su peso (kb)
Luego de la electroferesis, se tiñe el gel con colorantes que emiten fluorescencia al ser excitado con luz UV:
Estudios del ADN
Colorantes fluoerescentes BROMURO DE ETIDIO: altamente tóxico y
mutagénico.
Estudios del ADN
Colorantes fluoerescentes SYBR green, SYBR safe, SYBR gold. No es mutagénico ni tóxico.
Estudios del ADN
PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa
Usos: Detección de mutaciones Amplificación de genes de interés Estudios diagnósticos
Estudios del ADN
Transfección: Introducción de un fragmento de ADN externo a una célula animal.
Para qué? Caracterizar oncogenes Confirmar la identidad de genes Síntesis de ARN Expresión de proteínas, etc Estudio de síntesis y transporte intracelular
Cómo se introduce el ADN a la célula?
Una de técnicas es usando virus. El proceso se llama INFECCIÓN Una vez que el virus infecta las células en cultivo:
1. El fragmento de ADN de interés pasa del citoplasma al núcleo celular.
2. Se expresa produciendo el efecto deseado.
3. El ADN puede incorporarse en las células transfectadas de dos formas:
Momentánea: transfección transiente. Llevada a cabo por Adenovirus
Estable: implica la integración del ADN genoma celular. Retrovirus.
Selección de las células transfectadas
Junto con el ADN a insertar se incorporan genes que nos permiten identificar en cultivo a las células
transfectadas.
Genes mas utilizados: Resistencia a antibióticos: Hygromicina G418
Las células que no incorporaron el ADN durante la transfección mueren al colocar estos atb.
Permiten la expresión de GFP (proteína verde fluorescente)
Proteína verde fluorescente GFP
Cultivos celulares Animales de laboratorio
La proteína GFP fluorece bajo luz UV, la presencia esta proteína en la célula nos da la idea de una transfección exitosa: si está la proteína en la celula también esta nuestro ADN de interés.
Estudios de ARN
Electroforesis en gel:
Gel tenido con BrEty mirado con UV
Estudios de ARN
Recientemente:
Transfección con ARN
ARN interferente
Suprime la expresión de un gen en particular.
Es un ARN complementario al ADNm y al unirse a éste promueve su degradación.
Estudios de Proteínas
Se usan lisados celulares Sirve para identificar, cuantificar y evaluar la
función de proteínas como: Enzimas Proteínas estructurales Receptores
Sirve para evaluar indirectamente la funciones de genes a través de su producto:
Las Proteínas!
Estudios de Proteínas: Western Blot
Western Blot
Western Blot
Para la identificación de la proteína de interés se utiliza un “marcador de peso molecular”, que indica PM correspondiente a cada altura del gel.
Western Blot
Estudios In vivo
Investigación en Oncología
Animales de experimentación: contamos con un bioterio con cria propia de ratones. BALB/C
C57 B16/ J-GFP
Estudios in vivo
Objetivo: Estudiar el comportamiento in vivo de los modelos
celulares que generados in vitro.
Metodología: Inyección subcutánea, endovenosa, intraperitoneal,
etc., de las células en estudio.
Colocación de parches de las drogas en estudio en ratones a los cuales se les provocó experimentalmente la enferemdad.
Estudios in vivo
Se evalúa: Capacidad tumorigénica: porcentaje de toma
tumoral. Capacidad metastásica espontánea: producción
de metástasis por inoculación de celulas tumorales in situ.
Capacidad metastásica experimental: producción de metástasis por inoculación ev de las células en estudio.
Estudios in vivo
Capacidad tumorigénica
Estudio in vivo
Metástasis experimentales:
- via e.v.
- 21 días post inyección se cuentan las mts pulmonares
Aplicaciones en otros campos
Otras aplicaciones:
Virología:
Aislamiento y multiplicación de virus Producción de vacunas Estudio y producción de antivirales Detección de virus desconocidos Estudios de oncogénesis viral
Otras aplicaciones:
Transplantes/Injertos: Cultivo de piel Cultivo de celulas stem (pluripotentes) Cultivo de islotes pancreaticos,
hepatocitos, etc
Otras aplicaciones:
Fertilización in vitro Producción de biológicos (proteinas,
anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas).
Producción de transgénicos: GMOs (organismos geneticamente modificados: soja, arroz, ovinos, caprinos, etc.)
Transgenesis parcial: Terapia génica en humanos.
Agradecimientos:
Área de Investigación Instituto Roffo:
- Dra Lydia Puricelli
- Dr Martin Krasnapolski
- Lic. Maria Ines Diaz Bessone
- Lic. Denis Belgoroski
MUCHAS GRACIAS!!!
