Upload
others
View
15
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
CursodeBiologíaMolecularyGenómicaparaprofesoresdeEnseñanzaMedia2018
Dr.MarceloAntonelliProgramadeBiologíaCelularyMolecularICBMFacultaddeMedicinaUniversidaddeChile
ENERO2018
TemariodelaClaseParte1-Elcódigogenético-SíntesisdeproteínasParte2-Ingenieríagenética-Genotecas-Vectoresdeexpresión-Animalestransgénicos
Parte1:Elcódigogenéticoylabiosíntesisdeproteínas
Flujodelainformación
Síntesisdeproteínas
• mRNA
• Ribosomas
• aatRNA
• energía
• enzimasyfactores
HipótesisdelAdaptador
EstructuradelRNAdetransferencia(tRNA)
EstructuradeltRNA
ElCódigoGenético
CÓDIGOGENÉTICO20aa64codones
• Nosesuperpone
• Notienepuntuación
• Seleedecorrido
• Noesambiguo
• Esdegeneradooredundante
• Esuniversal
Característicasdelcódigogenético
Elcódigogenéticonoesambiguoyesdegenerado
• Nosesuperpone
• Notienepuntuación
• Seleedecorrido
• Noesambiguo
• Esdegeneradooredundante
• Esuniversal
Característicasdelcódigogenético
EnrealidadelCódigoGenéticonoesUniversal
Cisteina
Selenocisteina
¿CuántostRNAssenecesitanparalasintesisdelasproteínas?
LateoríadelbalanceodeterminaelnúmerodecodonesquepuedereconoceruntRNA
Serequiereunminimode32tRNAsparatraducirlos61codones(31codonesparalosaminoácidosyunoparalainiciación).
Aminoacil-tRNAsintetasas
• EnzimasquecatalizanlaunióndeunaminoácidoauntRNA(activacióndelosaminoácidos)
• Sonespecíficasparacadaaminoácido
Gln-tRNAsintetasa
Formacióndelenlacepeptídico
Reaccióndeactivacióndelaminoácido
ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA
ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA
• Fidelidaddelatraducción
• Conservacióndelaenergía
Aminoacil-tRNA
Latraducciónrequierelaparticipacióndeestructurascomplejasvisiblesaniveldelmicroscopioelectrónico……..
RibosomasESTRUCTURASDE
RNAyPROTEÍNA
Ribosomasbacterianos
versus
Ribosomaseucarióticos
Síntesisdeproteínasenprocarióntes
VisualizaciónsubunidadesribosomalesporMET
Acoplamientotranscripción-traducciónenbacterias
LecturadelmRNA5’3’
SíntesisNH3
+COO-
Reconocimientodelsitiodeiniciodelatraducciónenbacterias
SecuenciadeShineDalgarno
OtrosCodonesdeinicio:-Bacterias(E.coli)GUGyUUG-Eucariotes muyraroquenoseaATG
Arquitecturadelribosomabacteriano:
rRNA16S
ShineDalgarno
Iniciodelasíntesisdeproteínas
§ Subunidadribosomalmenor
§ factoresdeiniciación
§ mRNA
§ formilmetionil-tRNA
Subunidad30SdelRibosomadeE.coli
zonadecontactoconelmRNArRNA
Proteínasribosomales
SUBUNIDAD50SDELRIBOSOMA
Elongación
Formacióndelenlacepeptídicoenelribosoma
PeptidiltransferasarRNA23S
rRNA23S:estructurasecundaria
Traslocación
Términodelasíntesisdeproteínas
actividadpeptidilhidrolasa
RF=releasingfactor
Elongación
Bacterias Eucariontes
EF-Tu eEF1α
EF-Ts eEF1βγ
EF-G eEF-2
Término
Bacterias Eucariontes
RF1 RF
RF2
RF3
LastresfuncionesdelRNAenlasíntesisdeproteínas
GENPROCARIONTE
Transcripción
mRNA
Términodelatranscripción+1
Iniciodelatranscripción
regiónreguladora
Traducción
proteína
regióncodificante
AUG Codóndetérmino
3’5’
ShineDalgarno
+1
promotor
5’UTR3’UTR
ATG
DNA
EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes
+1
EUCARIONTE
Ensamblajedelosribosomasencélulaseucariontes
eIF4FisoftenusedtorefertothecomplexofeIF4A,eIF4E,andeIF4G.
Regulatingcap-dependenttranslationinitiation.Therecruitmentofthe40Sribosomalsubunittothe5ʹendofmRNAisacrucialandrate-limitingstepduringcap-dependenttranslation.
IniciodelatraducciónenEucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesisdeproteínaseneucariontes
Síntesis de proteínas en eucariontes
Síntesis de proteínas en eucariontes
Síntesis de proteínas en eucariontes
Parte2:DNARECOMBINANTEEINGENIERÍAGENÉTICA
EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes
+1
INGENIERÍAGENÉTICA
MANIPULACIÓNDELDNADELOSORGANISMOSVIVOS
1) INVESTIGACIÓNBÁSICA(ESTUDIODELAORGANIZACIÓN,EXPRESIÓNYFUNCIÓNDEGENESENLOSORGANISMOSVIVOS).2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓNCONSCIENTEDELOSGENESENSALUD,ENLAINDUSTRIADEALIMENTOS,ENLAAGRICULTURA,ETC.
PIEDRASANGULARESDELAINGIENIERÍAGENÉTICA
1. ENDONUCLEASASDERESTRICCIÓN(ENZIMASDERESTRICCIÓN)
2. REACCIÓNDEPOLIMERIZACIÓNDECADENAOPCR(POLYMERASECHAINREACCTION)
3. GENOTECASGENÓMICASYDEcDNA
TécnicasdeDNARecombinante
ELOBJETIVODELATECNOLOGIADELDNARECOMBINANTEes…………………
AislarsecuenciasdeDNAquecontengangenesyobtenermúltiplescopiasdeellos
para…………..
1. Conocersuestructuramolecular
2. Estudiarsufunciónbiológica
3. Manipularlos
4. Transferirlosdeunorganismoaotro⇒IngienieríaGenética
TÉCNICAS§ CLONAMIENTOMOLECULAR
§ PCR(reacciónencadenadelapolimerasa)
CLONAMIENTODEUNGEN
ETAPAS1) ObtencióndelfragmentodeDNAdeinterésmediantePCR(Gen).
2) Uniónaunvector(DNAvehículo):ObtencióndeDNArecombinante.
3) Introducciónenunacélulahospedera(Objetivo:perpetuarloyamplificarlo).
4)Rastreo(screening):Identificacióndecoloniasquecontienenel
DNArecombinantedeinterés.
ClonamientodeunGen
DNAVector FragmentodeDNA
AmplificacióndelDNAencélulahospedera
IdentificaciónyaislamientodelfragmentodeDNA
DNArecombinante
ClonamientoporPCR
ReaccióndePolimerasaenCadena(PCR)
u Técnica utilizada en la detección yclonamientodegenesdeinterés.
u DiagnósticoClínico.
u MedicinaForense.
CLONAMIENTODEUNPRODUCTODEPCR
HERRAMIENTASBÁSICAS• Enzimasderestricción
CLONAMIENTOMOLECULAR
Enzimasde
Restricción
DIGESTIONDELDNAPORENZIMASDERESTRICCION
Sitiodecorteenzimasderestricción
HERRAMIENTASBÁSICAS
• Vectores
CLONAMIENTOMOLECULAR
PLASMIDIODECLONAMIENTO
*Origendereplicaciónautónomo*Marcadordeselección*Sitiosúnicosderestricción
HERRAMIENTASBÁSICAS
• DNAligasa
CLONAMIENTOMOLECULAR
Ligacióndefragmentosderestricciónconextremoscohesivos
ClonamientoDirigido
Ligacióndeextremoromo
Ligacióndeextremocohesivo
HERRAMIENTASBÁSICAS
• Célulashospederas
CLONAMIENTOMOLECULAR
PROPAGACIONENCELULAHUESPED
¡Sepuedencomprar¡
Recordarsiemprecolocarlesitiosderestricciónalospartidoresparapoderclonarelfragmentoenunplasmidio
fragmentodePCR
EstudiodelaFuncióndeunGen
HerramientasdeEstudio:
u Análisiscomputacionalenbancodedatos:homologíadesecuenciaconungendeotroorganismocuyafunciónseconoce.
u Animalestransgénicos.
u Expresiónenbacteriasycélulaseucariontes.
u Mutagenesis
Vectordeexpresiónenbacterias
u AmplificacióndelgendeinterésporPCR.
u Clonamientoenvectordeexpresión.
u Induccióndelaexpresióndelgendeinterésenbacterias.
Intervenciónenlabiologíaanimal:
Transgénesis
¿Quéesunanimaltransgénico?
Unanimal transgénicoesunoqueportaun genquehasidodeliberadamenteinsertadoensugenoma.
El gen extraño es construído e insertado utilizandometodologíadeDNArecombinante.
Además el DNA del gen a ser incorporado debe incluirotrassecuenciasquelocapacitenpara:
-Serincorpordoenelgenomadelhospedante-Ser expresado correctamente por las células delhospedante.
¿CómogenerarunanimaltransgénicoenelLaboratorio?
Método1:Inyecciónalpronúcleomasculino
Laconstrucciónlinearizadaesinyectadaenelpronúcleomasculino
TransgénicosdelgenSry(TDFenhumanos)
RATONES TRANSGENICOS El gen de la hormona de crecimiento se ha modificado geneticamente para que
se exprese en gran cantidad .
El promotor de metallothionein es regulado
por metales Ratones alimentados con metales
Conclusiones:
-Integraciónmuytempranaeneldesarrollo.
-Antesdeladivisióndelaprimeracéluladelcigoto.
-Antes de que la población de células germinalessegregadelascélulassomáticasprimordiales.
-Integración estable en las celulas somáticas ygerminales.-TransmiciónMendelianadelgentransgénico.
Método2:Transferencianuclear
Dolly
Animalestransgénicosproducidosportransferencianuclear
GeneX
X
transfección
transducción
GeneXX
x
Transgénicosdelactoferrinaenbovino
u Utilizarlalechedelganadobovinocomo“reactor”paragenerargrandescantidadesdeunaproteínahumanadeinterésbiológico
Promotordecaseina
u Interésglobaldelaindustriaalimenticia
Ej:Transgénicosdelactoferrinahumana
Fin